Name: Evaluatie van de Bio-energetische Function in Cerebral vasculaire endotheelcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Leer hoe je de mitochondriale functie beoordeelt in cerebrale vasculaire endotheelcellen met behulp van een extracellular flux analyzer. Deze techniek helpt onderzoekers de bloed-hersenbarrière en neurologische aandoeningen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies: AHA 16SDG31170008 aan X.R. en NIH P20 GM109098, P01 AG027956 en U54 GM104942 aan J.W.S.

Opmerking: Het schema van het protocol wordt weergegeven in figuur 1, omvattende een tijdlijn van de procedures. 1. Cultuur en Passage van CVE Cells <ol><li> CVE kweek cellen (bEnd.3-cellen) in compleet groeimedium (hoog glucose Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium, DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine in een T75 cm2 weefselkweek kolf. Groeien bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. </li><li> Verwijder de celcultuur medium. Spoel de cellaag met 0,25% trypsine-EDTA 0,03%, en voeg 1 - 2 ml trypsine-EDTA-oplossing aan de kolf en bewaar de kolf bij 37 ° C gedurende 3-5 min. Houd u aan de cellen onder een omgekeerde microscoop totdat de cellaag wordt losgemaakt. Voeg 10 ml compleet kweekmedium en zuig de cellen door voorzichtig pipetteren. </li><li> Decanteer de vloeistof en cellen in een 15 ml centrifugebuis en centrifugeren bij 700 g gedurende 5 min om cellulaire resten te verwijderen. </li&gt; <li> Verwijder het supernatant van de centrifugebuis. Voeg 10 ml compleet groeimedium en resuspendeer de cel pellet. Spin de cellen bij 700 g gedurende 5 min. </li><li> Verwijder het supernatant van de centrifugebuis. Resuspendeer de celpellet in compleet groeimedium bij een concentratie van 2,0 x 10 5 cellen / ml (bepaald door het tellen met een hemocytometer; uitsluiten dode cellen met behulp van trypan-blauw kleuring). OPMERKING: vers ontdooide cellen worden sub-gekweekt gedurende ten minste 3 doorgangen voor experimenten. </li></ol> 2. Zaad en Treat Cellen op Cell Culture Plates <ol><li> Zaadcellen op een 96 putjes extracellulaire flux celcultuurplaat: 80 ul / putje. Plaats de celkweek plaat bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. Let op: 16 × 10 3 cellen per goed zal 60 te bereiken - 80% samenvloeiing binnen 24 uur. </li><li> Als de cellen worden blootgesteld aan een chemische, voeg de behandeling nadat de cellen gehecht aan de plaat bodem (8-24 uur na bekijkending). LET OP: Voor transfectie-experimenten, geen antibiotica toe te voegen in volledige groeimedium. </li></ol> 3. Beoordeling van de mitochondriale functie Met behulp van de Bioanalyzer <ol><li> Vóór de start van de analyse, hydrateren een extracellulair flux sensor cartridge kalibrant door toevoeging van 150 ul van extracellulaire flux kalibratieoplossing op de plaat en incuberen O / N bij 37 ° C zonder CO2. </li><li> Met behulp van de plaat wasmachine station, wijzigt de cel kweekmedium in pH 7,0 extracellulaire flux voedingsbodem. Incubeer de cellen bij 37 ° C zonder CO2 gedurende 30-60 min. </li><li> Bereid werkoplossingen van 8 uM oligomycin, 4,5 uM FCCP, 10 rotenon uM en 10 uM antimycin A in DMEM. Belasting 25 pi van de voorraad oplossingen in de cartridge injectie poorten: Port A, oligomycin; Poort B, FCCP; Port C, rotenon en antimycin A met extracellulaire flux voedingsbodem. Uitvoeren van de test protocol zoals beschreven in Tabel 1. </li><li> Laad de gehydrateerde cartridge in de bioanalyzer en de kalibratie uitvoeren door te klikken op de knop &quot;Start&quot;. Nadat de kalibratie is voltooid, verwijdert u de cartridge bodemplaat en laadt de cel plaat door te klikken op de &quot;Ontladen Cartridge&quot; prompt. Ga door met de test tot het einde van alle metingen. </li><li> Open het bestand en de snelheid waarden uit de bioanalyzer verkrijgen. Exporteer de gegevens naar een spreadsheet-bestand. </li></ol> 4. Gegevens Analyses LET OP: De berekeningen voor data-analyses worden hieronder geformuleerd. De waarden worden verkregen uit de bioanalyzer instrument de OCR in figuur 2. <ol><li> Basal ademhaling te berekenen, trekt de niet-mitochondriale ademhaling (metingen 10-12) van de basale waarde (meting 3). LET OP: Basal ademhaling = Basal - non-mitochondriale ademhaling = Rate ③ - Rate ⑩ ~ ⑫. </li><li> ATP producti berekenenop, trekt het ATP-gebonden ademhaling (metingen 4-6) van de basale waarde (meting 3). LET OP: de ATP-productie = Basal - ATP-linked ademhaling = Rate ③ - Rate ④ ~ ⑥. </li><li> Om maximale ademhaling berekenen, trekt de niet-mitochondriale ademhaling (metingen 10-12) vanaf de maximale ademhaling (metingen 7-9). LET OP: Maximale ademhaling = Maximum ademhaling - non-mitochondriale ademhaling = Rate ⑦ ~ ​​⑨ - Rate ⑩ ~ ⑫. </li><li> Om Spare capaciteit te berekenen, trekt u de basale waarde (meting 3) van de maximale ademhaling (metingen 7-9). LET OP: Spare capaciteit = Maximum ademhaling - Basal = Rate ⑦ ~ ​​⑨ - Rate ③. </li><li> Proton lek berekenen, trekt de niet-mitochondriale ademhaling (meetpunt 10 - 12) van het ATP-gebonden ademhaling (meetpunt 4). LET OP: Proton lek = ATP-linked ademhaling - non-mitochondriënl ademhaling = Rate ④ - Rate ⑩ ~ ⑫. </li></ol>

<ol><li>Quintero, M., Colombo, S. L., Godfrey, A., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+signaling+organelles+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Li, H., Bubolz, A. H., Zhang, D. X., Gutterman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cytoskeletal+elements+are+critical+for+flow-mediated+dilation+in+human+coronary+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng+Comput%22%5BJournal%5D)">Endothelial cytoskeletal elements are critical for flow-mediated dilation in human coronary arterioles.</a> Med Biol Eng Comput. 46, 469-478 (2008).</li>
<li>Al-Mehdi, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinuclear+mitochondrial+clustering+creates+an+oxidant-rich+nuclear+domain+required+for+hypoxia-induced+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Perinuclear mitochondrial clustering creates an oxidant-rich nuclear domain required for hypoxia-induced transcription.</a> Sci Signal. 5, ra47(2012).</li>
<li>Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BCa2%2B%5Di+signaling+between+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+in+neurons+is+regulated+by+microtubules.+From+mitochondrial+permeability+transition+pore+to+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">[Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Biol Chem. 280, 715-721 (2005).</li>
<li>Sutendra, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Nogo+and+the+mitochondria-endoplasmic+reticulum+unit+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">The role of Nogo and the mitochondria-endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension.</a> Sci Transl Med. 3, 88ra55(2011).</li>
<li>Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperfused+mitochondrial+state+achieved+at+G1-S+regulates+cyclin+E+buildup+and+entry+into+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11960-11965 (2009).</li>
<li>Doll, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+crisis+in+cerebrovascular+endothelial+cells+opens+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial crisis in cerebrovascular endothelial cells opens the blood-brain barrier.</a> Stroke. 46, 1681-1689 (2015).</li>
<li>Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+Blood-Brain+Barrier+Damage+in+Stroke%3A+Mitochondrial+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinfect+Dis%22%5BJournal%5D)">Deciphering the Blood-Brain Barrier Damage in Stroke: Mitochondrial Mechanism.</a> J Neuroinfect Dis. S2, e002(2015).</li>
<li>Pun, P. B., Lu, J., Moochhala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+ROS+in+BBB+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of ROS in BBB dysfunction.</a> Free Radic Res. 43, 348-364 (2009).</li>
<li>Sun, J., Hu, H., Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tert-butylhydroquinone+compromises+survival+in+murine+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Tert-butylhydroquinone compromises survival in murine experimental stroke.</a> Neurotoxicol Teratol. 54, 15-21 (2016).</li>
<li>Modis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bioenergetics+is+regulated+by+PARP1+under+resting+conditions+and+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cellular bioenergetics is regulated by PARP1 under resting conditions and during oxidative stress.</a> Biochem Pharmacol. 83, 633-643 (2012).</li>
<li>Brown, R. C., Morris, A. P., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+protein+expression+and+barrier+properties+of+immortalized+mouse+brain+microvessel+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Tight junction protein expression and barrier properties of immortalized mouse brain microvessel endothelial cells.</a> Brain Res. 1130, 17-30 (2007).</li>
<li>Bukeirat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34a+regulates+blood-brain+barrier+permeability+and+mitochondrial+function+by+targeting+cytochrome+c%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">MiR-34a regulates blood-brain barrier permeability and mitochondrial function by targeting cytochrome c.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36, 387-392 (2016).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Impairment+in+Cerebrovascular+Endothelial+Cells+is+Involved+in+the+Correlation+between+Body+Temperature+and+Stroke+Severity%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Impairment in Cerebrovascular Endothelial Cells is Involved in the Correlation between Body Temperature and Stroke Severity.</a> Aging Dis. 7, 14-27 (2016).</li>
<li>Oldendorf, W. H., Cornford, M. E., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+large+apparent+work+capability+of+the+blood-brain+barrier%3A+a+study+of+the+mitochondrial+content+of+capillary+endothelial+cells+in+brain+and+other+tissues+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">The large apparent work capability of the blood-brain barrier: a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat.</a> Ann Neurol. 1, 409-417 (1977).</li>
<li>Oldendorf, W. H., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greater+number+of+capillary+endothelial+cell+mitochondria+in+brain+than+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Greater number of capillary endothelial cell mitochondria in brain than in muscle.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 149, 736-738 (1975).</li>
<li>Kaczara, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+released+by+CORM-401+uncouples+mitochondrial+respiration+and+inhibits+glycolysis+in+endothelial+cells%3A+A+role+for+mitoBKCa+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide released by CORM-401 uncouples mitochondrial respiration and inhibits glycolysis in endothelial cells: A role for mitoBKCa channels.</a> Biochim Biophys Acta. 1847, 1297-1309 (2015).</li>
<li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> J Vis Exp. (96), e52350(2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen potentiële belangenconflicten zijn met betrekking tot het onderzoek, de auteurschap en/of de publicatie van dit artikel. De Open Access-kosten voor dit artikel werden gedekt door Agilent Technologies.

Dit protocol is een werkwijze voor het evalueren van de bio-energetische fenotype in cerebrale vasculaire endotheelcellen. Het dient als basis voor de bepaling endotheelcel mitochondriale evaluatie en is optimaal voor experimenten ontworpen om de mechanismen van stimuli die de mitochondriale signaling pathway in CVE cellen kunnen beïnvloeden onderzoeken. Het biedt ook een werkwijze voor het testen van potentiële geneesmiddelen voor BBB-verstoring geassocieerde ziekten. Kritische stappen in het protocol Extracellulaire flux bioanalyzers hebben de mogelijkheid om OCR te meten in real time. In deze test, identificatie van de geschikte celdichtheid is kritisch. Als de celdichtheid is dan 8 x 10 3 cellen per putje, de basale OCR te laag te analyseren (Figuur 2 en Figuur 3); als de cel dichtheid hoger is dan 32 × 10 3 cellen per putje, doen de cellen niet reageren op oligomycin of FCCP treatmegen (Figuur 2 en Figuur 3). De optimale celdichtheid voor deze cellijn in onze experimentele model is 16 × 10 3 cellen per well, die reproduceerbare resultaten en de gevoeligheid toont op prikkels 7 en behandelingen 10,14. Als een 24-wells bioanalyzer wordt gebruikt, zou nieuwe titraties van de celdichtheid vereist voor de test. Het is gedocumenteerd dat CVE&#39;s een grote hoeveelheid mitochondria vergelijking met andere endotheliale cellen of weefseltypes 15,16, suggereert de noodzaak van een grotere energieproductie en minder cellen voor het meten bioenergetica metabolisme. We hebben verschillende soorten brein endotheelcellen, zoals primaire en geïmmortaliseerde muizen getest cerebrovasculaire endotheelcellen 7 en geïmmortaliseerde humane cerebrovasculaire endotheel cellen (ongepubliceerde gegevens). Deze cellen nodig vergelijkbaar celdichtheden de aanvaardbare OCR (basale ademhaling OCR bereiken binnen 40-160 pmol / min voor96-well platen en 50-400 pmol / min gedurende 24 putjes) als de bio-energetica werd uitgevoerd. Kaczara et al. Beschreven meten bio-energetische metabolisme in humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC), die een hogere celdichtheid 17 gebruikt. Onze fractie heeft geen vat cellen uit andere weefsels of organen te evalueren. Theoretisch zou het mogelijk bioanalyzer gebruikt worden op elk celtype, maar vereist het optimaliseren van de test voor de celdichtheid, celkweekmedium en kweekomstandigheden (een speciale cellen kunnen vereisen beklede platen om goed te groeien). Het is nodig dat de experimenten worden voltooid om te zorgen voor de OCR dosis binnen het aanvaardbare bereik. Als de OCR in endotheliale cellen van andere organen is lager dan CVE&#39;s van de hersenen, het verhogen van de celdichtheid kan helpen binnen een acceptabel OCR bereik te krijgen. Als alternatief, als de cellen geen gebruik maakt van oxidatieve fosforylering als hun belangrijkste bron van energie, de bioanalyzer zou geen optima zijnl assay. De bioanalyzer maakt de sequentiële verstoring van de elektronentransport keten, gebaseerd op de volgorde waarin de reagentia worden toegepast. Eerst wordt oligomycin toegepast, die mitochondriale complex V (ATP synthase) remt. Tweede FCCP, een elektron ontkoppelrail, wordt toegepast, hetgeen leidt tot verstoring van de protongradiënt. Tenslotte rotenon en antimycin A, die remt mitochondriale complexen I en III respectievelijk worden toegevoerd aan tot een totale remming van de elektronenstroom. De volgorde van blootstelling aan het geneesmiddel is essentieel omdat de medicijnen blokkeren de specifieke elektronenvervoer kettingreactie en de opeenvolgende veranderingen kunnen worden gemeten om de mitochondriale functie weerspiegelt. Wijzigingen en problemen oplossen Om mitochondriale reactie op prikkels in CVE-cellen te evalueren, is het raadzaam dat de stimuli worden toegepast op cellen na de cellen worden gehecht aan de celkweek plaat bodem (zie de tijdlijnfiguur 1; duurt meestal minstens 6 uur). Om reproduceerbare resultaten te verkrijgen door behandelingen, is het uiterst belangrijk om de celdichtheid consistent. Als voorbehandeling voorafgaand aan zaaien van cellen is gemaakt, moet celdichtheid per voorbehandeling nauwkeurig worden gemeten, met uitzondering van de dode cellen te zaaien. Als transfectie is opgenomen in de experimentele opzet, wordt verwezen naar de fabrikant transfectie protocol. Blijkt uit de gegevens weergegeven in Figuur 4, werd miR-34a getransfecteerd in de CVE cellen met een lipofectamine transfectie kit, die antibiotica-vrij celkweekmedium en een mito-stresstest vereist dat de veranderingen in metabole functie overexpressie van miR-34a beoordelen . De doses van plasmide kunnen zijn geoptimaliseerd, zoals eerder gepubliceerd 13. Een andere verandering die kan worden aangebracht in het protocol verandert de concentratie van de reagentia. Een titratie curve van oligomycin, FCCP, en / of rotenon en Antimycin A kan worden completed. Daarnaast, indien deze test wordt gebruikt voor high throughput analyse van diverse drugs, wordt voorgesteld om een parallelle bepaling voor cellevensvatbaarheid en celproliferatie, die in onze eerdere publicaties beschreven werd 7,13 meten omvatten. De OCR waarden worden sterk beïnvloed door het aantal cellen (figuren 2 en 3) en de celproliferatie en levensvatbaarheid-assays ten goede aan de normalisering van de gegevens. De voltooiing van deze testen zijn bij de beoordeling van elke betreffende laboratorium. Beperkingen van de Techniek De belangrijkste beperking van dit protocol is dat we alleen een in vitro celkweek model in de studie. Momenteel zijn er geen beschikbare ex vivo modellen of diermodellen die endotheelcel mitochondriale functie kan richten. Nieuwe modellen zouden moeten worden ontwikkeld voor de beoordeling van bio-energetische functie in vivo en <em&gt; ex vivo in de toekomst studies. Een andere beperking is de uitbreiding van de barrière evaluaties na bioenergetica maatregelen. De experimenten kan niet worden uitgevoerd omdat, ten eerste, na de voltooiing van de bio-energetische metingen, de cellevensvatbaarheid wordt verminderd na de volledige verstoring van de elektronen transportketen; tweede worden specifieke celkweek platen en inserts die nodig zijn om bio-energetica waarden op te sporen en niet inzetstukken voor slagboom assessments passen. Daarom zijn er niet veel functionele bepalingen die na de bio-energetica test kan worden voltooid. Er wordt echter verwacht dat bijzondere inrichtingen kunnen worden ontwikkeld om functionele testen voor de bio-energetica analyse uit te voeren. Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / Alternative Methods Previous technieken mitochondriale functie uitwerkt noodzakelijk de isolatie van de mitochondria van de cellen 18. dit new techniek met de bioanalyzer maakt meting van mitochondriale activiteit in intacte cellen die meer van het cellulaire milieu dan evalueren geïsoleerde mitochondria behoudt. Toekomstige toepassingen of richtingen na Mastering deze techniek Dit protocol is ontworpen en ontwikkeld voor de bEnd.3 cellijn, maar het is ook compatibel met de primaire cerebrale vasculaire endotheliale (pCVE) cellen 7 of andere endotheel, en we hebben dit aangetoond in onze eerdere publicatie met behulp van pCVE cellen 7. Bij andere typen endotheel worden gebruikt, kan de bekleding van de kweekplaat en het gebruik van groeifactoren vereist. Echter, de titratie assay aanbevolen voor andere celtypes ook. Dit protocol heeft een algemene werkwijze die bij de evaluatie van de bio-energetica van CVE cellen worden vastgesteld, en kan verder worden toegepast op studies mechanisme of therapeutische respons op deze manier.

Algemeen wordt erkend dat de bloed-hersen-barrière (BBB) ​​gevormd door cerebrale vasculaire endotheliale (CVE) cellen heeft zeer aparte en unieke functies essentieel vasculaire biologie. Deze endotheelcellen gebruiken mitochondriën de meeste cellulaire levering van adenosine trifosfaat (ATP) genereren als een bron van chemische energie. Naast het leveren van ATP voor de CVE cellen, mitochondria diverse cellulaire processen reguleren in vasculaire endotheelcellen, zoals cellulaire signalering 1-4, apoptose 5, en controle van de celcyclus en celgroei 6. Ontregeling van bio-energetische mitochondriale functie in cellen CVE kunnen mitochondriale biogenese beïnvloeden, wat leidt tot verslechterde vasculaire endotheel activiteit en verergeren cerebrovasculaire ziekten en neurodegeneratieve aandoeningen, bijvoorbeeld beroerte 7,8 en de ziekte van Alzheimer (AD) 9. We hebben aangetoond dat beledigingen CVE cellen na blootstelling aan lipopolysacsacharide (LPS) schaden mitochondriale functie in CVE-cellen en verergeren beroerte uitkomsten 7. Tert-butylhydrochinon (tBHQ) stijgt de sterfte door te interfereren met oxidatieve fosforylering in CVE cellen 10. Daarom is de kwantitatieve model van bio-energetische functie CVE cellen niet alleen piloten een serie-mechanisme gerelateerde studies centrale zenuwstelsel (CNS) aandoeningen, maar ook een doorbraak in drug screening van therapeutische targeting mitochondriale vasculaire biologie. Geïsoleerde mitochondriën werden gebruikt om bioenergetica functie te meten. We 7 en anderen hebben 11 evaluaties van cellulaire bio-energetica in intacte cellen CVE gemeld door het gebruik van een extracellulaire flux bioanalyzer. De analysator verschaft het voordeel van endogene cellulaire bio-energetische evaluatie. Deze gevoelige en consequente test meet de mitochondriale metabolisme van CVE cellen en kan worden gebruikt om bioenergetic aantasting door sti evaluerenmuli, onderzoek naar de mechanismen van mitochondriale signaalwegen, en het scherm medicijnen of behandelingen die mitochondriale functie in CVE-cellen te beïnvloeden. Het zuurstofverbruik Rate (OCR) wordt opgenomen door het bioanalyzer met een farmacologische profilering benadering combineert het gebruik van vier mitochondriale verstoorders: oligomycin, carbonyl cyanide-4 (trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP), rotenon en antimycin A. In dit protocol we detail een geoptimaliseerde benadering waarmee het meten en berekenen van mitochondriale functionele parameters CVE cellen, waaronder basale mitochondriale ademhaling, ATP productie, proton lek, maximale ademhaling en reservecapaciteit ademhalingscapaciteit, in een enkele assay.

<table><tbody><tr><td>bEnd.3 cell line</td><td>ATCC</td><td>CRL-2299</td><td>25 - 30 passages</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>10% final concentration</td></tr><tr><td>Penicillin/Steptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>1&times;100 stocking</td></tr><tr><td>0.25% trypsin, 0.03% EDTA solution</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td>1.0 &micro;M final concentration</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>CAS 50-99-7</td><td>25 mM final concentration</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>1.0 &micro;M final concentration</td></tr><tr><td>Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>0.5 &micro;M final concentration</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>1.0 &micro;M final concentration</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>CAS 1397-94-0</td><td>1.0 &micro;M final concentration</td></tr><tr><td>Plate wash station</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extracellular flux bioanayzer&nbsp;&nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>XFe96</td><td></td></tr><tr><td>Extracellular flux cell culture plate</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>Extracellular flux sensor cartridge</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>Extracellular flux calibrant solution</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>Extracellular flux assay medium</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102365-100</td><td>PH buffered prior to assay</td></tr></tbody></table>

evaluatie van de bio-energetische function in cerebral vasculaire endotheelcellen

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

De integriteit van de bloed-hersen-barrière (BBB) ​​is kritisch voor hersenletsel voorkomen. Cerebrale vasculaire endotheel (CVE) cellen zijn een van de celtypes die de BBB omvatten; Deze cellen hebben een vraag naar zeer hoge-energie, die een optimale mitochondriale functie vereist. Bij ziekte of verwonding kan de mitochondriale functie in deze cellen worden gewijzigd, waardoor de ziekte of de opening van de BBB. In dit manuscript, introduceren we een methode om mitochondriale functie in CVE-cellen te meten met behulp van hele, intacte cellen en een bioanalyzer. Een mito stress test wordt gebruikt om de cellen die zijn verstoord, fysiek of chemisch uitdaging en de bio-energetische functie geëvalueerd. Daarnaast biedt deze methode biedt ook een handige manier om nieuwe therapieën die directe effecten op de mitochondriale functie te screenen. We hebben geoptimaliseerd de celdichtheid noodzakelijk zuurstofverbruik wel voldoende voor de berekening van verschillende mitochondriale para opleverenmeter, met inbegrip van ATP productie, maximale ademhaling, en reservecapaciteit. We de gevoeligheid van de test tonen ook door aan te tonen dat de introductie van de microRNA, miR-34a, leidt tot een uitgesproken en waarneembare afname van mitochondriale activiteit. Hoewel de in dit artikel gegevens geoptimaliseerd voor het bEnd.3 cellijn, hebben we ook geoptimaliseerd protocol voor primaire CVE cellen, wat suggereert verder het nut in preklinische en klinische modellen.

Om de functie van bio-energetische CVE cellen bepalen in reactie op oxidatieve stress, kozen we het murine brein microvasculaire endotheel cellijn bEnd.3, die dezelfde relatieve barrière-eigenschappen als primaire hersentumoren microvasculaire endotheelcellen 12 weergegeven. Aangezien de kinetiek en de relatieve intensiteit van de respons worden gevarieerd tussen de verschillende celtypen, werd de eerste reeks van experimenten ontworpen om meetbare OCR niveaus door het identificeren van het optimale aantal bEnd.3-cellen voor gebruik in de assay voor metabool profiel te verkrijgen, getoond in Figuur 2. Naar aanleiding van de evaluatie, worden de gegevens gekwantificeerd en weergegeven in figuur 3. Basal ademhaling, maximale ademhaling, en reserveonderdelen ademhalingscapaciteit toonde een proportionele respons met celdichtheid. Echter, ATP daalde de productie bij 64 x 10 3 cellen per putje werden geselecteerd, wat erop wijst dat de over-confluente celkweekniet geschikt voor dit experiment. De optimale celdichtheden liggen tussen 8-32 x 10 3 cellen per putje gebaseerd op de reactie op mitochondriale verstoorders. Voor daaropvolgende experimenten werd een zaaidichtheid van 16 x 10 3 cellen per putje werd gebruikt om optimale detectie van veranderingen in OCR. Gebruik 16 x 10 3 cellen per putje zagen we de verwachte responsen in OCR en aangetoond dat het microRNA miR-34a vermindert mitochondriale CVE cellen (figuur 4). We hebben eerder gemeld dat miR-34a verminderde oxidatieve fosforylering in deze cellen 13. De herhaalde experimenten toonden ook aan dat maximale ademhaling en reservecapaciteit significant verminderden door overexpressie van miR-34a in CVE&#39;s op 24 uur na transfectie, hoewel het basale ademhaling, ATP productie en proton lek had geen significante veranderingen (figuur 4) . deze gegevenstonen de gevoeligheid van de bioanalyzer veranderingen in mitochondriale CVE&#39;s detecteren. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig1.jpg" /> Figuur 1. Strategische Planning voor het experiment. De tijdlijn voor de cel, de plaat, en de voorbereiding cartridge wordt aangegeven. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig2.jpg" /> Figuur 2. Vertegenwoordiger Raw Data van Bioenergetische functie in CVE Cellen met verschillende celdichtheden. Zuurstofverbruik werden gemeten in CVE cellen met verschillende celdichtheden. Gegevens stellen gemiddelde ± SD (n = 5); OCR: Zuurstof verbruik; FCCP: carbonyl cyanide-4- (trifluormethoxy) fenylhydrazon;<html> Rot / Anti-A: rotenon en antimycin A. ①, ② en ③ geven basale ademhaling; ④, ⑤ en ⑥ geven ATP gekoppeld ademhaling; ⑦, ⑧ en ⑨ geven maximale ademhaling; ⑩, ⑪ en ⑫ wijzen op niet-mitochondriale ademhaling. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig3.jpg" /> Figuur 3. Representatieve resultaten van Bioenergetische Functie in CVE Cellen met verschillende celdichtheden. Basal ademhaling, ATP productie, maximale ademhaling, en de reservecapaciteit worden berekend op basis van de ruwe data gegenereerd door de bio-energetica functionele test in figuur 2 met behulp van de formules in hoofdstuk 4 . gegevens geven het gemiddelde ± SD (n = 5); OCR: Zuurstof verbruik.<html> f = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig4.jpg" /> Figuur 4: representatieve resultaten van Verminderde Bioenergetische functie van miR-34a (A) Ruwe data van mitochondriale functie na overexpressie van miR-34a na 24 uur na transfectie.. (B) Basal ademhaling, ATP productie, maximale ademhaling, en de reservecapaciteit worden berekend op basis van de ruwe data gegenereerd door de bio-energetica functionele test in figuur 4A; de parameters worden berekend door de in sectie 4. overexpressie van miR-34a formules vermindert mitochondriale functie in CVE cellen op 24 uur na transfectie. Gegevens stellen gemiddelde ± SD (n = 5); OCR: Zuurstof verbruik. ****, P &lt;0,0001.bestanden / ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="tafel 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847table1.jpg" /> Tabel 1. Het instrument Run Protocol.

Endotheelcellen mitochondriën zijn van cruciaal belang voor de bloed-hersen-barrière integriteit te behouden. We introduceren een protocol om bio-energetische functie meten cerebrale vasculaire endotheliale cellen.

Evaluatie van de Bio-energetische Function in Cerebral vasculaire endotheelcellen

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

De algemene doelstellingen van deze procedure zijn het beoordelen van hoe veranderingen in de mitochondriële functie de ontwikkeling van neurologische aandoeningen beïnvloeden en het ontwerpen van therapeutica die een direct effect hebben op openingen in de bloed-hersenbarrière. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van neurologische aandoeningen, zoals hoe de dood van neuronen na een beroerte kan worden geminimaliseerd? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een real-time beoordeling biedt van de mitochondriële functie in complete, intacte cellen.Nadat de cerebrale vasculaire endotheelcellen in een T75 cm² weefselkweekfles in compleet medium zijn gekweekt bij 37 °C en 5% CO2 tot een confluentie van 80%, wordt het celkweekmedium afgegoten en worden de cellen gespoeld met trypsin-EDTA. Voeg vervolgens 1 tot 2 mL vers trypsin-EDTA toe aan de fles en laat de cellen bij 37 °C gedurende 3 tot 5 minuten loskomen. Nadat onder een omgekeerde microscoop is bevestigd dat de cellen zijn losgelaten, wordt de reactie gestopt door voorzichtig 10 mL vers compleet celmedium toe te voegen, waarna de cellen voor centrifugatie worden overgebracht naar een conische buis van 15 mL.Verwijder het supernatant en was het pellet in 10 milliliters vers compleet groeimedium voor een volgende centrifugatie. Resuspendeer het pellet vervolgens in compleet groeimedium bij een concentratie van 2 × 10⁵ cellen per milliliter voor subcultuur. Na het juiste aantal subculturen zaait u 1,6 × 10⁴ cellen in 80 µL compleet medium per well op een 96-well extracellulaire flux cellijnplaat en plaatst u de plaat in een incubator op 37 °C met 5% CO2.Wanneer de cellen aan de plaat zijn gehecht, voegt u de gewenste behandeling toe aan de juiste putjes en plaatst u de cellen terug in de incubator. De dag voor de assay voor de functionele beoordeling van de mitochondriën hydrateert u een extracellular flux censor-cartridge met 150 µL extracellular flux calibrant-oplossing en incubeert u de plaat een nacht bij 37 °C zonder koolstofdioxide. De volgende ochtend gebruikt u het plaatwasstation om het celkweekmedium te vervangen door pH 7.0 extracellular flux assay-medium.Incubeer de cellen vervolgens 30 tot 60 minuten bij 37 °C, zonder koolstofdioxide. Wanneer de cellen geëquilibreerd zijn, plaatst u de gehydrateerde cartridge in de Bioanalyzer en klikt u op de knop Start om de kalibratie te beginnen. Klik aan het einde van de kalibratie op de melding Unlock Cartridge om de bodemplaat van de cartridge te verwijderen en de celplaat te plaatsen.Open vervolgens het gegevensbestand om de snelheidswaarden van de Bioanalyzer te verkrijgen voor export naar het spreadsheetbestand. Aangezien de kinetiek en relatieve intensiteit van de responsen variëren tussen de verschillende typen cerebrale vasculaire endotheelcellen, werd in deze experimenten een reeks concentraties bEnd. 3-cellen gebruikt om het optimale aantal cellen te bepalen voor het meten van de zuurstofconsumptiesnelheden in een metabole profileringsanalyse.Zoals waargenomen, vertonen de basale en maximale respiratie en de reserve-respiratoire capaciteit een proportionele respons op de celdichtheid. De ATP-productie neemt echter af wanneer de hoogste concentratie cellen per well wordt gebruikt, wat suggereert dat een overconfluente celcultuur niet geschikt is voor het experiment. De optimale celdichtheden lijken voor te komen in het middenbereik van het aantal cellen per well.Daarom werden de verwachte niveaus van de zuurstofconsumptiesnelheid in dit representatieve experiment beoordeeld met een gemiddelde celconcentratie, wat aantoont dat niet-coderende precursor-mRNA-moleculen de mitochondriale functie in cerebrale vasculaire endotheelcellen verminderen. Deze experimenten tonen ook aan dat de maximale respiratie en de reservecapaciteit significant worden verlaagd door de overexpressie van deze moleculen in cerebrale vasculaire endotheelcellen 24 uur na transfectie, hoewel de basale respiratie, ATP-productie en protonlek geen significante veranderingen vertonen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee dagen worden voltooid.Van het uitplaten van de cellen tot het beoordelen van de mitochondriale functie, mits dit correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het bepalen van de optimale celdichtheid uiterst belangrijk is voordat andere procedures worden gestart. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals assays voor celviabiliteit of glycolyse, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de veranderingen in de mitochondriale functie als gevolg van een afgenomen celviabiliteit of veranderingen in andere metabole routes.Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van mitochondriële functie om intacte cellen te gebruiken in plaats van geïsoleerde mitochondriën bij een verscheidenheid aan ziekten, waaronder neurologische aandoeningen, kanker of metabole stoornissen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de mitochondriële functie in cerebrale vasculaire endotheelcellen kunt beoordelen.

evaluation-bioenergetic-function-cerebral-vascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze methode wordt beschreven hoe isoleren en onsterfelijk microvasculaire endotheelcellen van muizenhersenen. We beschrijven een stap-voor-stap protocol vanaf het homogeniseren van het hersenweefsel, digestie stappen zaaien en immortalisatie van de cellen. Meestal duurt het ongeveer vijf weken voor het verkrijgen van een homogene, vereeuwigd microvasculaire endotheliale cellijn.

Genereren van een geïmmortaliseerde Murine Brain microvasculaire endotheliale cellijn als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Brain Barrier Model

This video demonstrates the assessment of the mitochondrial functioning of cerebral vascular endothelial (CVE) cells using an extracellular flux assay. CVE cells are plated in an extracellular flux cell culture plate. Extracellular flux sensors are hydrated before loading and calibration into the bioanalyzer. The plate containing cells is then loaded for analysis.

Assessing Mitochondrial Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Endotheliale dysfunctie wordt geassocieerd met tal van ziekten en is voorspellend voor ongunstige cardiovasculaire gebeurtenissen bij de mens. Flow-gemedieerde vaatverwijding (MKZ) is een niet-invasieve ultrasone methode voor het evalueren van de endotheelfunctie. Methodologische keuzes en de ervaring van de resultaten kunnen beïnvloeden. Een systematische aanpak van MKZ in menselijke studies wordt hier besproken.

Echografie Beoordeling van endotheel-afhankelijke Flow-gemedieerde vaatverwijding van de arteria brachialis in Clinical Research

Hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMEC) zijn onderling verbonden door specifieke junctionele eiwitten die een sterk gereguleerde barrière vormen die bloed en het centrale zenuwstelsel (CZS) scheiden, de zogenaamde bloed-hersenbarrière (BBB). De isolatie van primaire muis-hersenmicrovasculaire endotheelcellen, zoals besproken in dit protocol, maakt gedetailleerde in vitro studies van de BBB mogelijk.

Isolatie van Primary Muriene Brain microvasculaire endotheelcellen

Het huidige artikel beschrijft de methodologische overwegingen voor verschillende niet-invasieve beoordelingen van vasculaire functie en morfologie die vaak worden gebruikt in medisch onderzoek om verschillende stadia van atherosclerose te beoordelen.

Een methodologische aanpak van niet-invasieve Assessments van de vaatfunctie en morfologie

We beschrijven een eenvoudige celgebaseerde bioassay voor het detecteren, kwantificeren en volgen van de activiteit van leden van de vasculaire endotheliale groeifactor familie van liganden. De test maakt gebruik van chimère receptoren tot expressie gebracht in een factor-afhankelijke cellijn die een semi-kwantitatieve of kwantitatieve beoordeling van receptorbinding en verknoping verschaffen door het ligand.

Een eenvoudige bioassays voor de beoordeling van de vasculaire endotheliale groeifactoren

Hier gedemonstreerd zijn protocollen voor het isoleren van (1) vers intact cerebrale endothelial "buizen" en (2) gelijktijdige metingen van endothelial calcium en membraanpotentiaal tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie. Verder, deze methoden toestaan voor farmacologische tuning van endothelial cel calcium en elektrische signalering als individuele of interactieve experimentele variabelen.

Gelijktijdige metingen van intracellulair Calcium en membraanpotentiaal in vers geïsoleerd en Intact muis cerebrale endotheel

We presenteren drie eenvoudige in vitro testen-de lange afstand migratie test, de co-cultuur migratie test, en chemo-attractie test-dat gezamenlijk evalueren van de functies van de menselijke stamcel afgeleid periventricular endotheliale cellen en hun interactie met GABAergic interneuronen.

Migratie, Chemo-Attraction, en Co-Culture Assays voor menselijke stamcel-afgeleide endotheelcellen en GABAergic Neuronen

Intensieve voorbereiding van intacte cerebrale endotheelbuizen van muizen uit cerebrale parenchymale arteriolen wordt geïllustreerd voor het bestuderen van cerebrale bloedstroomregulatie. Verder demonstreren we de experimentele sterke punten van dit endotheelstudiemodel voor fluorescentiebeeldvorming en elektrofysiologische meting van belangrijke cellulaire signaalroutes, inclusief veranderingen in intracellulaire [Ca2 +] en membraanpotentiaal.

Isolatie en functionele analyse van arteriolar endotheel van muishersenparenchym

Dit protocol beschrijft een betrouwbaar en efficiënt in vitro model van de bloedbarrière van de hersenen. De methode maakt gebruik van cerebrale vasculaire endotheelcellen bEnd.3 van muizen en meet de transmembraan elektrische weerstand.

Opname van functionele integriteit van barrière op bEnd.3 vasculaire endotheelcellen via detectie van transendotheliale elektrische weerstand

Hier demonstreren we de techniek van het gebruik van op impedantie gebaseerde biosensoren: ECIS en cellZscope, voor het meten van de sterkte van de endotheliale barrière van de hersenen. We beschrijven de voorbereiding en techniek van het toevoegen van verschillende stimuli aan een in vitro model van het hersenendotheel. We meten, registreren en geven een representatieve analyse van de bevindingen.

Het meten van veranderingen in de integriteit van de endotheliale barrière van de hersenen met twee op impedantie gebaseerde biosensoren als reactie op kankercellen en cytokines

Leer hoe je de mitochondriale functie beoordeelt in cerebrale vasculaire endotheelcellen met behulp van een extracellular flux analyzer. Deze techniek helpt onderzoekers de bloed-hersenbarrière en neurologische aandoeningen te bestuderen.

Evaluatie van de Bio-energetische Function in Cerebral vasculaire endotheelcellen

Meer video's verkennen