Name: High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Leer een high-throughput, real-time assay om antimicrobiële verbindingen te identificeren die intracellulaire bacteriën doden zonder gastheercellen te beschadigen. Deze methode combineert bacteriële groeidetectie met cytotoxiciteitstests.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek gemeld in dit manuscript werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten van de National Institutes of Health onder award nummer R01AI099122 om Jek De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Gezondheid. We willen graag bedanken Jennifer Smith, David Wrobel, Su Chiang, Doug Flood, Sean Johnston, Jennifer Nale, Stewart Rudnicki, Paul Yan, Richard Siu en Rachel Warden uit de ICCB-Longwood Screening Facility en / of het National Screening Laboratorium voor de New England Regionale Centers of Excellence in Biodefense en Emerging Infectious Diseases (gesteund door U54AI057159) voor hun hulp bij de ontwikkeling en de prestaties van high-throughput screening assays. We willen ook graag bedanken Kenneth P. Smith voor nuttige opmerkingen over het manuscript.

1. Real Time Intracellulaire groei en eukaryote cel cytotoxiciteit Assay <ol><li> Het voorbereiden van gastheercellen (J774A.1 Cells) <ol><li> Cultuur J774A.1 Mus musculus macrofaag-achtige cellen in suspensie in RPMI 1640 met 9% ijzer aangevuld kalfsserum. Aanvankelijk passage in weefselkweek kolven. Na cellen confluent in een 75 cm2 weefselkweek kolf in 15 ml medium geworden, gesplitst door schrapen en verdunnen tot 65 ml met hetzelfde type medium, waarvan 15 ml wordt teruggevoerd naar de weefselkweek kolf en 50 ml overgebracht een 250 ml schudkolf bacteriën. </li><li> Voor opschaling cultuur in suspensie in 250 ml en / of 1000 ml bacteriële kolven gevuld tot een vijfde volume met weefselkweekmedium. Beluchten door rotatiesnelheid ongeveer 120 omwentelingen per minuut. Voor een consistente groei incuberen bij precies 5% CO2 en 37 ° C. </li><li> Oogst cellen wanneer ze de dichtheid te bereiken in het bereik van 2,5 x 10 6 cellen/ ml tot 5 x 10 6 cellen / ml. Zorg ervoor dat dode cel percentage (het gemakkelijkst bepaald door trypan blauwe vlekken) niet meer dan 25%, zoals dode cellen achtergrondgeluid in cytotoxiciteit assays zal toenemen. </li><li> Plaat in het wit, weefselkweek behandeld, 384-putjes 5 x 10 4 J774A.1 cellen in 30 ul weefselkweek medium per well. Incubeer overnacht microplaten tot 90% confluentie op de dag van het experiment bereiken. </li></ol></li><li> Het voorbereiden van Lichtgevende of Fluorescent Legionella pneumophila <ol><li> Passage L. pneumophila (LP02 :: Flaa :: lux 8) bacteriën op geschikt medium, dat wil zeggen, gebufferd houtskool gistextract (BCYE) medium. Bij gebruik van een thymidine auxotrofe stam medium aangevuld met 100 ug / ml thymidine. Bereid stukjes bacteriën experimenten door het verspreiden organismen dik op een nieuwe BCYE plaat en incuberen van één dag (of een eerdere passage plaat) of 2:58 (waar van ingevroren voorraad) te verkrijgen confluentegroei. <ol><li> Bereid BCYE platen door het oplossen van 10 g gistextract, 10 g N - (2-aceetamido) -2-aminoethaansulfonzuur, 0,35 g K 2 HPO 4 en 1 g monobasisch kaliumfosfaat α-ketoglutaraat in 950 ml gedeïoniseerd water. Op pH 6,9 met kaliumhydroxide (11,9 ml ≥2.5 molaire oplossing). </li><li> Voeg 15 g agar en 2 g geactiveerde kool; en breng aan 1 L eindvolume. Voeg een magnetische roerstaaf en autoclaaf. Koel medium tot 55 ° C en voeg filtergesteriliseerd oplossingen die 0,4 gram L-cysteïne en 0,42 g ammonium ijzer (III) citraat, opgelost in gedeïoniseerd water. Gebruik magneet roer plaat te mengen voorafgaand aan het gieten van Petri platen. </li><li> Voor het testen van L. pneumophila groei in axenic groeimedium, bereiden ACES-gistextract bouillon (AYE) door het combineren van alle chemische reagentia gebruikt voor BCYE niet voor houtskool agar. Filter steriliseren en onmiddellijk te gebruiken, of de vriezer bewaren voor latere experimenten. </li></ol></li><li> Resuspendeer organismen in de same kweekmedium weefsel voor J774A.1 cellen met 100 ug / ml thymidine suppletie waar nodig. </li></ol></li><li> macrofaag Infectie <ol><li> Voeg testverbindingen plaats (screenen van verbindingen en positieve en negatieve controles voor bacteriële groeiremming en eukaryote cel lysis). Bij voorkeur lossen voorraadoplossingen in ≥500x in DMSO (dimethylsulfoxide) of een waterige oplossing voldoende verdunning van voertuig mogelijk. <ol><li> Hoewel de voorraad oplossingen bevroren kunnen worden opgeslagen, vermijd vries-dooi cycli voor labiele verbindingen en antimicrobiële middelen. </li></ol></li><li> Verdun lichtgevende bacteriën targeten van 2,5 x 10 6 CFU (kolonievormende eenheid) / m en fluorescerende reporter-gemerkte bacteriën 1,0 x 10 7 CFU / ml in weefselkweekmedium en voeg geschikte niet-toxische, membraan-impermeante, nucleïnezuur- bindende kleurstof bij 2,5x eindassayconcentratie. </li><li> Voeg 20 ul van het mengsel aan elk J774A.1 cultuur goed, de definitieve test volume50 pl, bacteriële uiteindelijke concentratie 1 x 10 6 CFU / ml (lux operon reporter) of 4 x 10 6 10 CFU / ml (reporter fluorescent eiwit). </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 1-3 dagen in 5% CO2 bij 100% relatieve vochtigheid verdamping randeffecten te voorkomen. </li></ol></li><li> assay uitlezing <ol><li> Lees bacteriegroei en eukaryote cel toxiciteit op een microplaat luminometer en fluorimeter afhankelijk van reporters gebruikt. <ol><li> To-temperatuur geassocieerde randeffecten te vermijden, thermisch evenwicht microplaten vóór luminescentie lezing plaatsing in een enkele laag op een laboratoriumtafel met deksels kier ongeveer 20 minuten (of in een biologische veiligheidskast met deksels ongeveer 10 min). </li></ol></li><li> Terug microplaten om incubator als real-time uitlezing op latere tijdstippen gewenst is. </li></ol></li></ol> 2. Data Analysis <ol><li> Normaliseren van gegevens naar positieve en negatieve conbedieningstoetsen aan procent of fold-remming te berekenen voor intracellulaire groei van bacteriën en het percentage cytotoxiciteit voor eukaryote cellen. </li><li> Om assay robuustheid beoordelen, berekenen statistische scheiding tussen positieve en negatieve controles voor zowel bacteriegroei inhibitie en cytotoxiciteit via Z-factor (Z) meten waarbij Z &#39;= 1-3 (σ p + σ n) / | p p + p n |. In deze vergelijking, σ σ p en n de standaardafwijkingen van de positieve en negatieve controleputjes toegevoegd, respectievelijk; μ p p en n zijn de gemiddelde waarden voor de positieve en negatieve controleputjes toegevoegd, respectievelijk. <ol><li> Voor high-throughput screening assays, berekent standaard z-scores (of andere alternatieve kwantitatieve statistische maten) effecten van testverbindingen plaats bepalen. Als alternatief, berekenen een eenvoudige fold-reductie of log-voudige verlaging als een potentieel fysiologisch relevanter<html> maatregel effect magnitude voor geometrisch repliceren bacteriën. </li></ol></li></ol> 3. Single en multi-dimensionale (dat wil zeggen, Synergy) Dosis-respons testen en interpretatie van gegevens <ol><li> Bereid macrofagen en bacteriën zoals beschreven in protocol paragraaf 1. </li><li> Juist voorafgaand aan infectie of axenic incubatie antimicrobiële experimentele toevoegen belang in een seriële, verdubbeling verdunning serie, met het doel spanning aan de hoge kant een concentratie die groei volledig elimineert (dwz de minimale remmende concentratie of MIC) en de lage uiteindelijk een concentratie die geen duidelijke activiteit toont. </li><li> Gebruik een geautomatiseerd vloeistofverwerkingsysteem enkelvoudige dosis-respons en combinatorische synergie meetopstelling via directe, geautomatiseerde toevoeging van antimicrobiële verdunningen volgens het protocol van de fabrikant vergemakkelijken. </li><li> Overweeg gebruik van verder tweevoudige verdunningen, bijvoorbeeld,841 / 54841eq1.jpg &quot;/&gt; - voudige verdunning series en assay repliceert om de nauwkeurigheid en de reproduceerbaarheid van de gegevens te verhogen. </li><li> Voor macrofaag infectie, verdunnen lichtgevende bacteriën te richten van 2,5 x 10 6 CFU (kiemgetal) / ml in weefselkweek medium. Voeg 20 ul van het mengsel aan elk J774A.1 cultuur goed, de uiteindelijke assay volume 50 pl, uiteindelijke bacteriële concentratie 1 x 10 6 CFU / ml; en incuberen bij 37 ° C in 5% CO 2 bij 100% relatieve vochtigheid. <ol><li> Voor axenic groei testen verdund lichtgevende bacteriën tot een eindconcentratie van 1 x 10 6 CFU / ml in AYE medium, voeg 50 ul aan elk putje van een 384-wells plaat en incubeer bij 37 ° C in 5% CO 2 bij 100% relatieve vochtigheid. </li></ol></li><li> Bereken fractionele remmerconcentratie index antimicrobiële combinaties die bacteriegroei te remmen. Voor elk geneesmiddel in de combinatie (a, b,.. N) die leidt tot volledige of&gt; 99% remming van bacteriële gGROEI Bereken de afzonderlijke fractionele remmende concentratie (FIC a, b, n...) als volgt: FIC a = de concentratie van de verbinding &quot;a&quot; gedeeld door de minimale concentratie van inhibitor &quot;een&quot; als zodanig. . Met behulp van dezelfde formule, bereken FIC b, enz. Bereken vervolgens de combinatorische FIC-index of <img alt="vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/54841/54841eq2.jpg" /> FIC = FIC a + b + FIC. . .FIC N voor elke remmende combinatie. <ol><li> Gebruik de combinatorische index die het verst afwijkt van 1,0 tot synergie te beoordelen. Overweeg een cutoff van ≤0.5 als een conservatieve indicatie van een synergetisch effect en ≥4, een antagonist effect. 12 </li><li> Plot isobolograms, isocontour isobolograms, en / of isosurface isobolograms 6 als alternatieve grafische voorstellingen van combinatorische effecten. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Garzoni, C., Kelley, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus%3A+new+evidence+for+intracellular+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence.</a> Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).</li>
<li>Rosen, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+an+intracellular+bacterial+community+pathway+in+Klebsiella+pneumoniae+urinary+tract+infection+and+the+effects+of+FimK+on+type+1+pilus+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression.</a> Infect Immun. 76 (7), 3337-3345 (2008).</li>
<li>Blango, M. G., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+the+face+of+multiple+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54 (5), 1855-1863 (2010).</li>
<li>Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+impermeant%2C+DNA-binding+dye+fluorescence+as+a+real-time+readout+of+eukaryotic+cell+toxicity+in+a+high+throughput+screening+format%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format.</a> Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 219-228 (2014).</li>
<li>Edelstein, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+chemotherapy+for+legionnaires%27+disease%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial chemotherapy for legionnaires' disease: a review.</a> Clin Infect Dis. 21 Suppl 3, S265-S276 (1995).</li>
<li>Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Intracellular+Antimicrobial+Susceptibility+Testing+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Intracellular Antimicrobial Susceptibility Testing of Legionella pneumophila.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (12), 7517-7529 (2015).</li>
<li>Pedro-Botet, L., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella%3A+macrolides+or+quinolones%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Legionella: macrolides or quinolones?</a> Clin Microbiol Infect. 12 Suppl 3, 25-30 (2006).</li>
<li>Coers, J., Vance, R. E., Fontana, M. F., Dietrich, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+Legionella+pneumophila+growth+in+macrophages+requires+the+concerted+action+of+cytokine+and+Naip5%2FIpaf+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Restriction of Legionella pneumophila growth in macrophages requires the concerted action of cytokine and Naip5/Ipaf signalling pathways.</a> Cell Microbiol. 9 (10), 2344-2357 (2007).</li>
<li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+intravital+imaging+of+cellular+differentiation+with+a+bright+red-excitable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Non-invasive intravital imaging of cellular differentiation with a bright red-excitable fluorescent protein.</a> Nat Methods. 11 (5), 572-578 (2014).</li>
<li>Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C. Ch. 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEliopoulos%2C+GM+%22Antimicrobial+combinations.+In%3A+Antibiotics+in+Laboratory+Medicin%22">Antimicrobial combinations. In: Antibiotics in Laboratory Medicin</a>. Lorian, V. , Williams and Wilkins. 330-396 (1996).</li>
<li>Jones, R. E., Zheng, W., McKew, J. C., Chen, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+direct+compound+dispensing+method+using+the+HP+D300+digital+dispenser%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">An alternative direct compound dispensing method using the HP D300 digital dispenser.</a> J Lab Autom. 18 (5), 367-374 (2013).</li>
<li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy%2C+antagonism%2C+and+what+the+chequerboard+puts+between+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> J Antimicrob Chemother. 52 (1), (2003).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li>
<li>Berger, K. H., Merriam, J. J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+intracellular+targeting+properties+associated+with+mutations+in+the+Legionella+pneumophila+dotA+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Altered intracellular targeting properties associated with mutations in the Legionella pneumophila dotA gene.</a> Mol Microbiol. 14 (4), 809-822 (1994).</li>
<li>Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+defects+in+intracellular+growth+complemented+by+a+single+genetic+locus+in+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila.</a> Mol Microbiol. 7 (1), 7-19 (1993).</li>
<li>Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of Legionella pneumophila.</a> Curr Opin Microbiol. 2 (1), 30-34 (1999).</li>
<li>Kirby, J. E., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionnaires%27+disease%3A+the+pore+macrophage+and+the+legion+of+terror+within%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Legionnaires' disease: the pore macrophage and the legion of terror within.</a> Trends Microbiol. 6 (7), 256-258 (1998).</li>
<li>Kirby, J. E., Vogel, J. P., Andrews, H. L., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+pore-forming+ability+by+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evidence for pore-forming ability by Legionella pneumophila.</a> Mol Microbiol. 27 (2), 323-336 (1998).</li>
<li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279 (5352), 873-876 (1998).</li>
<li>Song, H., Fares, M., Maguire, K. R., Sidén, A., Potácová, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+Effects+of+Tetracycline+Analogues+%28Doxycycline%2C+Minocycline+and+COL-3%29+in+Acute+Myeloid+Leukemia+HL-60+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic Effects of Tetracycline Analogues (Doxycycline, Minocycline and COL-3) in Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells.</a> PLoS ONE. 9 (12), e114457(2014).</li>
<li>Isberg, R. R., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+genetic+locus+encoded+by+Yersinia+pseudotuberculosis+permits+invasion+of+cultured+animal+cells+by+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12.</a> Nature. 317 (6034), 262-264 (1985).</li>
<li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+in+vitro+cytotoxicity+assays+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development.</a> Expert Opin Drug Discov. 3 (6), 655-669 (2008).</li>
<li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+viability+and+cytotoxicity+testing+and+same-well+multi-parametric+combinations+for+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Chem+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening.</a> Curr Chem Genomics. 3, 33-41 (2009).</li>
<li>Mayr, L. M., Bojanic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+trends+in+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Novel trends in high-throughput screening.</a> Curr Opin Pharmacol. 9 (5), 580-588 (2009).</li>
<li>Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunlap%2C+P+%22Bioluminescence%3A+Fundamentals+and+Applications+in+Biotechnology+-+Volume+1%22">Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology - Volume 1</a>. Thouand, G., Marks, R. 1, Springer. 37-64 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We beschrijven real-time assays voor gelijktijdige detectie van intracellulaire groei van bacteriën en gastheercellen cytotoxiciteit. Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol. Ten eerste, voor robuuste test prestaties, moet er voldoende spectrale scheiding tussen bacteriële en cytotoxiciteit uitlezingen zijn. Een dergelijke scheiding is intrinsiek voor combinaties van luciferase operon reporters en TL-DNA-bindende kleurstoffen. Op basis van onze ervaring (Tabel 1-3, figuur 2),</st...

Ziekteverwekkers die in intracellulaire compartimenten groeien of verblijven tijdelijk moeilijk te therapeutisch roeien. Verplichten of relatief obligaat intracellulaire pathogenen zoals Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp. , Francisella tularensis en Mycobacterium spp. vereisen vaak langdurige cursussen van de antimicrobiële therapie voor de genezing die kunnen variëren van maanden tot zelfs jaren. Bovendien kan extracellulaire ziekteverwekkers tijdelijk bezet intracellulaire niches en zo ontsnappen goedkeuring door normale levels van antimicrobiële therapie en later ontstaan ​​nieuwe serie virulente infectie te veroorzaken. Staphylococcus aureus 1 en uropathogene Enterobacteriaceae 2,3 infecties zijn twee steeds meer erkend voorbeelden. Daarom is een fundamentele ontdekking van geneesmiddelen doel is om nieuwe antibiotica die doordringen in intracellulaire compartimenten identificeren. Optimale therapie om snel uit te roeienintracellulaire organismen en de ontwikkeling van resistentie door middel van sub-remmende antimicrobiële blootstelling te voorkomen is in het bijzonder wenselijk. Hiervoor hebben we een high-throughput screening technologie intracellulaire penetrant antimicrobiële targeting naar de intracellulaire groei van het model pathogeen, Legionella pneumophila identificeren. 4 Vorige klinische observaties wijzen erop dat standaard antimicrobiële gevoeligheid testen niet nauwkeurig te voorspellen in vivo therapeutische werkzaamheid tegen dit organisme. 5 In het bijzonder, was dit omdat grote klassen van antimicrobiële middelen, zoals β-lactamen en aminoglycosiden, hoewel zeer effectief tegen axenisch gegroeid Legionella, onvoldoende doordringen in de intracellulaire compartimenten waarin Legionella woont. 5,6 Later bewijs suggereerde dat technisch complexer intracellulaire groei assays effectief voorspeld klinische werkzaamheid. 7 </sup&gt; Helaas zijn deze assays bewerkelijk eindpunten assays vereisen geïnfecteerde macrofagen behandeld met antimicrobiële stoffen, worden gelyseerd op verschillende tijdstippen punten kiemgetal opsomming. Dergelijke assays zijn onpraktisch te doen op grote schaal en niet geschikt voor high-throughput drug discovery. Daarom ontwikkelden we technologie voor real-time bepaling van intracellulaire groei van bacteriën. 6 Dit werd bereikt door het gebruik van een bacteriële stam gemodificeerd door integratie van zowel een bacteriële luciferase operon 8 (eerste generatie assay hierboven beschreven) 4 of fluorescerend eiwit 9 reporters (tweede generatie orthogonale test hier beschreven) in het bacteriële chromosoom. Zo luminescerende of fluorescerend signaal verschaft een surrogaat, real-time uitlezen van aantal bacteriën. Echter, deze attributen niet te pakken een belangrijke verstorende factor in de intracellulaire infection assays, off-target effecten op gastheercellen. In het bijzonder, de dood van de gastheercel beperkt inherent intracellulaire groei en leidt tot vals positieve identificatie van antimicrobieel effect. Zoals veel verbindingen in screening bibliotheken eukaryote cel giftig, zoals valse positieven zou gelden antimicrobiële overweldigen, noodzakelijk een groot aantal van de follow-up, endpoint cytotoxiciteit assays voor een oplossing. Het was dus van groot belang om te kunnen eukaryote levensvatbaarheid van de cellen en intracellulaire groei tegelijkertijd beoordelen. Met name, een kenmerk van niet-levensvatbare eukaryote cellen is het verlies van celmembraanintegriteit. Probes die de permeabiliteit van de celmembraan testen kunnen daarom gebruikt worden om cellevensvatbaarheid te bepalen. We eerder gekarakteriseerde het vermogen van een reeks vermoedelijk celmembraan-impermeante, fluorescerende DNA-bindende kleurstoffen om vlekken en nucleaire DNA van dode cellen. 4 op binding nucleair DNA, deze kleurstoffen vertonen een grote toename van Quantum fluorescerende opbrengst resulteert in een verhoogde signaal over achtergrond oplossing fluorescentie. Als zodanig zijn deze kleurstoffen heeft het een kwantitatieve uitlezing van eukaryote celdood. 4 name, vonden we dat verschillende waren niet giftig zich tijdens langdurige co-incubatie met J774 macrofagen. Wanneer toegevoegd tijdens de eerste infectie, mits hij realtime de fluorescentie van eukaryote celdood kan worden gemeten met een microplaat fluorimeter of geobserveerd microscopisch. Daarom combineert het gebruik van een bacteriële reporter en niet-toxisch, membraan-impermeante, DNA-bindende kleurstoffen, konden we een eenvoudige, niet-destructieve, real-time bepaling van zowel bacteriologische belasting en eukaryote cel cytotoxiciteit tegelijk meten. Deze test heeft ons toegelaten om het scherm in 384-well plaat formaat ~ 10.000 bekende bioactieve stoffen, waaronder ~ 250 antimicrobiële stoffen en&gt; 240.000 kleine moleculen met functioneel uncharacterized activiteit voor de mogelijkheid om intracellulaire groei van de remmenLegionella pneumophila, terwijl tegelijkertijd het genereren eukaryote cel cytotoxiciteit voor elke verbinding. 6 Onze analyse van bekende antimicrobiële middelen tegen intracellulaire groei van Legionella was de meest uitgebreide verkenning van dit type tot nu toe. 6 Op basis van de efficiëntie van onze testformaat we vervolgens onderzocht de mogelijke synergistische effecten van bekende antimicrobiële stoffen bij gebruik in combinatie. Een van de meest voorkomende synergie proeven, de zogenaamde dambord assay wordt uitgevoerd door het bepalen standaard combinatorische effecten van tweevoudige seriële verdunningen van twee of meer antimicrobiële middelen. 10 In deze testen wordt synergie bepaald door de waarneming van groter effect wanneer twee of meer antimicrobiële middelen samen dan de som van de effecten van elk gemonteerde toegepast. Van de nota, tot nu toe, alleen gericht en selectieve synergie testen werden uitgevoerd tegen intracellulaire Legionella pneumophila </em&gt; vanwege de grote inspanning bij het traditionele eindpunt assays vermenigvuldigd met de combinatorische permutaties vereist. Synergie kunnen testen, maakten we gebruik van onze real-time intracellulaire groei / eukaryotische cytotoxiciteit assay in combinatie met geautomatiseerde digitale afgifte technologie 6. Deze automatisering mogen wij seriële verdunningen van verbindingen opgelost in DMSO of waterige oplossing alleen of in combinatie in 384 putjes afgeven. 11 Bovendien, zo krachtige vloeistofverwerking technologie mogen wij eenvoudig uitvoeren hogere resolutie, vierkantswortel van twee (in plaats van de standaard, resolutieverschillen verdubbeling) verdunning combinaties met hogere specificiteit in onze tweedimensionale bereiken, schaakbord synergie analyse. Deze resolutie is bijzonder waardevol bij het aanpakken van problemen op het gebied van synergie over de reproduceerbaarheid bij het gebruik van tweevoudige verdunningsreeks 12. Tenslotte onze test was kwantitatief en ook therefore gemeten gradaties van remming. Als resultaat was de zuiverheid gevangen het geheel van remmende informatie expressie in isocontour isobolograms waarin isolijnen verbinding combinatorische concentraties met een vergelijkbaar niveau van groeiremming. 6 Deze plotten strategie liet visualisatie van combinatorische dosis-respons curves. Om onze methodologie te illustreren, beschrijven we ons protocol voor het uitvoeren van deze testen en tonen representatieve resultaten.

<table><tbody><tr><td>J774A.1 cellen</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB-67</td><td>Gastcel</td></tr><tr><td>ACES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9758&nbsp;</td><td>Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium</td></tr><tr><td>Gistextract, ultragefilterd</td><td>Becton-Dickinson/Difco</td><td>210929</td><td>Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium; lagere kwaliteiten kunnen verminderde groei en/of veranderde gevoeligheid van Legionella voor groeiremmende middelen veroorzaken</td></tr><tr><td>Alfa-ketoglutaarzuur, monokaliumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2000</td><td>Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat, dibasisch</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium</td></tr><tr><td>L-cysteïne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7755</td><td>Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium</td></tr><tr><td>Ammonium ijzer (III) citraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879</td><td>Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium; ferric pyrofosfaat kan in plaats daarvan worden gebruikt, maar is moeilijker nauwkeurig af te wegen</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxideoplossing, geconcentreerd</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP236-500</td><td>Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium</td></tr><tr><td>Deonized water</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Voor het maken van buffered charcoal yeast extract agar en buffered yeast extract medium</td></tr><tr><td>Thymidine (weefselkweekkwaliteit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>Voor het suppleren van zowel RPMI 1640 als buffered yeast extract agar/medium &mdash; lagere kwaliteit thymidine kan voor het laatste worden gebruikt, maar kan verminderde celgroei en/of celdood in RPMI 1640 veroorzaken</td></tr><tr><td>RPMI 1640, standaardformulering</td><td>Corning via Thermo Fisher Scientific</td><td>10-040-CV</td><td>Voor het kweken van J774A.1 cellen voorafgaand aan het plateren; bevat 2 mM L-glutamine</td></tr><tr><td>RPMI 1640 zonder fenolrood</td><td>Corning via Thermo Fisher Scientific</td><td>17-105-CV</td><td>Voor het plateren van J774A.1 cellen in 384-well platen (niet geschikt voor groei voorafgaand aan plateren); bevat ook geen L-glutamine &mdash; aanvullen tot 2 mM vóór gebruik</td></tr><tr><td>L-glutamine, 200 mM in 0,85% NaCl (weefselkweekkwaliteit)</td><td>HyClone via Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td>Voor het suppleren van RPMI 1640 zonder L-glutamine, tot 2 mM eindconcentratie</td></tr><tr><td>IJzer-gesupplementeerd calf serum</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-510</td><td>Voor het suppleren van RPMI 1640, tot 9,1% eindconcentratie</td></tr><tr><td>Trypanblauw oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Voor het kleuren voor bepaling van J774A.1 celdood terwijl de celdichtheid wordt geteld</td></tr><tr><td>SYTOX Green, 5 mM oplossing in DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td>Voor het kleuren voor bepaling van J774A.1 celdood door fluorescendometring of epifluorescentiemicroscopie (in combinatie met oranje-rode of verre rode fluorescente bacteriën). Gebruik op 125 nM eindconcentratie.</td></tr><tr><td>Celkweekincubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-255-26</td><td>Voor incubatie van J774A.1 cellen (zowel voor als na infectie); kan ook worden gebruikt voor incubatie van bacteriën, of een standaard atmosfeer incubator kan in plaats daarvan worden gebruikt)</td></tr><tr><td>Orbitale shaker</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-01010</td><td>Voor het schudden van incubatie van J774A.1 cellen voor infectie; past binnen de celkweekincubator; inclusief shakerbasis 7744-01000 en tray 7740-01010 (deze zijn ook afzonderlijk verkrijgbaar)</td></tr><tr><td>Scheiderflessen (250 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-04</td><td>Voor het schudden van incubatie van J774A.1 cellen voor infectie</td></tr><tr><td>Scheiderklemmen voor flessen (250 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16250</td><td>Voor het schudden van incubatie van J774A.1 cellen voor infectie</td></tr><tr><td>Scheiderflessen (1.000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-07</td><td>Voor het schudden van incubatie van J774A.1 cellen voor infectie</td></tr><tr><td>Scheiderklemmen voor flessen (1.000 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16100</td><td>Voor het schudden van incubatie van J774A.1 cellen voor infectie</td></tr><tr><td>Sponsapschuim doppen voor flessen (250 ml-1.000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-1490-038</td><td>Voor het schudden van incubatie van J774A.1 cellen voor infectie; vermindert het risico op besmetting ten opzichte van standaard metalen doppen</td></tr><tr><td>MultiDrop Combi programmeerbare multikanaals peristaltiekpomp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5840300</td><td>Voor het doseren van J774A.1 cellen, medium en bacteriesuspensie met fluoroforen naar grote aantallen 384-well platen</td></tr><tr><td>Combi standaard boring manifold</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24072670</td><td>Standaard vooraf doseervolume van 20 &#956;l is onvoldoende om te compenseren voor sedimentatie &mdash; verhogen naar 80 &#956;l</td></tr><tr><td>Witte 384-well platen behandeld voor weefselkweek</td><td>Corning</td><td>3570</td><td>Voor het lezen van luminescentie en fluorescendie; Greiner catalogus # 781080 ook succesvol getest</td></tr><tr><td>DMSO (weefselkweekkwaliteit, in verzegeld ampullen)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Voor het oplossen van positieve controle en testverbindingen</td></tr><tr><td>Azithromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1088</td><td>Antibioticum positieve controle</td></tr><tr><td>Saponine (uit Quillaja schors)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4521</td><td>Cy

high throughput, real-time, dual-uitlezing het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditionele maatregelen van intracellulair antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit afhankelijk eindpunt assays. Dergelijke eindpunt assays vereisen een aantal extra experimentele stappen voorafgaand aan het uitlezen, zoals cellysis, kiemgetal bepaling of reagens toevoeging. Bij het uitvoeren van duizenden testen, bijvoorbeeld tijdens high-throughput screening, de stroomafwaartse inspanning vereist voor deze soorten tests is aanzienlijk. Daarom bij hoge doorvoer antimicrobiële ontdekking vergemakkelijken, hebben we een real-time test gelijktijdig remmers van intracellulaire bacteriële groei bepalen en beoordelen eukaryote cel cytotoxiciteit. Specifiek werd realtime intracellulaire groei van bacteriën detectie mogelijk gemaakt door het markeren bacteriële screening stammen met ofwel een bacteriële lux operon (1e generatie-test) of fluorescerend eiwit reporters (2 e generatie, orthogonale test). Een niet-toxisch, celmembraan-impermeante, nucleïnezuurbindende dyewerd toegevoegd tijdens aanvankelijke infectie van macrofagen. Deze kleurstoffen zijn uitgesloten van levensvatbare cellen. Echter, niet-levensvatbare gastheercellen verliezen membraan integriteit waardoor binnenkomst en tl-etikettering van nucleair DNA (desoxyribonucleïnezuur). Met name DNA binding is geassocieerd met een grote toename van fluorescentie kwantumopbrengst dat een oplossing op basis uitlezen van ontvangst celdood verschaft. We hebben deze gecombineerde test gebruikt om een ​​high-throughput screen in microplate format uitvoeren en intracellulaire groei en cytotoxiciteit beoordeeld met behulp van microscopie. Met name kan antimicrobiële synergie waarin het gecombineerde effect van twee of meer antimicrobiële stoffen wanneer zij samen toegepast groter dan wanneer afzonderlijk toegepast demonstreren. Testen op in vitro synergie tegen intracellulaire pathogenen gewoonlijk een wonderbaarlijke taak combinatoriële permutaties van antibiotica bij verschillende concentraties worden beoordeeld. Toch vonden we dat onze real-time analyse in combinatie met geautomatiseerde digitale afgifte technologie permitted facile synergie testen. Met behulp van deze benaderingen konden we systematisch overzicht werking van een groot aantal antimicrobiële alleen en in combinatie met het intracellulaire pathogeen, Legionella pneumophila.

Microplate intracellulaire groei assay Figuur 1 schema de test stappen. De geautomatiseerde getoonde stappen kunnen handmatig worden uitgevoerd. Echter doorzet aanzienlijk vergemakkelijkt middels vloeistofverwerking systemen. Figuur 2 toont representatieve resultaten van een 384-well microplaat, dual-uitlezing, real-time intracellul...

Er werd een doorvoer, real-time test ontwikkeld om gelijktijdig (1) eukaryotische cel-penetrante antibiotica te identificeren die zich richten op een intracellulair bacterieel pathogeen, en (2) de cytotoxiciteit van eukaryotische cellen te beoordelen. Een variatie op dezelfde technologie werd vervolgens gecombineerd met digitale doseertechnologie om gemakkelijke, hoge resolutie, dosis-respons en twee- en driedimensionale synergiestudies mogelijk te maken.

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

Het algemene doel van dit protocol is om een enkele combinatie real-time assay te gebruiken om specifieke kleine moleculaire remmers van intracellulaire bacteriële groei te identificeren die niet toxisch zijn voor gastheercellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van antimicrobiële ontdekking. In het bijzonder: welke typen verbindingen kunnen intracellulaire compartimenten binnendringen en pathogenen doden zonder de gastheercel te beschadigen?De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat bacteriële groei en toxiciteit voor zoogdiercellen gelijktijdig worden gedetecteerd met behulp van niet-destructieve real-time assays. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met de schaalbaarheid die het biedt. Het screenen van meer dan tienduizend verbindingen in één sessie vereist een geheel nieuwe set technieken en apparatuur.Naast Lucius tonen postdoctorale onderzoekers KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn en undergraduate Kat Truelson een gemeenschappelijke toewijding aan academische antimicrobiële ontdekking en translationele diagnostische microbiologie. Om gastcellen voor te bereiden, wordt J774A.1 macrofaag gecultiveerd in suspensie in RPMI 1640, aangevuld met negen procent ijzer-gesupplementeerd kalfsserum.Passageer de cellen in eerste instantie in weefselkweekflessen. Zodra de cellen confluent zijn geworden in een weefselkweekfles van 75 vierkante centimeter in 15 milliliters medium, worden de cellen gesplitst door ze los te schrapen en te verdunnen tot 65 milliliters met hetzelfde type medium. Breng 15 milliliters terug in de weefselkweekfles en overbreng 50 milliliters naar een bacteriële schudfles van 250 milliliter.Belucht door de rotatiesnelheid in te stellen op ongeveer 120 omwentelingen per minuut. Voor een consistente groei moeten de cellen worden geïncubeerd bij exact vijf procent kooldioxide en 37 °C. Oogst de cellen wanneer ze een dichtheid bereiken in het bereik van 2,5 miljoen cellen per milliliter tot 5 miljoen cellen per milliliter.Zorg ervoor dat het percentage dode cellen 25 procent niet overschrijdt, aangezien dode cellen de achtergrondruis in cytotoxiciteitstesten verhogen. Het is cruciaal om celbezinking in reservoirs te voorkomen bij het dispenseren van grote volumes macrofagen en bacteriën met vloeistofbehandelingssystemen. Draai de reservoirs elke paar minuten rond tijdens het dispenseren om non-uniformiteit in de putjes van de assayplaat te voorkomen.Zaai de cellen uit in witte, voor weefselkweek behandelde 384-well microplaten met 50.000 cellen in 30 µL weefselkweekmedium per well. Incubeer de microplaten overnight om op de dag van het experiment een confluentie van negentig procent te bereiken. Bereid bacteriële patches voor de experimenten voor door de organismen dik uit te strijken op een nieuwe BCYE-plaat en deze één dag te incuberen om convergente groei te verkrijgen.Resuspendeer de organismen in hetzelfde weefselkweekmedium dat werd gebruikt voor de J774A. 1 cellen. Om de macrofaaginfectie uit te voeren, voegt u de relevante testverbindingen toe, inclusief screeningverbindingen en positieve en negatieve controles voor bacteriële groeiremming bij eukaryote cellyse.Stamoplossingen moeten worden opgelost in een concentratie van groter dan of gelijk aan 500x in DMSO of een waterige oplossing, om voldoende verdunning van het oplosmiddel mogelijk te maken. Verdun luminescente bacteriën tot een doelconcentratie van 2,5 miljoen CFU per milliliter in weefselkweekmedium. Voeg vervolgens de passende niet-toxische, membraanimpermeante kleurstof voor het detecteren van nucleïnezuren toe bij 2,5x de uiteindelijke assayconcentratie.Voeg 20 µL van dit mengsel toe aan elke cultuurput. Het uiteindelijke assayvolume is 50 µL en de uiteindelijke bacteriële concentratie moet één miljoen CFU per mL zijn voor de lux epron reporter, of vier miljoen CFU per mL voor de fluorescente eiwitreporter. Incubeer gedurende één tot drie dagen bij 37 °C in 5% CO2 bij een relatieve vochtigheid van 100% om verdampingsrandeffecten te voorkomen.Om temperatuurgerelateerde randeffecten bij het aflezen van assayresultaten te voorkomen, moeten microplaten vóór het meten van de luminescentie thermisch worden geëquilibreerd door ze ongeveer 20 minuten lang in een enkele laag op een laboratoriumbank te plaatsen met de deksels op een kier. Meet de bacteriële groei en eukaryote celtoxiciteit op een microplaat-luminometer en fluorometer, afhankelijk van de gebruikte reporters. Plaats de microplaten terug in de incubator indien real-time uitlezing op latere tijdstippen gewenst is.Analyseer de gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol. Voor experimenten met dosisrespons en synergetische tests worden macrofagen met bacteriën voorbereid zoals voorheen. Vlak voor de infectie van de macrofagen, of de axene incubatie, wordt een geautomatiseerd vloeistofbehandelingssysteem gebruikt om een enkele dosisrespons in een combinatorische synergetische testopstelling te faciliteren via directe geautomatiseerde toevoeging van antimicrobiële verdunningen volgens het protocol van de fabrikant.Voeg antimicrobiële middelen van experimentele interesse toe in een seriële verdubbelingsverdunning. Het doel is om aan de hoge kant een concentratie te bereiken die de groei volledig elimineert, en aan de lage kant een concentratie die geen duidelijke activiteit vertoont. Hier worden representatieve resultaten over de tijd getoond voor bacteriële luminescentie en fluorescentie geassocieerd met cytotoxiciteit.Let op de contrasterende effecten van de antimicrobiële behandeling en het cytotoxische detergent voor eukaryote cellen. De gelijktijdige bepaling van de IC50 en CC50 dosis-respons in dezelfde screeningwells werd gebruikt om de selectiviteit voor het antibioticum Doxycycline vast te stellen. Bacteriële replicatie werd geremd door intermediaire concentraties van het antibioticum.Er werd echter cytotoxiciteit waargenomen bij hoge concentraties, in overeenstemming met de selectiviteit van ongeveer 100. Dezelfde assay-opzet werd gebruikt om de tweidimensionale dosisrespons te testen voor combinaties van Minocycline en Azithromycin. Isocontouren verbinden punten met een gelijke intracellulaire groeiremming.Hier suggereerden concave isocontouren sterke synergetische effecten voor de twee geneesmiddelen. Digitale doseerrobotica voor de opzet van de assay, real-time uitlezing en een high-throughput formaat maakten combinatorische triple synergie-testen mogelijk. Hier suggereert de waarneming van een duidelijk concav oppervlak een hoge mate van synergetisch effect voor combinaties van Minocycline, Azithromycin en Rifampine tegen de intracellulaire groei van Legionella pneumophila.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe fluorescentie- of luminescentie-assay-metingen kunnen worden gecombineerd met real-time cytotoxiciteitstests in een high-throughput assay-formaat. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals confocale microscopie, worden toegepast om vragen te beantwoorden over biologische gebeurtenissen in de gehele cel, die ook gerelateerd zijn aan hun antimicrobiële activiteit of whole-cell cytotoxiciteit. Hoewel wij de effecten op de replicatie van Legionella hebben bestudeerd, kunnen dezelfde technieken ook worden toegepast op andere intracellulaire pathogenen, zoals Brucella en microbacteria.We hebben dit protocol oorspronkelijk ontwikkeld bij de zoektocht naar een assay die eenvoudig en betrouwbaar genoeg was voor gebruik in een screeningformaat met een zeer hoge doorvoersnelheid. Houd er rekening mee dat het werken met bacteriële pathogenen, cellijnen en robotapparatuur inherente risico's met zich meebrengt en dat passende voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het gebruik van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

high-throughput-real-time-dual-readout-testing-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven een single-cell high-throughput assay voor cytotoxiciteit van T-cellen te meten wanneer geïncubeerd met tumor doelcellen. Deze werkwijze gebruikt een dichte, elastomeer reeks sub-nanoliter wells (~ 100.000 putjes / array) ruimtelijk beperken de T-cellen en doelcellen met gedefinieerde verhoudingen en is gekoppeld met fluorescentie microscopie effector-target conjugatie en daaropvolgende apoptose controleren.

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Zoogdierlijke cellen die het bacteriële bioluminescentie gencassette...

Autonoom Bioluminescente zoogdiercellen voor continue en real-time monitoring van de cytotoxiciteit

Hier beschrijven we cellulaire cytotoxiciteit en ronde infectiviteitsassays die zorgen voor een snelle en nauwkeurige screening van verbindingen om hun cellulaire cytotoxiciteit (CC50) bepalen en IC 50-waarden tegen WT en resistente HIV-1.

Snelle screening van HIV reverse transcriptase en integrase-remmers

Verbeterde in vitro neurotoxiciteitstesten zouden helpen bij het identificeren van nieuwe neuroprotectieve verbindingen. De bruikbaarheid van een real-time impedantie-gebaseerde celanalysator om cytotoxiciteit en cytoprotectie in neuronale cellijnen te bepalen en om de betrokkenheid van tweede boodschapperroutes te bepalen, waardoor inzicht wordt verkregen in het mechanisme van neuroprotectie, wordt gepresenteerd.

Real-Time Impedantie-gebaseerde Cell Analyzer als een instrument af te bakenen moleculaire pathways betrokken bij neurotoxiciteit en Neuroprotectie in een neuronale cellijn,

De volbloed cytotoxiciteit assay (WCA) is een cytotoxiciteit assay ontwikkeld door het opnemen van high-throughput cell technologie voor plaatsbepaling met fluorescentie microscopie en geautomatiseerde beeldverwerking. Hier beschrijven we hoe lymfoomcellen behandeld met een anti-CD20 antilichaam kan worden geanalyseerd real-time in humaan volbloed kwantitatieve cellulaire cytotoxiciteit analyse.

Real-time cytotoxiciteitsassays in humaan volbloed

We hebben een modulair high-throughput screening ontwikkeld voor het ontdekken van nieuwe verbindingen tegen Mycobacterium tuberculosis, intracellulaire targeting en-bouillon kweken bacteriën en cytotoxiciteit tegen de zoogdiergastheercel.

Systeem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit Screening van inhibitoren voor intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Nieuwe modellen en testen die het vroege proces van geneesmiddelontwikkeling voor de volgende generatie tuberculosebestrijdende middelen zouden verbeteren, zijn zeer wenselijk. Hier beschrijven we een snelle, goedkope en BSL-2-compatibele test om de werkzaamheid van geneesmiddelen tegen Mycobacterium tuberculosis te evalueren, die gemakkelijk kan worden aangepast voor screening met hoge doorvoer.

Een High-throughput Compatible Assay te evalueren Drug De werkzaamheid tegen macrofaag gepasseerd<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Het is vaak noodzakelijk om te beoordelen van de potentiële cytotoxiciteit van een reeks van verbindingen op gekweekte cellen. Hier beschrijven we een strategie om betrouwbaar op te schermen voor giftige stoffen in een 96-well formaat.

Een strategie om verbindingen te identificeren die van invloed zijn op de celgroei en overleving in gekweekte zoogdiercellen bij een lage tot matige doorvoer

Het protocol beschrijft een snelle, hoge doorvoer, betrouwbare, goedkope en onpartijdige test voor het efficiënt bepalen van cellulaire levensvatbaarheid. Deze test is vooral handig wanneer de mitochondriën van cellen zijn beschadigd, wat interfereert met andere tests. De test maakt gebruik van geautomatiseerd tellen van cellen bevlekt met twee nucleaire kleurstoffen - Hoechst 33342 en propidium jodide.

Een geautomatiseerde differentiële nucleaire kleuringtest voor nauwkeurige bepaling van Mitocan Cytotoxicity

Hier beschrijven we een methode voor het maken van dubbele emulsiedruppeltjes die één T-cel en een kankerdoelcel inkapselen om celdoding op eencellig niveau te onderzoeken. Deze methode maakt dubbele kwantificering mogelijk van zowel cytotoxische moleculen als apoptose van doelcellen binnen een grote populatie T-cellen.

Op druppels gebaseerde cytotoxiciteitstest om chimere antigeenreceptor-T-cellen op eencellig niveau te beoordelen

Hier presenteren we een protocol om potentiële anti-tuberculose-geneesmiddelkandidaten te identificeren via fenotypische screening, waaronder de chemische synthese van een 4-aminoquinolineverbinding, het bepalen van de minimale remmende concentratie tegen Mycobacterium tuberculosis en de beoordeling van de cytotoxiciteit in zoogdiercellijnen.

Identificatie van potentiële anti-TB-kandidaten: Een stapsgewijze gids voor synthese, MIC-bepaling en cytotoxiciteitsbeoordeling in zoogdiercellen

Leer een high-throughput, real-time assay om antimicrobiële verbindingen te identificeren die intracellulaire bacteriën doden zonder gastheercellen te beschadigen. Deze methode combineert bacteriële groeidetectie met cytotoxiciteitstests.

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit (Video) | JoVE Journal

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

Meer video's verkennen