Een geoptimaliseerde protocol voor Electroforetische Mobility Shift Assay Met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof-gemerkte oligonucleotiden

Het algemene doel van deze test is om eiwit-DNA-interacties te detecteren met behulp van niet-radioactieve proben. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van moleculaire biologie en biochemie, zoals het bepalen van de doelsequentie van DNA-eiwitten. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige, veilige en tijdbesparende alternatief is voor het gebruik van radioactieve proben.

Om deze procedure te beginnen, bereid een vijf procent natuurlijk polyacrylamidegel voor die 0,5x trisboraat EDTA of TBE bevat, en 2,5% glycerol, met behulp van een mini-eiwitgelsysteem. Om 30 milliliter geloplossing voor vier gels te bereiden, meng gedistilleerd water, TBE, ammoniumpersulfaat, TEMED, acrylamidebi, en glycerol. Laat de geloplossing onmiddellijk passeren.

Na polymerisatie, wikkel de gels in doorzichtige plasticfolie vooraf bevochtigd met 0,5x TBE en bewaar ze bij vier graden Celsius. Ontwerp vervolgens een lange oligonucleotide voor ongeveer 51 mer. Ontwerp complementaire korte oligonucleotiden voor ongeveer 14 mer met infrarood fluorescente kleurstofmodificatie aan het vijf-prime-uiteinde.

Zodra de oligonucleotiden zijn bereid, schors ze opnieuw in 1x Tris-EDTA-buffer tot een uiteindelijke concentratie van 100 micromolar. Voor annealing, meng 0,6 microliter vijf-prime-dye korte oligonucleotide, 1,2 microliter lange oligonucleotide, en 28,2 microliter natriumchloride Tris-EDTA-buffer in een 1,5 milliliter buis. Plaats de buis vijf minuten in kokend water, zet vervolgens de warmtebron uit en laat het water met de geanneleerde oligonucleotiden overnacht in het donker afkoelen.

Om dubbelstrengs DNA-proben te maken, meng 30 microliter van de geanneleerde oligonucleotiden met DNTP's, Klenow-buffer, Klenow vijf-prime-dye tag, en tweemaal gedestilleerd water in een 0,2 milliliter PCR-buis. Incubeer het mengsel gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius in een PCR-machine. Voeg vervolgens 3,4 microliter 0,5 molaire EDTA toe om de reactie te stoppen en inactiveer in warmte bij 75 graden Celsius gedurende 20 minuten in de PCR-machine.

Verdun vervolgens de gevulde proben met natriumchloride Tris-EDTA-buffer tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 micromolar. Bewaar de oligonucleotiden bij min 20 graden Celsius in het donker totdat ze klaar zijn om te worden gebruikt. Om niet-gelabelde proben te bereiden, meng 20 microliter lange oligonucleotide, 20 microliter Long R oligonucleotide, en 60 microliter natriumchloride Tris-EDTA-buffer in een 1,5 milliliter buis.

Plaats de buis vijf minuten in kokend water, zet vervolgens de warmtebron uit en laat het water met de geanneleerde oligo's overnacht afkoelen. Bereid een milliliter 5x bindingsbuffer door Tris HCl, natriumchloride, kaliumchloride, magnesiumchloride, EDTA, DTT, BSA, en tweemaal gedestilleerd water te mengen. Voordat u de bindingsreacties instelt, laat u de 5% natuurlijke polyacrylamidegel vooraf draaien in 0,5x TBE en 2,5% glycerol om alle sporen van ammoniumpersulfaat te verwijderen bij 80 volt gedurende 30 minuten tot een uur, of totdat de stroom niet langer varieert met de tijd.

Meng vervolgens vier microliter 5x bindingsbuffer, 80 tot 200 nanogram gezuiverd eiwit A, een microliter 0,1 micromolar gekleurde geconjugeerde sonde, en tweemaal gedestilleerd water. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur in het donker gedurende 15 minuten. Na incubatie, laadt u alle bindingsreacties op de gel en laat de gel lopen bij 10 volt per centimeter naar de gewenste afstand.

Dek de gelapparaat af met aluminium om de gel zoveel mogelijk in het donker te houden. Reinig de scannerbed van een infrarood beeldvormingssysteem met gedistilleerd water. Veeg de glazen platen met de gel droog en plaats ze op het scannerbed.

Open de infrarood beeldvormingssoftware en klik op het tabblad Verwerven. Gebruik voor dikkere platen de instellingen van 700 voor kanaal, auto voor intensiteit, 84 micrometer voor resolutie, medium voor kwaliteit en 3,5 millimeter voor focusoffset. Selecteer het gebied dat de gel op de scanner inneemt.

Klik tenslotte op Start om met het scannen te beginnen. De voortgang van de elektroforese kan worden gevisualiseerd met Orange G ladingskleurstof, terwijl Bromofenolblauw wordt gedetecteerd tijdens het scannen en daarom interfereert met beeldanalyse. Toevoeging van dI-dC aan de bindingsreactie schafte de binding van gezuiverd 6xHis-SOX-2 af met de vijf-prime-dye DNA-proben.

De LIM-4 mutant en SOX-2 koude sonde gemuteerd in de LIM-4 bindingsplaats is even efficiënt als de wilde type koude sonde in concurrentie met de infrarood fluorescente kleurstof gelabelde sonde voor binding aan 6xHis-SOX-2. Echter, de concurrentie-efficiëntie van de LIM-4 en SOX-2 mutant koude sonde gemuteerd in de SOX-2 bindingsplaats is veel lager dan de wilde type koude sonde voor binding aan 6xHis-SOX-2. Supershift assays van de SOX-2 DNA-complex met behulp van 6xHis en flag-epitopen resulteerden in een superverschoven SOX-2 DNA-band.

Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee tot vier uur worden uitgevoerd als het goed wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om de infrarood proben in het donker te houden. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals CRISPR cas9 genoombewerking worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden zoals de belangrijkheid van een bepaalde DNA-bindingssequentie.

Na de ontwikkeling van deze techniek heeft dit de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van biochemie om eiwit-DNA-interacties in verschillende modelorganismen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u eiwit-DNA-interacties kunt bepalen met behulp van niet-radioactieve DNA-labels. Vergeet niet dat het werken met acrylamid kan extreem gevaarlijk zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals persoonlijke beschermingsmiddelen altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.