Name: Conjugative Mating Testen voor sequentie-specifieke analyse van Transfer eiwitten die betrokken zijn in bacterieconjugatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Leer hoe je een gen uitschakelt in plasmideconjugatie en de effecten analyseert via koppelingsproeven. Deze methode helpt microbiologen eiwit-eiwitinteracties in bacteriële type vier secretiesystemen bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door een Discovery Grant van de Raad Natuurwetenschappen &amp; Engineering van Canada (NSERC).

<ol><li>Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+islands+in+pathogenic+and+environmental+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).</li>
<li>Furuya, E. Y., Lowy, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial-resistant+bacteria+in+the+community+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting.</a> Nat Rev Microbiol. 4 (1), 36-45 (2006).</li>
<li>Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R., Gelbart, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGriffiths%2C+A+%22An+Introduction+to+Genetic+Analysis%2C+7th+Edition%22">An Introduction to Genetic Analysis, 7th Edition</a>. , W.H. Freeman. San Fransisco. (2000).</li>
<li>Cooper, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+Speeds+Adaptation+by+Reducing+Competition+between+Beneficial+Mutations+in+Populations+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombination Speeds Adaptation by Reducing Competition between Beneficial Mutations in Populations of Escherichia coli.</a> PLoS Biol. Barton, N. H. 5 (9), 225(2007).</li>
<li>Lujan, S. A., Guogas, L. M., Ragonese, H., Matson, S. W., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+antibiotic+resistance+propagation+by+inhibiting+the+conjugative+DNA+relaxase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Disrupting antibiotic resistance propagation by inhibiting the conjugative DNA relaxase.</a> Proc Natl Acad Sci. 104 (30), 12282-12287 (2007).</li>
<li>Carattoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmids+and+the+spread+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plasmids and the spread of resistance.</a> Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).</li>
<li>Shala, A., Ferraro, M., Audette, G. F. Bacterial Secretion Systems: Nanomachines for Infection and Genetic Diversity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShala%2C+A+%22Handbook+of+Clinical+Nanomedicine%3A+Nanoparticles%2C+Imaging%2C+Therapy+and+Clinical+Applications%22">Handbook of Clinical Nanomedicine: Nanoparticles, Imaging, Therapy and Clinical Applications</a>. Bawa, R., Audette, G. F., Rubenstein, I. , Pan Sanford Publishing. Singapore. 657-686 (2016).</li>
<li>Tseng, T. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+systems+in+bacterial-host+associations%2C+and+their+description+in+the+Gene+Ontology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology.</a> BMC Microbiol. 9 (1), Suppl 1 2(2009).</li>
<li>Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+diversity+of+prokaryotic+type+IV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).</li>
<li>Lawley, T. D., Klimke, W. A., Gubbins, M. J., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F+factor+conjugation+is+a+true+type+IV+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">F factor conjugation is a true type IV secretion system.</a> FEMS Microbiol Lett. 224 (1), 1-15 (2003).</li>
<li>Lederberg, J., Tatum, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Recombination+in+Escherichia+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gene Recombination in Escherichia Coli.</a> Nature. 158 (4016), 558-558 (1946).</li>
<li>Smillie, C., Garcillan-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P. C., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+Plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mobility of Plasmids.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).</li>
<li>Willetts, N., Skurray, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Conjugation+System+of+F-Like+Plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The Conjugation System of F-Like Plasmids.</a> Annu Rev Genet. 14 (1), 41-76 (1980).</li>
<li>Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., Skurray, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+sequence+and+gene+products+of+the+transfer+region+of+the+F+sex+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor.</a> Microbiol Rev. 58 (2), 162-210 (1994).</li>
<li>Audette, G. F., Manchak, J., Beatty, P., Klimke, W. A., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+exclusion+in+F-like+plasmids+requires+intact+TraG+in+the+donor+that+recognizes+its+cognate+TraS+in+the+recipient%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Entry exclusion in F-like plasmids requires intact TraG in the donor that recognizes its cognate TraS in the recipient.</a> Microbiology. 153, Pt 2 442-451 (2007).</li>
<li>Christie, P. J., Atmakuri, K., Krishnamoorthy, V., Jakubowski, S., Cascales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+Architecture%2C+and+Function+of+Bacterial+Type+Iv+Secretion+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, Architecture, and Function of Bacterial Type Iv Secretion Systems.</a> Annu Rev Microbiol. 59 (1), 451-485 (2005).</li>
<li>Christie, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+secretion%3A+the+Agrobacterium+VirB%2FD4+and+related+conjugation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+-+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems.</a> Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1694 (1-3), 219-234 (2004).</li>
<li>Bhatty, M., Laverde Gomez, J. a, Christie, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+bacterial+type+IV+secretion+lexicon%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The expanding bacterial type IV secretion lexicon.</a> Res Microbiol. 164 (6), 620-639 (2013).</li>
<li>Christie, P. J., Cascales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+dynamic+properties+of+bacterial+Type+IV+secretion+systems+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and dynamic properties of bacterial Type IV secretion systems (Review).</a> Mol Membr Biol. 22 (1-2), 51-61 (2005).</li>
<li>Christie, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+secretion%3A+Intercellular+transfer+of+macromolecules+by+systems+ancestrally+related+to+conjugation+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Type IV secretion: Intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines.</a> Mol Microbiol. 40 (2), 294-305 (2001).</li>
<li>Christie, P. J., Whitaker, N., González-Rivera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+structure+of+the+bacterial+type+IV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mechanism and structure of the bacterial type IV secretion systems.</a> Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1578-1591 (2014).</li>
<li>Cascales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+VI+secretion+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The type VI secretion toolkit.</a> EMBO Rep. 9, 735(2008).</li>
<li>Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Regulation+of+the+Type+VI+Secretion+System%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure and Regulation of the Type VI Secretion System.</a> Annu Rev Microbiol. 66 (1), 453-472 (2012).</li>
<li>Chandran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+outer+membrane+complex+of+a+type+IV+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the outer membrane complex of a type IV secretion system.</a> Nature. 462 (7276), 1011-1015 (2009).</li>
<li>Rivera-Calzada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+bacterial+type+IV+secretion+core+complex+at+subnanometre+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of a bacterial type IV secretion core complex at subnanometre resolution.</a> EMBO J. 32 (8), 1195-1204 (2013).</li>
<li>Waksman, G., Fronzes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+bacterial+type+IV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of bacterial type IV secretion systems.</a> Trends Biochem Sci. 35, 691(2010).</li>
<li>Fronzes, R., Christie, P. J., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+biology+of+type+IV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The structural biology of type IV secretion systems.</a> Nat Rev Microbiol. 7 (10), 703-714 (2009).</li>
<li>Kaplan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+a+cell-embedded+megadalton+protein+complex+by+DNP-supported+solid-state+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR.</a> Nat Methods. 12 (7), 5-9 (2015).</li>
<li>Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+sex-factor-affinity+site+in+E.+coli+as+gamma+delta%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 45, Pt 1 135-140 (1981).</li>
<li>Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+pilus+in+recipient+cell+recognition+during+bacterial+conjugation+mediated+by+F-like+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids.</a> Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).</li>
<li>Jobling, M. G., Holmes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+vectors+with+the+pl5a+replicon%2C+kanamycin+resistance%2C+inducible+lacZ%CE%B1+and+pUC18+or+pUC19+multiple+cloning+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Construction of vectors with the pl5a replicon, kanamycin resistance, inducible lacZα and pUC18 or pUC19 multiple cloning sites.</a> Nucleic Acids Res. 18 (17), 5315(1990).</li>
<li>Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+regulation%2C+modulation%2C+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+P%28BAD%29+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P(BAD) promoter.</a> J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5978-5983 (2009).</li>
<li>Lawley, T. D., Gilmour, M. W., Gunton, J. E., Standeven, L. J., Taylor, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+Mutational+Analysis+of+Conjugative+Transfer+Region+1+%28Tra1%29+from+the+IncHI1+Plasmid+R27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Functional and Mutational Analysis of Conjugative Transfer Region 1 (Tra1) from the IncHI1 Plasmid R27.</a> J Bacteriol. 184 (8), 2173-2180 (2002).</li>
<li>Elton, T. C., Holland, S. J., Frost, L. S., Hazes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-Like+Type+IV+Secretion+Systems+Encode+Proteins+with+Thioredoxin+Folds+That+Are+Putative+DsbC+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">F-Like Type IV Secretion Systems Encode Proteins with Thioredoxin Folds That Are Putative DsbC Homologues.</a> J Bacteriol. 187 (24), 8267-8277 (2005).</li>
<li>Hazes, B., Frost, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+systems+biology+approach+to+study+type+II%2FIV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Towards a systems biology approach to study type II/IV secretion systems.</a> Biochim Biophys Acta. 1778, 1839-1850 (2008).</li>
<li>Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDX-MS+and+deletion+analysis+of+the+type+4+secretion+system+protein+TraF+from+the+Escherichia+coli+F+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid.</a> FEBS Lett. Tsolis, R. 590 (3), 376-386 (2016).</li>
<li>Audette, G. F., Van Schaik, E. J., Hazes, B., Irvin, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-binding+protein+nanotubes%3A+Learning+from+nature%27s+nanotech+examples%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">DNA-binding protein nanotubes: Learning from nature's nanotech examples.</a> Nano Lett. 4, 1897-1902 (2004).</li>
<li>Harris, R. L., Silverman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tra+proteins+characteristic+of+F-like+type+IV+secretion+systems+constitute+an+interaction+group+by+yeast+two-hybrid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tra proteins characteristic of F-like type IV secretion systems constitute an interaction group by yeast two-hybrid analysis.</a> J Bacteriol. 186 (16), 5480-5485 (2004).</li>
<li>Moore, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+F-Plasmid+Conjugative+Transfer+Gene+traU%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the F-Plasmid Conjugative Transfer Gene traU.</a> J Bacteriol. 172 (8), 4263-4270 (1990).</li>
<li>Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+pilus+in+recipient+cell+recognition+during+bacterial+conjugation+mediated+by+F-like+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids.</a> Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).</li>
<li>Klimke, W. A., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+the+role+of+the+transfer+gene%2C+traN%2C+of+the+F+and+R100-1+plasmids+in+mating+pair+stabilization+during+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of the role of the transfer gene, traN, of the F and R100-1 plasmids in mating pair stabilization during conjugation.</a> J Bacteriol. 180 (16), 4036-4043 (1998).</li>
<li>Jiang, W., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas%3A+New+Tools+for+Genetic+Manipulations+from+Bacterial+Immunity+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems.</a> Annu Rev Microbiol. 69 (1), 209-228 (2015).</li>
<li>Dahlberg, C., Bergstrom, M., Andreasen, M., Christensen, B. B., Molin, S., Hermansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+bacterial+conjugation+by+plasmids+from+marine+environments+visualized+by+gfp+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Interspecies bacterial conjugation by plasmids from marine environments visualized by gfp expression.</a> Mol Biol Evol. 15 (4), 385-390 (1998).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Bacterieconjugatie werkwijze een middel waarmee bacteriën genen kunnen verspreiden verschaffen van een evolutionair voordeel voor groei in veeleisende omgevingen, zoals de verspreiding van antibioticaresistentie markers. Omdat veel van de conjugatie plasmiden zijn zo groot, 12 functionele studies op het betrokken bij assemblage van de overbrenginrichting door mutatie van doelgenen de conjugatie plasmide zelf eiwitten onhandig. De protocollen die hierin beschreven een middel waarmee men gemakkelijker het doelg...

De overdracht van genen en eiwitten op micro-niveau organismaal speelt een centrale rol in bacteriële overleving en ontwikkeling en ontstekingsprocessen. De uitwisseling van DNA tussen bacteriën of tussen een bacterie en een cel kan worden bereikt door transformatie, conjugatie of transductie vector. 1,2 Conjugatie is uniek in vergelijking met transformatie en transductie dat tijdens conjugatie tussen gram-negatieve bacteriën zoals Escherichia coli, de overdracht van DNA optreedt in een donor-gecontroleerde wijze waardoor een complexe macromoleculaire verbindt donor en ontvangende cellen. Conjugatie is de meest directe manier waarop bacteriële cellen interageren met gastheercellen genen, eiwitten of chemicaliën te injecteren om gastheersystemen. 3 Heel vaak, de overdracht van dergelijke middelen heeft opmerkelijke effect op de host, variërend van pathogenese en carcinogenese aan de evolutie en adaptatie te organiseren. Het is aangetoond dat conjugatie recombination verhoogt de snelheid van de aanpassing 3-voudig in bacteriën met een hoge mutatie tarieven onder de omstandigheden van het milieu stress. 4 Bovendien conjugatie is veruit de meest voorkomende waarlangs antibiotische resistentiegenen in bacteriële stammen worden verspreid. 5,6 Micro-organismen hebben gespecialiseerde secretie systemen ontwikkeld om de overdracht van macromoleculen over cellulaire membranen te ondersteunen; Er zijn 9 typen secretie systemen (TSSS) in gramnegatieve bacteriën die zijn beschreven T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, evenals de Sec (secretie) en Tat (twee-arginine translocatie) trajecten. 7,8 Elk type secretie systeem is verder onderverdeeld in verschillende subtypen, noodzakelijk vanwege de diversiteit van eiwitten en het onderscheidend vermogen van paden betrokken bij verschillende bacteriële stammen. Bijvoorbeeld in de type IV secretie systeem (T4SS), de Ti en Cag systemen effector transport dat het F-plasmide te vergemakkelijken, R27 eennd pKM101 T4SSs vergemakkelijken overdracht van een conjugatie plasmide. 7,9,10 Een gedetailleerd inzicht in de mechanismen die organismen assembleren hun afscheiding systemen uit hun component eiwitten en deel cellulaire inhoud met een ontvanger of hun omgeving is een belangrijke factor in de ontwikkeling van gerichte strategieën om pathogene micro-organismen en de processen van de bestrijding cellulaire infectie. Na de initiële identificatie bacterieconjugatie in E. coli door Lederberg &amp; Tatum, 11 een groot aantal mobiele en conjugatie plasmiden geïdentificeerd en gekarakteriseerd. 12 Dergelijke mobiele plasmiden vertonen grote bereik grootte (van 1 tot meer dan 200 kilobasen (kb)), maar alle mobiele plasmiden bevatten relaxase, die de oorsprong van overdracht (oriT) waardoor het mogelijk overdracht van het plasmide herkent. Conjugatie plasmiden verdere genen coderen voor de assemblage van een functioneel T4SS en een soortIV koppeling eiwit. 12 Bijvoorbeeld de 100 kb F-plasmide van E. coli codeert alle conjugative genen binnen een 33,3 kB overdracht (TRA) regio. 13 De genen in de tra regio van het F plasmide coderen alle eiwitten die pilus vorming te vergemakkelijken, paring vorming pair (MPF), DNA-overdracht en uitsluiting functies tijdens conjugatie plasmide-overdracht. 10,14,15 Een aanzienlijke hoeveelheid kennis is beschikbaar voor conjugative T4SSs echter gedetailleerde structurele studies van het conjugative eiwitten en complexen worden alleen maar meer recent beschikbaar komen. 16-28 Om een ​​uitgebreid overzicht van de conjugatie proces samen te stellen, wordt een koppeling van gedetailleerde structurele studies naar analyses van conjugative overdracht eiwitten mutatie nodig. Dit kan worden bereikt door conjugatie paring assays. Voor de F-plasmide, elk eiwit gecodeerd in de tra regio speelt een rol in de F-gemedieerde conjugation; daarom zal de knockout / verwijdering van een genoverdracht de conjugatie capaciteit van de cel (figuur 1) af te schaffen. Terwijl kleinere mobiele plasmiden meer bijdragen standaard verwijderingsprocedures, voor groter conjugatie plasmiden zoals F, zijn gen knockouts gemakkelijker bereikt via homologe recombinatie waarbij het doelgen vervangen met één transporteren van een afzonderlijk antibioticumresistentiegen. In het huidige protocol, maken we gebruik van homologe recombinatie op een overdracht gen van belang met chlooramfenicol acetyltransferase (CAT) in de 55 kb F plasmide afgeleide pOX38-Tc vervangen; 29,30 de resulterende knockout plasmide pOX38-Tc Δgene :: Cm vergemakkelijkt weerstand tegen chlooramfenicol (Cm) in het kweekmedium. Donor cellen die pOX38-Tc Δgene :: Cm niet kunnen conjugatie DNA-overdracht / paring zoals waargenomen door middel van een paring test beïnvloeden; de paring efficiëntie van een pOX38-Tc Δgene :: Cm donor cel en een normale recipseerde zal afnemen of, vaker, worden afgeschaft. Conjugatie overdracht van de pOX38-Tc Δgene :: Cm plasmide kan worden hersteld via een klein herstel plasmide de gerichte overdracht gen. Dit herstel plasmide kan één zijn die constitutieve expressie verschaft, zoals plasmide pK184 (pK184-gen), 31 of een die induceerbare expressie bepaalt dat zolang de plasmide goed richt het gen naar de juiste locatie in de cel (cytoplasma of periplasma). Bijgevolg is in de paring assays tussen deze nieuwe donor (herbergen pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184-gen plasmiden) en een ontvangende cel, het koppelen efficiëntie verwacht te herstellen tot bijna die van een normale donor-ontvanger paring test. Dit systeem maakt het mogelijk om de functie van de knock-out gen sonde door het genereren van een reeks pK184-genconstructen (deleties of puntmutaties) en testen het vermogen van elke construct om de dekking capaciteit van de pOX38-Tc Δgene :: Cm herbergen herstellen donor cels.

<table><tbody><tr><td>GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet Gel Extraction Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0692</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet PCR Purification Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0702</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E0554S</td><td></td></tr><tr><td>Broad Range DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N0303A</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Eppendorf</td><td>4309000027</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation cuvettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB101</td><td>Cuvettes hebben een opening van 1 mm.</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td></td><td></td><td>Eindconcentraties</td></tr><tr><td>Chloramfenicol (Cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>20 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>Kanamycin (Km)</td><td>BioBasic Inc.</td><td>DB0286</td><td>50 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>Nalidixinezuur (Nal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8878-25G</td><td>10 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>Rifamycin (Rif)</td><td>Calbiochem</td><td>557303</td><td>20 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>Tetracycline (Tc)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td>10 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>Streptomycine (Sm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP910-50</td><td>50 &micro;g/mL</td></tr></tbody></table>

conjugative mating testen voor sequentie-specifieke analyse van transfer eiwitten die betrokken zijn in bacterieconjugatie

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

De overdracht van genetisch materiaal door bacteriële conjugatie is een proces dat plaatsvindt via complexen die worden gevormd door specifieke overdrachtseiwitten. In Escherichia coli vormen deze overdrachtseiwitten een DNA-overdrachtsmachinerie die bekend staat als de paringspaarvorming, of DNA-overdrachtscomplex, dat conjugatief plasmide-overdracht mogelijk maakt. Het doel van dit artikel is om een methode te bieden die kan worden gebruikt om de rol van een specifiek overdrachtseiwit dat betrokken is bij conjugatie te bepalen, door middel van een reeks deleties en/of puntmutaties in combinatie met paringstests. Het doelgen wordt uitgeschakeld op het conjugatieve plasmide en wordt vervolgens in trans geleverd door het gebruik van een klein herstelplasmide dat het doelgen bevat. Mutaties die het doelgen op het herstelplasmide beïnvloeden, kunnen informatie geven over functionele aspecten van het doelwiteiwit die resulteren in de verandering van de paringsefficiëntie van donorcellen die het gemuteerde gen bevatten. Veranderingen in paringsefficiëntie geven inzicht in de rol en belangrijkheid van het specifieke overdrachtseiwit, of een gebied daarin, bij het faciliteren van conjugatieve DNA-overdracht. Het koppelen van deze paringstest met gedetailleerde driedimensionale structurele studies zal een alomvattend begrip van de functie van het conjugatieve overdrachtseiwit bieden en tevens een middel bieden voor het identificeren en karakteriseren van gebieden van eiwit-eiwit interactie.

Werkwijze F-plasmide aangedreven bacterieconjugatie een gecoördineerd proces dat transporterende eiwitten omvat in de tra regio van het F-plasmide dat een T4SS voor pilus synthese en conjugatie DNA te vergemakkelijken assembleert. Het eiwit TRAF (GenBank toegangsnummer # BAA97961; UniProt ID P14497) vereist is voor conjugatie-F-pilus formatie. 10,14,35 - 37 Het eiwit bevat een C-terminale thioredoxine-achtige domein, hoewel het niet de katalytisc...

Hier presenteren we een protocol om een gen van belang dat betrokken is bij plasmide-conjugatie uit te schakelen en vervolgens het effect van het ontbreken ervan te analyseren met behulp van paringstests. De functie van het gen wordt verder onderzocht tot een specifiek gebied van zijn sequentie met behulp van deletie- of puntmutaties.

Conjugative Mating Testen voor sequentie-specifieke analyse van Transfer eiwitten die betrokken zijn in bacterieconjugatie

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Het algemene doel van deze kweekmethode is om de effecten van mutaties binnen het conjugatieve overdrachtsgen te beoordelen op zijn vermogen om plasmide-overdracht te beïnvloeden in de context van een functioneel type vier secretiecomplex. Deze methode maakt het mogelijk om specifieke vragen over eiwitten te stellen, zoals het identificeren van gebieden van eiwit-eiwitinteracties die optreden tussen overdrachtseiwitten terwijl ze een functioneel type vier secretiesysteem assembleren in bacteriële conjugatie. Bij deze techniek worden genen op grote conjugatieve plasmiden uitgeschakeld door homologe recombinatie.De genfunctie wordt beoordeeld door het doelgen aan de knock-outs op een kleiner plasmide te verstrekken. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat organisatie en set-up cruciaal zijn om deze procedure met succes uit te voeren. Goede experimentele voorbereiding is noodzakelijk om interpreteerbare resultaten te verkrijgen.Begin dit protocol met de voorbereiding van het verteerde pBAD33 plasmide zoals beschreven in het tekstprotocol. Voer elke vertering uit op een agarosegel. Gebruik een UV-kast en een steriele scheermes om de 2,8 kilobaseband die overeenkomt met de cath-sequentie uit de gel te snijden.Werk snel om de UV-blootstelling van het DNA te minimaliseren. Extraheer het DNA uit de uitgesneden gelplak met behulp van een gel-extractiekit volgens het protocol van de fabrikant. Om het geëxtraheerde cat-cassette te versterken door polymerasekettingreactie of PCR.Bereid het reactiemengsel voor in een steriele PCR-buis. Gebruik primers die overhangen bevatten die homoloog zijn aan de doelgensequentie voor homologe recombinatie. Stel een negatieve controle op die dezelfde componenten bevat, behalve vervang het sjabloon-DNA door dubbel gedestilleerd water.Stel ook een positieve controle op met sjabloon-DNA en primers waarvan bewezen is dat ze werken in een PCR-reactie. Meng alle reactie-inhoud voorzichtig door pipetteren. Vervolgens, versterk het geëxtraheerde cat-cassette met behulp van de PCR-parameters die in het tekstprotocol zijn vermeld.Gebruik slechts vijf microliters van elke reactie om de juiste amplificatiegrootte te bevestigen via agarosegelelektroforese. Zuiver de PCR-amplicon met behulp van een PCR-zuiveringskit met het protocol van de fabrikant. Voeg 300 nanogram van de versterkte cat-cassette toe aan 50 microliter elektrocompetente DY330R-cellen, die het pOX38-Tc-plasmide bevatten, op ijs.Pipet voorzichtig op en neer om te mengen. Herhaal deze stap met ongewijzigde pBAD33-plasmide als positieve controle. Breng vervolgens de cellen over naar een voorgekoelde elektroporatiecuvet van één millimeter.Elektroporatieer de cellen bij 1,8 kilovolt met een tijdconstante van 5,5 milliseconden met behulp van een elektroporation. Direct na het toepassen van de puls, verdun de cellen met één milliliter SOC-medium en breng ze over naar een verse microfugebuis. Incubeer de cellen gedurende twee uur bij 32 graden Celsius.Breng vervolgens 100 microliter van elk monster aan op agarplaten die 10 microgram per milliliter tetracycline en 20 microgram per milliliter chlooramfenicol bevatten. Verspreid de aliquot over de plaat met behulp van een steriele verspreider. Incubeer de plaat ondersteboven bij 32 graden Celsius voor een nacht.Selecteer de volgende dag voor de succesvolle recombinanten. Het cat-cassette dat in de cel is geïntroduceerd, zal een homologe recombinatie ondergaan met het gen van belang en de pOX38-Tc chlooramfenicol knock-outklonering creëren. Scheid de elektroporeer 300 nanogram van pK184 gen of pK184 genmutante plasmide in 50 microliter elektrocompetente DY330R-cellen die het pOX38-Tc chlooramfenicol knock-outplasmide bevatten zoals eerder beschreven.Voer om de XK1200 donorcellen te genereren een conjugatieve paring uit gevolgd door elektroporatie om XK1200 cellen te genereren die zowel de chlooramfenicol knock-out als het PK184-plasmide bevatten, zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid een overnachtcultuur van deze XK1200 donorcellen in 20 milliliter steriele LB met chlooramfenicol en kanamycine. Bereid ook MC4100-receptorcellen in 50 milliliter LB met 50 microgram per milliliter streptomycine voor met behulp van cellen uit een glycerolstock of uit een enkele kolonie op een agarplaat.Laat de culturen groeien bij 37 graden Celsius, schudden bij 200 rpm. Voeg glucose toe tot een eindconcentratie van 100 millimolar aan alle donorcellen. De volgende dag, maak 1 in 70 verdunningen van elke overnachtcultuur afzonderlijk in twee milliliter steriele LB met dezelfde antibiotica.Laat de cellen groeien tot de middenlog fase bij 37 graden Celsius, schudden bij 200 rpm. Centrifugeer de cellencultuur om de cellen te pellen en gooi het supernatant weg. Was vervolgens de celpellet eenmaal met koud steriele LB om de antibiotica te verwijderen.Nadat we een tweede keer hebben gecentrifugeerd, zoals eerder, suspenderen we de cellen in twee milliliter koud steriele LB. Aliquoteer in duplicaat 100 microliter donorcellen en 100 microliter receptorcellen in 800 microliter steriele LB-media voor een totaal volume van één milliliter. Laat de cellen een uur bij 37 graden Celsius paren zonder te schudden. Na een uur, vortex de cellen gedurende 30 seconden om de paringsparen te verstoren.Plaats vervolgens de cellen gedurende 10 minuten op ijs om verdere paring te voorkomen. Bereid met behulp van de middenlog-culturen en verse steriele LB zes seriële verdunningen van de donor- en receptorcellen van 1 en 100 tot 1 en 10 miljoen. Plaats op elke helft van een agarplaat met naladixinezuur, chlooramfenicol en kanamycine 10 microliter aliquots van elke verdunning van XK1200 donorcellen.Herhaal het spotten voor de verdunningen van de MC4100-receptorcellen op agarplaten die streptomycine bevatten. Bereid vervolgens zes verdunningen van de transconjuganten met behulp van het vortexmengsel en verse s

conjugative-mating-assays-for-sequence-specific-analysis-transfer

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Een snelle en efficiënte methode om vreemd DNA van belang te integreren in pre-en-klare acceptor stammen, aangeduid als landingsplaats stammen, beschreven. De methode maakt het mogelijk site-specifieke integratie van een DNA-cassette in de gemanipuleerde landingsplaats locus van een bepaalde stam, door middel van conjugatie en de expressie van de ΦC31 integrase.

Site-specifieke bacteriële chromosoom Engineering: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Source: Erdogan, F.,et al., Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the procedure for transferring an F plasmid from donor to recipient E. coli cells using a rescue plasmid and selecting transconjugants through dual antibiotic resistance. The process includes mixing bacterial cultures, incubation without shaking, disrupting mating pairs, and plating on selective media to confirm...

F Plasmid Transfer and Dual Antibiotic Selection in E. coli

We beschrijven hier drie verschillende protocollen voor de in vitro onderzoek conjugatie, transductie en natuurlijke transformatie in Staphylococcus aureus.

Methodologie voor de studie van horizontale genoverdracht in<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Met een doel te begrijpen van het gedrag van verschillende bacteriële conjugative DNA elementen onder verschillende omstandigheden, beschrijven we een protocol voor de detectie van verschillen in de frequentie van de conjugatie, met een hoge resolutie te schatten hoe efficiënt de donor-bacterie met deze opdracht start Woordherkomst en-opbouw.

Hoge resolutie vergelijking van bacteriële vervoeging frequenties

Hier presenteren we een protocol met een beschrijving van hoe ik) een zelfreplicerende vector met behulp van de cyanogate modulaire kloon Toolkit, II), introduceren de vector in een cyanobacterial gastheer door conjugatie, en III) karakteriseren transgene cyanobacteriën stammen met behulp van een plaat lezer of flow cytometrie.

Genetische modificatie van cyanobacteriën door conjugatie met behulp van de CyanoGate modulaire kloon Toolkit

We beschrijven een methode om verzadigende transposon mutantbibliotheken te genereren in gramnegatieve bacteriën en de daaropvolgende voorbereiding van DNA-ampliconbibliotheken voor hoge doorvoersequenties. Als voorbeeld richten we ons op de ESKAPE-ziekteverwekker, Acinetobacter baumannii,maar dit protocol is vatbaar voor een breed scala aan gramnegatieve organismen.

Transposon Insertion Libraries genereren in gram-negatieve bacteriën voor high-throughput sequencing

Hier beschrijven we de constructie van nulmutanten van Aeromonas in specifieke glycosyltransferasen of regio's die glycosyltransferasen bevatten, de beweeglijkheidstests en flagellenzuivering die worden uitgevoerd om de betrokkenheid en functie van hun gecodeerde enzymen in de biosynthese van een glycaan vast te stellen, evenals de rol van deze glycaan in bacteriële pathogenese.

Generatie van null-mutanten om de rol van bacteriële glycosyltransferasen in bacteriële motiliteit op te helderen

Conjugatie bemiddelt horizontale genoverdracht door plasmide-DNA over twee verschillende cellen te mobiliseren, waardoor de verspreiding van nuttige genen wordt vergemakkelijkt. Dit werk beschrijft een veelgebruikte methode voor de efficiënte detectie van conjugatieve plasmideoverdracht, gebaseerd op het gebruik van differentiële markers in het conjugatieve plasmide, donor en ontvanger om transconjugatie te detecteren.

Detectie van horizontale genoverdracht gemedieerd door natuurlijke conjugatieve plasmiden in E. coli

In dit manuscript beschrijven we een protocol om transcriptie en de remmende activiteit van antibacteriële middelen die zich richten op bacteriële transcriptie functioneel te onderzoeken.

In vitro transcriptie Testen en hun toepassing in Drug Discovery

Hier presenteren we een protocol dat de middelmatige tot hoge doorvoer functionele karakterisering van gen- en promotorconstructies in secundair stamweefsel van bomen binnen relatief korte tijdsbestek mogelijk maakt. Het is efficiënt, gemakkelijk te gebruiken en breed toepasbaar op een reeks boomsoorten.

Het gebruik van Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) voor het bestuderen van genen en Promoters Betrokken bij Wood Vorming en secundaire Stem Development

Leer hoe je een gen uitschakelt in plasmideconjugatie en de effecten analyseert via koppelingsproeven. Deze methode helpt microbiologen eiwit-eiwitinteracties in bacteriële type vier secretiesystemen bestuderen.

Conjugative Mating Testen voor sequentie-specifieke analyse van Transfer eiwitten die betrokken zijn in bacterieconjugatie

Meer video's verkennen