Name: Het meten van nitriet en nitraat, metabolieten in de stikstofoxide pathway, in biologische materialen met behulp van de chemoluminescentiemethode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Leer hoe u nitriet en nitraat kwantificeert in biologische monsters met behulp van chemiluminescentie. Deze eenvoudige en zeer gevoelige methode volgt stikstofoxide-metabolisme en -signalering in vasculaire biologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Auteurs willen kritische bijdragen van Dr A. Dejam en MM Pelletier erkennen in de ontwikkeling van het gebruik van nitriet behoud oplossing voor de nitriet metingen in het bloed.

Alle protocollen waaronder het gebruik van dieren werden goedgekeurd voor gebruik door NIDDK Animal Care en gebruik Comite en menselijk bloed werd verkregen van NIH Bloedbank van gezonde donoren. 1. Monstervoorbereiding <ol><li> Bereiding van nitriet behoud oplossing <ol><li> Bereid een oplossing die 890 mM kalium ferricyanide (K3Fe (CN) 6) en 118 mM NEM (N-ethylmaleïmide) in gedestilleerd water. Ontbinden goed totdat duidelijk is geel met geen kristallen aanwezig. Add NP-40 (octyl phenoxylpolyethoxylethanol) in een 1: 9 verhouding (v / v NP-40 / oplossing). Meng voorzichtig om schuimen en opslag voor ongeveer een week voorkomen bij 4 ° C). </li></ol></li><li> Verzameling en voorbereiding van bloedmonsters <ol><li> Verzamel bloed gebruikmakend van tenminste een 20 G naald hemolyse met heparine voorkomen coagulatie (5 U / ml) te voorkomen. Voor het hele bloedmonster, meng bloed met nitriet behoud oplossing onmiddellijk in een 1: 4 verhouding (v/ V oplossing / bloed). </li><li> Voor plasma en rode bloedcellen monsters gecentrifugeerd bloed verzameld gedurende 5 minuten bij 4000 xg bij 4 ° C om rode bloedcellen (RBC) en plasma te scheiden. Neem de bovenstaande vloeistof (plasma) en meng dit met behoud nitriet oplossing zoals hierboven beschreven voor de bepaling van nitriet in het plasma. </li><li> Verwijder voorzichtig resterende plasma en buffy coat uit het monster en pipet RBC monster uit de bodem van de buis verontreinigende andere soorten bloedcellen met een cut-off pipetpunt vermijden en deze hoeveelheid in een buisje met nitriet behoud oplossing in dezelfde verhouding als hierboven. </li><li> Meng elk monster (plasma en RBC) met koude methanol in een verhouding 1: 1 of 1: 2 (v / v sample / methanol) en centrifugeer ze bij 13.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 minuten om eiwitten neer te slaan. Neem de bovenstaande vloeistof en gebruiken voor het meten nitriet of bevriezen bereide monsters, indien nodig, op droog ijs en bewaar bij -80 ° C. Opmerking: Nitriet snel reacts met oxyhemoglobin (OxyHb) in bloedvormende nitraat. Aangezien OxyHb is altijd aanwezig in grote overmaat nitriet via deze reactie leidt tot nagenoeg volledige vernietiging van natuurlijk bloed nitriet met een tijdsbestek van ~ 10 min. Om de meeste endogene bloed nitriet te behouden, wordt nitriet behoud oplossing toegevoegd aan de hele bloedmonsters onmiddellijk na de bloedafname. De oplossing wordt snel lyseren van rode bloedcellen en oxideren OxyHb in methemoglobine (MetHb), een inactieve vorm van hemoglobine die niet chemisch reageert met nitriet. </li></ol></li><li> Bereiding van monsters van andere typen lichaamsvloeistof <ol><li> Na de monstername in de juiste container, meng goed met nitriet behoud oplossing, deproteinate en meet onmiddellijk of invriezen en bewaren bij -80 ° C. </li></ol></li><li> Verzameling en voorbereiding van weefselmonsters <ol><li> Verzamel weefsels van dieren geperfundeerd met gehepariniseerde zoutoplossing (10 U heparin / ml). Accijns ongeveer 1 g gewenst weefsel en homogeniseer ofwel middels een handmatige homogeniseerinrichting of een geautomatiseerd homogenisator. </li><li> Voeg bekende hoeveelheid nitriet behoud oplossing nodig om vloeiende homogenaat bereiken. </li><li> Zodra wordt gehomogeniseerd, precipiteren eiwitten met koud methanol (1: 1 of 1: 2 verhouding v / v sample / methanol) zoals hierboven beschreven, centrifugeer monsters bij 13.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Verzamel supernatant en meet nitriet niveaus. Indien nodig, te bevriezen monsters in elk stadium van de voorbereiding op droog ijs en bewaar bij -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Bereiding reduceerhulzen Solutions <ol><li> Tri-jodide (I 3) vermindering oplossing voor nitriet en R- (X) -NO determinatie 1,3,4 <ol><li> Bereid een oplossing van 301 mM KI samen met 138 mm I 2-oplossing in water. Meng met ijsazijn in 2: 7 verhouding (v / v oplossing / zuur) op een magnetische roerder gedurende ~ 30 minuten totdat allekristallen worden opgelost. Bij voorkeur te houden in een donkere fles, zoals jodide is lichtgevoelig, en gebruik binnen een week van voorbereiding. Opmerking: Deze oplossing zal verminderen nitriet in NO, en het zal ook los NO van R-SNO, R-NNO en Fe-NO functionele groepen (R- (X) -NO), maar nitraat zal niet worden aangetast. Het signaal van de hierboven NO gebaseerde functionele groepen kunnen van de ware nitriet signaal gescheiden worden door behandeling van de helft van het monster met aangezuurde sulfanilamide (AS) en het vergelijken van AS-behandelde en onbehandelde signaal. AS irreversibel vormt diazonium kation met nitriet en dit complex kan dan worden verminderd met I 3 oplossing. Voor AS behandeling, voor te bereiden 290 mm oplossing van sulfanilamide in 1 M HCl en voeg deze toe aan een portie van het monster in een verhouding van 1: 9 (v / v AS / monster). Meet de CL signaal AS-behandelde en onbehandelde delen van het monster. Bereken het ware nitriet signaal als verschil AS-behandelde en onbehandelde deel van het monster. Nitriet kan ook worden gemeten met een selectieve nitrite reducerende oplossing van ascorbinezuur / azijnzuur mengsel als beschreven in deel 2.2. Vanwege de gewoonlijk kleine hoeveelheid R- (X) -NO aanwezige soort metingen met AS-onbehandelde monsters in de meeste gevallen een zeer goede benadering van de totale nitriet. </li></ol></li><li> Ascorbinezuur / azijnzuur (4A) oplossing voor selectieve bepaling van nitriet 2 <ol><li> Bereid 500 mM ascorbinezuur in water. Meng deze oplossing met ijsazijn in een verhouding 1: 7 (v / v, ascorbinezuur / azijnzuur) om het reactiemengsel te bereiden. Opmerking: Deze oplossing is specifiek voor nitriet, niet NO vrijgeven van een R- (X) -NO species of nitraat. Echter, moet de oplossing van ascorbinezuur en azijnzuur vers bereid elke dag vóór de meting, ascorbinezuur gemakkelijk oxideert in oplossing. Voltooiing van nitriet reductie hangt af van de concentratie ascorbinezuur; en ten minste 50 mM ascorbinezuur wordt aanbevolen voor volledige rafvoer van plasma nitriet. Het is echter aanbeveling om enkele proef experimenten met verschillende concentraties ascorbinezuur en nitriet normen op het verwachte nitriet concentratiebereik vóór eindmonster metingen. Houd in gedachten dat ascorbinezuur enigszins put tijdens de metingen, zijn zo frequente wijzigingen van het reactiemengsel in het glas reactiekamer aanbevolen. </li></ol></li><li> Vanadium (III) chloride verminderen oplossing voor nitraat bepaling 9 <ol><li> Bereid 51 mM oplossing van VCL 3 in 1 M HCl. Filter oplossing door 200 um filter en op te slaan in een donkere fles, te gebruiken binnen twee weken. Opmerking: Deze oplossing zal nitraat, nitriet en alle R- (X) -NO soorten te verminderen, dus als vergelijkbare hoeveelheden van nitriet of andere R- (X) -NO aanwezige soorten samen met nitraat zijn, de uiteindelijke nitraatgehalte moet worden berekend als het verschil tussen de signalen CL verkrijgbaar VCL 3 en I3 reducerende oplossingen. </li></ol></li></ol> 3. chemiluminescentie (CL) Analyzer Setup en Metingen <ol><li> Standaard oplossing <ol><li> Bereid 1 pM oplossing van natriumnitriet (NaNO 2). Dezelfde oplossing kan gebruikt worden voor nitriet en nitraat bepalingen. </li></ol></li><li> Het gebruik van NO-analysator Let op: er zijn er twee in de handel verkrijgbare NO analyzers die gevoelig genoeg is voor biologisch onderzoek doeleinden - Sievers NOA en Ecophysics CLD 88Y. Beiden werken volgens hetzelfde principe; Het belangrijkste verschil is dat CLD 88Y gebruikt zuurstof uit de kamerlucht ozon maken (O 3), terwijl NOA is een externe zuurstoftank hiervoor. De onderstaande procedure beschrijft de set-up voor de Sievers NOA. <ol><li> instrument setup <ol><li> Voer de eerste opzet van de NO-analysator volgens de aanbevelingen van de fabrikantzoals te zien in Figuur 1. </li><li> Open O 2 tank is aangesloten op het instrument. Kies &quot;analyse&quot; en &quot;enter&quot; in het hoofdmenu op het voorpaneel. Op het volgende scherm kies &quot;start&quot; en druk op &quot;enter&quot;. Sluit het zuur trap (bevattende 1 M NaOH) aan het instrument zoals getoond in figuur 1. </li><li> Wacht tot fotomultiplicator afgekoeld om de temperatuur beneden -12 ° C en de reactiekamer wordt geëvacueerd tot 6 Torr. Het duurt ongeveer 30 minuten om een ​​stabiele vlakke basislijn te bereiken. De basislijn moet stabiliseren zoals 1-2 mV, de nominale waarde minder belangrijk is dan de stabiliteit. Opmerking: Als nitraat gemeten, zet het koelwaterbad (ingesteld op 4 ° C, welke als koelval dient voor zuur en waterdamp) en verwarming waterbad (de belangrijkste reactiekamer, 95 ° C). De snelheid van de reductie van nitraat in NO in VCL 3 oplossing temperatuurafhankelijk is, en het is heel traag bij kamertemperatuur tempetuur, zodat aanzienlijke toename van de temperatuur nodig om de reactie te observeren. </li><li> Open Hij tank en sluit de glazen reactiekamer zuur val zoals te zien op Figuur 1. Vul de reactiekamer met de juiste oplossing te verminderen, vermindering van de borrelende om minimum en sluit reactiekamer om het zuur te houden. Met behulp van trial and error, stel de hij borrelen tarief voor het instrument aanzuigsnelheid (meestal ~ 200 ml / min voor Siever&#39;s NOA) overeenkomen. </li><li> Schakel de computer die het instrument en start Labview gebaseerde Liquid software. Voor het inschakelen van de communicatie tussen het instrument en de acquisitie software, druk op &quot;enter&quot; als in &quot;menu data&quot; tot het scherm leest &quot;output enabled&quot; en druk op &quot;duidelijk&quot; om terug te keren naar data-scherm. </li><li> Wacht tot een stabiele basislijn spoor op het scherm en start het injecteren van monsters en standaarden in nitriet verminderen oplossing door het septum. Altijd wachten om een ​​stabiele basislijn aft te bereikenre van de piek. Dit kan tot 2 min. De Liquid software heeft een optie om &quot;teken&quot; tijden van de injectie en annoteren de injectie en het zal deze opmerkingen exporteren naar een apart bestand (filename.info) als een nuttige aanvulling op het gegevensbestand (filename.data). </li><li> Zodra monsters en standaarden worden gemeten, kiest u &quot;stop&quot; optie in het Liquid software menu - zullen deze gegevens van een tijdelijk bestand te schrijven in een permanente file bekend als &quot;filename.data&quot;. Door op &quot;afbreken&quot; optie zal de meting te beëindigen zonder het schrijven van verkregen gegevens in een permanente file. </li><li> Om experiment beëindigen, verwijdert u de machine uit het reactievat door het uitschakelen van de kraan op de top van reactievat en koppel de slang tussen zuur val en reactievat (zie figuur 1). Nu stoppen met NOA analyzer - druk op &quot;duidelijk&quot;, ga naar &quot;analyseren&quot;, zet de machine op &quot;standby&quot; en &quot;bevestigen&quot; stand-by. Bij regelmatig, de gebruikteinstrument kan worden achtergelaten in de standby-modus voor enkele weken. Schakel de toevoer van zuurstof. Spoel vervolgens de reducerende oplossing uit de reactiekamer, ontkoppel en sluit Hij tank uit de glazen reactievat en klaar bent met het reinigen van reactievat. </li></ol></li><li> Normen en sample-injecties <ol><li> Injecteer 50 pi 1 uM nitriet oplossing in reactiemengsel onder toepassing van een goed gewassen Hamilton spuit. Wacht minstens 1-2 min tussen de injecties tot goede scheiding van pieken te bereiken. Herhaal de injectie van 50 ul duplicaten aan elk data punt te krijgen. Was de spuit met gedemineraliseerd water na elke injectie. </li><li> Om de volledige set van gegevens voor standaard curve te verwerven, verder met dubbele injecties van 100, 150 pi (extra 200 ul kan nodig zijn als hoge concentraties nitriet en nitraat wordt verwacht) van 1 uM nitriet oplossing. In elk geval, zorg om te wachten totdat het signaal weer zakt naar de basislijn en vervolgens verwerven 1-2 min van baseline tot goede scheiding van pieken te bereiken. Noot: Nitriet normen kan worden gemeten op elk moment tijdens experimenten. Echter de voorkeur om de standaardkromme voor meetgegevens te verkrijgen, omdat het ook dient als een onafhankelijke controle instrument functionaliteit. Wanneer de gegevens worden verzameld, hoeveelheid monster geïnjecteerd moet leiden tot een goed uitgesproken pieken. Toch moet er rekening mee worden gehouden dat de fotomultiplicator is lineair slechts tot ~ 800 mV, zodat geen van de piek moet hoger zijn dan ~ 700 mV zijn. Dit kan worden bereikt door het verminderen van de hoeveelheid geïnjecteerde monster of verdunnen van het monster met gedeïoniseerd water. Elk punt moet worden gemeten ten minste in tweevoud. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Nitrite+in+Blood+Samples+Using+the+Ferricyanide-Based+Hemoglobin+Oxidation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay.</a> Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).</li>
<li>Nagababu, E., Rifkind, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+plasma+nitrite+by+chemiluminescence+without+interference+of+S-%2C+N-nitroso+and+nitrated+species%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species.</a> Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).</li>
<li>Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E. The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPinder%2C+AG+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Redox-Mediated+Signal+Transduction%22">Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction</a>. Hancock, J. T. 476, Humana press. Totowa, NJ. 11-28 (2008).</li>
<li>Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+measurement+of+blood+and+plasma+nitrite+by+chemiluminescence%3A+pitfalls+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions.</a> Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).</li>
<li>Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+circulating+nitrite+and+S-nitrosothiols+by+reductive+chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B%22%5BJournal%5D)">Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence.</a> J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).</li>
<li>Bryan, N. S., Grisham, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+detect+nitric+oxide+and+its+metabolites+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples.</a> Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).</li>
<li>Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+gas-phase+chemiluminescence+and+flow+injection+analysis+for+measurement+of+nitric+oxide+pool+in+biological+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices.</a> Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).</li>
<li>Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+for+the+sensitive+and+specific+measurement+of+S-nitrosothiols%2C+iron-nitrosyls+and+Nitrite+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples.</a> Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).</li>
<li>Smárason, A. K. 1, Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+serum+nitrate%2C+a+stable+end+product+of+nitric+oxide%2C+in+women+with+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Obstet+Gynaecol%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia.</a> Br J Obstet Gynaecol. 104 (5), 538-543 (1997).</li>
<li>Beckman, J. S., Congert, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Measurement+of+Dilute+Nitric+Oxide+in+Solution+with+an+Ozone+Chemiluminescent+Detector%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%3A+A+companion+to+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector.</a> Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).</li>
<li>Bates, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+measurements+by+chemiluminescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroprotocols%3A+A+companion+to+Methods+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection.</a> Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).</li>
</ol>

Dr. Alan Schechter wordt vermeld als een co-uitvinder verschillende octrooien de National Institutes of Health voor het gebruik van nitriet zouten voor de behandeling van cardiovasculaire ziekten. Hij ontvangt royalties gebaseerd op NIH verlening van deze octrooien voor de klinische ontwikkeling, maar geen andere compensatie.

Kritische stappen in het protocol Monsters van alle oplossingen (inclusief het water) wordt gebruikt voor te bereiden, te verdunnen of op andere wijze te behandelen originele monsters moeten worden opgeslagen en gecontroleerd op mogelijke nitriet of (vaker) de verontreiniging door nitraten. We vonden dat de meeste vervuiling afkomstig is van water en vele chemicaliën die worden gebruikt bij de behandeling van het monster (ferricyanide in het bijzonder) aanzienlijk deel van de verontreiniging do...

Nitriet, en in mindere breiden nitraat in bloed tijdens algemene toestand van lichaam NO metabolisme. Nitriet concentraties in het bloed en de meeste organen en weefsels zijn alleen in hoge nanomolaire of lage micromolaire bereik, nitraat gewoonlijk aanwezig in veel hogere hoeveelheden - in het micromolaire bereik. Veranderingen in nitrietniveaus door ziekteprogressie of veranderingen in voedingsgewoonten zijn vrij klein en alleen kan worden gemeten met een zeer gevoelige methode. Vanwege hun verschillende niveaus en metabolische processen, afzonderlijke bepaling van nitriet en nitraat niveau essentieel. Zogenaamde &quot;NOx bepaling&quot; wanneer nitriet en nitraat elkaar gemeten heeft weinig waarde. Verschillende werkwijzen voor het kwantificeren nitriet in diverse biologische monsters ontwikkeld - de meest voorkomende is de oudste, gebaseerd op het Griess reactie die oorspronkelijk in 1879 had beschreven Zelfs met moderne WIJZIGIns, de gevoeligheid grenswaarde voor nitriet haalbaar door Griess &#39;methode is in de lage micromolaire bereik. Chemiluminescentie (CL), in combinatie met tri-jodide reducerende oplossing, wordt momenteel beschouwd als de meest gevoelige methode, waardoor kwantificatie in het lage nanomolaire bereik van nitrietconcentraties 1-8,10,11. Dezelfde methode CL combinatie met vanadium (III) chloride reducerende oplossing, kan worden gebruikt voor gevoelige metingen van nitraat, nauwkeurig in het nanomolaire gebied 9. CL detecteert vrij gas NO. Daarom nitriet, nitraat, R-nitrosothiols (R-SNO), R-nitrosoamines (R-NNO) of metaal-verbindingen NO (later in manuscript genoemd &quot;R- (X) -NO&quot;), worden omgezet in vrij NO gas teneinde de oorspronkelijke hoeveelheid gekwantificeerd via CL. Conversie naar NO wordt bereikt met verschillende reducerende oplossingen, afhankelijk van de aard van de NO metaboliet. Na de conversie wordt vrij NO gas verwijderd uit het reactievat door een dragergas (He, N2 of Ar) in de reactiekamer van CL analysator waarin ozon (O 3) wordt gecombineerd met NO om stikstofdioxide (NO 2) in de geactiveerde toestand. Bij terugkeer naar de grondtoestand, NO 2 * uitzendt in infrarode gebied en uitgezonden foton wordt gedetecteerd door fotomultiplicator (PMT) van CL instrument. De intensiteit van het uitgezonden licht is rechtevenredig met NO-concentratie reactiekamer, waarop de berekening van de concentratie van de oorspronkelijke soorten met de juiste calibratie curves maakt. In ons protocol, we eerst het huidige CL op basis van de bepaling van nitriet en nitraat in de meest gebruikte klinische instellingen - in het bloed en plasma, en dan bespreken we hoe deze ionen in de weefselmonsters te bepalen. Ook nader uiteen hoe de oorspronkelijke fysiologische nitrietconcentratie in nitrietvrije reactieve omgevingen, zoals bloed en de compartimenten, plasma en rode bloedcellen te behouden.

<table><tbody><tr><td>kaliumferricyanide; K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-ethylmaleïmide</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-nonylfenyl-polyethyleenglycol</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>sulfanilamide; AS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>azijnzuur, glazuur</td><td>Sigma</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>ascorbinezuur&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>kaliumiodine; KI</td><td>Sigma</td><td>60399</td><td></td></tr><tr><td>jodium; I2</td><td>Sigma</td><td>207772</td><td>lichtgevoelig, giftig</td></tr><tr><td>natriumnitriet; NaNO2</td><td>Sigma</td><td>563218</td><td></td></tr><tr><td>vanadium(III)chloride; VCl3</td><td>Sigma</td><td>208272</td><td>licht gevoelig, giftig</td></tr><tr><td>GentleMac</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sievers NOA 280i</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLD 88Y</td><td>&nbsp;Ecophysics&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

het meten van nitriet en nitraat, metabolieten in de stikstofoxide pathway, in biologische materialen met behulp van de chemoluminescentiemethode

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Stikstofoxide (NO) is een van de belangrijkste regulator moleculen in vasculaire homeostase en ook een neurotransmitter. Enzymatisch geproduceerde NO wordt geoxideerd tot nitriet en nitraat door interacties met diverse oxy-heem eiwitten en andere nog niet bekende paden. Het omgekeerde proces, was reductie van nitriet en nitraat in NO ontdekt in zoogdieren in het laatste decennium en wordt steeds meer aandacht als een van de mogelijke wegen ofwel voorkomen of verlichten van een hele reeks cardiovasculaire, metabole en spierziekten waarvan men vermoedt dat worden geassocieerd met een verminderde niveaus van NO. Het is daarom belangrijk om de hoeveelheid NO en zijn metabolieten schatten verschillende lichaamscompartimenten - bloed, lichaamsvloeistoffen en de verschillende weefsels. Bloed, vanwege de goede bereikbaarheid, is de geprefereerde compartiment wordt gebruikt voor de schatting van NO metabolieten. Vanwege de korte levensduur (paar milliseconden) en lage sub-nanomolaire concentratie, directe betrouwbare metingen van het bloed NO &lt;em&gt; In vivo huidige grote technische problemen. Aldus NO beschikbaarheid wordt meestal geschat op basis van de hoeveelheid van de oxidatieproducten, nitriet en nitraat. Deze twee metabolieten worden altijd apart gemeten. Er zijn verschillende goed gevestigde werkwijzen om de concentraties in biologische vloeistoffen en weefsels te bepalen. Hier presenteren we een protocol voor chemoluminescentiemethode (CL), gebaseerd op spectrofotometrische detectie van NO na nitriet of nitraat door tri-jodide of vanadium (III) chloride-oplossing, respectievelijk. De gevoeligheid voor nitriet en nitraat opsporing is in lage nanomolaire bereik, die CL stelt als de meest gevoelige methode die momenteel beschikbaar zijn voor veranderingen in NO metabole routes te bepalen. We in detail uitleggen hoe je monsters van biologische vloeistoffen en weefsels te bereiden met het oog op de originele hoeveelheid nitriet en nitraat aanwezig op het moment van de collectie en hoe ze hun respectieve bedragen in monsters te bepalen behouden. Beperkingen van de CL-techniek zijn ook explained.

Figuur 2 toont representatieve resultaten vanuit normen en vijf verschillende monsters. Zoals getoond in deze figuur fotomultiplicator voltage onmiddellijk optreedt na nitriet-houdende oplossing (standaards of monsters) wordt geïnjecteerd in reducerende oplossing (injecties geraadpleegd worden door rode pijlen onder de curve) en keert terug naar de basislijn waarde als alle nitriet in het geïnjecteerde oplossing werd verminderd. Het is ook duidelijk uit deze figuur die n...

Stikstofmonoxide (NO) is een belangrijk signaalmolecuul bij vasculaire homeostase. NO-productie in vivo is te laag voor directe meting. Chemiluminescentie biedt nuttige inzichten in de NO-cyclus via het meten van zijn precursoren en oxidatieproducten, nitriet en nitraat. De bepaling van nitriet/nitraat in lichaamsweefsels en -vloeistoffen wordt uitgelegd.

Het meten van nitriet en nitraat, metabolieten in de stikstofoxide pathway, in biologische materialen met behulp van de chemoluminescentiemethode

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

Het doel van dit protocol is om chemiluminescentie te gebruiken om stikstofmonoxide in biologische monsters te kwantificeren door de niveaus van nitriet en nitraat te kwantificeren, met behulp van trijodide en vanadiumchloride reducerende oplossingen. Dit protocol biedt een krachtig hulpmiddel voor het volgen van stikstofmonoxide metabolisme en signalering, zowel regionaal als longitudinaal vanuit een verscheidenheid aan biologische monsters. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de eenvoud en hoge gevoeligheid.Demonstrerend deze procedure zal Katelyn Cassel, onze IRTA-fellow, zijn. Zij zal ons laten zien hoe nitriet gemeten kan worden door chemiluminescentie gekoppeld aan trijodide oplossing. Om te beginnen, maak een nitriet-behoudende oplossing.Bereid een oplossing met één 118 millimolair NEM en 890 millimolair kalium-ferrocyanide in gedistilleerd water. Los de vaste stoffen op tot de oplossing helder geel is zonder kristallen. Voeg vervolgens deze oplossing toe aan NP 40 in een volume-op-volume verhouding van 9 tot 1.Meng de oplossing voorzichtig om schuimen te voorkomen. Voorts mag dit mengsel nooit worden gevortist. De nitriet-behoudende oplossing kan ongeveer een week worden gebruikt als het bij 4 graden Celsius wordt bewaard.Het protocol kan worden gebruikt op veel vers verkregen biologische monsters. In dit geval werd vers afgenomen bloed gecentrifugeerd om een plasmamonster voor testen te verkrijgen. Het is erg belangrijk om bloed of andere biologische monsters die een grote hoeveelheid heem-eiwitten bevatten, zoals hemoglobine of myoglobine, zo snel mogelijk te verwerken, omdat de heem-eiwitten zullen reageren met het nitriet en het nitriet zullen vernietigen.Nu, om het grootste deel van het endogene bloednitriët onmiddellijk te bewaren, meng het plasma met een nitriet-behoudende oplossing in een 1 tot 4 volume-op-volume verhouding. Tijdens elk stadium van deze bereiding kan het monster op droog ijs worden ingevroren. Om het monster te deproteineren, meng het met een gelijke hoeveelheid koud methanol.Centrifugeer vervolgens het monster gedurende 15 minuten bij 13000 G en 4 graden Celsius om eiwitten te laten bezinken. Neem het supernatant en gebruik het voor nitrietmeting. Voor gevoelige meting van nitriet wordt een trijodide reducerende oplossing als het meest effectief beschouwd.Zorg er bij het bereiden ervan voor dat alle kristallen oplossen. Bewaar de oplossing in een donkere fles en gebruik het binnen een week na bereiding. Een vanadiumchloride reducerende oplossing biedt de meeste nauwkeurigheid voor het meten van nitraat.Een 1 micromolaire oplossing van nitriet wordt gebruikt voor de bepaling van de standaardcurve voor nitriet, evenals nitraat. Stel de stikstofmonoxide analyzer in volgens de instructies van de fabrikant. Open eerst de zuurstoftank, zet het instrument aan en verbind het met een zuurval, die één molaire natriumhydroxide bevat.Open vervolgens de heliumtank en verbind de glazen reactiekamer met de heliumtank. Laad nu de reactiekamer met trijodide oplossing voor nitrietmeting. Voeg anti-schuimmiddel toe.Pas de gastoevoersnelheid aan om het kabbelen te vertragen. Verbind vervolgens de zuurval met de reactiekamer. Pas de heliumstroom aan, gebruikend proef en fout, om de zuigkracht van het instrument te matchen.Start nu de op visuele programmering gebaseerde vloeistofsoftware. Schakel eerst de communicatie tussen het instrument en de acquisitiesoftware in vanuit het Data-menu, dan vanuit het hoofdmenu op het voorpaneel start de analyse. Wacht tot de fotomultiplierkoeler is afgekoeld tot onder min 12 graden Celsius en de fotomultiplier is gestabiliseerd.Na ongeveer 30 minuten zal de baseline zijn gestabiliseerd tot binnen 1 of 2 millivolt. De stabiliteit van de waarde is cruciaal, niet de waarde zelf. Nadat de analyzer is gestabiliseerd, gebruik een goed gewassen Hamilton-seringpomp om oplossingen te injecteren.Injecteer eerst ten minste drie verschillende volumes van de 1 micromolaire nitriet standaard. Injecteer de oplossingen in de reducerende oplossing door het septum. Injecteer elke standaard of monster twee keer.Indien hoge nitrietniveaus en monsters worden verwacht, overweeg dan om een groot vierde volume van standaard nitrietoplossing te injecteren voor een betere bepaling van de helling van de standaardcurve. Observeer altijd de output en wacht tot de analyzer weer is gestabiliseerd naar de baseline voordat u het volgende monster injecteert. Dit duurt minimaal een minuut.Gebruik monstervolumes die onder de 700 millivolt pieken voor nauwkeurige resultaten. Was de spuit grondig met gedeïoniseerd water tussen runs. Het is erg belangrijk om de spuit grondig te wassen.Nadat alle metingen zijn gedaan, drukt u op de stop optie in de software. De gegevens worden automatisch opgeslagen. Door op stoppen te drukken, wordt de meting beëindigd zonder de gegevens op te slaan.Sluit de afsluitkraan bovenop de reactievat en koppel de slang die de zuurval en de reactievat verbindt los. Zet na het experiment de analyzer op standby. Druk op analyse op het hoofdpaneel en bevestig dat deze in de standby-modus gaat.Schakel vervolgens de zuurstoftoevoer uit. Koppel de slang van de O2-tank naar de zuurval los. Spoel vervolgens de trijodide oplossing uit met helium.Sluit vervolgens en koppel de heliumtank los van de glazen reactievat. Reinig tenslotte het vat met ethanol en water indien nodig. Het testen van standaarden samen met plasmamonsters toont aan dat onmiddellijk na hun injectie de fotomultiplier spanning toeneemt en terugkeert naar de baseline zodra al het nitriet is gereduceerd, wat tot een minuut kan duren.Om het signaal te kwantificeren, werd een standaardcurve geconstrueerd van de standaarden, met behulp van het gebied onder de piek van de spanningssprong. Met behulp van de standaardcurve was de kwantificering van de monsters zeer reproduceerbaar tussen hun dubbele injecties. Chemiluminescentie wordt beschouwd als de gouden standaard voor het bepalen van nitrietconcentraties.Eenmaal beheerst, is de gevoeligheidslimiet voor nitriet zo laag als twintig millimolar. Het belangrijkste bij het

measuring-nitrite-nitrate-metabolites-nitric-oxide-pathway-biological

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De endogene productie van stikstofoxide (NO) regelt diverse biologische functies. Het wordt steeds duidelijker dat verstoring of ontregeling van NO op basis van signalering is betrokken bij vele ziekten bij de mens. Methoden voor het kwantificeren van relevante NO metabolieten kunnen nieuwe diagnostische of prognostische biomarkers voor ziekte bij de mens.

Analytische technieken voor het testen van stikstofoxide biologische activiteit

De niveaus van het ontstekingssignaalmolecuul stikstofmonoxide (NO) worden gewoonlijk gemeten met behulp van Griess reagens. In dit protocol hebben we een aangepaste Griess-test gemaakt die gebruik maakt van levend Drosophila hersenweefsel om de afscheiding van NO op een eenvoudige, meetbare en zeer herhaalbare manier te detecteren.

Nieuwe kwantitatieve analyse van het gehele weefsel van stikstofmonoxideniveaus bij de Drosophila neuro-inflammatoire respons

In dit artikel beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige manier aangepast met de fluorescentie kleurstof diaminofluorescein 2-diacetaat (DAF-2DA) en dihydroethidium (DHE) voor en face gelijktijdige detectie en visualisatie van intracellulaire stikstofoxide (NO) en superoxide anion (O 2 .- ) respectievelijk in vers geïsoleerde intacte aorta's van een obesitas muismodel.

En Face Detection van stikstofoxide en superoxide in endotheellaag van Intact slagaders

Vorige werk suggereert dat de stikstofisotopische samenstelling van atmosferische stikstofoxiden de invloed van verschillende bronnen in het milieu zou kunnen onderscheiden. We rapporteren over een geautomatiseerde, mobiele, veldgebaseerde methode voor de hoge verzamelingsefficiëntie van atmosferisch NOx voor N-isotopische analyse met een uurlijkse tijdresolutie.

Geautomatiseerd, hoge-resolutie Mobile opvangsysteem voor de Stikstof isotopenanalyse van NO<sub&gt; x</sub

Dit witboek beschrijft stikstofmonoxide (NO) fumigatie protocollen voor postharvest ongediertebestrijding. Begassing kamers zijn gespoeld met stikstof (N2) ultralow zuurstof voorwaarden voordat NO vast te stellen wordt geïnjecteerd. Aan het eind, zijn kamers gespoeld met N2 om te verdunnen NO vóór bloot producten aan de lucht om te voorkomen dat blootstelling aan2.

Procedures van laboratorium fumigatie voor ongediertebestrijding met stikstofmonoxide Gas

Α-hydroxylatie van kankerverwekkende nitrosaminen door cytochroom P450s is de geaccepteerde metabolische weg die produceert van DNA-beschadiging tussenproducten, die leiden mutaties tot. Nieuwe gegevens blijkt evenwel verdere oxidatie te nitrosamides kan optreden. We beschrijven een algemene methode voor het opsporen van nitrosamides vervaardigd uit in vitro cytochroom P450-gekatalyseerde metabolisme van nitrosaminen.

Een algemene methode voor het opsporen van Nitrosamide-formatie in het metabolisme In Vitro van nitrosaminen door cytochroom P450s

Een reeks methoden om de potentiële DNRA-snelheid te bepalen op basis van 14NH4+/15NH4+ analyses wordt in detail verstrekt. NH4+ wordt omgezet in N2O via verschillende stappen en geanalyseerd met behulp van quadrupole gaschromatografie-massaspectrometrie.

Meting van de potentiële tarieven van dissimilatorische nitraatreductie naar Ammonium op basis van 14NH4+/15NH4+ Analyses via sequentiële conversie naar N2O

We presenteren protocollen voor drie verschillende methoden voor de homogenisatie van vier verschillende spiergroepen van rattenskeletspierweefsel om de niveaus van nitraat en nitriet te meten en te vergelijken. Verder vergelijken we verschillende monstergewichten om te onderzoeken of de grootte van het weefselmonster de resultaten van homogenisatie beïnvloedt.

Bereiding van ratskeletspieren homogenaten voor nitraat- en nitrietmetingen

Hier presenteren we protocollen voor het detecteren van stikstofmonoxide en zijn biologisch relevante derivaten met behulp van op chemiluminescentie gebaseerde assays met een hoge gevoeligheid.

Chemiluminescentie-gebaseerde assays voor de detectie van stikstofmonoxide en zijn derivaten van autoxidatie en nitrosated compounds

Dit protocol beschrijft een methode om de productie van stikstofoxide (NO) te kwantificeren in luchtwegepitelculturen die gedifferentieerd zijn bij het lucht-vloeistofinterface (ALI) door nitriet te meten in apicale secreties met behulp van een trijodide-gebaseerde chemiluminescentie-assay.

Meting van stikstofmonoxideproductie in muizen-tracheale epitheelcelculturen, onderscheiden aan de lucht-vloeistofgrens

Leer hoe u nitriet en nitraat kwantificeert in biologische monsters met behulp van chemiluminescentie. Deze eenvoudige en zeer gevoelige methode volgt stikstofoxide-metabolisme en -signalering in vasculaire biologie.

Het meten van nitriet en nitraat, metabolieten in de stikstofoxide pathway, in biologische materialen met behulp van de chemoluminescentiemethode (Video) | JoVE Journal

Het meten van nitriet en nitraat, metabolieten in de stikstofoxide pathway, in biologische materialen met behulp van de chemoluminescentiemethode

Meer video's verkennen