Conjugative Mating Testen voor sequentie-specifieke analyse van Transfer eiwitten die betrokken zijn in bacterieconjugatie

Het algemene doel van deze kweekmethode is om de effecten van mutaties binnen het conjugatieve overdrachtsgen te beoordelen op zijn vermogen om plasmide-overdracht te beïnvloeden in de context van een functioneel type vier secretiecomplex. Deze methode maakt het mogelijk om specifieke vragen over eiwitten te stellen, zoals het identificeren van gebieden van eiwit-eiwitinteracties die optreden tussen overdrachtseiwitten terwijl ze een functioneel type vier secretiesysteem assembleren in bacteriële conjugatie. Bij deze techniek worden genen op grote conjugatieve plasmiden uitgeschakeld door homologe recombinatie.

De genfunctie wordt beoordeeld door het doelgen aan de knock-outs op een kleiner plasmide te verstrekken. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat organisatie en set-up cruciaal zijn om deze procedure met succes uit te voeren. Goede experimentele voorbereiding is noodzakelijk om interpreteerbare resultaten te verkrijgen.

Begin dit protocol met de voorbereiding van het verteerde pBAD33 plasmide zoals beschreven in het tekstprotocol. Voer elke vertering uit op een agarosegel. Gebruik een UV-kast en een steriele scheermes om de 2,8 kilobaseband die overeenkomt met de cath-sequentie uit de gel te snijden.

Werk snel om de UV-blootstelling van het DNA te minimaliseren. Extraheer het DNA uit de uitgesneden gelplak met behulp van een gel-extractiekit volgens het protocol van de fabrikant. Om het geëxtraheerde cat-cassette te versterken door polymerasekettingreactie of PCR.

Bereid het reactiemengsel voor in een steriele PCR-buis. Gebruik primers die overhangen bevatten die homoloog zijn aan de doelgensequentie voor homologe recombinatie. Stel een negatieve controle op die dezelfde componenten bevat, behalve vervang het sjabloon-DNA door dubbel gedestilleerd water.

Stel ook een positieve controle op met sjabloon-DNA en primers waarvan bewezen is dat ze werken in een PCR-reactie. Meng alle reactie-inhoud voorzichtig door pipetteren. Vervolgens, versterk het geëxtraheerde cat-cassette met behulp van de PCR-parameters die in het tekstprotocol zijn vermeld.

Gebruik slechts vijf microliters van elke reactie om de juiste amplificatiegrootte te bevestigen via agarosegelelektroforese. Zuiver de PCR-amplicon met behulp van een PCR-zuiveringskit met het protocol van de fabrikant. Voeg 300 nanogram van de versterkte cat-cassette toe aan 50 microliter elektrocompetente DY330R-cellen, die het pOX38-Tc-plasmide bevatten, op ijs.

Pipet voorzichtig op en neer om te mengen. Herhaal deze stap met ongewijzigde pBAD33-plasmide als positieve controle. Breng vervolgens de cellen over naar een voorgekoelde elektroporatiecuvet van één millimeter.

Elektroporatieer de cellen bij 1,8 kilovolt met een tijdconstante van 5,5 milliseconden met behulp van een elektroporation. Direct na het toepassen van de puls, verdun de cellen met één milliliter SOC-medium en breng ze over naar een verse microfugebuis. Incubeer de cellen gedurende twee uur bij 32 graden Celsius.

Breng vervolgens 100 microliter van elk monster aan op agarplaten die 10 microgram per milliliter tetracycline en 20 microgram per milliliter chlooramfenicol bevatten. Verspreid de aliquot over de plaat met behulp van een steriele verspreider. Incubeer de plaat ondersteboven bij 32 graden Celsius voor een nacht.

Selecteer de volgende dag voor de succesvolle recombinanten. Het cat-cassette dat in de cel is geïntroduceerd, zal een homologe recombinatie ondergaan met het gen van belang en de pOX38-Tc chlooramfenicol knock-outklonering creëren. Scheid de elektroporeer 300 nanogram van pK184 gen of pK184 genmutante plasmide in 50 microliter elektrocompetente DY330R-cellen die het pOX38-Tc chlooramfenicol knock-outplasmide bevatten zoals eerder beschreven.

Voer om de XK1200 donorcellen te genereren een conjugatieve paring uit gevolgd door elektroporatie om XK1200 cellen te genereren die zowel de chlooramfenicol knock-out als het PK184-plasmide bevatten, zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid een overnachtcultuur van deze XK1200 donorcellen in 20 milliliter steriele LB met chlooramfenicol en kanamycine. Bereid ook MC4100-receptorcellen in 50 milliliter LB met 50 microgram per milliliter streptomycine voor met behulp van cellen uit een glycerolstock of uit een enkele kolonie op een agarplaat.

Laat de culturen groeien bij 37 graden Celsius, schudden bij 200 rpm. Voeg glucose toe tot een eindconcentratie van 100 millimolar aan alle donorcellen. De volgende dag, maak 1 in 70 verdunningen van elke overnachtcultuur afzonderlijk in twee milliliter steriele LB met dezelfde antibiotica.

Laat de cellen groeien tot de middenlog fase bij 37 graden Celsius, schudden bij 200 rpm. Centrifugeer de cellencultuur om de cellen te pellen en gooi het supernatant weg. Was vervolgens de celpellet eenmaal met koud steriele LB om de antibiotica te verwijderen.

Nadat we een tweede keer hebben gecentrifugeerd, zoals eerder, suspenderen we de cellen in twee milliliter koud steriele LB. Aliquoteer in duplicaat 100 microliter donorcellen en 100 microliter receptorcellen in 800 microliter steriele LB-media voor een totaal volume van één milliliter. Laat de cellen een uur bij 37 graden Celsius paren zonder te schudden. Na een uur, vortex de cellen gedurende 30 seconden om de paringsparen te verstoren.

Plaats vervolgens de cellen gedurende 10 minuten op ijs om verdere paring te voorkomen. Bereid met behulp van de middenlog-culturen en verse steriele LB zes seriële verdunningen van de donor- en receptorcellen van 1 en 100 tot 1 en 10 miljoen. Plaats op elke helft van een agarplaat met naladixinezuur, chlooramfenicol en kanamycine 10 microliter aliquots van elke verdunning van XK1200 donorcellen.

Herhaal het spotten voor de verdunningen van de MC4100-receptorcellen op agarplaten die streptomycine bevatten. Bereid vervolgens zes verdunningen van de transconjuganten met behulp van het vortexmengsel en verse s