Eencellige genexpressie met behulp van Multiplex RT-qPCR heterogeniteit van Rare lymfoïde populaties karakteriseren
January 19th, 2017
Dit protocol beschrijft hoe de expressie van een groot scala van genen op het klonale niveau te beoordelen. Single-cell RT-qPCR levert zeer betrouwbare resultaten met een sterke gevoeligheid voor honderden monsters en genen.
Het algemene doel van dit experiment is om meerdere genexpressie in enkele cellen te observeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie, zoals heterogeniteit van moleculaire signaturen binnen een celpopulatie, of een zeldzame moleculaire signatuur. Het grote voordeel van deze techniek is dat specifieke moleculaire signaturen met minimaal 48 verschillende genen in veel cellen tegelijkertijd kunnen worden beoordeeld.
Begin deze procedure door een voorversterkingsmix voor 48 reacties in een buis van 1,5 milliliter voor te bereiden. Voeg aan de buis 240 microliter specifieke retrotranscriptiebuffer, 62,4 microliter lage EDTA TE-buffer en 9,6 microliter Taq DNA-polymerase toe. Verdeel met behulp van een elektronische pipet 6,5 microliter van de voorversterkingsmix over elk van de 48 putjes in een 96-putjesplaat voor één cel.
Bereid vervolgens een 0,2x assaymix in een buis van 1,5 milliliter. Voeg aan de buis 1,4 microliter van elke primer toe. Breng het eindvolume aan op 140 microliter met lage EDTA TE-buffer.
Verdeel met behulp van een elektronische pipet 2,5 microliter van de 0,2x assaymix over de 48 putjes in de 96-putjesplaat voor één celsortering, die de voorversterkingsmix bevat. Verzegeld de plaat met een afdekfolie. Vorm de plaat en draai hem een minuut lang met 280 g.
Enkele hepatische intrinsieke lymfoïde cellen, of ILC's, worden gesorteerd door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering. Begin deze procedure door een lege 96-putjesplaat als test te gebruiken. Plaats de testplaat op de plaathouder met de één-put op de linkerkant en richting de experimentator.
Stel de plaathouder zo in dat er een druppel in het midden van de één-put komt met verificatiebeads. Wanneer goed afgesteld, plaats de 96-putjesplaat voor één celsortering met de assaymix en de voorversterking op de plaathouder. Teken het plaatlay-out en sorteer één cel per putje van de gated populatie.
De juiste positionering van elke cel op de 96-putjesplaat voor één celsortering is essentieel, en een plaatlay-out moet worden bewaard op een spreadsheetsoftware. Laat één putje met 0,2x assaymix en voorversterkingsmix zonder cellen, als een controle zonder invoer. Optioneel, laat twee rijen van zes putjes voor cDNA-verdunning als controles voor primerefficiëntie.
Onmiddellijk na de celsortering, vorm en draai de 96-putjesplaat voor één celsortering. Plaats de plaat in de thermocycler. Voer omgekeerde transcriptie en voorversterking uit zoals aangegeven.
Voorversterking van specifieke doelgenen op gesorteerd één cel is vereist om voldoende materiaal te hebben. Verdun de voorversterkte monsters door 36 microliter lage EDTA TE-buffer toe te voegen in elk putje. Om deze procedure te starten, bereid 191 microliter van een Master Mix door 175 microliter van een qPCR Master Mix en 17,5 microliter van het monsterladingsreagens in een buis van 1,5 milliliter te pipetten.
Verdeel op een nieuwe 96-putjesplaat 3,6 microliter van de Master Mix over elk van de 48 putjes. Dit is de 96-putjes monsterplaat. Breng 2,9 microliter voorversterkte cDNA over van de 96-putjesplaat voor één celsortering naar de nieuwe 96-putjes monsterplaat, en behoud dezelfde positie voor elk monster tussen de twee platen.
Bereid een 96-putjes assayplaat voor door drie microliter van het assayladingsreagens over elk van de 48 putjes op een nieuwe 96-putjesplaat te verdelen. Voeg drie microliter primers toe aan elk putje. De juiste positionering van elke primer in de 96-putjes assayplaat is essentieel.
Bewaar een plaatlay-out op een spreadsheetsoftware. Om deze procedure te starten, plaats de geïntegreerde microfluïdische circuit, of IFC, op de werktafel, en controleer de kleppen met een spuit. Verwijder het dopje van de spuit, plaats deze loodrecht op één klep, en druk stevig.
De O-ring zou moeten bewegen. Vul de chip met controlevloeistof. Nadat u de vorige stappen met de tweede klep herhaalt, verwijdert u de zwarte folie van de onderkant van de chip.
Laad de chip in de IFC-controller. Selecteer op het IFC-controllerscherm prime en vervolgens run. Vervolgens werpt u de chip uit en verzegelt u de zwarte folie op de onderkant van de chip opnieuw.
Gebruik een achtkanaals pipet om vijf microliter van de 96-putjes assayplaat over te brengen naar de één, of de linkerkant, van de chip. Verwissel de punten voor elk putje van de chip. Vermijd het maken van luchtbellen, en als er luchtbellen verschijnen, gebruik dan 10 microliter punten om ze te verwijderen.
Vul de linkerkant van de chip zoals aangegeven. Vul op dezelfde manier de rechterkant van de chip met vijf microliter van de 96-putjes monsterplaat. Voor het succes van dit experiment is het essentieel dat de IFC-chip goed gevuld is voor een juiste lading in de IFC-controller.
Verwijder de blauwe folie van de onderkant van de chip, en laad de chip in de IFC-controller. Selecteer op het IFC-controllerscherm load mix en vervolgens run. Wanneer voltooid, werpt u de chip uit en verzegelt u de blauwe folie op de onderkant van de chip opnieuw.
Om de chip te laten lopen, selecteert u eerst de dataverzamelsoftware op de microfluïdische qPCR-computer. Zodra het start, selecteert u new run. Selecteer eject en laad de chip.
Na het instellen van de software zoals beschreven in het tekstprotocol, selecteert u start run. De reactie duurt ongeveer 90 minuten. Om met de gegevensanalyse te beginnen, opent u de realtime PCR-analysesoftware, selecteert u file en opent u, vindt u de experimentmap en selecteert u chip run dot b m one-bestand.
Klik op analysis view, results table en heat map view. Vakken gemarkeerd met een x zijn onder de drempeldetectieniveau, en/of hadden slechte versterkingscurven. Noem de monsters.
Ga naar sample setup en selecteer new SBS 96. Klik op mapping en selecteer het monsterlay-out volgens het 96-putjes monsterplaatlay-out. Kopieer en plak het monsterlay-outontwerp van de spreadsheetsoftware.
Definieer het geplakte lay-out als monsternaam.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om genexpressie op klonaal niveau te beoordelen met behulp van single-cell RT-qPCR. Deze techniek maakt het mogelijk om meerdere genexpressies gelijktijdig te evalueren en biedt inzicht in cellulaire heterogeniteit.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Genexpressie
- Single-Cell Analyse
Achtergrond
- Het begrijpen van genexpressie op single-cell niveau is cruciaal voor het bestuderen van cellulaire diversiteit.
- Deze methode kan zeldzame moleculaire signaturen binnen celpopulaties identificeren.
- Single-cell RT-qPCR biedt hoge gevoeligheid en betrouwbaarheid.
- Het maakt de beoordeling van minimaal 48 verschillende genen in veel cellen mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om genexpressie in individuele cellen te observeren.
- Om de heterogeniteit van moleculaire signaturen te onderzoeken.
- Om zeldzame moleculaire signaturen in celpopulaties te identificeren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een pre-amplificatie mix voor 48 reacties.
- Gebruik van specifiek retrotranscriptiebuffer en Taq DNA polymerase.
- Distributie van de pre-amplificatie mix in een 96-well plate.
- Toepassing van single-cell RT-qPCR voor genexpressieanalyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beoordeling van genexpressie in meerdere enkele cellen.
- Identificatie van heterogeniteit in moleculaire signaturen.
- Demonstratie van de gevoeligheid en betrouwbaarheid van de methode.
- Mogelijkheid om een groot aantal genen gelijktijdig te analyseren.
Conclusies
- Dit protocol biedt een robuuste methode voor single-cell genexpressieanalyse.
- Het verbetert het begrip van cellulaire diversiteit en moleculaire signaturen.
- De techniek is toepasbaar in verschillende gebieden, inclusief immunologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Single-cell multiplex RT-qPCR enables high-resolution characterization of gene expression heterogeneity in rare lymphoid populations, addressing a critical challenge in immunology and early drug discovery. By resolving cellular diversity at the clonal level, this approach enhances predictive confidence in target validation and supports risk-adjusted portfolio decisions. Its ability to profile dozens of genes per cell streamlines discovery-stage triage and informs translational research strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of molecular heterogeneity within rare immune cell populations.
- Supports functional target validation by distinguishing precursor stages and response diversity.
- Facilitates mechanistic de-risking through clonal-level gene expression profiling.
- Improves predictive confidence for target selection and prioritization.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell systems for downstream multiplexed gene expression workflows.
- Delivers quantitative, reproducible outputs across dozens of genes per cell.
- Enables scalable, cost-effective screening of rare populations and multiple conditions.
- Supports robust assay standardization and platform reuse for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression signatures with disease-relevant immune cell subsets.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of immune targets.
- Enables identification of translational biomarkers within heterogeneous populations.
- Reduces biological risk by clarifying cellular response diversity.
Pipeline & Workflow Integration
This single-cell multiplex RT-qPCR method integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, particularly for immune cell targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving gene expression at the single-cell level.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative gene expression data for assay readiness and condition comparison.
- Analytics: Provides heat map and statistical outputs to compare gene signatures across cell subsets.
- Translational Research: Connects cellular heterogeneity insights to biomarker discovery and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for rare population analysis across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune target validation.
- Operational Value: Standardizes single-cell workflows and enables high-throughput, cost-effective analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying cellular heterogeneity early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immune-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell sorting, microfluidics, and multiplex qPCR analysis.
- Demands access to fluorescence-activated cell sorting and microfluidic qPCR instrumentation.
- Necessitates rigorous plate layout tracking and cross-team standardization for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different rare cell types or developmental stages.
- Careful control setup and data analysis are essential to avoid misinterpretation of heterogeneity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Preparing a 96-well Single-cell Sorting Plate
1:55
Single-cell Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS)
3:02
Pre-amplification
3:38
Preparing a 96-well Sample Plate
4:23
Preparing a 96-well Assay Plate
4:51
Preparing and Running the Single-cell Gene-expression Chip
6:52
Data Analysis
8:04
Results: Single-cell Multiplex RT-qPCR Identifies Cell Heterogeneity of the Liver ILC Compartment
9:33
Conclusion
