Het meten van nitriet en nitraat, metabolieten in de stikstofoxide pathway, in biologische materialen met behulp van de chemoluminescentiemethode
25 december 2016
Stikstofmonoxide (NO) is een belangrijk signaalmolecuul bij vasculaire homeostase. NO-productie in vivo is te laag voor directe meting. Chemiluminescentie biedt nuttige inzichten in de NO-cyclus via het meten van zijn precursoren en oxidatieproducten, nitriet en nitraat. De bepaling van nitriet/nitraat in lichaamsweefsels en -vloeistoffen wordt uitgelegd.
Het doel van dit protocol is om chemiluminescentie te gebruiken om stikstofmonoxide in biologische monsters te kwantificeren door de niveaus van nitriet en nitraat te kwantificeren, met behulp van trijodide en vanadiumchloride reducerende oplossingen. Dit protocol biedt een krachtig hulpmiddel voor het volgen van stikstofmonoxide metabolisme en signalering, zowel regionaal als longitudinaal vanuit een verscheidenheid aan biologische monsters. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de eenvoud en hoge gevoeligheid.
Demonstrerend deze procedure zal Katelyn Cassel, onze IRTA-fellow, zijn. Zij zal ons laten zien hoe nitriet gemeten kan worden door chemiluminescentie gekoppeld aan trijodide oplossing. Om te beginnen, maak een nitriet-behoudende oplossing.
Bereid een oplossing met één 118 millimolair NEM en 890 millimolair kalium-ferrocyanide in gedistilleerd water. Los de vaste stoffen op tot de oplossing helder geel is zonder kristallen. Voeg vervolgens deze oplossing toe aan NP 40 in een volume-op-volume verhouding van 9 tot 1.
Meng de oplossing voorzichtig om schuimen te voorkomen. Voorts mag dit mengsel nooit worden gevortist. De nitriet-behoudende oplossing kan ongeveer een week worden gebruikt als het bij 4 graden Celsius wordt bewaard.
Het protocol kan worden gebruikt op veel vers verkregen biologische monsters. In dit geval werd vers afgenomen bloed gecentrifugeerd om een plasmamonster voor testen te verkrijgen. Het is erg belangrijk om bloed of andere biologische monsters die een grote hoeveelheid heem-eiwitten bevatten, zoals hemoglobine of myoglobine, zo snel mogelijk te verwerken, omdat de heem-eiwitten zullen reageren met het nitriet en het nitriet zullen vernietigen.
Nu, om het grootste deel van het endogene bloednitriët onmiddellijk te bewaren, meng het plasma met een nitriet-behoudende oplossing in een 1 tot 4 volume-op-volume verhouding. Tijdens elk stadium van deze bereiding kan het monster op droog ijs worden ingevroren. Om het monster te deproteineren, meng het met een gelijke hoeveelheid koud methanol.
Centrifugeer vervolgens het monster gedurende 15 minuten bij 13000 G en 4 graden Celsius om eiwitten te laten bezinken. Neem het supernatant en gebruik het voor nitrietmeting. Voor gevoelige meting van nitriet wordt een trijodide reducerende oplossing als het meest effectief beschouwd.
Zorg er bij het bereiden ervan voor dat alle kristallen oplossen. Bewaar de oplossing in een donkere fles en gebruik het binnen een week na bereiding. Een vanadiumchloride reducerende oplossing biedt de meeste nauwkeurigheid voor het meten van nitraat.
Een 1 micromolaire oplossing van nitriet wordt gebruikt voor de bepaling van de standaardcurve voor nitriet, evenals nitraat. Stel de stikstofmonoxide analyzer in volgens de instructies van de fabrikant. Open eerst de zuurstoftank, zet het instrument aan en verbind het met een zuurval, die één molaire natriumhydroxide bevat.
Open vervolgens de heliumtank en verbind de glazen reactiekamer met de heliumtank. Laad nu de reactiekamer met trijodide oplossing voor nitrietmeting. Voeg anti-schuimmiddel toe.
Pas de gastoevoersnelheid aan om het kabbelen te vertragen. Verbind vervolgens de zuurval met de reactiekamer. Pas de heliumstroom aan, gebruikend proef en fout, om de zuigkracht van het instrument te matchen.
Start nu de op visuele programmering gebaseerde vloeistofsoftware. Schakel eerst de communicatie tussen het instrument en de acquisitiesoftware in vanuit het Data-menu, dan vanuit het hoofdmenu op het voorpaneel start de analyse. Wacht tot de fotomultiplierkoeler is afgekoeld tot onder min 12 graden Celsius en de fotomultiplier is gestabiliseerd.
Na ongeveer 30 minuten zal de baseline zijn gestabiliseerd tot binnen 1 of 2 millivolt. De stabiliteit van de waarde is cruciaal, niet de waarde zelf. Nadat de analyzer is gestabiliseerd, gebruik een goed gewassen Hamilton-seringpomp om oplossingen te injecteren.
Injecteer eerst ten minste drie verschillende volumes van de 1 micromolaire nitriet standaard. Injecteer de oplossingen in de reducerende oplossing door het septum. Injecteer elke standaard of monster twee keer.
Indien hoge nitrietniveaus en monsters worden verwacht, overweeg dan om een groot vierde volume van standaard nitrietoplossing te injecteren voor een betere bepaling van de helling van de standaardcurve. Observeer altijd de output en wacht tot de analyzer weer is gestabiliseerd naar de baseline voordat u het volgende monster injecteert. Dit duurt minimaal een minuut.
Gebruik monstervolumes die onder de 700 millivolt pieken voor nauwkeurige resultaten. Was de spuit grondig met gedeïoniseerd water tussen runs. Het is erg belangrijk om de spuit grondig te wassen.
Nadat alle metingen zijn gedaan, drukt u op de stop optie in de software. De gegevens worden automatisch opgeslagen. Door op stoppen te drukken, wordt de meting beëindigd zonder de gegevens op te slaan.
Sluit de afsluitkraan bovenop de reactievat en koppel de slang die de zuurval en de reactievat verbindt los. Zet na het experiment de analyzer op standby. Druk op analyse op het hoofdpaneel en bevestig dat deze in de standby-modus gaat.
Schakel vervolgens de zuurstoftoevoer uit. Koppel de slang van de O2-tank naar de zuurval los. Spoel vervolgens de trijodide oplossing uit met helium.
Sluit vervolgens en koppel de heliumtank los van de glazen reactievat. Reinig tenslotte het vat met ethanol en water indien nodig. Het testen van standaarden samen met plasmamonsters toont aan dat onmiddellijk na hun injectie de fotomultiplier spanning toeneemt en terugkeert naar de baseline zodra al het nitriet is gereduceerd, wat tot een minuut kan duren.
Om het signaal te kwantificeren, werd een standaardcurve geconstrueerd van de standaarden, met behulp van het gebied onder de piek van de spanningssprong. Met behulp van de standaardcurve was de kwantificering van de monsters zeer reproduceerbaar tussen hun dubbele injecties. Chemiluminescentie wordt beschouwd als de gouden standaard voor het bepalen van nitrietconcentraties.
Eenmaal beheerst, is de gevoeligheidslimiet voor nitriet zo laag als twintig millimolar. Het belangrijkste bij het
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel bespreekt de kwantificering van stikstofmonoxide (NO) in biologische monsters met behulp van chemiluminescentie. De methode richt zich op het meten van nitriet- en nitraatgehaltes, welke precursoren en oxidatieproducten van NO zijn, wat inzicht biedt in het metabolisme en de signalering ervan.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Vasculaire biologie
Achtergrond
- Stikstofmonoxide is een cruciale signaleringsmolecule bij de vasculaire homeostase.
- Directe in vivo meting van NO is uitdagend vanwege de lage productieniveaus.
- Chemiluminescentie is een techniek die helpt bij het begrijpen van de NO-cyclus.
- Nitriet en nitraat zijn belangrijke indicatoren voor het NO-metabolisme.
Doel van de studie
- Om stikstofmonoxide in biologische monsters te kwantificeren.
- Om het metabolisme en de signalering van stikstofmonoxide in de tijd te volgen.
- Om een eenvoudige en gevoelige meettechniek te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Chemiluminescentie voor het kwantificeren van nitriet en nitraat.
- Gebruik van trijodide- en vanadiumchloride-reducerende oplossingen.
- Bereiding van een nitriet-conserveeroplossing.
- Meting van nitrietgehaltes in diverse biologische monsters.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol kwantificeert effectief de nitriet- en nitraatspiegels.
- De hoge gevoeligheid en eenvoud van de methode zijn aangetoond.
- De resultaten kunnen worden gebruikt om stikstofmonoxide-signalering in verschillende contexten te begrijpen.
- De techniek is toepasbaar op een verscheidenheid aan biologische monsters.
Conclusies
- Chemiluminescentie is een waardevol instrument voor het bestuderen van het metabolisme van stikstofmonoxide.
- De methode maakt regionale en longitudinale tracking van NO-signalering mogelijk.
- Deze aanpak kan ons begrip van de vasculaire biologie verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Kwantitatieve meting van nitriet en nitraat via chemiluminescentie maakt nauwkeurige tracking van het stikstofmonoxidemetabolisme mogelijk, een kritiek pad in vasculair en metabolisch onderzoek. Deze methode met hoge gevoeligheid ondersteunt vroege ontdekking en mechanische risicoreductie door betrouwbare surrogaatmarkers voor de NO-biobeschikbaarheid te bieden. De integratie van deze metingen versterkt het voorspellend vertrouwen op cruciale omslagpunten in portefeuilles voor cardiovasculaire en metabole ziekten.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt analyse van de activiteit van het stikstofoxidepad mogelijk via kwantificeerbare metaboliet-uitlezingen.
- Ondersteunt biologische risicovermindering door endogene NO-productie te onderscheiden van exogene invloeden.
- Faciliteert functionele doelwitvalidatie door nitriet-/nitraatniveaus te koppelen aan modulatie van het signaalpad.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen bij het prioriteren van NO-gerelateerde doelwitten in discovery-pipelines.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt gevalideerde, kwantitatieve resultaten voor assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid.
- Maakt de bereiding van biologische monsters mogelijk die geschikt zijn voor screeningsworkflows met een hoge gevoeligheid.
- Ondersteunt schaalbaarheid en hergebruik van het platform door diverse biologische matrices te accommoderen.
- Levert een betrouwbare evaluatie van verbindingen via een robuuste meting van NO-metabolieten.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Sluit aan bij ziekte-relevante modellen door NO-padmetabilieten in bloed en weefsels te kwantificeren.
- Garandeert continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door longitudinale monitoring mogelijk te maken.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling op basis van kwantitatieve metabolische read-outs.
- Biedt mechanistische risicoreductie voor programma's gericht op cardiovasculaire en metabole ziekten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze chemiluminescentiemethode is geïntegreerd van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek en ondersteunt hypothese-testen, assay-ontwikkeling en translationele continuïteit.
- Discoverybiologie: Kwantitatieve meting van nitriet/nitraat verduidelijkt de activiteit van de NO-route en ondersteunt hypothesegedreven onderzoek.
- Screening: Output met een hoge gevoeligheid maakt reproduceerbare assay-ontwikkeling en screening-gereedheid mogelijk.
- Analytica: Kwantificering op basis van een standaardcurve biedt robuuste statistische output voor de vergelijking van condities.
- Translationeel onderzoek: Metingen in bloed en weefsels ondersteunen de afstemming van biomarkers en preklinische continuïteit.
- Hergebruik in de onderneming: Het protocol is aanpasbaar voor verschillende monstertypes, wat bijdraagt aan een brede bruikbaarheid binnen R&D.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in NO-padstudies.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en schaalbare meetworkflows.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen mogelijk en vermindert biologische risico's in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van programma's gericht op NO.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in chemiluminescent instrumentatie en monsterbehandeling.
- Vereist toegang tot gespecialiseerde analysatoren en reducerende oplossingen voor de detectie van nitriet/nitraat.
- Necessiteert strikte standaardisatie tussen teams voor monsterpreparatie en analyse.
- Aanpasbaar aan diverse biologische matrices, maar gevoelig voor de snelheid van monsterverwerking en conservering.
- Precisie is kritiek; kleine procedurele fouten kunnen de kwantitatieve resultaten aanzienlijk beïnvloeden.
