Plunge Invriezen: een instrument voor de Ultrastructureel en immunolokalisatiestudies van Suspension Cellen in Transmission Electron Microscopy
5 mei 2017
Dit handschrift beschrijft een gemakkelijk te gebruiken en goedkope Cryofixatie werkwijze voor het zichtbaar suspensiecellen door transmissie- elektronenmicroscopie.
Het doel van de volgende experimenten is om een tool voor te stellen voor ultrastructurele en immunolocalisatiestudies van suspensiecellen voor visualisatie in transmissie-elektronenmicroscopie. Deze techniek is eenvoudig te gebruiken, goedkoop en geeft een uitstekende behoud van de celstructuur. Dit is een kweek van suspensiecellen.
Eerst worden de cellen geoogst door verschillende centrifugaties om een pellet in een microcentrifugebuis te verkrijgen. In een tweede stap wordt het monster snel bevroren door middel van duikbevriezing, waardoor de cellen worden geïmmobiliseerd en de vorming van ijskristallen wordt beperkt. Vervolgens wordt vriessubstitutie uitgevoerd om water te vervangen door oplosmiddel dat osmiumtetraoxide als fixatief bevat om celstructuren te stabiliseren.
De resultaten tonen aan dat duikbevriezing en vriessubstitutie de infrastructuur van de cellen perfect behouden. Chemische fixatie was een primaire methode voor het fixeren van weefsel of cellen voor transmissie-elektronenmicroscopie, maar met deze methode worden meestal artefacten en extractie van cellulaire inhoud waargenomen. Een alternatief voor chemische fixatie is cryofixatie.
Deze methode vertegenwoordigt de beste keuze voor het produceren van de hoogste kwaliteit morfologie in dunne harssecties. Duikbevriezing is een cryofixatietechniek die moleculen in de cel onmiddellijk immobiliseert om schade door conventionele chemische fixatie te voorkomen. Voordat de steekproef wordt ondergedompeld, moet een rooster met Formvar-film worden voorbereid om als ondersteuning voor het bevriezen te worden gebruikt.
Polijst de glazen plaat met een pluisvrij doek tot het glanst en veeg schoon. Dompel de glazen plaat enkele seconden in een oplossing van Formvar 0,3% in chloroform en laat deze rechtop drogen in een beker. De manipulatie moet worden uitgevoerd onder een afzuigkap met beschermende kleding vanwege de aanwezigheid van chloroform.
Na het vullen van een kristallisator met gedistilleerd water, laat een glazen staaf over het wateroppervlak glijden om stof te verwijderen. Wanneer de film droog is, score de randen met een scherp scheermesje zodat de film kan worden opgetild. Besla de plaat door zwaar op de plaat uit te ademen om een laag waterdamp op de film te krijgen.
Drift de film onmiddellijk op het wateroppervlak door de bodem van de plaat aan te raken met een hoek van ongeveer 30 graden ten opzichte van het wateroppervlak. Laat de plaat langzaam in het bad zakken en trek de film er zo nodig vanaf. De Formvar-film zakt langzaam op het wateroppervlak neer.
Bevestig de film op de rand van de kristallisator met behulp van een pincet. Leg voorzichtig de 400-mazig koperroosters met de zijde naar beneden op de film in de gebieden met de juiste dikte en zonder rimpels. De film met roosters wordt opgehaald door ze te bedekken met Joseph-papier terwijl ze op het wateroppervlak drijven.
Pak de rand van het Joseph-papier op en de film met roosters moet mee komen. Laat uw vingers niet het wateroppervlak aanraken, anders loopt u het risico een film in het water achter te laten. Laat de roosters enkele uren drogen voordat u ze gaat gebruiken.
Voor ultrastructurele studies, plaats de osmiumtetraoxide-ampul in een glazen fles. Schud de fles goed om de ampul te breken. Voeg een geschikt volume aceton 100% toe om een eindconcentratie van 4% te hebben. Roer de fles met het vriessubstitutiemedium en doseer 1,5 milliliter porties in cryovialen met een plastic overdrachtspijpje.
Sluit alle doppen en bewaar ze in de vriezer op min 84 graden voor gebruik. Voor studies naar eiwitimmunolabeling, bereid 0,1% uraanacetaat in aceton. Wanneer de oplossing helder wordt, filtreer met behulp van een 0,2 micrometerfilter en doseer 1,5 milliliter porties in cryovialen.
Bewaar ze in de vriezer op min 84 graden voor gebruik. Om er zeker van te zijn dat u de juiste consistentie van pellets van verschillende celtypen heeft, rauwe gistcellen in minimaal compleet vloeibaar medium om één 10 tot de negen cellen te verkrijgen. Escherichia coli in DTY-medium om vijf 10 tot de 10 bacteriecellen te verkrijgen.
Leishmania-flagellum in AM-medium en Trypanosoma brucei in SDM79-medium om vijf 10 tot de acht parasietcellen te verkrijgen. Breng het kweekmedium met suspensiecellen over in een 50 milliliter propleenbuis en centrifugeer gedurende drie minuten bij 1.500 g. Verwijder het supernatant en suspendeer het pellet opnieuw in één milliliter van het respectieve celkweekmedium.
Centrifugeer in een microcentrifugebuis gedurende één minuut bij 3.900 g. Verwijder het supernatant volledig. Voor de duikbevriezingsmethode moet een propaanfles met een buisje dat is verbonden met de propaancilinder worden gebruikt.
Omdat propaan mogelijk explosief is, moet de liquefactie worden uitgevoerd in een goed geventileerde ruimte of in een afzuigkap. Er zijn geen open vlammen toegestaan. Persoonlijke beschermingsmiddelen, inclusief cryohandschoenen, moeten altijd worden gedragen bij gebruik van vloeibaar stikstof.
Plaats een kleine hoeveelheid vloeibaar stikstof in een polystyreenbakje. Plaats de messing kop in vloeibaar stikstof. Er verschijnen bubbels.
Wacht tot de bubbels verdwijnen. De messing kop is dan bevroren. Plaats de buis die is verbonden met de propaancilinder in contact met de muur van de messing kop.
Open voorzichtig de klep van de propaancilinder. Er vormt zich veel rook omdat propaan niet begint te vloeibaar worden. Wanneer het propaan begint te vloeibaar worden, verdwijnt de rook.
Stop de liquefactie door de klep van de propaancilinder te sluiten en snel de buis te verwijderen die is verbonden met de propaancilinder. Vul de polystyreenbak met vloeibaar stikstof tot vijf millimeter vanaf de bovenkant van de messing kop. Bevriest kleine messing kopjes waar we het monster na het bevriezen zullen vervangen door ze in vloeibaar stikstof te plaatsen.
Plaats één kopje voor één monster. Wees voorzichtig om monsters niet te mengen. Om de juiste consistentie van de pellet te verkrijgen, is het alleen nodig om de kweekcondities en centrifugatieparameters te respecteren die eerder zijn aangegeven.
Bevries de pincet voor gebruik. Neem een
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een gebruiksvriendelijke en goedkope cryofixatiemethode voor het visualiseren van suspensiecellen via transmissie-elektronenmicroscopie. De techniek biedt een uitstekende preservering van de cellulaire structuur, waardoor deze geschikt is voor ultrastructurele studies en immunolocalisatie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Elektronenmicroscopie
Achtergrond
- Suspensiecellen vereisen specifieke technieken voor een effectieve visualisatie.
- Traditionele methoden bieden mogelijk geen optimale preservering van cellulaire structuren.
- Transmissie-elektronenmicroscopie is een krachtig instrument voor het bestuderen van de celultrastructuur.
- Snelle vriestechnieken kunnen de vorming van ijskristallen minimaliseren.
Doel van de studie
- Om een kosteneffectieve methode voor te stellen voor het visualiseren van suspensiecellen.
- Om de preservering van cellulaire structuren tijdens microscopie te verbeteren.
- Om ultrastructurele studies en immunolocalisatie te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Oogsten van cellen via centrifugatie om een pellet te verkrijgen.
- Snel plunge-vriezen om de cellen te immobiliseren.
- Vries-substitutie met gebruik van osmiumtetroxide als fixatief.
- Visualisatie met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie.
Belangrijkste resultaten
- De methode behoudt cellulaire structuren effectief.
- De visualisatiekwaliteit is verbeterd in vergelijking met traditionele methoden.
- Het is een kosteneffectieve oplossing voor onderzoekers.
- Het biedt een betrouwbaar instrument voor ultrastructurele studies.
Conclusies
- De voorgestelde cryofixatiemethode is gebruiksvriendelijk en voordelig.
- Het verbetert de visualisatie van suspensiecellen aanzienlijk.
- Deze techniek kan op brede schaal worden toegepast in diverse onderzoeksettings.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Het behoud van de natuurlijke cellulaire ultrastructuur en antigeniciteit is van cruciaal belang voor targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in de vroege fase van geneesmiddelenontwikkeling. Conventionele chemische fixatie introduceert artefacten die de betrouwbaarheid van de gegevens in gevaar brengen, waardoor het risico op uitval in een later stadium toeneemt. Deze kosteneffectieve cryofixatiemethode maakt reproduceerbare, hoogwaardige beeldvorming van suspensiecellen mogelijk, wat bijdraagt aan betrouwbare go/no-go-beslissingen in het preklinische portfoliobeheer.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de natuurlijke eiwitlokalisatie en de integriteit van macromoleculaire complexen te behouden.
- Operationele waarde: Levert artefactvrije ultrastructurele gegevens om pathway-activatie te verduidelijken en mechanistische ambiguïteit te verminderen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het voorspellend vertrouwen in de biologie van het doelwit door de antigeniciteit te behouden voor immunolokalisatiestudies.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare biologische monsters die geschikt zijn voor downstream imaging-gebaseerde screeningplatforms.
- Kwantitatieve output: Levert structurele gegevens en lokalisatiegegevens met een hoge resolutie, waardoor objectieve vergelijkingen tussen experimentele condities mogelijk zijn.
- Schaalbaarheid: Maakt gebruik van toegankelijke apparatuur en protocollen, wat adaptatie over meerdere suspensie-cellijnen voor assay-validatie vergemakkelijkt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelatie: Toepasbaar op pathogenen en modelsystemen (bijv. gist, bacteriën, parasieten) die relevant zijn voor screening van doelwitten bij infectieziekten.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen discovery imaging en preklinische validatie door de ultrastructuur over verschillende modelsystemen te behouden.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Maakt mechanistische risicoreductie mogelijk door middel van gevalideerde structurele gegevens en antigeniciteitsgegevens vóór de lead-optimalisatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is te integreren in vroege discovery-workflows waarbij suspensiecelmodellen worden gebruikt voor target engagement en pathway-analyse, wat de identificatie van lead-verbindingen ondersteunt door middel van betrouwbare structurele en lokalisatie-readouts.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten en de verduidelijking van pathways door het behoud van inheemse macromoleculaire arrangementen en de integriteit van organellen.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie mogelijk door reproduceerbare monstervoorbereiding en kwantitatieve ultrastructurele resultaten.
- Analytics: Levert morfometrische en lokalisatiemetingen die vergelijkende analyse van verbindingen of genetische perturbaties vergemakkelijken.
- Translationeel Onderzoek: Handhaaft continuïteit van discovery tot preklinische stadia door het behoud van antigeniciteit en ultrastructuur in ziekterelevante suspensiemodellen.
- Enterprise Hergebruik: Vertegenwoordigt een herbruikbare, kosteneffectieve capaciteit voor ultrastructurele validatie over meerdere projecten en cellsystemen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen door artefactvrije ultrastructuur en behouden antigeniciteit voor betrouwbare targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over verschillende suspensieceltypen zonder dat hiervoor apparatuur voor hoogdrukvriezen is vereist.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door het verminderen van biologische fout-positieven als gevolg van fixatieartefacten, wat de kapitaalefficiëntie verhoogt.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering op basis van gevalideerde structurele en lokalisatiegegevens, waardoor biologische uitval in een laat stadium wordt verminderd.
Overwegingen bij de implementatie
- Expertise in cryofixatietechnieken en de veilige omgang met vloeibaar propaan en vloeibare stikstof onder condities van een zuurkast.
- Instrumentatie voor plunge freezing (propaansysteem), centrifugatie en beeldvorming met transmissie-elektronenmicroscopie.
- Standaardisatie van reagentia voor vries-substitutie (osmiumtetroxide, uranylacetaat) en spoelprotocollen met aceton/ethanol tussen teams.
- Overwegingen voor aanpassing aan variërende pelletconsistentie en celtypen, waarvoor optimalisatie van centrifugatie- en oogstparameters vereist is.
- Praktische beperkingen omvatten handmatige stappen bij de rastervoorbereiding en het hanteren van cryovials, wat de doorvoersnelheid in omgevingen met grote volumes kan beïnvloeden.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:00
Title
1:38
Preparation of Formvar Grid Film
3:53
Preparation of Freeze-substitution Medium
5:06
Preparation of Cells
6:11
Liquefaction of Propane
7:32
Plunge Freezing of Samples
8:32
Freeze-substitution
9:04
Sample Warming
10:57
Results: Plunge Freezing Results in Improved Preservation of the Intracellular Structures
12:50
Conclusion
