-Cefoperazone behandelde muismodel van klinisch relevante Clostridium difficile Strain R20291

Het algemene doel van dit protocol is om een stapsgewijze handleiding te bieden voor het implementeren van het cefoperazone muismodel van Clostridium difficile infectie, met speciale nadruk op klinisch ziektemonitoring, bacteriëntelling, toxinecytotoxiciteit en histopathologische veranderingen na uitdaging. Dit gedetailleerde protocol zal onderzoekers helpen om nauwkeurig een muismodel van Clostridium difficile infectie uit te voeren, wat essentieel is voor het bestuderen van de pathogenese van deze bacterie en het toegang krijgen tot nieuwe therapieën. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van dit muismodel is dat blootstelling aan één antibioticum gedurende vijf dagen muizen vatbaar maakt voor kolonisatie van C.difficile en voor een langdurig klinisch verloop van infectie gelijktijdig met de menselijke ziekte.

Om te beginnen, neem de C.difficile stam van belang en vortex. In een laminaire stroomkast, verdun de stam in steriel water in een schroefdopbuis tot een concentratie van tien tot de vijfde sporen per 25 microliter. Label de mixtuur als sporeninoculum en plaats de buis in een 65 graden Celsius waterbad gedurende 20 minuten.

Vervolgens, in de laminaire stroomkast, pipet 50 microliter van het verwarmde sporeninoculum in een steriele microcentrifugebuis en breng het in de anaerobe kamer tot verder gebruik. Laad het resterende sporeninoculum in een een milliliter spuit bevestigd aan een steriele bulb-tip gastrische intubatie naald. In een laminaire stroomkast, neem een muis en immobiliseer de kop door het dier voorzichtig te beteugelen door de losse huid van de nek en rug.

Gebruik de wijsvinger en zorg ervoor dat het dier niet vocaliseert of tekenen van benauwdheid vertoont, immobiliseer het hoofd van het dier verder en verleng het slokdarm. Houd de muis in een rechtopstaande, verticale positie en breng voorzichtig de intubatie naald in de zijkant van de mond. Richt de intubatie naald langs het dak van de mond en breng hem langzaam in de slokdarm.

Zodra de naald ongeveer halverwege de slokdarm is, injecteer 25 microliter van het sporeninoculum en trek dan voorzichtig de naald terug. Breng het dier terug naar zijn kooi en observeer het op tekenen van hoesten of ademhalingsproblemen die kunnen wijzen op onbedoelde trachea-toediening. Neem vervolgens het eerder opgeslagen sporeninoculum aliquot in de anaerobe kamer en eventueel overgebleven intubatie sporeninoculum en maak één tot tien seriële verdunningen in 180 microliter van 1x PBS.

Voer vier tot vijf van deze verdunningen uit. Gebruik asseptiek en breng 100 microliter van elke seriële verdunning over naar een afzonderlijke TCCFA plaat. Neem elke keer een nieuwe steriele L-vormige verspreider en verdeel de verdunning inocula gelijkmatig op elke plaat.

Incubeer de platen onder anaerobe omstandigheden gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. Tel uiteindelijk de C.difficile kolonies op elke verdunningsplaat en bereken de kolonievormingseenheden om de infectiedosis te verkrijgen die aan de muizen is toegediend. Om fecale monsters van muizen te verzamelen voor beoordeling, houd de muis eerst licht maar stevig vast door de losse huid op de nek en rug, zorg ervoor dat het dier geen benauwdheid vertoont.

Gebruik de pink om voorzichtig de staart van het dier op te tillen, waardoor de anus zichtbaar wordt. Houd een steriele microcentrifugebuis van bekende gewicht direct onder de anus van het dier, zorg ervoor dat de buis niet direct het muis raakt. Wanneer het dier ontlast, verzamel de fecale pellet in de buis.

Bewaar de buis bij kamertemperatuur totdat alle noodzakelijke monsters zijn verzameld. Weeg de buizen met feces op een analytische weegschaal en noteer de massa tot vier decimalen. Bereken het gewicht van de fecale pellet door het gewicht van de buis af te trekken.

Bereken vervolgens een een tot tien verdunning van de inhoud en resuspendeer in 1x PBS. Gebruik de punt van de pipette om het fecale materiaal voorzichtig in oplossing te brengen. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, waardoor de inhoud zich kan bezinken.

Bewaar de oplossingen anaeroob en maak seriële verdunningen voor elk monster in 1x PBS. Breng 100 microliter van elke seriële verdunning over op TCCFA platen. Gebruik een steriele L-vormige verspreider en breng het medium gelijkmatig aan op de platen.

Incubeer de platen onder anaerobe omstandigheden gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. Tel uiteindelijk de C.difficile kolonies en bereken de kolonievormingseenheid per gram fecale inhoud. Deze figuur toont het muisgewicht in de dagen na uitdaging met C.difficile R20291.

Op dag nul is het basisgewicht ingesteld op 100. Het gemiddelde muis lichaamsgewicht werd elke dag daarna gemeten, gedurende 14 dagen. Er werd een significante gewichtsafname waargenomen bij uitgedaagde muizen op dagen twee tot zeven na de uitdaging.

Muizen leken zich na dit punt te herstellen en gewicht te herwinnen. Hier worden de C.difficile belasting in de feces in de dagen na de uitdaging getoond. Na 24 uur na de uitdaging waren alle muizen gekoloniseerd met 10 tot de zevende CFUs per gram feces.

Deze belasting was afgenomen vanaf dag zeven, hoewel C.difficile nog steeds aanwezig is. Histopathologisch onderzoek van muizen gedurende de tijdsloop van de infectie toonde de meest significante pathologische veranderingen in de cecum. Totale cecale histologische scores waren significant verschillend tussen dag nul en dagen twee en vier na de uitdaging.

Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn in dit muismodel worstelen met de berekening en bereiding van het sporeninoculum dat wordt gebruikt om de muizen uit te dagen en de berekening van de fecale C.difficile bacteriële belasting. Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden dat wijzigingen in de dosis of stam van C.difficile sporen die aan muizen worden toegediend, het resultaat van dit model kunnen veranderen.