Name: Een geoptimaliseerde protocol voor Electroforetische Mobility Shift Assay Met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof-gemerkte oligonucleotiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Leer een geoptimaliseerd fluorescerend EMSA-protocol voor het detecteren van eiwit-DNA-interacties met infrarood fluorescerende probes. Deze veilige, niet-radioactieve methode bespaart tijd en biedt duidelijke visualisatie voor moleculair biologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een Alfred P. Sloan Research Fellowship (aan C.-F.C.) en een NIH R01-subsidie (5R01GM098026-05 aan C.-F.C.). We danken David Crowe voor toegang tot het geavanceerde infrarood beeldvormingssysteem.

OPMERKING: EMSA&#39;s via fluorescent gelabelde DNA probes of andere vormen van gelabelde DNA delen dezelfde protocollen voor eiwit of celextract bereiding, eiwit-DNA bindingsreactie en PAGE gel voorbereiding en actief (Figuur 1A). De belangrijkste verschillen zijn DNA labeling procedures, post-run gel processtappen, en detectiemethoden. 1. Gel Voorbereiding <ol><li> Bereid 5% natieve polyacrylamidegel die 0,5 x TBE (45 mM Tris-boraat, 1 mM EDTA) en 2,5% glycerol, met een mini-eiwit gelsysteem (8,3 cm breed x 7,3 cm lengte x 0,75 mm dikte). <ol><li> Tot 30 ml geloplossing bereiden 4 gels, meng 5 ml 30% acrylamide / Bis (37,5: 1), 3 ml 5x TBE (0,45 M Tris-boraat, 10 mM EDTA), 1,5 ml 50% glycerol, 300 pl van 10% ammoniumpersulfaat, 15 ui TEMED en 20,2 ml DDH 2 O grondig. OPMERKING: Acrylamide is schadelijk en giftig, handvat met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. </li&gt; </ol></li><li> Cast de gel oplossing onmiddellijk. Na de polymerisatie, wikkel de gels in doorzichtige plastic wrap pre-bevochtigd met 0.5x TBE en bewaar ze bij 4 ° C. </li></ol> 2. Voorbereiding van de infrarood fluorescerende kleurstof-gelabelde probes LET OP: Houd de infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte oligonucleotiden buurt van licht zoveel mogelijk tijdens de bereiding, opslag en experimenten. <ol><li> Ontwerpen en bestellen oligonucleotiden. <ol><li> Ontwerpen lang oligonucleotide voor ~ 51-meren. LET OP: De lange oligonucleotide sequentie van de LIM-4 / SOX-2 probe is TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. Lange oligonucleotiden niet PAGE of HPLC zuivering nodig. </li><li> Ontwerp van complementaire korte oligonucleotiden voor ~ 14-meren met infrarood fluorescerende kleurstof modificatie aan het 5&#39;-uiteinde (5&#39;Dye) en een smelttemperatuur boven 37 ° C. OPMERKING: De korte oligonucleotidesequentie van de LIM-4 / SOX-2 sonde 5&#39;Dye-GGGAGAAGATTTTG. De minimale synthese schaal van 5&#39;Dye-gelabelde korte oligonucleotiden is 100 nM. Daarom is de oligonucleotiden vereisen HPLC zuivering. </li></ol></li><li> Resuspendeer oligonucleotiden 1x Tris-EDTA buffer (TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) tot een eindconcentratie van 100 uM. </li><li> Gloeien Short (5&#39;Dye) en Long oligonucleotiden. <ol><li> Meng 0,6 pl 5&#39;Dye-Short oligo (100 uM), 1,2 ui oligo Long (100 uM) en 28,2 pi natriumchloride-Tris-EDTA buffer (STE 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) in een 1,5 ml buis. </li><li> Plaats de buis in kokend water gedurende 5 minuten. Zet de warmtebron en laat het water met de gehechte oligo&#39;s te koelen O / N in het donker. </li></ol></li><li> Vul het 5 &#39;overhangende versmolten 5&#39;Dye-korte / lange oligos met Klenow DNA polymerase om dubbelstrengs DNA probes maken. <ol><li> Bereid de reactie door het mengen30 pi versmolten korte / lange oligos met 5&#39;Dye tag, 8,5 ui 10X Klenow-buffer, 1,7 ui 10 mM dNTP&#39;s, 1,7 pl Klenow (3 &#39;-&gt; 5&#39; exo-) (5 U / pl) en 43,1 ul van DDH 2 O in een 0,2 ml PCR-buis. </li><li> Incubeer 60 min bij 37 ° C in een PCR-machine. </li><li> Voeg 3,4 ul 0,5 M EDTA om de reactie en warmte inactiveren bij 75 ° C gedurende 20 minuten in een PCR-machine te stoppen. </li></ol></li><li> Verdun ingevulde probes (0,7 uM) in STE voor uiteindelijke concentratie van 0,1 uM. </li><li> Store oligo&#39;s bij -20 ° C in het donker totdat klaar voor gebruik. Oligo mag maximaal maximaal een jaar bij deze aandoening. OPMERKING: Om DNA-probes met mutant bindingsplaatsen genereren mutant versies van lange oligonucleotiden worden gegloeid met 5&#39;Dye-gelabelde korte oligonucleotiden, gevolgd door fill-in van 5 &#39;overhangen met Klenow. Aangetoond is dat de sonde met één streng gelabeld met een infrarood fluorescerendekleurstof slechts 30% intensiteit van de probe met beide strengen gemerkt met de kleurstof. Als intensiteit van het signaal moet worden versterkt, zijn lang oligo&#39;s van beide strengen gelabeld met infrarood fluorescerende kleurstoffen op 5 &#39;uiteinden en gehybridiseerd aan infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte probes te maken. </li></ol> 3. Voorbereiding van Unlabeled / Cold Probes (concurrenten) Opmerking: Lange oligonucleotiden met complementaire sequenties (Long en LongR) werden gekoppeld aan ongelabelde probes te maken voor concurrentie-analyse met infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte probes. <ol><li> Meng 20 pl 100 pM Long, 20 pl 100 pM LongR oligonucleotiden en 60 ul STE in een 1,5 ml buis. </li><li> Plaats de buis in kokend water gedurende 5 minuten, zet de warmtebron en laat het water met de gehechte oligo&#39;s &#39;s nachts af te koelen. </li></ol> 4. Binding Reaction en elektroforese <ol><li> Bereid 1 ml 5x bindingsbuffer door 50 gl60, van 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 10 pl van 5 M NaCl; 200 pi van 1 M KCl, 5 pl 1 M MgCl2, 10 pl 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 pl 1 M DTT; 25 ui 10 mg / ml BSA, en 695 pl DDH 2 O. OPMERKING: De 5x Binding Buffer kunnen worden hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -20 ° C. Een ander punt van overweging is dat de verschillende transcriptiefactoren verschillende modificaties om de binding buffer zal hebben. </li><li> Vlak voor het opzetten bindingsreacties, voorlooptijd de 5% natieve polyacrylamidegel in 0,5x TBE + 2,5% glycerol om alle sporen ammoniumpersulfaat verwijderen bij 80 V gedurende 30-60 minuten, of totdat de huidige niet meer tijd varieert. </li><li> Stel de bindingsreactie in eindvolume van 20 pi. <ol><li> Meng 4 pl 5x bindingsbuffer 80-200 ng gezuiverd proteïne A (in 50% glycerol, dwz SOX-2), 1 pl 0,1 uM kleurstof geconjugeerd probe (eindconcentration: 5 nm) en DDH 2 O. </li><li> Facultatief: Als koud probe concurrenten nodig, voeg verschillende concentraties (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) koud probes. </li><li> Optioneel: Wanneer de interactie tussen eiwitten A en B (dat wil zeggen, SOX-2 en LIM-4) getest, voeg 80-200 ng gezuiverde eiwit B (in 50% glycerol, dwz LIM-4). </li><li> Facultatief: Als nucleair extract preparaat gebruikt waarbij specifieke binding van proteïne A worden bevestigd, voeg antilichaam specifiek voor proteïne A (dat wil zeggen anti-6xHis, anti-FLAG, etc.). </li><li> Incuberen bij R / T donker gedurende 15 min. </li></ol></li><li> Laad alle van de binding reactie op de gel en laat de gel bij 10 V / cm tot gewenste afstand. </li></ol> 5. Imaging OPMERKING: De gel werd direct gescand in de glasplaten een geavanceerd infrarood beeldvormingssysteem. Daarom kan de gel verder opgelost en herhaaldelijk gescand (figuren 1C en <strong&gt; 2). Een nabij infrarood fluorescerend beeldvormingssysteem hoofdzakelijk voor Western blots werd ook getest om de gel te scannen, maar alleen de geavanceerde infrarood beeldvormingssysteem kon de gel met goede resolutie scannen. De beschreven methode is specifiek voor een bepaalde infrarood imaging software, hoewel andere softwarepakketten kunnen gebruikt worden. <ol><li> Reinig het bed van de scanner met DDH 2 O en goed laten drogen voordat u gaat scannen. Droogwrijven glasplaten van de gel en plaats de platen die de gel op de scanner bed. </li><li> Open de infrarood imaging software en ga naar het tabblad &#39;Acquire&#39;. Wanneer de dunnere plaat (1 mm) wordt geplaatst op de scanner bed, gebruik maken van de instellingen van Kanaal: 700, Intensiteit: Auto, Resolutie: 169 urn, Kwaliteit: medium, en Focus offset: 1,5 mm. Wanneer de dikkere plaat (3 mm) wordt geplaatst op de scanner bed, gebruik maken van de instellingen van Kanaal: 700, Intensiteit: Auto, Resolutie: 84 pm, Kwaliteit: medium, en Focus offset: 3,5 mm. Focus gecompenseerd afhankelijk van dedikte van de glasplaat. </li><li> Selecteer het gebied dat de gel inneemt op de scanner. Klik op &#39;Start&#39; om de scan te starten. </li><li> Herhaal elektroforese en bovendien nodig scannen. </li></ol>

<ol><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li>
<li>Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+probes+in+the+electrophoretic+mobility+shift+assay+to+examine+specific+dsDNA%2C+ssDNA+or+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).</li>
<li>Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+background+problems+in+nonradioactive+northern+and+Southern+blot+analyses+enables+higher+sensitivity+than+32P-based+hybridizations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations.</a> Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).</li>
<li>Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+two-color+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+detecting+both+nucleic+acids+and+protein+in+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels.</a> Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).</li>
<li>Alqadah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmitotic+diversification+of+olfactory+neuron+types+is+mediated+by+differential+activities+of+the+HMG-box+transcription+factor+SOX-2%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2.</a> EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).</li>
<li>Jullien, N., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LUEGO%3A+a+cost+and+time+saving+gel+shift+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure.</a> Biotechniques. 51, 267-269 (2011).</li>
<li>Poulin-Laprade, D., Burrus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+Using+Radiolabeled+DNA+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes.</a> Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).</li>
<li>Ruscher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+based+non-radioactive+electrophoretic+mobility+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay.</a> J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17, 14-20 (2011).</li>
<li>Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+goes+beyond+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Sox2 goes beyond stem cell biology.</a> Cell cycle. , (2016).</li>
<li>Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+competitor+poly%28dI-dC%29.poly%28dI-dC%29+levels+is+advised+in+DNA-protein+interaction+studies+involving+enriched+nuclear+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins.</a> Biotechniques. 20, 439-444 (1996).</li>
<li>Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+detection+of+biotin-protein+conjugates+with+a+green+fluorescent+streptavidin+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Methods%22%5BJournal%5D)">In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe.</a> Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).</li>
<li>Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+fluorescent+electrophoretic+mobility+shift+assay+improved+for+the+quantitative+and+multiple+analysis+of+protein-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).</li>
<li>Steiner, S., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+electrophoretic+mobility+shift+assay+in+the+analysis+of+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins.</a> Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

fEMSAs zijn een efficiënt instrument om eiwit-DNA interacties te onderzoeken, en zijn een alternatief voor radioactieve labeling van DNA. Fluorescerende kleurstoffen zoals infrarood kleurstoffen zijn commercieel verkrijgbaar, en een veiligere en milieuvriendelijkere manier dan radioactieve DNA labeling. EMSA&#39;s met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte oligonucleotiden vereisen geen postrun gel processtappen, en dus tijd en kosten te besparen in vergelijking met andere DNA-labeltechnieken. De tijd te...

EMSA&#39;s worden gebruikt om de interacties tussen DNA en eiwitten geanalyseerd door natieve polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) een mengsel van een eiwit van interesse en een gemerkte DNA-probe die potentiële doelplaatsen van het eiwit 1 te lossen. Een DNA probe gebonden met proteïne migreert langzamer vergeleken met een vrij DNA probe, en derhalve vertraagd in zijn migratie door een polyacrylamide-matrix. Radioactief merken van DNA door 32 P is de belangrijkste methode voor de detectie in EMSA&#39;s geweest. Hoewel de toepassing van radioactief merken in biochemisch onderzoek gunstig is geweest, zijn de methoden van alternatieve DNA labeling met vergelijkbare gevoeligheid wordt ingezet als gevolg van de gezondheids- en veiligheidsrisico&#39;s in verband met de behandeling van radioactiviteit. Deze alternatieve werkwijzen omvatten conjugatie van biotine DNA met 2 of digoxigenine (DIG) 3 (beide worden vervolgens gedetecteerd door chemiluminescentie systemen), SYBR groen kleuring van de gels PAGE 4,of directe detectie van DNA-fluorescente kleurstof conjugaten door het scannen van de gel 5,6. De opgeloste gels EMSA&#39;s gebruikt radioactief gemerkte DNA-probes vereisen postrun verwerking, autoradiografie films of fosforimager systeem radioactieve signalen 1,7 detecteren. Gels EMSA gebruik biotine- 2 of DIG-geconjugeerd 3 DNA probes moeten worden verwerkt en overgebracht op een geschikt membraan en gedetecteerd door chemiluminescentie 6. SYBR groene kleuring van de gel vereist postrun gel kleuring en fluorescentie scanner 4. Aangezien postrun gel bewerkingsstappen zijn vereist voor EMSA&#39;s met behulp van deze DNA-labeling-technieken, kunnen de omgezette gel slechts eenmaal getest. Daarentegen kunnen DNA-probes gelabeld met fluoroforen direct worden gedetecteerd in de gel in de glasplaten met een scanner. Daarom kan de DNA-eiwit interacties worden gevolgd en meerdere malen op verschillende tijdstippen getest tijdens de vlucht, dievermindert de tijd en kosten. De DNA-fluorescerende kleurstof conjugaten die zijn gebruikt voor EMSA&#39;s omvatten Cy3 6,8, 6,8 Cy5, fluoresceïne 9 en infrarood fluorescerende kleurstoffen 4-6. Gentranscriptieregulatie vereist eiwit-DNA interacties van transcriptiefactoren en hun target genen. De coördinatie van deze interacties genereert diverse celtypen vanuit een gemeenschappelijke voorouder tijdens de ontwikkeling van dieren. Een onpartijdige forward genetische screen identificeerde een missense mutatie, G73E, in de sterk geconserveerd HMG DNA-bindende domein van de Caenorhabditis elegans transcriptiefactor SOX-2. De mutatie resulteert in een cel identiteit transformatie van AWB olfactorische neuronen in AWC olfactorische neuronen op moleculair, morfologische en functionele niveaus 5,10. SOX-2 regelt differentieel de terminal differentiatie van AWB en AWC neuronen door interactie met context-afhankelijke partner transcriptiefactoren en de respectieveDNA doelplaatsen 5,10. SOX-2 partners met LIM-4 (LHX) in terminal AWB neuronale differentiatie, terwijl de SOX-2 partners met CEH-36 (OTX / OTD) in terminal AWC neuronale differentiatie. Luciferase reporter assays tonen aan dat SOX-2 en mutant SOX-2 G73E eiwitten coöperatieve interacties met cofactoren transcriptionele LIM-4 en CEH-36 een promoter uitgedrukt in AWB en AWC neuronen activeren. Echter, SOX-2 en mutant SOX-2 G73E weergegeven differentiële activering eigenschappen van de promotor. Om de moleculaire basis van differentiële DNA bindingsactiviteiten van SOX-2 en SOX-2 G73E te onderzoeken werden uitgevoerd fEMSAs met deze eiwitten en de potentiële doelplaatsen. Eerst werd een bioinformatica aanpak om de biologisch relevante DNA bindende sequenties in het promotorgebied 1 kb gebruikt in de luciferase assay identificeren. Sinds meerdere potentiële SOX-2 bindende locaties in de promotor aanwezig waren, hebben we ons gerichton voorspelde SOX-2 bindingsplaatsen naast vermeende CEH-36 of LIM-4-bindende plaatsen en evolutionair geconserveerd tussen verschillende soorten aaltjes. Deze sequenties werden gedeleteerd of gemuteerd, en vervolgens in vivo getest op hun activiteit GFP reporter transgenen in AWB of AWC neuronen tot expressie. Door deze benadering identificeerden we potentiële LIM-4 / SOX-2 en CEH-36 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen die specifiek zijn voor de expressie van GFP in AWB en AWC neuronen respectievelijk 5 vereist. We onderzochten de mogelijke verschillen in de DNA-binding van SOX-2 en SOX-2 G73E behulp van Femsa met de geïdentificeerde LIM-4 / SOX-2 en CEH-36 / SOX-2 aangrenzende doelwit sites. Onze analyse toonde aan dat EMSA SOX-2 G73E de DNA-probe die de LIM-4 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen (vereist voor genexpressie in AWB) niet zo efficiënt WT SOX-2 deed niet binden. Echter, SOX-2 en SOX-2 G73E had geen verschil in het binden van de DNA-probe die het CEH-36 / SOX-2 adjacent target site (die nodig zijn voor genexpressie in AWC) 5,10. Onze analyses geven FEMSA mechanistisch inzicht in de aard van de SOX-2 G73E-mutatie in zowel het gebruik van DNA-bindingsactiviteit van de AWB naar AWC celidentiteit transformatiefenotype. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol van FEMSA met gezuiverd 6xHis-SOX-2 of 6xHis-SOX-2 G73E samen met infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte DNA-probes met de LIM-4 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen als een case study aan te pakken een belangrijke biologische vraag.

<table><tbody><tr><td>30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>Acrylamide is schadelijk en giftig.</td></tr><tr><td>6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)</td><td>ThermoFisher</td><td>MA1-21315</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag M2 antibody&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA) moleculaire biologie kwaliteit</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>5'IRDye700-gelabelde DNA Oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Aangepaste DNA oligo</td><td>Deze worden in het manuscript vermeld als '5'Dye-gelabelde of infrarood fluoresceine dye-gelabelde DNA oligos'. Het bedrijf zal 5' IRDye gelabelde-DNA oligonucleotiden op maat synthetiseren. Vereist minimaal 100&nbsp;&mu;M schaal synthese en HPLC zuivering.</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'-->5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>LightShif Poly (dI-dC)</td><td>ThermoFisher</td><td>20148E</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp;Vertical Electrophoresis Cell&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC&nbsp;</td><td>Dit wordt in het manuscript aangeduid als een 'mini eiwit gel systeem'. Elk elektroforetisch systeem kan worden gebruikt zolang het glazen platen zijn van minder dan 25 cm x 25 cm in grootte.</td></tr><tr><td>Odyssey CLx Infrarood Imaging Systeem</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Odyssey CLx Infrarood Imaging Systeem</td><td>Dit wordt in het manuscript aangeduid als een 'geavanceerd infrarood imaging systeem'.</td></tr><tr><td>Odyssey Fc Imaging Systeem&nbsp;</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Odyssey Fc Dual-Mode Imaging Systeem</td><td>Dit wordt in het manuscript aangeduid als een 'nabij infrarood fluorescent imaging systeem voornamelijk voor Western blots'.</td></tr><tr><td>Image Studio software (versie 4.0)</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Image Studio software&nbsp;</td><td>Dit wordt in het manuscript aangeduid als een 'specifieke imaging software'.&nbsp;</td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3756-25G</td><td></td></tr><tr><td>6x Orange ladingsdye</td><td></td><td></td><td>0.25% Orange G; 30% Glycerol</td></tr><tr><td>0.5x TBE</td><td></td><td></td><td>45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x TE</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x STE</td><td></td><td></td><td>100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>5x Binding Buffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 &#956;g/mL BSA</td></tr></tbody></table>

een geoptimaliseerde protocol voor electroforetische mobility shift assay met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof-gemerkte oligonucleotiden

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Elektroforetische mobiliteit (EMSA) zijn instrumenteel middel om de interacties tussen eiwitten en hun doel DNA-sequenties te karakteriseren. Radioactiviteit de meest gangbare DNA labeling in EMSA&#39;s geweest. Echter, recente vorderingen in fluorescente kleurstoffen en scanmethodes het gebruik van fluorescerende tagging van DNA als alternatief voor radioactiviteit de voordelen van eenvoudige bediening gevraagd, bespaart tijd, lagere kosten en betere veiligheid. We hebben recent gebruikte fluorescerende EMSA (FEMSA) om met succes een belangrijke biologische vraag. Onze FEMSA analyse geeft mechanistisch inzicht in het effect van een missense mutatie, G73E, in de sterk geconserveerd HMG transcriptiefactor SOX-2 op olfactorische soort neuron diversificatie. We vonden dat mutant SOX-2 G73E eiwit verandert specifieke DNA-bindende activiteit, waardoor olfactorische neuron identiteit transformatie veroorzaken. Hier presenteren we een optimale en kosteneffectieve stap-voor-stap protocolvoor FEMSA met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte oligonucleotiden die de LIM-4 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen en gezuiverd SOX-2 eiwitten (WT en mutant SOX-2 G73E eiwitten) als biologisch voorbeeld.

Oranje G ladingskleurstof (6x: 0,12 g oranje G in 100 ml 30% glycerol) kan de bindingsreactie toegevoegd vóór het laden om de voortgang van de elektroforese zichtbaar. Overige laad- kleurstoffen zoals broomfenolblauw zal worden gedetecteerd tijdens het scannen en dus interfereren met beeldanalyse (Figuur 1B). In sommige gevallen van EMSA&#39;s, vooral als nucleair extract preparaat gebruikt, poly-deoxyinosinic...

We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol van TL-elektroforetische mobiliteit shift assays (Femsa) met behulp van gezuiverd SOX-2 eiwitten in combinatie met infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte DNA-probes als een case study van een belangrijke biologische kwestie aan te pakken.

Een geoptimaliseerde protocol voor Electroforetische Mobility Shift Assay Met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof-gemerkte oligonucleotiden

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Het algemene doel van deze assay is het detecteren van eiwit-DNA-interacties met behulp van niet-radioactieve probes. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de moleculaire biologie en biochemie, zoals het bepalen van de DNA-doelsequentie van eiwitten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudig, veilig en tijdbesparend alternatief is voor het gebruik van radioactieve probes.Om deze procedure te starten, bereid een vijf procent native polyacrylamidegel voor die 0,5x tris-boraat-EDTA of TBE en 2,5% glycerol bevat, met behulp van een mini-proteïnegelsysteem. Om 30 milliliter geloplossing voor vier gels te bereiden, meng gedestilleerd water, TBE, ammoniumpersulfaat, TEMED, acrylamide-bis en glycerol. Giet de geloplossing onmiddellijk uit.Wikkel na polymerisatie de gels in transparante vershoudfolie die vooraf is bevochtigd met 0,5x TBE en bewaar deze bij vier graden Celsius. Ontwerp vervolgens een lang oligonucleotide van ongeveer 51 meren. Ontwerp complementaire korte oligonucleotiden van ongeveer 14 meren met een infrarode fluorescerende kleurstofmodificatie aan het vijf-prime uiteinde.Zodra de oligonucleotiden zijn voorbereid, worden

an-optimized-protocol-for-electrophoretic-mobility-shift-assay-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video describes the method to analyze protein-ligand interaction by mobility-shift affinity capillary electrophoresis. This method can be used for characterizing the binding behavior of a protein with various charged ligands.

Mobility Shift Affinity Capillary Electrophoresis: A Method to Analyze Sample-Ligand Interactions Depending on Differential Migration of Protein-Ligand Complexes

In this video, we demonstrate the electrophoretic mobility shift assay to detect protein-DNA interactions using infrared fluorescent-labeled DNA probes. When the protein binds to the DNA probe, it forms a large complex that migrates slowly on and appears as a shifted band on the gel.

Electrophoretic Mobility Shift Assay for Detection of Transcription Factor-DNA Complexes

Studies van biomoleculen in vivo zijn cruciaal voor het begrijpen van moleculaire functie in een biologische context. Hier beschrijven we een nieuwe methode die de internalisatie van fluorescerende biomoleculen, zoals DNA of eiwitten, in levende micro-organismen mogelijk maakt. Analyse van in vivo gegevens opgenomen door middel van fluorescentiemicroscopie wordt ook gepresenteerd en besproken.

Internalisatie en observatie van TL biomoleculen in levende micro-organismen via Electroporatie

Hier presenteren we een protocol om RNA / eiwit interacties te analyseren. De elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA) is gebaseerd op de differentiële migratie van RNA / eiwit-complexen en vrij RNA in natieve gelelektroforese. Door een radioactief gemerkte RNA-probe, kan RNA / eiwit-complexen worden gevisualiseerd door autoradiografie.

Elektroforetische mobiliteit Shift Assay (EMSA) voor de studie van RNA-eiwit interacties: Het IRE / IRP Voorbeeld

We presenteren een strategisch plan en protocol voor het identificeren van niet-coderende genetische varianten die de binding van transcriptiefactoren (TF) aan DNA beïnvloeden. Er wordt een gedetailleerd experimenteel protocol gegeven voor elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay (EMSA) en DNA-affiniteitsprecipitatie-assay (DAPA) analyse van genotype-afhankelijke TF DNA-binding.

Screening voor Functionele niet-coderende genetische varianten Met behulp van Electroforetische Mobility Shift Assay (EMSA) en DNA-affiniteit Neerslag Assay (DAPA)

Inheemse polyacrylamide gelelektroforese is een fundamenteel hulpmiddel voor het analyseren van RNA-eiwitinteracties. Traditioneel hebben de meeste experimenten verticale gels gebruikt. Horizontale gels verschaffen echter verschillende voordelen, zoals de mogelijkheid om complexen te monitoren tijdens elektroforese. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor het genereren en gebruiken van horizontale inheemse gelelektroforese.

Horizontale Gel Electroforese voor Verbeterde Detectie van Proteïne-RNA Complexen

Dit protocol beschrijft de karakterisatie van de polymerase van DNA synthese van gemodificeerd DNA door middel van observatie van wijzigingen in het nabij-infraroodspectrum fluorescently geëtiketteerde DNA met behulp van de Elektroforese van het gel en gel beeldvorming. Acrylamide gels worden gebruikt voor hoge resolutie beeldvorming van de scheiding van korte nucleic zuren, die op verschillende tarieven afhankelijk van grootte migreren.

DNA-Polymerase activiteit Assay gebruikend nabij-infrarood fluorescerende gelabelde DNA gevisualiseerd door Acrylamide Gel elektroforese

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van thiazole oranje voor de opsporing van DNA in gel elektroforese experimenten. Het gebruik van thiazole oranje kunt eliminatie van ethidiumbromide en fluorescentie detectie kan worden bereikt met UV of blauw licht.

De Elektroforese van het DNA met behulp van Thiazole oranje in plaats van ethidiumbromide of alternatieve kleurstoffen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het bepalen van nucleïnezuurmetaboliserende enzymen, met behulp van voorbeelden van ligase-, nuclease- en polymerase-enzymen. De test maakt gebruik van fluorescerend gelabelde en niet-gelabelde oligonucleotiden die kunnen worden gecombineerd om duplexen te vormen die RNA- en/of DNA-schade of tussenproducten van de route nabootsen, waardoor het enzymgedrag kan worden gekarakteriseerd.

Gebruik van gemodificeerde synthetische oligonucleotiden om nucleïnezuurmetaboliserende enzymen te testen

Dit protocol schetst het ontwerp van gesplitste hybridisatiesondes die gebruik maken van fluorescerende oplichtende aptameer DAP-10-42 als signaalreporter en hun toepassing voor nucleïnezuurdetectie en differentiatie tussen doelen met single-nucleotidesubstituties.

Gesplitste hybridisatiesonde die gebruik maakt van een DNA-fluorescerende oplichtende aptameer als signaalreporter voor sequentiespecifieke nucleïnezuuranalyse

Leer een geoptimaliseerd fluorescerend EMSA-protocol voor het detecteren van eiwit-DNA-interacties met infrarood fluorescerende probes. Deze veilige, niet-radioactieve methode bespaart tijd en biedt duidelijke visualisatie voor moleculair biologisch onderzoek.

Een geoptimaliseerde protocol voor Electroforetische Mobility Shift Assay Met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof-gemerkte oligonucleotiden (Video) | JoVE Journal

Een geoptimaliseerde protocol voor Electroforetische Mobility Shift Assay Met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof-gemerkte oligonucleotiden

Meer video's verkennen