Immunokleuring van biocytine gevuld en Verwerkte secties voor Neurochemische Markers

Het doel van dit protocol is om een efficiënte methode te presenteren voor het identificeren van neuronen die zijn gepatched tijdens elektrofysiologische opnamen met behulp van biocytine en immunokleuring voor het herstel van morfologie voorafgaand aan herkleuring met specifieke antilichamen om de neurochemische identiteit te bepalen. Dus deze methode beschrijft een belangrijke stap die nodig is om de diversiteit in neuronale structuur en functie te bestuderen. Dit is essentieel om hun rol in hersennetwerken te begrijpen.

Het belangrijkste voordeel van het gebruik van sequentiële verwerkingstechnieken is dat het de verlies van gegevens elimineert vanwege de onmogelijkheid om de morfologie te herstellen. Dus dit helpt ook bij het leiden van de neurochemische markers die in deze cellen moeten worden getest. Hoewel deze methode wordt beschreven voor morfologisch herstel van cellen in dikke secties, kan deze ook worden toegepast op dunne secties en op eerder gekleurde en gemonteerde monsters.

Algemeen kunnen neutralen die nieuw zijn voor deze methode moeite hebben met het opnieuw verzegelen van de soma terwijl ze zich losmaken van de cel, en kunnen ze te weinig tijd toestaan voor succesvolle vullingen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat specifieke technieken vereist zijn voor effectief biocytine-vullen van cellen om de volledige morfologie te herstellen. Om deze procedure te beginnen, in voltage clamp configuratie, toepassen kleine korte voltagestappen met behulp van de membraantestfunctie in badmodus terwijl de cel wordt genaderd.

Patch op de cel door zuiging toe te passen. Houd vervolgens de cel op negenenzeventig millivolt. Let op de ontwikkeling van een giga-ohmverbinding.

Compenseer voor capacitieve overgangen en breng vervolgens gecontroleerde zuiging aan met een spuit of door de mond om gehele cel configuratie te bereiken. Schat de gehele cel capaciteit en serieweerstand in, en stop de membraantest pulsen. Serieweerstand van minder dan 10 megaohm is optimaal.

Dit zal zorgen voor het tot stand brengen van gehele cel opnamecondities om biocytine-vulling toe te staan. Na voltooiing van de fysiologische opnamen, herstel de patch clamp configuratie door de opnamepijp in kleine stappen langzaam te verplaatsen, afwisselend omhoog en naar buiten in voltage clamp modus. De meest kritische stap bij het bereiken van morfologisch herstel van cellen, is om de hersluiting van de neuronale soma te waarborgen terwijl de opnamepijp zich losmaakt van de cel.

Met behulp van de membraantestfunctie, visualiseer het verlies van capacitieve overgangen en de instorting van stroomreacties tot een rechte lijn, wat wijst op de hersluiting van de cel en de totstandbrenging van een buitenste patch aan de pijppunt. Ondertussen zal het vasthouden van de cel op een gedepolariseerd potentiaal het hersluitingsproces vergemakkelijken. Na het losmaken van de pijp van de cel, houd de slice in de opnamekamer gedurende drie tot vijf minuten om de kleurstof te transporteren naar de distale dendritische en axonale processen.

Vervolgens wordt de slice overgebracht naar een 24-well plaat bevattende 4%PFA voor fixatie. 24 tot 48 uur na PFA fixatie, worden alle vaste slices overgebracht naar nul punt een molar PBS voor opslag vóór immunokleuring. In deze procedure, was de weefsels drie keer gedurende 10 minuten elke in nul punt een molar PBS.

Blokkeer vervolgens de weefsels met 10 procent blokkerend serum gedurende een uur bij kamertemperatuur. Vervolgens, incubeer de secties in primaire antilichamen CB1R bij kamertemperatuur overnacht om cannabinoid receptor type 1 expressie te identificeren. Was vervolgens de hersensecties drie keer gedurende 10 minuten elke in 0.1 molar PBS.

Streptavidine en secundair antilichaam naar het eerste primaire antilichaam worden beide toegevoegd aan de welplaat en overnacht bij vier graden Celsius bewaard. Vervolgens, incubeer de secties in streptavidine rood kleurstofconjugaat bij vier graden Celsius overnacht in het donker om de biocytine te onthullen. Hierna, was de hersensecties drie keer gedurende 10 minuten elke in 0.1 molar PBS.

Om de fluorescentie te beschermen en om herkleuring in de toekomst te vergemakkelijken, monteer de secties op een gelijkmatig gespreid montagemedium. Verzegelde de randen van de dekglasjes met heldere nagellak. In deze stap, verwijder de nagellak van de glazen plaat met een wattenstaafje van aceton.

Verwijder het dekglas voorzichtig met een fijne pincet en breng een paar druppels 0.1 molar PBS aan op de secties. Het is cruciaal om het procesweefsel niet te beschadigen tijdens het losmaken van het weefsel van het waterige montagemedium. Verwijder de secties voorzichtig van de plaat met een fijne penseel en was ze in 0.1 molar PBS gedurende 24 tot 48 uur op een schudder, en bewaar ze weg van licht bij vier graden Celsius.

Om volledige verwijdering van het montagemedium te verzekeren, was de secties een tot twee keer op de volgende dag in 0.1 molar PBS gedurende 10 minuten elke keer. Vervolgens, incubeer de secties met een tweede primaire antilichaam cholecystokinine gedurende een dag. Was de hersensecties drie keer gedurende 10 minuten elke in 0.1 molar PBS.

Vervolgens, kleuren de secties met een fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam geit anti-muis. Zorg ervoor dat de excitatie emissie spectra van het secundaire antilichaam niet overlappen met streptavidine en eerdere immunofluorescente kleurstoffen. Daarna, monteer de secties in waterig montagemedium.

Verzegelde de randen van het dekglas met heldere nagellak. Na succesvolle biocytine vulling en het eerste immunokleuring proces, kan de neuronale structuur worden gevisualiseerd en geïmager zoals getoond in de confocale afbeelding verkregen bij 60x vergroting. De sectie werd ook geïmmunokleurt voor CB1R samen met biocytine, en de CB1R immunokleuring in de biocytine expresserende neuronale soma wordt aangegeven door de pijlpunt.

Dezelfde sectie werd verwerkt voor CCK immuno-reactiviteit na een week, en de afbeelding toont succesvolle herstel van CCK immuno kleuring in verschillende neuronen aangegeven door de asterisk. Merk op dat de biocytine gelabelde cel aangegeven door de pijlpunt geen CCK heeft geexpresseerd. Een samengevoeg