Name: Plunge Invriezen: een instrument voor de Ultrastructureel en immunolokalisatiestudies van Suspension Cellen in Transmission Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: Leer een kosteneffectieve cryofixatiemethode voor ultrastructurele en immunolokalisatiestudies van suspensiecellen met transmissie-elektronenmicroscopie. Deze techniek biedt uitstekende behoud van celstructuren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij spreken onze dank uit aan M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet, en A. Devin voor hun hulp en opmerkingen over de manuscript. We zijn dankbaar voor de elektronische beeldvorming pool van Bordeaux Imaging Center waar de beelden werden genomen. Dit werk werd ondersteund door het Centre National de la Recherche Scientifique.

1. Bereiding van Formvar Grid Film OPMERKING: Voer chloroform manipulatie onder een zuurkast met behulp van persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, laboratoriumjas, glazen). Met 400 mesh koper roosters elektronenmicroscopie. Bij andere soorten rooster (andere maaswijdte, goud en nikkel grids), de kwaliteit van het bevriezen is erger. <ol><li> Bereid een 100 ml oplossing van 0.3% formvar in chloroform. Laat het overnacht lossen zonder schudden. </li><li> Put 400 mesh (aantal openingen per vierkante inch) elektron microscopycopper roosters (diameter 3,05 mm) in een glazen flesje (hoogte 3 cm en de diameter 2 cm) met aceton. Roer het glazen flesje met een cirkelvormige handbeweging. Verwijder het aceton met een plastic pipet overdracht. Laat het oplosmiddel verdampen gedurende 5 minuten. Breng de rasters door ze te gieten op een filtreerpapier en laat ze drogen gedurende 5 minuten. </li><li> Polijsten een 76 x 26 mm2 glasplaatje schoon met een pluisvrije doek tot glanzend / glad.</li><li> Neem een ​​kristallisator (diameter 15 cm, hoogte: 7 cm en capaciteit 1200 ml) en vul tot de rand met gedestilleerd water. Reinig het wateroppervlak door het passeren van een glasstaaf over het oppervlak twee keer om stof te verwijderen. </li><li> Houd het glasplaatje tussen twee vingers en dompel het in de formvar oplossing voor een paar seconden. Houd deze rechtop te drogen onder een omgekeerde beker gedurende 5 minuten. </li><li> Wanneer de film droog is, de score van de randen van de glasplaat met een scherp scheermesje definiëren de grenzen van de folie losraakt van de glijbaan. </li><li> Haal diep adem en adem zwaar op de dia naar een laag waterdamp te krijgen op en onder de film om de film enigszins ondoorzichtig te maken en de zichtbaarheid te vergroten. <ol><li> Onmiddellijk zweven de film op de kristallisator wateroppervlak door op de onderzijde van de schuif met een hoek van ongeveer 30 °. Laat de film afgifte uit de glijbaan en afschilferen op het kristallisator wateroppervlak. Trek de film weg depincet, indien nodig. </li></ol></li><li> Leg de roosters ondersteboven op de film drijvend op het wateroppervlak in de gebieden die de juiste dikte (ongeveer 10 nm) en zonder rimpels. </li><li> Pak de film door het bedekken van de netten Joseph papier ze drijven op het wateroppervlak kristallisator. <ol><li> Houd de Joseph papier met één hand, raakt u het ene uiteinde van de Joseph papier aan één uiteinde van de film. Wacht tot de Joseph papier helemaal nat. Verwijder de Jozef papier met de roosters vast op. </li></ol></li><li> Plaats de roosters gedurende 24 uur in een afgedekte petrischaal voor de definitieve droging en opslag voorafgaand aan gebruik bij kamertemperatuur. </li></ol> 2. Bereiding van vorst-substitutie Medium OPMERKING: Osmiumtetroxide (OsO 4) en uranylacetaat zijn gevaarlijke chemische stoffen. Behandel ze in de zuurkast tijdens het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder een laboratoriumjas en handschoenen. Follow de veiligheidsvoorschriften voor het omgaan (OsO4) en uranyl acetaat. Gebruik O-ring cryovials lekkage van OsO4 voorkomen. <ol><li> ultrastructurele studies <ol><li> Zet glas OsO 4 ampul in een glazen fles. </li><li> Breek de ampul door schudden van de kolf. </li><li> Een zodanig volume aceton 100% tot 4% eindconcentratie te verkrijgen. </li><li> Roer en verdeel 1,5 ml porties in 1,8 ml cryovials. </li></ol></li><li> eiwit immuunlabeling <ol><li> Plaats 0,05 g uranyl acetaat in een glazen kolf. </li><li> Voeg 50 ml 100% aceton. </li><li> Roer de oplossing met een magnetische roerder. Wanneer de oplossing helder wordt, filteren met behulp van een 0,2 urn filter. </li><li> Afzien van 1,5 ml porties in 1,8 ml cryovials. OPMERKING: Bereid de cryovaatjes met freeze-substitutie medium voorafgaand aan de duik invriezen en bewaar ze in -84 ° C vriezer. Keer de glazen fles weg te gooien hetOsO 4 ampul in het gevaarlijk afval. </li></ol></li></ol> 3. Bereiding van Cellen OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang voor het succes van de methode. Voor alle celtypen, groeien de cellen aan het aangegeven aantal cellen te verkrijgen. Centrifugeer de buis aangegeven op de aangegeven tijd en snelheid. <ol><li> Om de geschikte consistentie van de pellets van verschillende celtypen te verkrijgen, groeien de cellen als volgt: <ol><li> Voor Saccharomyces cerevisiae en Schizosaccharomyces pombe, gist inoculeren in 5 ml minimaal of volledig vloeibaar medium. Incubeer overnacht bij 28 ° C, roterende (180 rpm). Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) van de overnacht kweek. Verdun gistcellen tot een OD600 van 0,2 in 50 ml vers selectief medium. Blijven cellen incuberen bij 28 ° C, het roteren, tot 1 x 10 7 9 gistcellen te verkrijgen. </li><li> Voor Leishmania flagellum, inokeningen parasieten in 5 ml AM-medium met 7,5% FCS (foetaal kalfsserum). Incubeer overnacht bij 24 ° C, roterende (180 rpm). Meet de OD 600 van de nachtelijke cultuur. Verdun parasiet cellen aan een OD600 van 0,2 in 50 ml vers selectief medium. Blijven cellen incuberen bij 24 ° C, het roteren, 5 x 10 8 cellen parasiet 12 te verkrijgen. </li><li> Voor Trypanosoma brucei, parasieten inoculeren in 5 ml SDM-79 medium met 10% FCS en 30 ug / ml hygromycine. Incubeer overnacht bij 27 ° C, roterende (180 rpm). Meet de OD 600 van de nachtelijke cultuur. Verdun parasiet cellen aan een OD600 van 0,2 in 50 ml vers selectief medium. Blijven cellen incuberen bij 27 ° C, het roteren, 5 x 10 8 cellen parasiet 13 te verkrijgen. </li><li> Voor Escherichia coli, bacteriën inoculeren in 5 ml DYT medium met 100 ug / ml ampicilline. Incubeer overnacht bij 37 ° C, roterende (180rpm). Meet de OD 600 van de nachtelijke cultuur. Verdun bacteriecellen een OD600 van 0,2 in 50 ml vers selectief medium. Blijven cellen incuberen bij 37 ° C, het roteren, 5 x 10 10 bacteriecellen 14 te verkrijgen. OPMERKING: Na overnacht incubatie kunnen cellen in kweek in hetzij logaritmische en stationaire groeifase. Zeer langzaam groeiende cel stammen kunnen incubatietijd langer dan één nacht, of enten van een groter aantal cellen nodig hebben, zoals empirisch bepaald. </li></ol></li><li> Voor alle celtypes, breng het kweekmedium dat de cellen tot 50 ml polypropyleen buis en centrifugeer gedurende 3 min bij 1.500 x g. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet van alle celtypes in 1 ml van de desbetreffende celkweekmedium. </li><li> Centrifuge alle celtypes in een microcentrifuge buis gedurende 1 min bij 3.900 x g. Volledig verwijderen van de bovenstaande vloeistof. </li><li> Houd de cellen op ijs. </li></ol> Opmerking: Behandel vloeibare stikstof voorzichtig. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder cryogloves en googles. Propaan potentieel explosief, zodat voeren de vloeibaarmaking in een goed geventileerde ruimte of in een zuurkast. Geen open vuur zijn niet toegestaan. <ol><li> Zet ongeveer 150 ml vloeibare stikstof in een schotel van polystyrene. Plaats een koperen kop (hoogte 3,6 cm, diameter 2 cm en de dikte 1,5 mm) in vloeibare stikstof te bevriezen. Laat de vloeibare stikstof door te dringen in de koperen beker. </li><li> Wacht totdat de bellen verdwijnen om zeker te zijn dat de koperen beker is bevroren. </li><li> Zet de slang verbonden met de gasfles in contact met de koperen bekerwand. </li><li> Open voorzichtig propaan cilinderafsluiter. LET OP: Bij deze stap, de propaan vloeibaar wordt in de koperen beker. </li><li> Stop het vloeibaar maken door het sluiten van propaan cilinder en snel verwijderen van de gasslang. </li><li> Vul het polystyreen bak met vloeistof niTrogen tot 5 mm van de bovenkant van de koperen beker. Laat de vloeibare stikstof door te dringen in messing beker. </li></ol> 5. Plunge Bevriezing van het monster <ol><li> Zet ongeveer 200 ml vloeibare stikstof in polystyreen tray. Vries kleine messing bekers (hoogte 1,5 cm diameter 2,5 cm en de dikte 1 mm) door ze in vloeibare stikstof. Zet een cup voor een draagkabel celmonster. Zorg dat er geen monsters te mengen. Daartoe zet monster 1 in de beker 1, monster 2 in de beker 2, enz. </li><li> Bevries de pincet door dompelen de tip in vloeibare stikstof. </li><li> Storten dubbele rand dissectie naald in de verkregen pellet in 3,5. </li><li> Met een pincet, neem een ​​400 mesh koper microscopie rooster bekleed met formvar bereid in paragraaf 1. </li><li> Met het ontleden naald, een druppel van de verkregen pellet in 3,5 op de grid. Probeer verschillende druppel maten (bv 2, 5 en 10 pi). </li><li> Zeer snel dompelen de raster bezit van het pincet in vloeibaar propaan genbeoordeelde hoofdstuk 4 en roer het raster met cirkelvormige beweging gedurende enkele seconden. </li><li> Een snelle overdracht van de bevroren rooster met de pincet om de kleine koperen beker bevroren in paragraaf 5.1. LET OP: Voor elk monster te maken ten minste 3 roosters. bevriezen altijd het pincet alvorens een koperen raster. </li></ol> 6. Freeze-substitutie OPMERKING: Osmiumtetroxide is potentieel explosief, zodat een luchtverfrisser ademhalingstoestel met damppatronen. Het bevriezen van het fixeermiddel in vloeibare stikstof voordat plunge invriezen is ook een oplossing. <ol><li> Voor ultrastructuur studies, opent de cryovial 1,8 ml buisjes met vries-substitutie medium bereid in paragraaf 2.1. Voor immunolokalisatiestudies Open de cryovial 1,8 ml buisjes met vries-substitutie medium bereid in paragraaf 2.2. Plaats de dop op de cryovials. </li><li> Bevries de pincet door dompelen de tip in vloeibare stikstof. </li><li> Snel verwijder de dop en breng de bevroren roosters iNTO de cryovials met de pincet. </li><li> Plaats de dop terug op de cryovials. </li><li> Herhaal dit voor elk raster van elk monster. </li><li> Sluit alle doppen en roer het cryovials met een cirkelvormige handbeweging te zorgen voor de monsters de vries-substitutie medium. </li><li> Plaats de cryovials in een luchtdichte doos voor 3 dagen in een -84 ° C vriezer gedurende het invriezen en vervangingsproces. </li></ol> 7. Monster Warming <ol><li> ultrastructuur studies <ol><li> Dragen de cryovials in een schotel van polystyrene een -30 ° C vriezer (een snelle verwarming te vermijden). Plaats ze in de -30 ° C vriezer gedurende 1 uur. </li><li> Plaats de cryovials in een -15 ° C vriezer gedurende 2 uur. Plaats de monsters bij 4 ° C gedurende 2 uur en daarna gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Verwijder het bevriezen substitutie medium met een kunststof pipet overdracht. Voeg ongeveer 500 pi van 100% aceton. </li><li> Roer het cryoflesje 1,8 mlmet een cirkelvormige handbeweging snel en giet het aceton (1,5 ml) dat de roosters in een glazen flesje (hoogte 3 cm en een diameter van 2 cm). </li><li> Spoel dezelfde cryovial met 1 ml 100% aceton om zeker alle rasters te hebben overgedragen. Roer de cryovial met een cirkelvormige handbeweging en giet de inhoud van de cryovial in een glazen flesje. </li><li> Spoel alle glazen flacon met 3 ml 100% aceton 3 keer gedurende 10 min. </li><li> Volg de procedures inbedding en integratie zoals beschreven in referentie 15. Impregneren monster met toenemende concentraties van epoxyhars in aceton (25%, 50% en 75%) en verankeren van het monster met 100% epoxyhars gelatinecapsules. </li></ol></li><li> immuunlabeling studies <ol><li> Draag de 1,8 ml cryovials in een schotel van polystyrene de -30 ° C vriezer (een snelle verwarming te vermijden). </li><li> Plaats de cryovials gedurende 2 uur in een -30 ° C vriezer. </li><li> Bij een -30 °<html> C vriezer, roer het cryoflesje met een cirkelvormige handbeweging snel en giet de bevriezing substitutie medium in een polypropeen flesje (5 cm en diameter 1,5 cm). </li><li> Vervang het bevriezen substitutie medium met 2 ml vers medium vries-substitutie. </li><li> Plaats de polypropyleen flesje gedurende 2 uur in een -30 ° C vriezer. </li><li> Spoel het polypropeen flesje gedurende 1 uur met 2 ml 100% aceton en drie keer gedurende 1 uur met 2 ml 100% ethanol. </li><li> Volg de procedures inbedding en integratie zoals beschreven in referentie 15. Impregneren monster met toenemende concentraties van acrylhars (25%, 50% en 75% in aceton) en verankeren van het monster met 100% acrylhars in gelatinecapsules. </li></ol></li></ol> 8. Visualisatie van monsters <ol><li> Na inbedden, maakt 80 nm ultradunne secties van de monsters met een ultramicrotoom. Contrast secties met 2% loodcitraat bij kamertemperatuur gedurende 1 minass = &quot;xref&quot;&gt; 15. </li><li> Gebruik een 80 kV en 120 kV elektronenmicroscoop aan de secties 15 te observeren. </li></ol>

<ol><li>Palade, G. E., Porter, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+endoplasmic+reticulum.+I.+Its+identification+in+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ.</a> J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).</li>
<li>Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artefacts+and+morphological+changes+during+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Artefacts and morphological changes during chemical fixation.</a> J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).</li>
<li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+high+pressure+frozen+samples%3A+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).</li>
<li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Out+with+the+old+and+in+with+the+new%3A+rapid+specimen+preparation+procedures+for+electron+microscopy+of+sectioned+biological+material%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material.</a> Protoplasma. 251, 429-448 (2014).</li>
<li>Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).</li>
<li>Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+counterbalances+endoplasmic+reticulum+expansion+during+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response.</a> PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).</li>
<li>Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+non-selective+autophagic+degradation+of+mitochondria+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast.</a> Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).</li>
<li>Gilkey, J. C., Staehling, A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jemt.1060030206/abstract">Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure.</a> Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).</li>
<li>Nogales, E., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM%3A+A+Unique+Tool+for+the+Visualization+of+Macromolecular+Complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity.</a> Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).</li>
<li>Baba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy in yeast.</a> Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).</li>
<li>Leunissen, J. L. M., Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-pressurized+rapid+freezing+%28SPRF%29%3A+a+novel+cryofixation+method+for+specimen+preparation+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy.</a> J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).</li>
<li>Lefebvre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LdFlabarin+a+new+BAR+domain+membrane+protein+of+Leishmania+flagellum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum.</a> PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).</li>
<li>Tetaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TbFlabarin%2C+a+flagellar+protein+of+Trypanosoma+brucei%2C+highlights+differences+between+Leishmania+and+Trypanosoma+flagellar-targeting+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals.</a> Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).</li>
<li>Wasmer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+NMR+spectroscopy+reveals+that+E+coli+inclusion+bodies+of+HET-s%28218-289%29+are+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).</li>
<li>Lefebvre-Legendre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+to+assemble+the+alpha+3+beta+3+subcomplex+of+the+ATP+synthase+leads+to+accumulation+of+the+alpha+and+beta+subunits+within+inclusion+bodies+and+the+loss+of+mitochondrial+cristae+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).</li>
<li>Paumard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ATP+synthase+is+involved+in+generating+mitochondrial+cristae+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology.</a> EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).</li>
<li>Gabriel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fox2-dependent+fatty+acid+%C3%9F-oxidation+pathway+coexists+both+in+peroxisomes+and+mitochondria+of+the+ascomycete+yeast+Candida+lusitaniae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae.</a> PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).</li>
<li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+rapid+cooling+and+its+implications+for+cryoimmobilization+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells.</a> Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).</li>
<li>Meryman, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+living+cells%3A+principles+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of living cells: principles and practice.</a> Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).</li>
<li>Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close-to-native+ultrastructural+preservation+by+high+pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing.</a> Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).</li>
<li>Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+high-pressure+freezing+and+quick+freeze+substitution+of+plant+tissues+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51844(2014).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+autophagy+in+the+filamentous+fungus+Podospora+anserina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina.</a> Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).</li>
<li>Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+chemical+fixation+method+suitable+for+immunogold+localization+of+green+fluorescent+protein+in+the+Golgi+apparatus+of+tobacco+Bright+Yellow+%28BY-2%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells.</a> J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).</li>
<li>Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+high+pressure+freezing+and+freeze+substitution+method+to+preserve+the+labile+vaccinia+virus+nucleocapsid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid.</a> J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij hebben geen belangenconflicten.

TEM is een krachtige methode voor ultrastructurele waarneming van organellen, cellen en weefsels. Cryofixatie / vries-substitutie is momenteel de beste methode voor het behoud van zowel ultrastructuur en eiwitten antigeniciteit. Chemische fixatieven penetreren en handelen langzaam waardoor structurele herschikkingen vóór de volledige stabilisatie van de ultrastructuur 2. Omgekeerd Cryofixatie / vries-substitutie stabiliseert direct cellulaire structuren 4. Echter, Cryofixa...

Monster voorbereiding is van cruciaal belang voor het succes van een elektronenmicroscopie studie. EM conventionele fixatie was de primaire methode voor het bevestigen van weefsels of cellen voor transmissie elektronenmicroscopie (TEM) 1. Eerst, aldehyden en osmiumtetroxide worden gebruikt om het materiaal bij kamertemperatuur chemisch oplossen. Daarna wordt het materiaal met organische oplosmiddelen gedehydrateerd, geïnfiltreerd en ingebed in epoxyhars. Deze werkwijze is afhankelijk van de penetratiegraad van fixatieven in de cel. Bijgevolg worden de artefacten en winning van celinhoud meestal waargenomen 2. Cryofixatie is duidelijk een beter alternatief voor het behoud van cellulaire structuren 3, waardoor ze intact. De hoogste kwaliteit van TEM beelden 4 in dunne harssecties kunnen worden verkregen met de Cryofixatie / vries substitutiemethode. Het doel van deze techniek is om verglaasd bi verkrijgensche monsters zonder ijskristallen vormen of met ijskristallen klein genoeg de ultrastructuur van de cellen te beschadigen. Hoge druk invriezen (HPF) en ultrasnelle Cryofixatie, die ook wel plunge freezing (PF), op twee manieren monsters cryofix. HPF immobiliseert moleculen in de cel onmiddellijk en voorkomt schade door conventionele EM fixatie. Verschillende soorten bevriezen machines en automatische vervanging apparaten zijn ontwikkeld 5. Bevriezing machines en materialen (vloeibare stikstof, monsterdragers, etc.) zijn duur, maar ze zorgen voor de productie van hoogwaardige elektronmicrografen 6, 7. PF is een techniek die gebruikt werd in de vroege jaren 1950 en in de literatuur beschreven als eenvoudige en goedkope 8 .Tijdens de PF procedure wordt het voorbereide monster bevroren bij een hoge snelheid te verkrijgen ijskristallen kleiner dan 3 tot 5 nm. Daartoe wordt het monsterondergedompeld in een vloeibaar cryogeen, zoals ethaan, propaan, of een etheen-propeen-mengsel. Sinds de jaren 1950 zijn er verbeteringen van PF gedaan om deze techniek beschikbaar te maken voor een groter aantal gebruikers. Hogedruk vriezen is momenteel de enige werkbare manier om een groot aantal monsters te bevriezen dikker dan 50 urn (tot een dikte van 200 urn voor schijfvormige monsters) 5, terwijl PF grote schaal wordt gebruikt voor beeldvorming kleine voorwerpen (&lt;100 nm ) zoals macromoleculaire complexen gesuspendeerd in een dunne film van amorf ijs 9. Grotere monsters, bijvoorbeeld eukaryote cellen, kunnen worden cryofixed PF, maar vereist monsterhouders, zoals capillaire buizen of koper sandwichsystemen 8, 10, 11. Hier een snelle, eenvoudig te gebruiken en voordelig plunge freezing / vries-substitutie technologie geschikt voor diverse suspensie celkweken gepresenteerd.

<table><tbody><tr><td>Grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>T400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Formvar</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>Propaan N35</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dubbele rand dissectie naald</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72947</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>61802-02</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetraoxide</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19130</td><td></td></tr><tr><td>Glazen vial 8.5 mL</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>64252</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl acetaat</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>48851</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>Sigma</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Glijmiddelvrije glazen plaatjes</td><td>VWR international</td><td>631-9439</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrylic hars</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>104371</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy hars M</td><td>Sigma</td><td>10951</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy hars M verharder</td><td>Sigma</td><td>10953</td><td></td></tr><tr><td>Dibutyl ftalaat</td><td>Sigma</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy hars M versneller</td><td>Sigma</td><td>10952</td><td></td></tr><tr><td>Kristallisatiekamer</td><td>Fischer scientific</td><td>08-762-9</td><td></td></tr><tr><td>Joseph papier</td><td>VWR international</td><td>111-5009</td><td></td></tr><tr><td>Messen kommen</td><td></td><td></td><td>doe het zelf winkel of zelf gemaakt</td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shizosacharomyces cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leishmania amazonensis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luchtdichte doos</td><td>Fischer scientific</td><td>7135-0001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Luchtzuiverende ademhalingsbeschermer</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 7502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cartridge voor ademhalingsbeschermer</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 6001</td><td></td></tr><tr><td>Deeltjesfilter</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 5N11&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

plunge invriezen: een instrument voor de ultrastructureel en immunolokalisatiestudies van suspension cellen in transmission electron microscopy

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is een buitengewone hulpmiddel voor het bestuderen van cel ultrastructuur, om eiwitten te lokaliseren en te visualiseren macromoleculaire complexen bij zeer hoge resolutie. Echter, om zo dicht mogelijk bij de oorspronkelijke staat te krijgen, is perfect monster- conservering vereist. Conventionele elektronenmicroscopie (EM) fixatie met aldehyden, bijvoorbeeld, biedt geen goede ultrastructurele bewaring. De langzame penetratie van fixatieven induceert cel reorganisatie en het verlies van de verschillende celcomponenten. Daarom is de conventionele EM fixatie niet zorgen voor een onmiddellijke stabilisatie en behoud van structuren en antigeniciteit. De beste keuze voor de behandeling van intracellulaire gebeurtenissen op Cryofixatie gevolgd door vries-substitutie fixatiemethode dat cellen houdt in hun natieve toestand te gebruiken. Hoge druk invriezen / vries-substitutie, die de integriteit van cellulaire ultrastructuur behoudt, is de meest gebruikte methode, maar vereist expensive apparatuur. Hier wordt een eenvoudig te gebruiken en goedkope vries fixatiemethode gevolgd door vries-substitutie voor suspensie celkweken gepresenteerd.

In dit artikel wordt een eenvoudig te gebruiken en goedkope plunge freezing werkwijze voor ultrastructurele (figuur 1 en figuur 2) en immunokleuring (figuur 3) studies gepresenteerd. We laten zien dat het niet nodig is om speciale apparatuur voor de vries-substitutie procedure en dat de opwarming procedure duurt minder dan 6 uur in plaats van de 24 uur met behulp van een speciaal systeem. <p cla...

Dit handschrift beschrijft een gemakkelijk te gebruiken en goedkope Cryofixatie werkwijze voor het zichtbaar suspensiecellen door transmissie- elektronenmicroscopie.

Plunge Invriezen: een instrument voor de Ultrastructureel en immunolokalisatiestudies van Suspension Cellen in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Het doel van de volgende experimenten is om een tool voor te stellen voor ultrastructurele en immunolocalisatiestudies van suspensiecellen voor visualisatie in transmissie-elektronenmicroscopie. Deze techniek is eenvoudig te gebruiken, goedkoop en geeft een uitstekende behoud van de celstructuur. Dit is een kweek van suspensiecellen.Eerst worden de cellen geoogst door verschillende centrifugaties om een pellet in een microcentrifugebuis te verkrijgen. In een tweede stap wordt het monster snel bevroren door middel van duikbevriezing, waardoor de cellen worden geïmmobiliseerd en de vorming van ijskristallen wordt beperkt. Vervolgens wordt vriessubstitutie uitgevoerd om water te vervangen door oplosmiddel dat osmiumtetraoxide als fixatief bevat om celstructuren te stabiliseren.De resultaten tonen aan dat duikbevriezing en vriessubstitutie de infrastructuur van de cellen perfect behouden. Chemische fixatie was een primaire methode voor het fixeren van weefsel of cellen voor transmissie-elektronenmicroscopie, maar met deze methode worden meestal artefacten en extractie van cellulaire inhoud waargenomen. Een alternatief voor chemische fixatie is cryofixatie.Deze methode vertegenwoordigt de beste keuze voor het produceren van de hoogste kwaliteit morfologie in dunne harssecties. Duikbevriezing is een cryofixatietechniek die moleculen in de cel onmiddellijk immobiliseert om schade door conventionele chemische fixatie te voorkomen. Voordat de steekproef wordt ondergedompeld, moet een rooster met Formvar-film worden voorbereid om als ondersteuning voor het bevriezen te worden gebruikt.Polijst de glazen plaat met een pluisvrij doek tot het glanst en veeg schoon. Dompel de glazen plaat enkele seconden in een oplossing van Formvar 0,3% in chloroform en laat deze rechtop drogen in een beker. De manipulatie moet worden uitgevoerd onder een afzuigkap met beschermende kleding vanwege de aanwezigheid van chloroform.Na het vullen van een kristallisator met gedistilleerd water, laat een glazen staaf over het wateroppervlak glijden om stof te verwijderen. Wanneer de film droog is, score de randen met een scherp scheermesje zodat de film kan worden opgetild. Besla de plaat door zwaar op de plaat uit te ademen om een laag waterdamp op de film te krijgen.Drift de film onmiddellijk op het wateroppervlak door de bodem van de plaat aan te raken met een hoek van ongeveer 30 graden ten opzichte van het wateroppervlak. Laat de plaat langzaam in het bad zakken en trek de film er zo nodig vanaf. De Formvar-film zakt langzaam op het wateroppervlak neer.Bevestig de film op de rand van de kristallisator met behulp van een pincet. Leg voorzichtig de 400-mazig koperroosters met de zijde naar beneden op de film in de gebieden met de juiste dikte en zonder rimpels. De film met roosters wordt opgehaald door ze te bedekken met Joseph-papier terwijl ze op het wateroppervlak drijven.Pak de rand van het Joseph-papier op en de film met roosters moet mee komen. Laat uw vingers niet het wateroppervlak aanraken, anders loopt u het risico een film in het water achter te laten. Laat de roosters enkele uren drogen voordat u ze gaat gebruiken.Voor ultrastructurele studies, plaats de osmiumtetraoxide-ampul in een glazen fles. Schud de fles goed om de ampul te breken. Voeg een geschikt volume aceton 100% toe om een ​​eindconcentratie van 4% te hebben. Roer de fles met het vriessubstitutiemedium en doseer 1,5 milliliter porties in cryovialen met een plastic overdrachtspijpje.Sluit alle doppen en bewaar ze in de vriezer op min 84 graden voor gebruik. Voor studies naar eiwitimmunolabeling, bereid 0,1% uraanacetaat in aceton. Wanneer de oplossing helder wordt, filtreer met behulp van een 0,2 micrometerfilter en doseer 1,5 milliliter porties in cryovialen.Bewaar ze in de vriezer op min 84 graden voor gebruik. Om er zeker van te zijn dat u de juiste consistentie van pellets van verschillende celtypen heeft, rauwe gistcellen in minimaal compleet vloeibaar medium om één 10 tot de negen cellen te verkrijgen. Escherichia coli in DTY-medium om vijf 10 tot de 10 bacteriecellen te verkrijgen.Leishmania-flagellum in AM-medium en Trypanosoma brucei in SDM79-medium om vijf 10 tot de acht parasietcellen te verkrijgen. Breng het kweekmedium met suspensiecellen over in een 50 milliliter propleenbuis en centrifugeer gedurende drie minuten bij 1.500 g. Verwijder het supernatant en suspendeer het pellet opnieuw in één milliliter van het respectieve celkweekmedium.Centrifugeer in een microcentrifugebuis gedurende één minuut bij 3.900 g. Verwijder het supernatant volledig. Voor de duikbevriezingsmethode moet een propaanfles met een buisje dat is verbonden met de propaancilinder worden gebruikt.Omdat propaan mogelijk explosief is, moet de liquefactie worden uitgevoerd in een goed geventileerde ruimte of in een afzuigkap. Er zijn geen open vlammen toegestaan. Persoonlijke beschermingsmiddelen, inclusief cryohandschoenen, moeten altijd worden gedragen bij gebruik van vloeibaar stikstof.Plaats een kleine hoeveelheid vloeibaar stikstof in een polystyreenbakje. Plaats de messing kop in vloeibaar stikstof. Er verschijnen bubbels.Wacht tot de bubbels verdwijnen. De messing kop is dan bevroren. Plaats de buis die is verbonden met de propaancilinder in contact met de muur van de messing kop.Open voorzichtig de klep van de propaancilinder. Er vormt zich veel rook omdat propaan niet begint te vloeibaar worden. Wanneer het propaan begint te vloeibaar worden, verdwijnt de rook.Stop de liquefactie door de klep van de propaancilinder te sluiten en snel de buis te verwijderen die is verbonden met de propaancilinder. Vul de polystyreenbak met vloeibaar stikstof tot vijf millimeter vanaf de bovenkant van de messing kop. Bevriest kleine messing kopjes waar we het monster na het bevriezen zullen vervangen door ze in vloeibaar stikstof te plaatsen.Plaats één kopje voor één monster. Wees voorzichtig om monsters niet te mengen. Om de juiste consistentie van de pellet te verkrijgen, is het alleen nodig om de kweekcondities en centrifugatieparameters te respecteren die eerder zijn aangegeven.Bevries de pincet voor gebruik. Neem een ​​

plunge-freezing-tool-for-ultrastructural-immunolocalization-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Illustreren we hier hoe u elektron cryotomography (ECT) te gebruiken om de ultrastructuur van bacteriële cellen in near-native staten studie, om "macromoleculaire" (~ 4 nm) resolutie.

Electron Cryotomography van bacteriële cellen

Neuronale processen bewaren voor ultrastructurele analyse beschrijven we een protocol voor beplating van primaire neuronen van elektronenmicroscopie netten gevolgd door flash-bevriezen, waardoor monsters gesuspendeerd in een laag van glasachtige ijs. Deze monsters kunnen worden onderzocht met een cryo-elektronenmicroscoop om structuren te visualiseren op de nanometer schaal.

Voorbereiding van de primaire neuronen voor het visualiseren neurites in een bevroren gehydrateerd Staat Met behulp van Cryo-electron tomography

Basistechnieken en verfijningen van freeze-fractuur verwerking van biologische monsters en nanomaterialen voor onderzoek door transmissie elektronenmicroscopie worden beschreven. Deze techniek is een aangewezen methode voor het onthullen ultrastructureel functies en specialisaties van biologische membranen en voor het verkrijgen van Ultrastructureel dimensionale en ruimtelijke gegevens in materials sciences en nanotechnologie producten.

Fundamentele Technische Elementen van Freeze-fractuur / Freeze-ets in Biological Electron Microscopy

Het verkrijgen van hoogwaardige transmissie-elektronenmicroscoopbeelden is een uitdaging, vooral in het geval van plantencellen, die overvloedige grote watergevulde vacuolen en beluchte ruimtes hebben. Tandem hogedrukvriestechniek en snelle vriessubstitutie verminderen de bereidingstijd van plantenmonsters voor TEM aanzienlijk, terwijl ze monsters produceren met uitstekende ultrastructurele behoud.

Tandem Hogedruk Invriezen en Quick Freeze Vervanging van plantaardige weefsels voor Transmission Electron Microscopy

We ontwikkelden een nieuwe techniek in elektronenmicroscopie, "flash-and-vries," dat de visualisatie van membraan dynamiek met ms temporele resolutie mogelijk maakt. Deze techniek combineert de optogenetic stimulatie van neuronen met hogedruk vriezen. Hier tonen we de procedures en een beschrijving van de protocollen in detail.

Flash-en-Freeze: een nieuwe techniek op Capture Membrane Dynamics met Electron Microscopy

Hier is een protocol voor celkweek op siliciumnitride membranen en Plunge-bevriezing voorafgaand aan röntgenfluorescentie Imaging met een Synchrotron cryogene X-Ray nanoprobe. Wanneer alleen kamertemperatuur nano-analyse wordt verstrekt, kunnen de bevroren monsters verder gevriesdroogd worden. Dit zijn cruciale stappen om informatie te verkrijgen over de intracellulaire Elemental Composition.

Celkweek op siliciumnitride membranen en Cryopreparation voor Synchrotron X-Ray fluorescentie nano-analyse

Hier wordt een protocol gepresenteerd dat de monstervoorbereiding en gegevensverzamelingsstappen beschrijft die nodig zijn in cryo zachte röntgentomografie (SXT) om de ultrastructuur van hele cryo-geconserveerde cellen in beeld te brengen met een resolutie van 25 nm halve toonhoogte.

Een 3D cartografische beschrijving van de cel door Cryo Soft X-ray Tomography

Hier laten we zien hoe het sandwich-vriesapparaat kan worden gebruikt voor het snel invriezen van biologische monsters, waaronder bacteriën, gist, gekweekte cellen, geïsoleerde cellen, dierlijke en menselijke weefsels en virussen. We laten ook zien hoe u monsters kunt voorbereiden op ultradunne secties na snelvriezen.

Snelvriezen met behulp van sandwichbevriezingsapparaat voor goed ultrastructureel behoud van biologische monsters in elektronenmicroscopie

Dit manuscript schetst de blot-and-plunge-methode om biologische monsters handmatig te bevriezen voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje.

Handmatige Blot-and-Plunge Freezing van biologische monsters voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje

Hier presenteren we een pijplijn voor 3D-correlatieve gerichte ionenbundelfrezen op het begeleiden van de voorbereiding van cellulaire monsters voor cryo-elektronentomografie. De 3D-positie van fluorescerend gelabelde eiwitten van belang wordt eerst bepaald door cryo-fluorescentiemicroscopie en vervolgens gericht op frezen. Het protocol is geschikt voor zoogdieren, gisten en bacteriële cellen.

Monstervoorbereiding door 3D-correlatieve gefocuste ionenbundelfrezen voor cryo-elektronentomografie met hoge resolutie

Dit videoprotocol illustreert hoe scanning-transmissie-elektronenmicroscopietomografie van virologische monsters moet worden uitgevoerd. Voor optimale resultaten worden monsters bereid door vries onder hoge druk en daaropvolgende vriessubstitutie.

Scanning transmissie-elektronenmicroscopietomografie in de virologie: 3D-beeldvorming van onder hoge druk ingevroren, vriesgesubstitueerde monsters

Leer een kosteneffectieve cryofixatiemethode voor ultrastructurele en immunolokalisatiestudies van suspensiecellen met transmissie-elektronenmicroscopie. Deze techniek biedt uitstekende behoud van celstructuren.

Plunge Invriezen: een instrument voor de Ultrastructureel en immunolokalisatiestudies van Suspension Cellen in Transmission Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal

Plunge Invriezen: een instrument voor de Ultrastructureel en immunolokalisatiestudies van Suspension Cellen in Transmission Electron Microscopy

Meer video's verkennen