Name: Online Grootte-uitsluiting en ionenuitwisselingschromatografie op een SAX Beamline (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Leer online SEC en IEC implementeren op een SAXS beamline voor structurele biologie. Deze methode minimaliseert vertragingen tussen monsterbereiding en meting, waardoor eiwitdenaturatie wordt voorkomen en datakwaliteit verbetert.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We erkennen financiële steun voor het project van de Franse subsidie REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 en door onderzoekssubsidies van de Service de Santé des Armées en de Délégation Générale pour l'Armement. We zijn de ESRF dankbaar voor de SAXS-beamtijd. We danken Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister en Guy Schoehn voor financiële en wetenschappelijke ondersteuning.

<ol><li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+%28SAXS+and+WAXS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li>
<li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li>
<li>Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+small+angle+X-ray+scattering+%28SAXS%29+of+flexible+and+intrinsically+disordered+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins.</a> FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).</li>
<li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+solution+scattering+%28SAXS%29+combined+with+crystallography+and+computation%3A+defining+accurate+macromolecular+structures%2C+conformations+and+assemblies+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).</li>
<li>Vestergaard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+biostructural+changes%2C+dynamics%2C+and+interactions+-+Small-angle+X-ray+scattering+to+the+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue.</a> Arch. Biochem. Biophys. , (2016).</li>
<li>David, G., Pérez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography%3A+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).</li>
<li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Pipeline+for+Purification%2C+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Lambright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+techniques+enhance+the+quality+and+scope+of+information+obtained+from+SAXS%5BTitle%5D)+AND+%22ACA+Trans%22%5BJournal%5D)">Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS.</a> ACA Trans. , 1-12 (2013).</li>
<li>Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid-chromatography-coupled+SAXS+for+accurate+sizing+of+aggregating+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Synchrotron+Radiat%22%5BJournal%5D)">Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins.</a> J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).</li>
<li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+GH3.+12+protein+conformation+through+HPLC-integrated+SAXS+measurements+combined+with+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).</li>
<li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).</li>
<li>Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+ion-exchange+chromatography+for+small+angle+X-ray+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst%22%5BJournal%5D)">Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering.</a> Acta Cryst. , (2016).</li>
<li>Selkirk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Purification+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ion-exchange chromatography.</a> Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).</li>
<li>Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+exchange+chromatography+of+proteins+and+clearance+of+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).</li>
<li>Pernot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upgraded+ESRF+BM29+beamline+for+SAXS+on+macromolecules+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Synchrotron+Radiat%22%5BJournal%5D)">Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution.</a> J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).</li>
<li>Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+evolution+of+the+archaeo-eukaryotic+primase+superfamily+and+related+palm-domain+proteins%3A+structural+insights+and+new+members%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).</li>
<li>Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+helicases+and+nucleic+acid+translocases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).</li>
<li>Hutin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+vaccinia+virus+helicase-primase+D5%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5.</a> J. Virol. , 4604-4613 (2016).</li>
<li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioSAXS+Sample+Changer%3A+a+robotic+sample+changer+for+rapid+and+reliable+high-throughput+X-ray+solution+scattering+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).</li>
<li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISPyB+for+BioSAXS%2C+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).</li>
<li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline%2C+BM29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).</li>
<li>Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATSAS+2.1-towards+automated+and+web-supported+small-angle+scattering+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).</li>
<li>Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+Map%2C+a+goodness-of-fit+test+for+one-dimensional+X-ray+scattering+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra.</a> Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).</li>
<li>Schrodinger, LLC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+PyMOL+Molecular+Graphics+System%2C+Version+1.8%22">The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8</a>. , (2015).</li>
<li>Jensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+SAXS+measurements+facilitated+by+online+HPLC+buffer+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Synchrotron+Radiat%22%5BJournal%5D)">Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange.</a> J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).</li>
<li>Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+ultracentrifugation+coupled+to+small-angle+X-ray+scattering+on+macromolecular+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes.</a> J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Voor veel macromoleculen, wordt een laatste zuiveringsstap met behulp van chromatografie vereist voor SAX het verzamelen van gegevens om een ​​goede kwaliteit dataset te verkrijgen. Echter, niet alle monsters stabiel; zij kunnen gevoelig zijn voor aggregatie of opnieuw evenwicht zijn om een ​​mengsel van oligomerisatie staten. Daarom is een laatste keer zuiveringsstap de bundellijn nodig is om de tijd tussen zuivering en gegevensverzameling minimaliseren om de beste kwaliteit SAXS gegevens. Afhankelijk van de biofysische eigenschappen van het eiwit van belang kunnen SEC-SAXS of IEC-SAX worden gekozen om een ​​optimale kwaliteit van het monster te verkrijgen. Hier, op een eiwit construct afgeleid van de helicase / primase D5, beide technieken zijn toegelicht en besproken. Overname van SEC-SAX data wordt steeds meer en meer gestandaardiseerd en is beschikbaar op veel BioSAXS beamlines. Gegevensanalyse name achtergrond aftrek, is relatief eenvoudig en gemakkelijk. Echter, een stabiele buffer signaalen de voldoende scheiding van de macromoleculaire soorten blijft essentieel. Daarom is het essentieel dat voldoende tijd voor de kolom grondig equilibreren reserveren. Falen van deze werkwijze kan het gevolg afbreekbare verontreinigingen van overeenkomstige grootte als het eiwit van belang, lage concentraties en stralingsgevoelige buffers. In de praktijk aanvankelijk SEC-SAXS waarschijnlijk wordt gebruikt als de methode van keuze voor de meeste macromoleculaire monsters. Nog veel zuiveringsprotocollen een voorafgaande IEC-stap door de aanwezigheid van verontreinigingen of aggregatie. Aangezien elke concentratie en chromatografie stap gaat gepaard met verlies van monster (geschat op 30-50%) en de tijd direct IEC-SAXS gunstig. Voor monsters die niet kunnen worden gezuiverd door SEC, hetzij door de aanwezigheid van vergelijkbare grootte &quot;contaminanten&quot; of omdat ze sterk geaggregeerde onder voldoende concentraties IEC-SAXS zou altijd beter geschikt benadering. Verder ondersteund de hogere stroomsnelhedendoor vele IEC kolommen kunnen helpen de transittijd tussen zuivering en meting verminderen. In het hier gepresenteerde voorbeeld, werd gebruikt met een IEC stap elutie, waardoor de scheiding van de nauwe toppen van D5 323-785 van verontreinigingen door het zorgvuldig kiezen van de zoutconcentratie stappen. In principe is het aantal stappen is onbeperkt, maar praktisch wordt ten minste 1 stap per piek vereist, en niet te veel moet worden gekozen. Voor de achtergrond aftrek hierboven beschreven, is het cruciaal om een ​​relatief groot aantal verschillende buffersamenstellingen meten om de overeenkomende vinden. Een gemeenschappelijk nadeel van beide technieken is een onnauwkeurige eiwitconcentratie informatie. Als gevolg van deze nauwkeurige bepaling van de massa op basis van forward verstrooiing is niet mogelijk. Voor bolvormige eiwitten zoals D5 323-785, de Porod volume biedt een alternatief, zij het minder nauwkeurige, massa schatting, maar voor zeer flexibel of ontvouwen eiwittenDeze aanpak zou niet geldig zijn. Een variatie van de stapsgewijze gradiënt IEC-SAX hier gepresenteerde methode is het gebruik van een lineaire gradiënt plaats. Hoewel het mogelijk is met zoveel stappen werken als gewenst sub-pieken te isoleren onder toepassing van een stapsgewijze elutie met lineaire gradiënt benadering, is het vereist om de gradiëntvoorwaarden zorgvuldig optimaliseren om de pieken te scheiden volledig alvorens de SAXS experiment. Achtergrond aftrekken in deze benadering kan worden gedaan frame wijs en kan worden gecontroleerd door de vergelijking van de afzonderlijke frames, maar het vereist meer geavanceerde verwerking van gegevens, en een speciale software bestaat nog niet. De keuze van een geschikte kolom essentieel is voor beide technieken, zoals de scheiding van de macromoleculaire species bepaalt. Size-exclusiekolommen verschillen laadvermogen, het groottebereik scheidbare macromoleculen en resolutie, terwijl ionenuitwisselingskolommen verschillen in de aard en de dichtheidhun geïmmobiliseerd kosten. Terwijl de hier gepresenteerde protocol beschrijft het ESRF bundellijn BM29, aanpassing aan andere SAXS bundellijn is in principe eenvoudig. De belangrijkste eisen zijn een voldoende hoge röntgenstralen flux en een geschikte detector (idealiter enkel-foton-counting), redelijke signaal-geluidsgegevens te verkrijgen in het traject van seconden of minder, en een online Vloeistofchromatografiesysteem staat het creëren hellingen. De precieze uitvoering zal uiteraard afhangen van de lokale omgeving bundellijn. De verkregen op D5 323-785 met behulp van de twee methoden resultaten verschillen enigszins. De gyrostraal iets kleiner voor de IEC gegevens dan de SEC data en de lokale minima van de verstrooiing curve verschoven iets grotere verstrooiing vectoren. Dit betekent dat de D5 323-785 gemeten IEC-SAX iets compacter dan D5 323-785 gemeten met SEC-SAXS. Dit kan be gevolg van verschillen in de monsterbereiding, de tijd tussen zuivering en meting (IEC sneller), of, minder vaak, een verontreiniging in de SEC-gezuiverde monster. De kraal modellen verkregen volledig zelfstandig met beide methoden vergelijkbaar (Figuur 1H). D5 323-785 toont de verwachte holle, hexamere structuur 18. Concluderend online ionenuitwisseling en online size-exclusiechromatografie belangrijke biochemische zuiveringswerkwijzen die direct SAX 6,7,9-12,25,26 kunnen worden gekoppeld. De achtergrond aftrek van IEC-SAX data is iets moeilijker en dubbelzinnige dan SEC-SAXS, maar is het toch mogelijk. Afhankelijk van de biofysische eigenschappen van het eiwit van belang, zowel SEC en IEC-SAXS oog op het optimaliseren van soorten scheiding met inherente voordelen. Mits de validatiestappen (zoals beschreven) correct worden waargenomen, kan de verkregen data te analyseren with vertrouwen en modellen kan worden bepaald met behulp van de standaard beschikbare instrumenten binnen de gemeenschap. Samen, beide technieken mogelijk online scheiding voor een breed scala van biologische macromoleculen, waardoor gegevens niet toegankelijk zijn via standaard statische metingen.

BioSAXS is een krachtig hulpmiddel om de vorm van nano-sized objecten 1-4 te bepalen. De verstrooiing van röntgenstraling door een oplossing met macromoleculen, grootte in het nm wordt opgenomen bij zeer lage hoeken. Dit hoekbereik bevat informatie over globale parameters: de straal van winding; de grootste intraparticle afstand; het deeltje vorm; en de mate van vouwen, denaturatie of aandoening. De techniek is niet vereist kristallen, en het macromolecuul in oplossing blijft en dus in bepaalde omstandigheden nabootsen belangrijke parameters van de cel, zoals ionsterkte, pH, enz. De kennis van deze elementen gehouden kunnen helpen om, bijvoorbeeld, de fysiologisch relevante oligomere toestand van een eiwit van belang of om een ​​voorgestelde model van een complex te valideren. De karakterisering van proteïne-proteïne interacties in verschillende bufferomstandigheden, het creëren van modellen ontbrekende domeinen, de verfijning van homologie modellen en debeëindiging van discrete gevouwen en ontvouwen toestanden kunnen snel en eenvoudig 5 worden uitgevoerd. Zoals met elke techniek, BioSAXS intrinsieke tekortkomingen: geaggregeerde of gedenatureerde monsters, mengsels van deeltjes, heterogene monsters, stralingsschade en buffer mismatches kan leiden tot niet-interpreteerbare gegevens. Voor veel analysemethoden wordt impliciet aangenomen dat het monster monodisperse, een vereiste dat vaak moeilijk te verkrijgen in de praktijk. In veel gevallen, de afbraak van het monster is subtiel en kan niet in de gegevens op zichzelf worden gedetecteerd en elke poging om de gegevens te interpreteren geeft onnauwkeurige of misleidende resultaten. Om deze hindernissen te overwinnen, de combinatie van grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en SAXS werd uitgevoerd op vele bundellijnen datakwaliteit te waarborgen en deze techniek toegankelijker voor steeds moeilijker monsters 6-11 maken. Onlangs hebben we een nieuwe methode voor het repertoire van ontwikkeling online ionenuitwisselingchromatografie (IEC) -gekoppelde SAXS 12. Beide technieken zijn het openen van SAX om een ​​breed scala van biologische deeltjes die vroeger onmogelijk te analyseren. De keuze van de methode om te gebruiken is afhankelijk van de biofysische eigenschappen van de deeltjes van belang. SEC scheidt macromoleculen door hun omvang, waarbij ten minste 10% verschil in schijnbare molecuulmassa nodig voor de scheiding. Fysieke beperkingen van de kolom en fysiologische eigenschappen van de monsters, zoals hydrofobe oppervlakken, flexibiliteit, en het gebrek aan stabiliteit, ook bemoeilijken het verzamelen van gegevens, analyse en interpretatie. Ionenuitwisselingschromatografie, welke moleculen op basis van hun lading te scheiden, dus hun bindingsaffiniteit aan de kolom IEC, kan worden gebruikt in plaats van of naast SEC. De totale lading kan gemakkelijk worden gemanipuleerd door het veranderen van de pH of het variëren van de zoutconcentratie van de buffer, voor een relatief eenvoudige werkwijze voor de gecontroleerde elution van de moleculen van de kolom IEC. Via de lading, de scheiding van soortgelijke en groottes van moleculen die anders moeilijk te scheiden zou kunnen worden routinematig uitgevoerd IEC. Bovendien IEC heeft het voordeel te kunnen gaan met verdunde monsters, zodat men de concentratiestappen, waarbij het potentiële risico van denatureren van het eiwit dragen voorkomen. Helaas, als de ladingsverdeling sterk sample-afhankelijke, IEC vereist optimalisatie met betrekking tot de pH en zoutconcentraties 13,14. Voor veel proteïnen die moeilijk uit te drukken, zuiveren, of beide, slechts geringe hoeveelheden monster beschikbaar te bestuderen. Het is van belang efficiënt en het aantal zuiveringsstappen de verliezen te minimaliseren en derhalve. Daarom is de laatste zuiveringsstap online direct vóór SAXS data acquisitie, teneinde de waarschijnlijkheid van het verzamelen van een goede dataset verhogen. HierPresenteren wij en vergelijk online SEC-SAX en IEC-SAXS. Beide technieken werden uitgevoerd op BioSAXS bundellijn BM29 aan de European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble, Frankrijk 15. Als een test case, gebruikten we de D5N en helicase domein van de vaccinia virus eiwit D5, die vrij moeilijk te analyseren structureel met andere methoden was. De vaccinia virus is een lid van de familie Poxviridae en is 98% identiek aan het variolavirus, de oorzaak van pokken. Met behulp van de vaccinia-systeem, bestuderen we de replicatie machines, met de nadruk hier op de essentiële helicase-primase D5. D5 is een 95-kDa eiwit met een N-terminale archeo-eukaryote primase (AEP) domein 16 gevolgd door een cysteïne clustergebied (res. 240-345) 16. Verder naar de C-terminus heeft een D5N domein (res. 340-460), die altijd geassocieerd met D5-type helicasen, en tenslotte een superfamilie 3 (SF3) helicasedomein (res. 460-785) 17 (Figure 1A). De helicase domein van D5 bouwt een hexamere ringstructuur die nodig is voor sterke binding aan DNA. Dankzij de recente SAX en EM-studies, worden de lage resolutie structuren van de primase en de helicase domeinen nu bekend 18. Hier laten we zien hoe de geïmplementeerde online chromatografie technieken te gebruiken op de BioSAXS bundellijn BM29 bij ESRF om inzicht te krijgen in de structuur van het C-terminale fragment (residu 323-785) van D5.

<table><tbody><tr><td>1,4-dithiothreitol [DTT]</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td></td></tr><tr><td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel</td><td>Biorad</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>F 548</td><td></td></tr><tr><td>acetic acid glacial</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>20104.298</td><td></td></tr><tr><td>Agarose D-5</td><td>Euromedex</td><td>LF45130653</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K</td><td>Millipore Ltd</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Euromedex</td><td>EU0400-D</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagene</td><td>70750-3</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>8122</td><td></td></tr><tr><td>Complete protease inhibitor cocktail&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11231400</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10 DG Desalting column</td><td>Bio-rad</td><td>732-2010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Euromedex</td><td>26-128-6405-C</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Roche</td><td>656313</td><td></td></tr><tr><td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>H0537</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>20252.295</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>AppliChem Panreac</td><td>A1073,0500</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>LB broth Miller</td><td>Fluka Analytical</td><td>L3152</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ICN Biomedicals Inc.</td><td>191421</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>27808.297</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>Fermentas</td><td>ER0571</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21 Star (DE3)&nbsp;</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>C6010-03</td><td></td></tr><tr><td>pProEx HTb vector&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>10711018</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>&nbsp;Eurofins mwg operon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel extraction kit</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kid</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel stain</td><td>Invitrogen life technology</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TEV</td><td></td><td></td><td>home made</td></tr><tr><td>TOP 10</td><td>Invitrogen life technology</td><td>C404003&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td>Uno Q 1R column&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>720 0011</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>MPBiomedicals, LLC</td><td>194834</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beamline control software BsXCuBE</td><td>ESRF</td><td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td><td>local development</td></tr><tr><td>Camserver software</td><td>Dectris</td><td>n.a.</td><td>detector control software</td></tr><tr><td>DAMAVER</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>program om ab initio modellen uit te lijnen&nbsp;</td></tr><tr><td>DAMMIF</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>ab initio model reconstructie programma</td></tr><tr><td>HPLC programma Biologic Duo Flow</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC programma LabSolutions</td><td>Shimadzu</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>ISPyB</td><td>ESRF</td><td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td><td>local development</td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>programma dat de manipulatie met experimentele SAXS uitvoert</td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>DeLano Scientific LLC</td><td>https://www.pymol.org/</td><td>software voor visualisatie</td></tr><tr><td>SUPCOMB</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>programma om 3D structuren te superimposen</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparaten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Duo Flow</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Biofrac Fractiecollector</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC systeem</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labsonic P</td><td>Sartorius Stedim biotech</td><td>BBI8535108</td><td></td></tr></tbody></table>

online grootte-uitsluiting en ionenuitwisselingschromatografie op een sax beamline

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Biologische kleine hoek röntgen verstrooiing (BioSAXS) is een krachtige techniek moleculaire en structurele biologie gebruikt oplossingsstructuur, grootte en vorm deeltjesgrootte en oppervlak-tot-volumeverhouding van macromoleculen te bepalen. De techniek is toepasbaar op een breed scala van oplossingsomstandigheden spanning een breed bereik van concentraties, pH, ionische sterkte, temperatuur, additieven, enz., Maar het monster vereist monodispers zijn. Deze waarschuwing heeft geleid tot de uitvoering van vloeistofchromatografie systemen op SAXS beamlines. Hier beschrijven we de stroomopwaartse integratie van grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en ionenuitwisselingschromatografie (IEC) een bundellijn verschillende werkwijzen voor optimale achtergrond aftrek en gegevensreductie. Als voorbeeld beschrijven we hoe we SEC- en IEC-SAXS op een fragment van de essentiële vaccinia virus eiwit D5, bestaande uit een D5N helicase domein. We bepalen de algehele vorm en moleculair gewicht, die de hexamere structuur van the eiwit.

De resultaten van de model-vrije invariante analyse zijn weergegeven in Tabel 1. De analyse van de D5 323-785 SEC-SAX gegevens toonden een molecuulmassa schatting (een Porod analyse) van 345 kDa versus 338 kDa waargenomen onder toepassing van IEC-SAXS. Beide zijn in overeenstemming met de verwachte massa van 6 keer 53,5 kDa (321 kDa) voor een hexameer. De ab initio modellering van beide datasets werd ondernomen zonder opgelegde symmetrie (SEC-SAX: χ 2 = 0,88, IEC-SAX: χ 2 = 3,1) en het gebruik van C6 symmetrie (SEC-SAX: χ 2 = 1,0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Aangezien de algemene fit voor de verstrooiing gegevens voor beide reconstructies zijn vergelijkbaar in beide gevallen (figuur 1D en E), kan worden aangenomen C6 symmetrie. Dus het model overeen met een hexagonale kegel-achtige structuur met een centraal kanaal, die gedeeltelijk belemmerd wordt (SEC Figuur 1F; IEC: <strong&gt; Figuur 1G, overlay figuur 1H). Een onderzoek van individuele modellen voor middeling blijkt dat dit obstructie is waarschijnlijk een artefact van de middeling proces. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg" /> Figuur 1: SAX data analyse en vergelijking van D5 323 -785 (figuur aangepast van referenties 12 en 18). A) Schematische domeinstructuur van D5 eiwit en D5 323-785. B) Offline ionenwisseling chromatogram met de aanduiding van de drie pieken. Oranje curve: absorptie bij 280 nm (au), blauwe curve: percentage buffer B. Percentages buffer B bij de pieken zijn aangegeven. C) Online ionenwisseling chromatogram. Toets zoals in B. Bovendien is de gemeten intensiteit wordt groen aangegeven. De experimentele curve een verstrooiingnd berekende curve van de verkregen door SEC-SAXS D) en IEC E) data-analyse van de D5 323-785 model. F) Bead model van D5 323-785 gebaseerd op SEC data en G) IEC gegevens. H) Overlay van de SEC en IEC modellen. De panelen in F) tot H) werden gemaakt met behulp van een moleculaire visualisatie software 24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Gegevensverzameling parameters </td><td></td></tr><tr><td> Instrument: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> Golflengte (A) </td><td> 0.99 </td></tr><tr><td> Q-range (-1) </td><td> ,0032-,49 </td></tr><tr><td> Sample-to-detectorafstand </td><td> 2.864 m </td></tr><tr><td> tijdopname (sec) </td><td> 1 per frame </td></tr><tr><td> concentratiegebied </td><td> nvt </td></tr><tr><td> (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> Detector </td><td> Pilatus 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> Flux (fotonen / s) </td><td> 1 x 10 12 </td></tr><tr><td> Bundelbreedte (um 2) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> Structurele parameters voor D5 323-785, SEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) [Van Guinier] </td><td> 0,0237 </td></tr><tr><td> Rg (A) [van Guinier] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> q min Rg - Qmax Rg gebruikt Guinier </td><td> 0,77-1,24 </td></tr><tr><td> Dmax (A) [P (r)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> q-range gebruikt voor p (r) (-1)</td><td> 0,02-0,17 </td></tr><tr><td> Porod volume V p (A3) [van Scatter] </td><td> (570 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Moleculaire massa M r (kDa) [van V p] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> Berekend monomeer heer van sequentie (kDa) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> Structurele parameters voor D5 323-785, IEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) [Van Guinier] </td><td> 0,386 </td></tr><tr><td> Rg (A) [van Guinier] </td><td> 46,5 ± 0,1 </td></tr><tr><td> q min Rg - Qmax Rg gebruikt Guinier </td><td> 0,44-1,29 </td></tr><tr><td> Dmax (A) [P (r)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> q-range gebruikt voor p (r) (-1) </td><td> 0,03-0,18 </td></tr><tr><td> Porod volume Vp (&amp; #197; 3) [van Scatter] </td><td> (577 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Moleculaire massa M r (kDa) [van V p] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> Berekend hexameric heer van sequentie (kDa) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> Tabel 1: SAXS gegevensparameters. De tabel geeft een overzicht van de parameters van SAXS data-acquisitie en analyse.

De bepaling van de oplossing structuur van een eiwit door kleine hoek röntgen verstrooiing (SAXS) vereist monodisperse monsters. Hier presenteren we twee mogelijkheden te verzekeren minimale vertragingen tussen monstervoorbereiding en data acquisitie: online size-exclusion chromatography (SEC) en online ionenuitwisselingschromatografie (IEC).

Online Grootte-uitsluiting en ionenuitwisselingschromatografie op een SAX Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Het algemene doel van het implementeren van online uitsluitingschromatografie en ionenuitwisselingschromatografie op smalle hoek röntgenverstrooiing straallijnen is om betere kwaliteit laag resolutie modelgegevens te verkrijgen door minimale vertragingen tussen monstervoorbereiding en dataverwerving te garanderen. Deze methoden kunnen helpen om belangrijke vragen in het veld van structurele biologie te beantwoorden. Net als de straalbewerking, de grootste intra-deeltjesafstand, de deeltjesvorm, de mate van opvouwing, denaturatie of onregelmatigheid.SAXS vereist molaard verstrooide monsters. Het grote voordeel van deze techniek is dat de tijd tussen de zuivering en de meting kort is, wat helpt om monstersdenaturatie of advictie te voorkomen. Voordat u naar de straallijnfaciliteit gaat, bereidt u een geconcentreerd monster voor volgens eerder gepubliceerde methoden en voert u SEC-testruns uit.Bij de straallijnfaciliteit plaatst u één milliliter gelfiltratiebuffer in een 1,5 milliliter reactiebuis. Verbind vervolgens de fles met gelfiltratiebuffer met een HPLC-systeem in lijn met de flow-through capillaire van de SAXS-opstelling. Stel de stroomsnelheid, maximale kolomdruk en verwervingstijd in.Let op de tegendruk zonder de kolom. Spuit de leidingen leeg en verbind en breng vervolgens de grootte-uitsluitingschromatografiekolom in evenwicht. Laad het één milliliter buffermonster in de monsterwisselaar.Verlaat en zet vast of sluit de experimentele hutch af, log vervolgens in op de straallijnbesturingssoftware in de monsterwisselaarmodus. Stuur het buffermonster in de monsterwisselaar direct door de SAXS flow-through capillaire. Voer een korte SAXS-testrun uit en controleer of de geluidsarme röntgenverstrooiingsintensiteit geen tekenen van stralingsschade vertoont.Schakel het straallijnbesturingssysteem over naar HPLC-modus en voer een SAXS-testrun van buffer door het volledige HPLC SAXS-systeem. Als de gegevens niet overeenkomen met de eerste meting, breng opnieuw in evenwicht en voer een andere testrun uit. Vervolgens centrifugeert u in het laboratorium het eiwitmonster 13.000 keer G gedurende 10 minuten om aggregaten te verwijderen.Breng het supernatant over in een HPLC-compatibel glazen glaasje. Laad het glaasje in de autosampler en noteer de monsterpositie. Vergrendel de hutch en maak een map voor de experimentgegevens in het straallijnbesturingssysteem.Klik vervolgens in de HPLC-software op snel batch. Stel het bestandspad in en activeer automatische ASCII-conversie van UV Vis-gegevens. Voer het injectievolume en de monsterpositie in de autosampler in.Klik op 'start' om de run aan de wachtrij toe te voegen. Voer de bestandsnaam in, maar klik nog niet op 'opslaan'. In de straallijnbesturingssoftware stelt u het aantal dataframes in, zodat de SAXS-gegevensverzameling iets langer is dan de HPLC-verwervingstijd.Open de straallijnsluiter en start de SAXS-gegevensverzameling. Schakel over naar de HPLC-software en klik op 'opslaan' om het monster te injecteren. Noteer het framenummer aan het begin van de UV Vis-gegevensverwerving en controleer de geaccumuleerde intensiteit in de tijd.Tijdens de monstervoorbereiding voert u een IEC-testrun uit met een lineaire natriumchloridegradiënt van 25 millimolair tot één molair. Bepaal voor elke piek van belang de corresponderende hoeveelheid hoog zout buffer B in de mobiele fase. Om het IEC SAXS-experiment te beginnen, bewaar één milliliter monsters van buffers A en B en verbind vervolgens de buffers met het HPLC-systeem.Stel de HPLC-parameters in en spoel vervolgens het systeem leeg en spoel de leidingen met laag zoutblijvende buffer A. Verbind en breng de ionenuitwisselingskolom in evenwicht met buffer A. Laad de één milliliter monsters van buffers A en B in de monsterwisselaar. Vergrendel de hutch en voer voor elke buffermonster een korte SAXS-testrun uit in de monsterwisselaarmodus om de buffergevoeligheid voor stralingsschade te controleren. Schakel vervolgens over naar HPLC-modus en voer een andere SAXS-testrun uit voor buffer A. Vergelijk de verstrooiingspatronen met die verkregen uit de monsterwisselaartestrun.Maak vervolgens een map voor de experimentgegevens. Ontwerp vervolgens een stapsgewijze HPLC-gradiënt die begint met nul procent hoog zout buffer B en stijgt met vijf procent met tussenpozen van twee kolomdvolumes om honderd procent buffer B te bereiken. Stel een enkele gradiëntrun in waarbij geen monster wordt geïnjecteerd. Open de straallijnsluiter, start de SAXS-gegevensverzameling en start de HPLC-run.Let op het aantal frames dat is verstreken toen de UV Vis-gegevensverwerving begon. Controleer na de gegevensverwerving of de geaccumuleerde intensiteit constant bleef gedurende ten minste 100 frames en overeenkomt met de waarden verkregen uit de monsters van buffers A en B. Maak vervolgens een andere stapsgewijze gradiënt HPLC-methode, beginnend met nul procent buffer B. Maak een stap voor elke procent B-waarde bepaald in de offline IEC-gradiënttestrunne. Voeg gradiëntstappen toe met één procentpunt lager en 1,5 punten hoger dan elk van die waarden.Stel elk stappeninterval in op 2,5 kolomdvolumes en de laatste stap in de gradiënt op honderd procent B. Verdun het supernatant zo nodig om de samenstelling van buffer A te bereiken. Stop de HPLC-pompen, koppel de kolomslang los van de detectoren en plaats het einde van de leiding in een container om het kolomstroom te verzamelen. Breng vervolgens de buffer A-lijn over in het verdunde monster en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de buis zijn gevangen. Start de pompen om het monster in de kolom te trekken.Zodra de monstercontainer bijna leeg is, stopt u de pompen en zet de buffer A-fles terug op de leiding. Start de pompen en laat buffer A twee kolomdvolumen door de kolom lopen, stop vervolgens de pompen en sluit de kolom weer aan op de detectoren. Gebruik de nieuwe stapsgewijze methode om een enkele HPLC-run op te zetten zonder automatische monsterinjectie.Open de straallijnsluiter en verwerf de SAXS- en UV Vis-gegevens. Controleer de geaccumuleerde intensiteit in de tijd

online-size-exclusion-ion-exchange-chromatography-on-saxs

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video demonstrates the cation exchange chromatography technique to isolate recombinant protein from the insect cell protein lysate.

Cation Exchange Chromatography: A Technique to Isolate Target Recombinant Protein from Insect Cell Lysate Based on Net Surface Charge

This video describes SEC-MALS, which leverages the abilities of size-exclusion chromatography (SEC) and multi-angle light scattering (MALS). In SEC-MALS, the SEC separates proteins or protein complexes based on their size, and the MALS detector determines the average molecular weight by measuring the intensity of the light scattered by the molecule at different angles.

Size-Exclusion Chromatography with Multi-Angle Light Scattering for Protein Oligomers

Een methode voor massaspectrometrische analyse van endogene peptiden in menselijke cerebrospinale vloeistof (CSF) wordt gepresenteerd. Door molecuulgewicht cut-off filtratie, chromatografische pre fractionering, massaspectrometrische analyse en een daaropvolgende combinatie van peptide identificatie strategieën, bleek het mogelijk om uit te breiden van de bekende CSF peptidome bijna tien keer in vergelijking naar eerdere studies.

Bereiding van de monsters voor de analyse van de Endopeptidomic van menselijke cerebrospinale vloeistof

Hier beschrijven we hoe het gebruik van de geautomatiseerde screening en mailopties voor gegevens verzamelen beschikbaar op sommige synchrotron straallijnen. Wetenschappers verzenden de synchrotron, cryocooled monsters en de diffractie eigenschappen worden gescreend, de verzamelingen gegevens worden verzameld en verwerkt en, waar mogelijk, de oplossing van een structuur wordt uitgevoerd — allemaal zonder menselijke tussenkomst.

Volledig autonoom karakterisering en het verzamelen van gegevens van kristallen van biologische macromoleculen

Dit protocol beschrijft het gebruik van hoge-specificiteit-ionenwisselingschromatografie met multi hoek lichtverstrooiing voor een nauwkeurige molmassabepalingen van eiwitcomplexen, eiwitten en peptiden in een heterogene monster. Deze methode is waardevol voor kwaliteitsbeoordeling, alsook wat betreft de karakterisatie van inheemse oligomeren, gratis varianten en gemengd-EiwitSteekproeven.

Ionenwisselingschromatografie (IEX) gekoppeld aan meerdere hoek lichtverstrooiing (MALS) voor eiwit scheiding en karakterisering

Een veelzijdig cryoslicing BN-MS protocol met behulp van een microtoom wordt gepresenteerd voor hoge-resolutie complexome profilering.

Hoge-resolutie Complexome profilering door Cryoslicing BN-MS analyse

SEC-BioSAXS metingen van biologische macromoleculen zijn een standaardbenadering voor het bepalen van de oplossingsstructuur van macromoleculen en hun complexen. Hier analyseren we SEC-BioSAXS-gegevens van twee soorten vaak aangetroffen SEC-sporen: chromatogrammen met volledig opgeloste en gedeeltelijk opgeloste pieken. We tonen de analyse en deconvolutie met behulp van scatter en BioXTAS RAW.

Analyse van SEC-SAXS-gegevens via EFA-deconvolution en Scatter

Hier presenteren we een protocol voor cryogene monstervoorbereiding en overdracht van kristallen naar het vacuümeindstation op beamline I23 bij Diamond Light Source, voor macromoleculaire röntgenkristallografie-experimenten met lange golflengte.

Monstervoorbereidings- en overdrachtsprotocol voor in-vacuüm kristallografie met lange golflengte op Beamline I23 bij Diamond Light Source

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Leer online SEC en IEC implementeren op een SAXS beamline voor structurele biologie. Deze methode minimaliseert vertragingen tussen monsterbereiding en meting, waardoor eiwitdenaturatie wordt voorkomen en datakwaliteit verbetert.

Online Grootte-uitsluiting en ionenuitwisselingschromatografie op een SAX Beamline

Meer video's verkennen