Evaluatie van de Bio-energetische Function in Cerebral vasculaire endotheelcellen

De algemene doelen van deze procedure zijn om te beoordelen hoe mitochondriale functieverstoringen de ontwikkeling van neurologische stoornissen beïnvloeden en om therapieën te ontwerpen die een direct effect hebben op openingen in de bloed-hersenbarrière. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurologische stoornissen, zoals hoe kan neuronale celdood worden geminimaliseerd na een beroerte? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een real-time beoordeling biedt van de mitochondriale functie in hele intacte cellen.

Nadat de cerebrale vasculaire endotheelcellen zijn gekweekt in compleet medium, in een T75 centimeter vierkante weefselkweekkolf, bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide tot 80% confluency, gooit u het cellenkweekmedium weg en spoelt u de cellen af met trypsine EDTA. Voeg vervolgens een tot twee milliliter vers trypsine EDTA toe aan de kolf en los de cellen af bij 37 graden Celsius gedurende drie tot vijf minuten. Nadat u onder een omgekeerde microscoop hebt bevestigd dat de cellen zijn losgelaten, stopt u de reactie met zachte toevoeging van 10 milliliter vers compleet cellenmedium en brengt u de cellen over naar een 15 milliliter conische buis voor centrifugatie.

Gooit u het supernatant weg en wast u de pellet in 10 milliliter vers compleet groeimedium voor een andere centrifugatie. Suspendeerd vervolgens de pellet in compleet groeimedium met een concentratie van twee keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter voor subculturering. Na het juiste aantal subcultures, zaait u 1,6 keer 10 tot de vierde cellen in 80 microliter compleet medium per putje, op een 96-well extracellulaire flux cellenkweekplaat en plaats de plaat in een 37 graden Celsius incubator met 5% koolstofdioxide.

Wanneer de cellen aan de plaat zijn gehecht, voegt u de behandeling van belang toe aan de juiste putjes en brengt u de cellen terug naar de incubator. De dag voor de mitochondriale functionele beoordeling, hydrateert u een extracellulaire flux sensor cartridge met 150 microliter extracellulaire flux calibratieoplossing en incubeert u de plaat over nacht bij 37 graden Celsius zonder koolstofdioxide. De volgende ochtend, gebruikt u de plaatwasstation om het cellenkweekmedium te vervangen door pH 7.0 extracellulaire flux assay medium.

Vervolgens incubeert u de cellen bij 37 graden Celsius, zonder koolstofdioxide, gedurende 30 tot 60 minuten. Wanneer de cellen in evenwicht zijn, laadt u de gehydrateerde cartridge in de Bioanalyzer en klikt u op de Start knop om de calibratie te beginnen. Aan het einde van de calibratie, klikt u op de Unlock Cartridge prompt om de cartridge bodemplaat te verwijderen en laadt u de cellenplaat.

Open vervolgens het databestand om de snelheidswaarden van de Bioanalyzer te verkrijgen voor export naar het spreadsheetbestand. Aangezien de kinetiek en relatieve intensiteit van de reacties variëren tussen de verschillende cerebrale vasculaire endotheelceltypen, werd in deze experimenten een reeks concentraties van bEnd. 3 cellen gebruikt om het optimale aantal cellen te identificeren voor het meten van de zuurstofverbruikssnelheid in een metabolisch profileringsassay.

Zoals waargenomen, tonen de basale en maximale ademhalingen en reserve ademhalingscapaciteit een proportioneel antwoord op de celdichtheid. ATP productie daalt echter wanneer de hoogste concentratie cellen per putje wordt gebruikt, wat suggereert dat een overconfluente cellencultuur niet geschikt is voor het experiment. Met de optimale celdichtheden die in het middenbereik van celaantal per putje lijken te zijn.

Daarom werden de verwachte zuurstofverbruikssnelheidsniveaus beoordeeld in dit representatieve experiment met behulp van een middenbereikcelconcentratie, waaruit blijkt dat niet-coderende precursor-mRNA-moleculen de mitochondriale functie in cerebrale vasculaire endotheelcellen verminderen. Deze experimenten tonen ook aan dat de maximale ademhaling en reservecapaciteit significant verminderd zijn door de overexpressie van deze moleculen in cerebrale vasculaire endotheelcellen 24 uur na transfectie, ook al vertonen de basale ademhaling, ATP productie en protonlek geen significante veranderingen. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in twee dagen worden voltooid.

Van het plateren van de cellen tot het toegankelijk maken van mitochondriale functie, als het correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het bepalen van de optimale celdichtheid uiterst belangrijk is voordat u met andere procedures begint. Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden, zoals celviabiliteit of glycolytische assays, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de veranderingen die optreden in de mitochondriale functie als gevolg van een verminderde celviabiliteit of veranderingen in andere metabole routes.

Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van mitochondriale functie voor het gebruik van intacte cellen binnen geïsoleerde mitochondriën en een verscheidenheid aan ziekten, waaronder neurologische ziekten, kanker of metabole stoornissen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u toegang krijgt tot mitochondriale functie in cerebrale vasculaire endotheelcellen.