High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

Het algemene doel van dit protocol is om een enkele combinatie real-time test te gebruiken om specifieke kleine molecuulremmers van intracellulaire bacteriegroei te identificeren die niet toxisch zijn voor gastcellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van antimicrobiële ontdekking. Specifiek, welke soorten verbindingen kunnen doordringen in intracellulaire compartimenten en pathogenen doden zonder de gastcellen te schaden?

De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat de bacteriegroei en de toxiciteit voor zoogdiercellen gelijktijdig worden gedetecteerd met behulp van niet-destructieve, real-time testen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen met de schaalbaarheid die het biedt. Het testen van meer dan tienduizend verbindingen in een sessie vereist een geheel nieuwe reeks technieken en apparatuur.

Naast Lucius, demonstreren postdoctorale fellows, KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn en undergraduate Kat Truelson een gemeenschappelijke verbintenis tot academische ontdekking van antimicrobiële middelen en translationele diagnostische microbiologie. Om gastcellen voor te bereiden, kweekt J774A. 1 macrofaag in suspensie in RPMI 1640, met negen procent ijzer gesupplementeerd kalfsserum.

Passeer cellen aanvankelijk in weefselkweekflacons. Nadat cellen conflueërend zijn in een weefselkweekfles van 75 vierkante centimeter in 15 milliliter medium, verdeel de cellen door ze te schrapen en te verdunnen tot 65 milliliter met hetzelfde type medium. Plaats 15 milliliter terug in de weefselkweekfles en breng 50 milliliter over naar een bacteriële shakerfles van 250 milliliter.

Beadem door de rotatiesnelheid in te stellen op ongeveer 120 omwentelingen per minuut. Voor consistente groei, incubeer op precies vijf procent koolstofdioxide en 37 graden Celsius. Oogst de cellen wanneer ze een dichtheid bereiken in het bereik van twee en een half miljoen cellen per milliliter tot vijf miljoen cellen per milliliter.

Zorg ervoor dat het percentage dode cellen niet hoger is dan 25 procent, omdat dode cellen de achtergrondruis in cytotoxiciteitstests zullen verhogen. Het is van cruciaal belang om celbezinking in reservoirs te voorkomen wanneer u grote volumes macrofagen en bacteriën met vloeibare handlers doseert. Zwaai reservoirs elke paar minuten terwijl u doseert om ongelijkmatigheid en putjes in het assayplaat te voorkomen.

Plaat de cellen in witte weefselkweek behandelde 384-welk microplaten bij 50.000 cellen in 30 microliter weefselkweekmedium per putje. Incubeer microplaten een nacht om negentig procent confluëntie te bereiken op de dag van het experiment. Bereid plekken bacteriën voor experimenten voor, door organismen dik op een nieuwe BCYE-plaat te verspreiden en één dag te incuberen om confluënte groei te verkrijgen.

Suspendoor de organismen opnieuw in hetzelfde weefselkweekmedium dat voor de J774A. 1 cellen is gebruikt. Om de macrofaaginfectie uit te voeren, voeg testverbindingen van belang toe, inclusief screeningsverbindingen, en positieve en negatieve controles voor bacteriegroeiremming in eukaryotische cellyse.

Stockoplossingen moeten worden opgelost in een concentratie van meer dan of gelijk aan 500x in DMSO of een waterige oplossing, om voldoende verdunning van het voertuig mogelijk te maken. Verdun luminescente bacteriën tot een doel van twee en een half miljoen CFU per milliliter in weefselkweekmedium. Voeg vervolgens geschikte niet-toxische membraanimpermeante nucleïnezuurvindende kleurstof toe bij twee en een half x de uiteindelijke assayconcentratie.

Voeg 20 microliter van deze mix toe aan elke kweekput. Het uiteindelijke assayvolume is 50 microliter en de uiteindelijke bacterieconcentratie moet een miljoen CFU per milliliter zijn voor de lux epron reporter, of vier miljoen CFU per milliliter voor de fluorescente eiwitreporter. Incubeer bij 37 graden Celsius, gedurende één tot drie dagen in vijf procent koolstofdioxide bij 100 procent relatieve vochtigheid om verdampingsrandeffecten te voorkomen.

Om temperatuurafhankelijke randeffecten te voorkomen bij het lezen van assayresultaten, thermisch equilibreer microplaten voorafgaand aan luminescentiemeting door ze ongeveer 20 minuten in een enkele laag op een laboratoriumbank te plaatsen met de deksels halfopen. Lees bacteriegroei en eukaryotische celtoxiciteit op een microplate luminometer en fluorometer zoals geschikt is voor de gebruikte reporters. Breng microplaten terug naar de incubator als real-time uitlezing op latere tijdstippen gewenst is.

Analyseer de gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol. Voor dosisrespons- en synergietestexperimenten, bereid macrofagen in bacteriën zoals eerder. Net voorafgaand aan macrofaaginfectie of axenische incubatie, gebruik een geautomatiseerd systeem voor vloeistofdosisering om een enkele dosisrespons in combinatoire synergietest op te zetten door directe geautomatiseerde toevoeging van antimicrobiële verdunningen volgens het protocol van de fabrikant.

Voeg antimicrobiële middelen van experimenteel belang toe in een seriële verdubbeling verdunningsreeks. Het doel is om, aan de hoge kant, een concentratie te bestrijken die volledig groei elimineert, en aan de lage kant, een concentratie die geen duidelijke activiteit vertoont. Hier getoond zijn representatieve resultaten over tijd voor bacteriële luminescentie en cytotoxiciteit geassocieerde fluorescentie.

Let op de contrasterende effecten van antimicrobiële behandeling en eukaryotisch celcytotoxisch detergent. Dual IC50 en CC50 dosisresponsbepaling in dezelfde screeningsputten werd gebruikt om de selectiviteit voor het antibioticum Doxycycline te bepalen. Bacteriële replicatie werd geremd door intermediaire concentraties antibioticum.

Echter, cytotoxiciteit werd waargenomen bij hoge concentraties, consistent met de selectiviteit van ongeveer 100. Hetzelfde assayformaat werd gebruikt om tweedimensionale dosisrespons te testen voor combinaties van Minocycline en Azithromycine. Isocontouren verbinden punten van gelijke intracellulaire groeiremming.

Hier suggereren concaaf isocontouren sterke synergistische effecten voor de twee geneesmiddelen. Digitale doseerrobotica voor assayopstelling, real-time uitlezing en hoogdoorvoerformaat maakte combinatoire triple synergietest mogelijk. Hier suggereren de waarneming van een