Een geoptimaliseerde protocol voor Electroforetische Mobility Shift Assay Met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof-gemerkte oligonucleotiden

Het algemene doel van deze assay is het detecteren van eiwit-DNA-interacties met behulp van niet-radioactieve probes. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de moleculaire biologie en biochemie, zoals het bepalen van de DNA-doelsequentie van eiwitten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudig, veilig en tijdbesparend alternatief is voor het gebruik van radioactieve probes.

Om deze procedure te starten, bereid een vijf procent native polyacrylamidegel voor die 0,5x tris-boraat-EDTA of TBE en 2,5% glycerol bevat, met behulp van een mini-proteïnegelsysteem. Om 30 milliliter geloplossing voor vier gels te bereiden, meng gedestilleerd water, TBE, ammoniumpersulfaat, TEMED, acrylamide-bis en glycerol. Giet de geloplossing onmiddellijk uit.

Wikkel na polymerisatie de gels in transparante vershoudfolie die vooraf is bevochtigd met 0,5x TBE en bewaar deze bij vier graden Celsius. Ontwerp vervolgens een lang oligonucleotide van ongeveer 51 meren. Ontwerp complementaire korte oligonucleotiden van ongeveer 14 meren met een infrarode fluorescerende kleurstofmodificatie aan het vijf-prime uiteinde.

Zodra de oligonucleotiden zijn voorbereid, worden deze gesuspendeerd in 1x Tris-EDTA-buffer tot een uiteindelijke concentratie van 100 µM. Meng voor het annealen 0,6 µL van het korte oligonucleotide met prime dye, 1,2 µL van het lange oligonucleotide en 28,2 µL natriumchloride-Tris-EDTA-buffer in een buisje van 1,5 mL. Plaats het buisje gedurende vijf minuten in kokend water, schakel vervolgens de warmtebron uit en laat het water met de geannealde oligonucleotiden overnacht in het donker afkoelen.

Meng voor het maken van dubbelstrengs DNA-probes 30 µL van de geannealde oligonucleotiden met dNTP's, Klenow-buffer, Klenow 5'-kleurstoflabel en dubbel gedestilleerd water in een 0,2 mL PCR-buisje. Incubeer het mengsel gedurende 60 minuten bij 37 °C in een PCR-apparaat. Voeg vervolgens 3,4 µL 0,5 M EDTA toe om de reactie te stoppen en inactiveer door hitte bij 75 °C gedurende 20 minuten in het PCR-apparaat.

Verdun daarna de ingevulde probes met sodiumchloride Tris-EDTA-buffer tot een eindconcentratie van 0,1 micromolair. Bewaar de oligonucleotiden bij minus 20 graden Celsius in het donker tot gebruik. Meng voor de bereiding van niet-gelabelde probes 20 microliter long oligonucleotide, 20 microliter Long R oligonucleotide en 60 microliter sodiumchloride Tris-EDTA-buffer in een 1,5 milliliter buis.

Plaats de buis gedurende vijf minuten in kokend water, schakel vervolgens de warmtebron uit en laat het water met de geanneleerde oligos overnacht afkoelen. Bereid één milliliter 5x bindingsbuffer door Tris HCl, natriumchloride, kaliumchloride, magnesiumchloride, EDTA, DTT, BSA en dubbel gedestilleerd water te mengen. Voordat de bindingsreacties worden opgezet, dient de 5% native polyacrylamidegel voor te lopen in 0,5x TBE en 2,5% glycerol om alle sporen van ammoniumpersulfaat te verwijderen bij 80 volt gedurende 30 minuten tot één uur, of totdat de stroom niet langer varieert in de tijd.

Meng vervolgens vier µL 5x bindingsbuffer, 80 tot 200 ng gezuiverd eiwit A, één µL 0,1 µM kleurstofgeconjugeerde probe en dubbel gedestilleerd water. Incubeer het mengsel 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Laad na incubatie de volledige bindingsreactie op de gel en laat de gel lopen bij 10 V/cm tot de gewenste afstand.

Bedek de gelapparatuur met aluminiumfolie om de gel zoveel mogelijk in het donker te houden. Maak de scanplaat van een infrarood beeldvormingssysteem schoon met gedestilleerd water. Veeg de glazen platen waarin de gel zich bevindt droog en plaats deze op de scanplaat.

Open de software voor infraroodbeeldvorming en klik op het tabblad Acquire. Gebruik voor dikkere platen de instellingen 700 voor kanaal, auto voor intensiteit, 84 micrometers voor resolutie, medium voor kwaliteit en 3,5 millimeters voor focus offset. Selecteer het gebied op de scanner dat door de gel wordt ingenomen.

Klik ten slotte op Start om de scan te beginnen. De voortgang van de elektroforese kan worden gevisualiseerd met Orange G laadkleurstof, terwijl Bromophenol blue wordt gedetecteerd tijdens het scannen en daarom de beeldanalyse verstoort. Toevoeging van dI-dC aan de bindingsreactie hief de binding van gezuiverd 6xHis-SOX-2 met de 5'-gekleurde DNA-probes op.

De LIM-4 mutant en de SOX-2 koude probe die gemuteerd is in de LIM-4 bindingssite zijn even efficiënt als de wildtype koude probe in het concurreren met de infrarood-fluorescente kleurstof-gelabelde probe voor binding aan 6xHis-SOX-2. De competitie-efficiëntie van de LIM-4 en SOX-2 mutant koude probe die gemuteerd is in de SOX-2 bindingssite is echter veel lager dan die van de wildtype koude probe voor binding aan 6xHis-SOX-2. Supershift-assays van het SOX-2 DNA-complex met gebruik van 6xHis en flag epitopen resulteerden in een gesupershiftede SOX-2 DNA-band.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee tot vier uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de infraroodsondes in het donker te houden. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals CRISPR-cas9 genoomredactie, worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het belang van een specifieke DNA-bindingssequentie.

Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de biochemie om eiwit-DNA-interacties in diverse modelorganismen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe eiwit-DNA-interacties bepaald kunnen worden met behulp van niet-radioactieve DNA-labels. Vergeet niet dat werken met acrylamide extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen, altijd in acht moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.