Name: Meting van differentieel gemethyleerde INS DNA-Species in monsters humaan serum als een Biomarker van Islet β Cell Death (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Leer hoe je differentieel gemethyleerde INS DNA-soorten in humaan serum meet als biomarker voor β-celdood. Deze digitale PCR-methode detecteert vroege celdood bij type 1 diabetes met hoge gevoeligheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een National Institutes of Health-subsidie UC4 DK104166 (aan RGM). We wensen de assistentie van het Indiana Diabetes Research Center Translation Core te erkennen, ondersteund door een National Institutes of Health-subsidie P30 DK097512.

Ethische verklaring: Protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van Indiana University. Ouders van proefpersonen gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming en kinderen ouder dan 7 jaar gaven toestemming voor hun deelname.
1. Serumverwerking
OPMERKING: De assay zoals beschreven, is grondig getest met menselijk serum dat als volgt werd geïsoleerd.
<ol>
	<li>Verzamel bloed in één rode top (geen toevoeging; ongecoat) bloedopnamebuisje.</li>
	<li>Laat 30 min op kamertemperatuur staan om het stolsel te laten vormen.</li>
	<li>Centrifugeer de buis bij 2.000 x g gedurende 10 min op kamertemperatuur. Breng de supernatant (serum) over naar een nieuwe buis bestemd voor serumopslag (polypropyleen schroefdopbuisjes, grootte afhankelijk van monsters).</li>
	<li>Bewaar monsters bij -80 °C totdat ze klaar zijn voor DNA-isolatie.</li>
</ol>
2. DNA-extractie uit serum
OPMERKING: DNA wordt geëxtraheerd met een DNA-extractiekit met behulp van 50 μl serum (aanbevolen), volgens het protocol van de fabrikant met enkele aanpassingen.
<ol>
	<li>Bereid 200 μl lysisbuffer + 1 μl poly(A) (5 μg) per monster in een microcentrifugeerbuisje. Vortex gedurende 15 sec. Zet opzij tot stap 2.3.</li>
	<li>Neem serummonsters uit de -80 °C vriezer en laat ze op kamertemperatuur ontdooien. Breng het volume van het serummonster op 200 μl totaal met behulp van fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, met calciumchloride en magnesiumchloride).</li>
	<li>Lyseer het monster door 20 μl protease (1,4 Anson eenheden/ml) toe te voegen aan het monster, gevolgd door 200 μl lysisbuffer/polyA-mengsel (uit stap 2.2) en vortex gedurende 8 sec. Incubeer het monster gedurende 10 min bij 56 °C, en centrifugeer vervolgens kort gedurende 7 sec op volle snelheid in een microcentrifugeerbuisje (>10.000 x g).</li>
	<li>Precipiteer DNA door 230 μl 100% ethanol toe te voegen aan het monster en vortex gedurende 8 sec. Centrifugeer kort gedurende 7 sec op volle snelheid (>10.000 x g).</li>
	<li>Breng het DNA aan op de spinkolom door 600 μl monstermengsel toe te voegen aan de mini-spinkolom. Centrifugeer gedurende 1 min bij 6.000 x g. Gooi de flow-through weg en plaats de kolom in een schone buis.</li>
	<li>Was het DNA door 500 μl wasbuffer 1 toe te voegen aan de kolom. Centrifugeer gedurende 1 min bij 6.000 x g. Gooi de flow-through weg en plaats de kolom in een schone buis. Voeg 500 μl wasbuffer 2 toe aan de kolom en centrifugeer gedurende 3 min op volle snelheid (>10.000 x g). Plaats de kolom in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugeerbuis en centrifugeer weer gedurende 1 min op volle snelheid.</li>
	<li>Elueer het DNA door de kolom in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugeerbuis te plaatsen en 60 μl elutiebuffer direct op het filter toe te voegen. Het is belangrijk om de puntjes tussen monsters te wisselen om kruisbesmetting te voorkomen. Incubeer gedurende 5 min op kamertemperatuur, en centrifugeer vervolgens gedurende 1 min bij 6.000 x g. Voeg nog eens 60 μl elutiebuffer toe en centrifugeer gedurende 1 min bij 6.000 x g. </li>
	<li>Bewaar DNA bij -20 °C voor later gebruik of ga direct door met bisulfietconversie.</li>
</ol>
3. Bisulfietconversie
OPMERKING: Bisulfietconversie wordt uitgevoerd met behulp van een bisulfietconversiekit, volgens het protocol van de fabrikant met enkele aanpassingen.
<ol>
	<li>Voeg 130 μl bisulfietconversiereagens toe aan 20 μl DNA uit stap 2.7 in een PCR-buisje (enkele 0,2 ml PCR-buis of 8-strip PCR-buisjes) om ongemethyleerde cytosines om te zetten in uracils. Bewaar de resterende 40 μl DNA voor later gebruik of gebruik in replicareacties. Mix 20 keer door op en neer te pipetteren en centrifugeer kort om ervoor te zorgen dat er geen druppels op de zijden of het deksel zitten. Incubeer in een waterbad of thermische cycler als volgt: 98 °C gedurende 8 min, 54 °C gedurende 60 min, 4 °C gedurende 5 min.
	<ol>
		<li>Ga naar stap 3.2 of bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 20 uur.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Voeg 600 μl bindingsbuffer toe aan de spinkolom en plaats de kolom in de meegeleverde opvangbuis. Breng het bisulfiet behandelde DNA aan op de kolom en mix door 10 keer op en neer te pipetteren. Centrifugeer gedurende 30 sec op volle snelheid (>10.000 x g). Gooi de flow-through weg.</li>
	<li>Was het DNA door 100 μl wasbuffer aan de kolom toe te voegen en centrifugeer gedurende 30 sec op volle snelheid (>10.000 x g).</li>
	<li>Voer desulfomering uit om de sulfonaatgroep te verwijderen om de conversie van ongemethyleerde cytosines in uracil te finaliseren door 200 μl desulfomeringsbuffer aan de kolom toe te voegen. Laat 20 min op kamertemperatuur staan en centrifugeer vervolgens gedurende 30 sec op volle snelheid (>10.000 x g).</li>
	<li>Was het DNA door 200 μl wasbuffer aan de kolom toe te voegen en centrifugeer gedurende 30 sec op volle snelheid. Gooi de flow-through weg en herhaal deze wasstap.</li>
	<li>Plaats de kolom in een 1,5 ml microcentrifugeerbuis. Elueer DNA door 10 μl elutiebuffer direct toe te voegen aan het kolomfilter. Incubeer gedurende 1 min. Centrifugeer gedurende 3

<ol><li>Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+crosstalk+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell crosstalk in type 1 diabetes.</a> Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).</li>
<li>Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+beta-cell+function+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).</li>
<li>Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+immunobiology+to+%CE%B2-cell+biology%3A+the+changing+perspective+on+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes.</a> Islets. 6 (2), 28778(2014).</li>
<li>Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITN-JDRF+Type+1+Diabetes+Combination+Therapy+Assessment+Group+Developing+combination+immunotherapies+for+type+1+diabetes%3A+recommendations+from+the+ITN-JDRF+Type+1+Diabetes+Combination+Therapy+Assessment+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group.</a> Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).</li>
<li>Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://hirnetwork.org/">https://hirnetwork.org/</a> (2016).</li>
<li>Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevations+in+Circulating+Methylated+and+Unmethylated+Preproinsulin+DNA+in+New-Onset+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes.</a> Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).</li>
<li>Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Specific+Methylation+of+Human+Insulin+Gene+and+PCR+Assay+for+Monitoring+Beta+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death.</a> PLoS ONE. 9 (4), 94591(2014).</li>
<li>Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2+cell+death+and+dysfunction+during+type+1+diabetes+development+in+at-risk+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals.</a> J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).</li>
<li>Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tissue-specific+cell+death+using+methylation+patterns+of+circulating+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).</li>
<li>Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239 (4839), 487-491 (1988).</li>
<li>Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+gene+expression+is+regulated+by+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Insulin gene expression is regulated by DNA methylation.</a> PloS One. 4 (9), 6953(2009).</li>
<li>Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+%CE%B2+cell+death+in+diabetes+using+differentially+methylated+circulating+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).</li>
<li>Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+islet+%CE%B2-cell+death+in+vivo+by+multiplex+PCR+analysis+of+differentially+methylated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA.</a> Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).</li>
<li>Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+bisulphite+modification+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: bisulphite modification and analysis.</a> J. Vis. Exp. (56), (2011).</li>
<li>Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation-specific+PCR+unraveled%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Methylation-specific PCR unraveled.</a> Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).</li>
<li>Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+methylation-specific+polymerase+chain+reaction+method+for+monitoring+beta+cell+death+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes.</a> PloS One. 7 (10), 47942(2012).</li>
<li>Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Sozzi, G., Roz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+storage+of+whole+plasma+or+isolated+plasma+DNA+on+the+results+of+circulating+DNA+quantification+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays.</a> J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Methylering van cytosinen van DNA-methyltransferase maakt de epigenetische controle van transcriptie van veel genen. De INS-gen bij de mens is bijna uitsluitend tot expressie gebracht in eilandje β-cellen, en er lijkt een correlatie tussen de frequentie van methylering van cytosines in de INS gen silencing van de 11 transcriptie. Als zodanig, de meeste celtypen hebben substantieel hogere frequenties van methylatie van de INS-gen bij verschillende cytosines vergelijking met cellen P ...

Type 1 diabetes (T1D) is een auto-immuunziekte die wordt gekenmerkt door de vernietiging van insuline producerende eilandjes β cellen door autoreactieve T-cellen 1. De diagnose van type 1 wordt gewoonlijk plaats na meting van hyperglycemie (bloedglucose&gt; 200 mg / dl) in een slanke jonge individu, dat met ketoacidose zou voorstellen als bewijs van insulinedeficiëntie. Ten tijde van de diagnose van type 1, blijken er aanzienlijk verlies van β celfunctie en massa (50-90%) 2. In klinische studies, verschillende immuun modulerende geneesmiddelen die op het ogenblik van de diagnose werd ingesteld resulteerde in de stabilisatie van β celfunctie (en vermoedelijk massa), maar niets hebben geleid tot klinische remissie van de ziekte, een bevinding dat de oproep voor de ontwikkeling heeft verhoogd van biomerkers voor vroege detectie van de ziekte en de lengterichting volgen van de effectiviteit van combinatietherapieën 3,4. Inspanningen van internationale consortia, zoals eenis de Human Islet Research Network Consortium bij de National Institutes of Heath 5, hebben benadrukt de noodzaak om biomarkers die zich richten op β cel stress en dood in T1D ontwikkelen. 9 - In lijn met deze inspanningen, hebben onze groep en anderen onlangs biomarkeranalyses Deze maatregel circuleren, epigenetisch gemodificeerd DNA fragmenten die in de eerste plaats het gevolg zijn van stervende cellen β 6 ontwikkeld. In alle gepubliceerde onderzoeken tot nu toe heeft de nadruk gelegd op de kwantificering van het menselijk gen dat codeert voor prepro (INS), die een grotere mate van ongemethyleerde CpG posities in de coderende en promotergebieden vergelijking met andere celtypen blijkt. De bevrijding van niet-gemethyleerd INS DNA-fragmenten werd de hypothese als in de eerste plaats als gevolg van het sterven (necrotische, apoptotische) β-cellen. Onze recente studies is gebleken dat in de jeugd, verhogingen in zowel niet-gemethyleerd en gemethyleerd DNA INS op positie -69 bp (ten opzichte van thij transcriptionele site en start) werden waargenomen in nieuwe-onset T1D, en samen diende als specifieke biomarkers voor deze populatie 6. Deze biomarkeranalyses omvatten de isolatie van celvrije DNA uit serum of plasma met behulp commerciële kits rotatie, gevolgd door een bisulfiet omzetting van het geïsoleerde DNA (die niet-gemethyleerde cytosines omzetten uracils, waardoor gemethyleerde cytosines intact). In dit rapport beschrijven we de technische aspecten van het serum monstername, isolatie van cel-vrij DNA uit serum, bisulfiet conversie, en de prestaties van de druppel digitale PCR (voortaan digitaal PCR) voor het differentieel gemethyleerd INS DNA.

<table><tbody><tr><td>Red Top Vacutainer&nbsp;</td><td>Beckon Dickinson</td><td>366441</td><td>geen additief, ongecoat binnenkant, 10 ml</td></tr><tr><td>Cryovial Tube</td><td>Simport</td><td>T310-3A</td><td>polypropyleen, schroefdopbuis, elke maat</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51106</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A)</td><td>Sigma</td><td>P9403</td><td>opgelost in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8,0 + 1 mM EDTA) tot 5 &micro;g/&micro;l&nbsp;</td></tr><tr><td>Absolute Ethanol (200 Proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (met CaCl2 en MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml PCR 8-stripbuizen</td><td>MidSci</td><td>AVST</td><td></td></tr><tr><td>8-stripdoppen, koepel</td><td>MidSci</td><td>AVSTC-N</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Methylation-Lightning Kit</td><td>Zymo</td><td>D5031</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix voor Probes (geen dUTP)</td><td>Biorad</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Control voor Probes</td><td>Biorad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix</td><td>Life Technologies</td><td>AH21BH1</td><td></td></tr><tr><td>EcoR1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101L</td><td></td></tr><tr><td>twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted</td><td>Eppendorf</td><td>951020346</td><td></td></tr><tr><td>Pierceable Foil Heat Seal</td><td>Biorad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR Plate Sealer</td><td>Biorad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System</td><td>Biorad</td><td>1864101</td><td></td></tr><tr><td>Automated Droplet Generation Oil voor Probes</td><td>Biorad</td><td>186-4110</td><td></td></tr><tr><td>DG32 Cartridge voor Automated Droplet Generator</td><td>Biorad</td><td>186-4108</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Tips voor Automated Droplet Generator</td><td>Biorad</td><td>186-4120</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Tip Bins voor Automated Droplet Generator</td><td>Biorad</td><td>186-4125</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Biorad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Reader</td><td>Biorad</td><td>186-4003</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Droplet Reader Oil</td><td>Biorad</td><td>186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

meting van differentieel gemethyleerde<em&gt; ins</em&gt; dna-species in monsters humaan serum als een biomarker van islet β cell death

Measurement of Differentially Methylated INS DNA Species in Human Serum Samples as a Biomarker of Islet &#946; Cell Death

De dood van eiland-α-cellen wordt geacht ten grondslag te liggen aan de pathogenese van vrijwel alle vormen van diabetes en gaat vooraf aan de ontwikkeling van openbare hyperglykemie, vooral bij type 1 diabetes. De ontwikkeling van gevoelige en betrouwbare biomarkers van α-celdood kan vroege therapeutische interventie mogelijk maken om de ontwikkeling van diabetes te voorkomen of uit te stellen. Onlangs hebben verschillende groepen, waaronder de onze, gemeld dat celvrij, differentieel gemethyleerd DNA dat preproinsuline codeert (INS) in de circulatie gecorreleerd is met α-celdood bij pre-type 1 diabetes en nieuw-onset type 1 diabetes. Hier presenteren we een stapsgewijs protocol dat digitale PCR gebruikt voor het meten van celvrij INS DNA dat differentieel gemethyleerd is op cytosine op positie -69 bp (relatief ten opzichte van de transcriptionele startplaats). We tonen aan dat de assay kan onderscheiden tussen gemethyleerd en ongemethyleerd cytosine op positie -69 bp, lineair is over verschillende ordes van grootte, absolute kwantificering van DNA-kopienummers biedt en kan worden toegepast op monsters van menselijk serum van individuen met nieuw-onset type 1 diabetes en ziektevrije controles. Het hier beschreven protocol kan worden aangepast aan elke DNA-soort waarvoor detectie van differentieel gemethyleerde cytosines gewenst is, of dit nu uit de circulatie of uit geïsoleerde cellen en weefsels is, en kan absolute kwantificering van DNA-fragmenten bieden.

Om gegevens op de juiste wijze te interpreteren, maken we gebruik van plasmide controles voor zowel de niet-gemethyleerde en gemethyleerde doelwit INS DNA in elk digitaal PCR run. Deze controles zorgen ervoor dat signalen die overeenkomen met gemethyleerd en niet-gemethyleerd DNA zijn duidelijk te onderscheiden. Figuur 1 toont de 2-D spreidingsdiagrammen overeenkomt met druppeltjes van plasmide controles met bisulfiet geconverteerd niet-gemethyleerd INS...

De dood van eilandje-β-cellen gaat vooraf aan de ontwikkeling van type 1 diabetes, en het detecteren van dit proces kan vroege therapeutische interventie mogelijk maken. Hier bieden we een gedetailleerde beschrijving van hoe je differentieel gemethyleerde INS DNA-soorten in menselijk serum kunt meten als een biomarker van β-celdood.

Meting van differentieel gemethyleerde<em&gt; INS</em&gt; DNA-Species in monsters humaan serum als een Biomarker van Islet β Cell Death

The death of islet &#946; cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank ...

Het algemene doel van deze procedure is het meten van differentieel gemethyleerde preproinsuline-DNA-soorten in menselijk serum als biomarker voor bètaceldood. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van diabetes, zoals: vindt er bètaceldood plaats op een bepaald tijdstip tijdens de ontwikkeling van type 1 diabetes? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we door het gebruik van digitale PCR de mate van bètaceldood kunnen bepalen in zeer kleine hoeveelheden serum.Nadat serum uit menselijke bloedmonsters is verzameld volgens het tekstprotocol, bereidt u in een microcentrifugebuis 200 µL lysisbuffer en 1 µL poly(A) per monster voor. Vortex de buis gedurende 15 seconden. Haal de serummonsters uit de vriezer van -80 °C en ontdooi deze op kamertemperatuur.Gebruik vervolgens PBS om het volume van het serummonster aan te vullen tot 200 µL. Lyséer de monsters door 20 µL protease en 200 µL van de lysisbuffer poly(A)mix toe te voegen. Vortex de buisjes gedurende acht seconden en incubeer de monsters 10 minuten bij 56 °C.Centrifugeer de buisjes vervolgens op maximale snelheid gedurende zeven seconden. Precipiteer het DNA door 230 µL 100% ethanol aan de monsters toe te voegen en vortex de buisjes gedurende acht seconden. Centrifugeer de buisjes daarna op maximale snelheid gedurende zeven seconden.Breng vervolgens 600 µL van de monster-mengsels aan op spin-kolommen en centrifugeer de kolommen gedurende één minuut bij 6000 ×g. Verwijder het doorstroomvolume en plaats de kolommen in schone buisjes. Voeg 500 µL washbuffer één toe aan de kolommen en centrifugeer de monsters gedurende één minuut bij 6000 ×g.Gooi vervolgens de doorloop weg en plaats de kolommen in schone buisjes. Voeg 500 µL washbuffer twee toe aan de kolommen en centrifugeer deze drie minuten op maximale snelheid. Plaats de kolommen daarna in nieuwe 1,5 mL microcentrifugebuisjes en centrifugeer ze opnieuw gedurende één minuut.Om het DNA te elueren, plaatst u de kolommen in nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuizen en voegt u 60 microliters elutiebuffer direct toe aan de filters. Na het incuberen van de kolommen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, centrifugeert u de monsters bij 6000 ×g gedurende één minuut. Gooi de kolom weg en bewaar de monsters tot ze klaar zijn voor bisulfietconversie.Om ongemethyleerde cytosines om te zetten in uracilen, voegt u 130 µL bisulfietconversiereagens toe aan 20 µL DNA in PCR-buisjes. Meng de monsters 20 keer door te pipetteren en centrifugeer de buisjes kort om er zeker van te zijn dat er geen druppels aan de wanden of het deksel zitten. Incubeer de monsters in een waterbad of thermocycler zoals hier getoond.Plaats de kolommen in de meegeleverde opvangbuisjes en voeg 600 microleters bindingsbuffer toe aan de spinzuilen. Breng het bisulfietbehandelde DNA aan op de kolommen en meng dit door 10 keer met de pipet op en neer te pipetteren. Centrifugeer de monsters vervolgens op maximale snelheid gedurende 30 seconden en verwilder het doorstroomvolume.Voeg vervolgens 100 µL wasbuffer toe aan de kolom en centrifugeer gedurende 30 seconden. Voeg daarna 200 µL desulfineringsbuffer toe aan de kolommen om de sulfinaatgroepen te verwijderen en de omzetting van ongemethyleerde cytosines naar uracil te voltooien. Laat de monsters 20 minuten rusten bij kamertemperatuur en centrifugeer de kolommen vervolgens gedurende 30 seconden.Was het DNA door 200 µL wasbuffer aan de kolommen toe te voegen en centrifugeer deze gedurende 30 seconden. Gooi vervolgens de doorstroomvloeistof weg en herhaal de wasstap. Plaats de kolommen in 1,5 mL microcentrifugebuisjes en elueer het DNA door 10 µL elutiebuffer direct op de kolomfilters aan te brengen.Incubeer de monsters gedurende één minuut en centrifugeer ze vervolgens 30 seconden om het DNA te elueren. Gooi de kolommen weg en bewaar de monsters. Kwantificeer het teruggewonnen DNA via spectrofotometrie bij een absorptie van 260 nanometers.Maak een mastermix met voldoende oplossing voor elk monster en elke controle. Neem minstens één monster met water, één monster van plasmid met niet-gemethyleerde insuline en één monster met een een-op-een mengsel van plasmids. Zet multiplex PCR-reacties op in een 96-wells plaat door eerst 19,5 µL mastermix aan elke well toe te voegen.Voeg 2,5 µL van het bisulfit-geconverteerde DNA-monster toe aan de betreffende wells. Meng de wells vervolgens door meerdere keren op en neer te pipetteren. Gebruik folie en een plate sealer om de plaat af te sluiten en centrifugeer deze in een plate spinner totdat er geen vloeistof meer aan de wanden van de wells kleeft.Om de automatische druppelgenerator via het touchscreen in te stellen, stelt u het aantal gebruikte rijen in door de rijen aan te raken waarin monsters in de putjes van de plaat zijn geladen. Om contaminatie te voorkomen, vult u de verbruiksartikelen van achteren naar voren, beginnend met de cartridges langs de achterste rij van het instrument. Plaats vervolgens de tips in de middelste rij.Plaats vervolgens de 96-wells plaat in het instrument. Haal daarna een cold block uit de vriezer van -20 °C en plaats hierin een nieuwe 96-wells plaat met rand. Plaats het block met de plaat in het instrument, naast de plaat met de monsters.Voeg olie toe aan de dispenser voor het instrument en selecteer het type olie op het touchscreen. Tik op de blauwe Start-knop om de run te starten. Bevestig vervolgens de plaatconfiguratie en tik op de knop Start Run om te beginnen.Zodra de run is voltooid, verwijdert u de 96-wells plaat met de nieuw gevormde druppels en sluit u deze af met folie met behulp van een plaatsealer. Voer vervolgens PCR uit in een thermische cycler met behulp van het volgende programma. Plaats de plaat op de druppelreader en stel de reader in door op het tabblad Setup te klikken.Open vervolgens een nieuw sjabloon door op Template New te klikken. Gebruik de well-editor om de parameters voor elk monster in te stellen. Geef elk monster een unieke naam.Stel het experiment in op Rare Event Detection en selecteer bij de mastermix de mix die is gebruikt voor het voorbereiden van de reactie. Geef Target 1 een naam, zoals Unmethylated, en stel Target 1 in als onbekend, of U. Geef Target 2 een naam, zoals Methylated, en stel Target 2 in als referentie, of R. Klik op het tabblad Run om de run te starten en voer een bestandsnaam in. Selecteer vervolgens in het venster Run Options de detectiechemie.Om de gegevens te analyseren, opent u de resultaten in het tabblad Analyse en gebruikt u de 2D-plot op basis van positieve controles om de gegevens te analyseren. Deze figuur toont de 2D-stippendiagrammen die overeenkomen met druppels voor plasmidcontroles, bestaande uit bisulfiet-geconverteerd, niet-gemethyleerd insuline-DNA, gemethyleerd insuline-DNA en een één-op-één mengsel van de twee plasmiden. Let op dat er in dit paneel een lichte verschuiving van de FAM-positieve druppels naar het VIC-kanaal is, wat duidt op de probe voor het gemethyleerde insuline-DNA.Op dezelfde manier is er een zeer geringe verschuiving van de VIC-positieve druppels in het FAM-kanaal, wat wijst op kruisreactiviteit van de probe voor ongemethyleerd DNA met gemethyleerd DNA. Om de lineariteit van de primers aan te tonen, werden mengsels van de twee plasmiden over verschillende grootteordes gebruikt in de PCR-reacties. Zoals hier getoond, kunnen variërende concentraties van één plasmide lineair worden gedetecteerd in de aanwezigheid van een constante hoeveelheid van het tweede plasmide.In deze figuur werden monsters van vier personen met recent ontstane type 1-diabetes en vier controlemonsters zonder type 1-diabetes geanalyseerd. De gegevens tonen aan dat personen met type 1-diabetes verhoogde niveaus van zowel ongemethyleerd als gemethyleerd insuline-DNA vertonen in vergelijking met de controles, zoals eerder aangetoond. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in acht uur voor 30 monsters worden uitgevoerd, mits deze correct wordt uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om contaminatie in alle stappen te vermijden. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van diabetes om het gebruik van deze techniek als biomarker voor de ontwikkeling van type 1 diabetes te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de mate van bètaceldood kan worden bepaald door ongemethyleerd en gemethyleerd preproinsuline in celvrij DNA uit menselijk serum te meten.Vergeet niet dat het werken met DNA-extractiebuffers zeer gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure, zoals het dragen van handschoenen en een laboratoriumjas en het vermijden van desinfectiemiddelen die bleek bevatten.

measurement-differentially-methylated-ins-dna-species-human-serum

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Cel-gemedieerde lymphocytotoxicity (CML) testen kunnen worden gebruikt voor het autoreactieve reacties en onderzoek naar mechanismen van celdood in vitro test. Echter, met behulp van live-cell confocale microscopische beeldvorming technieken met fluorescente kleurstoffen, het type en de kinetiek van celdood en gebruik gemaakt van de paden worden bestudeerd in meer detail.

Methoden om Beta Cell Death gemedieerd beoordelen door cytotoxische T lymfocyten

This video showcases the electrochemiluminescence detection of islet autoantibodies in human serum. The antibodies in the serum bridge the ruthenium-conjugated antigen to the biotinylated capture antigen, forming complexes that are detected by electrochemiluminescence measurements.

Detection of Human Islet Autoantibodies Using an Electrochemiluminescence Assay

Laser microdissectie is een techniek die het herstel van de geselecteerde cellen uit minieme hoeveelheden parenchym mogelijk maakt. Hier beschrijven we een protocol voor die menselijke pancreatische eilandjes van chirurgische preparaten worden gebruikt voor transcriptoom studies. Ons protocol verbetert de intrinsieke autofluorescentie van menselijke beta-cellen, waardoor hun collectie.

Verbeterd protocol voor Laser Microdissection der humane pancreatische eilandjes Van Chirurgische Specimens

We presenteren hier een protocol voor de isolatie van eilandjes uit het muismodel van type 2 diabetes, Leprdb en details van een live-cel assay voor het meten van insulinesecretie uit intacte eilandjes dat gebruikmaakt van 2 foton microscopie.

LepR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Model van Type 2 Diabetes: eilandjes van Langerhans Isolatie en live-cell 2-Photon Imaging van intacte Eilandjes

Hier voorgesteld hebben we de methoden voor het detecteren van menselijke islet autoantilichamen met behulp van electrochemiluminescence (ECL) testen. Het protocol, gebruikt voor het voorspellen van type 1 diabetes, kan worden uitgebreid om te detecteren autoantilichamen voor andere auto-immune ziekten.

Electrochemiluminescence testen voor menselijke Islet autoantilichamen

Ex vivo alvleesklier islet studies zijn belangrijk voor onderzoek naar diabetes. Bestaande technieken om te studeren van gekweekte eilandjes in hun oorspronkelijke 3-dimensionale architectuur zijn zelden gebruikte, tijdrovend en inefficiënt. Dit werk beschrijft een nieuwe, eenvoudige en efficiënte methode voor het genereren van kwalitatief hoogwaardige paraffine secties van hele gekweekte eilandjes.

Alvleesklier Islet insluiten voor paraffine secties

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van hoogwaardige, grootschalige transcriptome gegevens van afzonderlijke cellen van geïsoleerde menselijke alvleesklier eilandjes met behulp van een druppel-gebaseerde microfluïdische single-cell RNA sequencing technologie.

Eencellige RNA-sequencing en analyse van menselijke pancreatic eilandjes

Deze studie maakt gebruik van multi-kleuring fluorescentie-gebaseerde markers van celdood en apoptose in combinatie met confocale microscopie om cytokine-geïnduceerde apoptose en β-celspecifieke dood in pancreaseilandjes te beoordelen. Het onthult ruimtelijke en temporele veranderingen in celdood en apoptose als reactie op extracellulaire stimuli.

Geïsoleerde behandeling van pancreaseilandjes en meting van apoptose

Hier beschrijven we instellingen om parallel de circadiane bioluminescentie en de secretoire activiteit van humane eilandcellen en primaire myotubes te monitoren. Hiervoor gebruikten we lentivirale genoverdracht van een luciferase kernklok reporter, gevolgd door in vitro synchronisatie en het verzamelen van uitstroommedium door continue celperfusie.

Parallel Meting van de circadiane klok genexpressie en hormoon in Human primaire celculturen

We beschrijven hier een relatief snelle en eenvoudige benadering voor het in kaart brengen van genoom-breed replicatietiming bij zoogdieren, van celisolatie tot de basisanalyse van de sequentieresultaten. Een genomische kaart van een representatief replicatieprogramma zal worden verstrekt volgens het protocol.

Genoom-brede analyse van zoogdieren Replication Timing door DNA Content Measurement

Leer hoe je differentieel gemethyleerde INS DNA-soorten in humaan serum meet als biomarker voor β-celdood. Deze digitale PCR-methode detecteert vroege celdood bij type 1 diabetes met hoge gevoeligheid.

Meting van differentieel gemethyleerde

Meer video's verkennen