-Cefoperazone behandelde muismodel van klinisch relevante

Het algemene doel van dit protocol is om een stapsgewijze handleiding te bieden voor de implementatie van het cefoperazon-muismodel voor Clostridium difficile-infectie, met speciale nadruk op klinische ziektemonitoren, bacteriële enumeratie, toxinecytotoxiciteit en histopathologische veranderingen na de challenge. Dit gedetailleerde protocol helpt onderzoekers om een muismodel van Clostridium difficile-infectie nauwkeurig uit te voeren, wat essentieel is voor het bestuderen van de pathogenese van deze bacterie en het evalueren van nieuwe therapeutica. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van dit muismodel is dat blootstelling aan één antibioticum gedurende vijf dagen muizen vatbaar maakt voor kolonisatie door C.difficile en leidt tot een langdurig klinisch infectieverloop dat overeenkomt met de menselijke ziekte.

Begin met het nemen van de gewenste C.difficile-stamvoorraad en vortex deze. Verdun de voorraad in een laminaire flowkast in steriel water in een buis met schroefdop tot een concentratie van 10⁵ sporen per 25 µL. Label het mengsel als sporeninoculum en plaats de buis gedurende 20 minuten in een waterbad van 65 °C.

Pipette vervolgens, in de laminaire flowkast, 50 µL van het verwarmde sporeninoculum in een steriele microcentrifugebuis en plaats deze in de anaerobe kamer tot verder gebruik. Laad het resterende sporeninoculum in een spuit van 1 mL die is voorzien van een steriele maagsonde-naald met stompe punt. Immobiliseer in een laminaire flowkast de kop van een proefmuis door het dier voorzichtig bij de losse huid van de nek en rug vast te houden.

Immobiliseer de kop van het dier verder en rek de slokdarm uit met de wijsvinger, waarbij moet worden gewaarborgd dat het dier geen geluiden maakt of tekenen van stress vertoont. Houd de muis in een rechtopstaande, verticale positie en voer de gavage-naald voorzichtig via de zijkant van de bek in. Richt de gavage-naald langs het gehemelte en voer deze langzaam verder in de slokdarm.

Zodra de naald zich ongeveer halverwege in de slokdarm bevindt, injecteert u 25 µL van het sporeninoculum en trekt u de naald vervolgens voorzichtig terug. Plaats het dier terug in de kooi en observeer het op tekenen van hoesten of respiratoire distress, wat kan wijzen op onbedoelde intratracheale toediening. Neem vervolgens het sporeninoculum-aliquot dat eerder in de anaerobe kamer is bewaard, samen met het resterende sporeninoculum voor gavage, en maak hiervan seriële verdunningen van één tot tien in 180 µL 1x PBS.

Voer vier tot vijf van deze verdunningen uit. Breng met behulp van aseptische techniek 100 µL van elke seriële verdunning over naar een individuele TCCFA-plaat. Verdeel de verdunningsinocula gelijkmatig over elke plaat met telkens een nieuwe steriele L-vormige spreader.

Incubeer de platen onder anaerobe omstandigheden gedurende 24 uur bij 37 °C. Tel tot slot de C.difficile-kolonies op elke verdunningsplaat en bereken de colony forming units om de toegediende infectieuze dosis voor de muizen te bepalen. Om fecesmonsters van de muizen te verzamelen voor analyse, fixeer het proefdier eerst licht maar stevig bij de losse huid van de nek en rug, waarbij u ervoor zorgt dat het dier geen stress ervaart.

Til met de pink voorzichtig de staart van het dier op om de anus bloot te leggen. Houd een steriele microcentrifugebuis van bekend gewicht direct onder de anus van het dier, waarbij u ervoor zorgt dat de buis de muis niet direct raakt. Verzamel de fecale pellet in de buis zodra het dier defaceert.

Bewaar de buis bij kamertemperatuur totdat alle benodigde monsters zijn verzameld. Weeg de buizen met feces op een analytische balans en noteer de massa tot vier decimalen. Bereken het gewicht van de fecespellet door het gewicht van de buis eraf te trekken.

Bereken vervolgens een verdunning van één op tien van de inhoud en resuspendeer deze in 1x PBS. Gebruik de pipetpunt om de feces voorzichtig in de oplossing te homogeniseren. Incubeer de monsters 30 minuten bij kamertemperatuur, zodat de inhoud kan bezinken.

Houd de oplossingen anaeroob en maak voor elk monster seriële verdunningen in 1x PBS. Breng 100 microliters van elke seriële verdunning over op TCCFA-platen. Gebruik een steriele L-vormige spreider om het medium gelijkmatig over de platen te verdelen.

Incubeer de platen onder anaerobe omstandigheden bij 37 °C gedurende 24 uur. Tel tot slot de C.difficile-kolonies en bereken het aantal colony forming units per gram fecale inhoud. Deze figuur toont het gewicht van de muizen in de dagen na infectie met C.difficile R20291.

Op dag nul wordt het basisgewicht vastgesteld op 100. Het gemiddelde lichaamsgewicht van de muizen werd de volgende 14 dagen dagelijks gemeten. Een significante gewichtsafname werd waargenomen bij de uitgedaagde muizen op dag twee tot zeven na de uitdaging.

De muizen leken vanaf dit punt te herstellen en weer aan gewicht te winnen. Hier wordt de C.difficile-last in de feces in de dagen na de challenge getoond. 24 uur na de challenge waren alle muizen gekoloniseerd met 10 ⁷ CFUs per gram feces.

Deze last was vanaf dag zeven afgenomen, hoewel C.difficile nog steeds aanwezig is. Histopathologisch onderzoek van de muizen gedurende het verloop van de infectie toonde de meest significante pathologische veranderingen in het caecum aan. De totale histologische scores van het caecum verschilden significant tussen dag nul en dag twee en vier na de challenge.

Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met dit muismodel moeite hebben met de berekening en bereiding van het sporeninoculum dat wordt gebruikt om de muizen te infecteren, en met de berekening van de bacteriële C.difficile-belasting in de feces. Bij het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om te onthouden dat wijzigingen in de dosis of de stam van de C.difficile-sporen die aan de muizen worden toegediend, de uitkomst van dit model kunnen beïnvloeden.