Name: Analyse van Simian Immunodeficiency Virus-specifieke CD8 + T-cellen in resusapen door peptide-MHC-I tetrameer kleuring (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Leer CD8+ T-cellen kwantificeren tegen SIV in resusapen met peptide-MHC-I tetrameer kleuring. Deze ex vivo methode zonder in vitro herstimulatie helpt vaccinresponsen en infectie-evaluaties bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij willen graag David Watkins bedanken voor de ondersteuning van de experimenten die de optimalisatie van de huidige methodiek ingeschakeld. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd mede ondersteund door een pilot subsidie ​​verstrekt door de Miami Center for AIDS Research van de National Institutes of Health onder award nummer P30AI073961. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.

Het gebruikt in dit handschrift perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) werden verkregen van Indiase rhesus makaken ondergebracht bij de Wisconsin National Primate Research Center. Deze dieren werden in overeenstemming met de Weatherall verslag in het kader van een protocol door de Universiteit van Wisconsin Graduate School Animal Care en gebruik Comite 33 goedgekeurd verzorgd. Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd onder verdoving en alle inspanningen werden gedaan om potentiële lijden te minimaliseren. 1. PKI Treatment LET OP: Dit is optioneel, maar aanbevolen voor Mamu-B * 017: 01 tetrameren. Zie Resultaten en discussie secties. <ol><li> Resuspendeer in PBMC R10 medium bij een concentratie van 1,6 x 10 7 cellen / ml. </li><li> Voeg 50 ul van de celsuspensie met de corresponderende flowcytometrie buizen. Voeg 50 ul van een 100 nM oplossing van PKI aan elke buis. </li><li> Vortex elke buis. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Tegen het einde van dezestap moet elke buis 100 ui van een celsuspensie bevattende 8,0 x 10 5 PBMC en 50 nM PKI hebben. </li><li> Ga verder met de pMHC-I tetrameer kleuring stap. </li></ol> 2. Kleuring met fluorochroom gemerkte pMHC-I tetrameren <ol><li> Voor de voorbereiding van de pMHC-I tetrameer master mix, centrifuge de pMHC-I tetrameer buizen bij 20.000 g gedurende ten minste 15 min bij 4 ° C. Het doel van deze stap is om proteïneaggregaten pellet in het pMHC-I tetrameer oplossing die achtergrondkleuring kan toenemen. Zodra de centrifugatiestap wordt uitgevoerd, voorkomen pipetteren van de bodem van de buis waarbij het eiwit aggregaten opstapelen. </li><li> Bereid genoeg pMHC-I tetrameer master mix aan alle experimentele buizen vlekken. Bereid een overmaat van 15% van het totale volume van deze master mix te vertegenwoordigen pipetteerfout. </li><li> Verdunnen pMHC-I tetrameren in vlek buffer (bijv Brilliant Stain buffer), zodat 25 ul van de pMHC-I tetrameer master mix zijn Added om elke test. <ol><li> Label PBMC met twee pMHC-I tetrameren per test; een geconjugeerd aan allofycocyanine (APC) en de andere Brilliant Violet (BV) 421. </li></ol></li><li> Voeg 8,0 x 10 5 PBMC in het overeenkomstige stromingscytometrie buizen in een eindvolume van 100 pl. Als de cellen werden onderworpen aan de hierboven beschreven behandeling PKI, moeten ze reeds geresuspendeerd in 100 gl bij deze stap. </li><li> Voeg 25 ul van pMHC-I tetrameer master mix de overeenkomstige flowcytometrie buizen. Tegen het einde van deze stap, moet het eindvolume in elke buis 125 pl. </li><li> Vortex elke buis om de celsuspensie te homogeniseren. </li><li> Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 45 min. Bereid het oppervlak vlekken mAb cocktail tijdens deze 45 minuten incubatie. </li></ol> 3. Surface kleuring <ol><li> Bereid genoeg mAb master mix aan alle experimentele buizen vlekken. Bereid een overmaat van 15% van het totale volume van deze master mix verantwoordingvoor pipetteren fout. </li><li> Pas het volume van de master mix met beits buffer, zodat 50 ul worden toegevoegd per test. </li><li> Voor een goede uitsluiting van niet-CD8 + T-cellen en afbakening geheugen subsets gebruik getitreerde hoeveelheden mAb gericht tegen de volgende moleculen op het oppervlak kleuring master mix. OPMERKING: De fluorochromen geconjugeerd aan elke mAbs als referentie: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8a BV 785, CD28 PE Cy7 en CCR7 FITC. Merk op dat de mAbs tegen CD14, CD16 en CD20 geconjugeerd met hetzelfde fluorochroom (bijv BV 510) aangezien zij worden opgenomen in het &quot;dump&quot; poort. </li><li> Onder andere een opgelapt kleurstof voor het discrimineren van dode cellen in het oppervlak vlekken master mix [ie, amine reactieve kleurstof (ARD)]. Zorg ervoor dat de ARD reagens is geconjugeerd aan een fluorochroom met een vergelijkbare emissie-spectrum als die wordt gebruikt in het &quot;dumpen&quot; gate. In dit geval gebruikt ARD Aqua. </li><li> Voeg 50 glde kleuring master mix beschreven 3,1-3,4 om de corresponderende flowcytometrie buizen. Tegen het einde van deze stap, moet het eindvolume in elke buis 175 pl. </li><li> Vortex elke buis. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 25 min. </li><li> Was de cellen met wasbuffer (PBS bevattende 0,1% runderserumalbumine en 0,45 g / l NaN3). LET OP: Natriumazide is een giftige stof. Blootstelling aan zelfs kleine hoeveelheden kan leiden tot symptomen veroorzaken. Behandel deze stof op basis van de door de Environmental Health and Safety (EHS) Kantoor opgegeven bij de instelling waar deze experimenten worden uitgevoerd richtlijnen. </li><li> Centrifugebuizen bij 510 xg gedurende 5 minuten. decanteren supernatant voorzichtig in een aparte afvalbak. Zorg ervoor dat de pellet niet te verstoren. LET OP: niet decanteren wasbuffer supernatant in reservoirs met bleekwater als het kan reageren met de natriumazide aanwezig is in de wasbuffer en resulteren in de vorming van een giftig gas 34. Contact de EHS Office op de instelling waar deze experimenten worden uitgevoerd voor richtlijnen over hoe te ontdoen van natriumazide. </li><li> Na decanteren vortex de cellen in de resterende vloeistof in elke buis vastgehouden. </li></ol> 4. Cell Fixatie <ol><li> Voeg 250 gl van een 2% paraformaldehyde (PFA) oplossing voor alle buizen aan de cellen vast. LET OP: PFA is een giftige stof. Blootstelling aan zelfs kleine hoeveelheden kan leiden tot symptomen veroorzaken. Handvat deze stof volgens de EHS Bureau de bij de instelling waar deze experimenten worden uitgevoerd richtlijnen. <ol><li> Aangezien de 2% PFA oplossing isotoon moeten zijn aan de cellen gebruikt PBS om deze te bereiden. Honderd milliliter van een 2% PFA oplossing is voldoende voor meerdere experimenten. Grondig vortex alle buizen onmiddellijk na de toevoeging van 2% PFA teneinde de vorming van cel aggregaten voorkomen. </li></ol></li><li> Incubeer in het donker bij 4 ° C gedurende 20 min. </li><li> wash cellen door het herhalen van de stappen 3,7-3,9. Zodra deze stap is voltooid, kunnen de cellen gedurende 24-48 uur worden bewaard in het donker bij 4 ° C. Alvorens over te gaan tot de Permeabilisatie fase vortex grondig uit de buisjes. </li></ol> 5. Permeabilisatie van cellen <ol><li> Voeg 500 pl permeabilisatie buffer. Vortex alle buizen. </li><li> Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> Was de cellen door het herhalen van de stappen 3,7-3,9. </li></ol> 6. Intracellulaire kleuring <ol><li> Bereid genoeg mAb master mix aan alle experimentele buizen vlekken. </li><li> Regel het volume met PBS of beits buffer, zodat 50 ul van de intracellulaire mAb master mix worden toegevoegd per test. </li><li> Bereid de mAb master mix in 6.1 en 6.2 beschreven aan de hand getitreerde hoeveelheden mAb gericht tegen CD3 en GZM B. OPMERKING: TCR koppeling door pMHC-I tetrameren kan leiden tot CD3 internalisatie, die kunnen interfereren met de detectie van tetrameer + CD3 + CD8 +T-cellen als de anti-CD3 mAb wordt toegevoegd aan het oppervlak vlekken master mix. Om dit te voorkomen, voeg de anti-CD3 mAb in dit stadium, dat wil zeggen na de cellen gepermeabiliseerd. De fluorochromen geconjugeerd aan elk mAb zijn opgenomen als referentie: CD3 PerCP Cy5.5 en GZM B PE. </li><li> Voeg 50 ul van mAb cocktail aan de overeenkomstige buizen. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Was de cellen door het herhalen van de stappen 3,7-3,9. De buizen zijn binnen een flow cytometer worden verkregen. </li></ol>

<ol><li>Parham, P. Antigen Recognition by T Lymphocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParham%2C+P+%22The+Immune+System%2C+3rd+ed%22">The Immune System, 3rd ed</a>. Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. , Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC. New York, NY. 125-154 (2009).</li>
<li>Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tetramer+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The tetramer transformation.</a> J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).</li>
<li>Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A brief history of CD8 T cells.</a> Eur J Immunol. 37, Suppl 1 103-110 (2007).</li>
<li>Murali-Krishna, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+antigen-specific+CD8+T+cells%3A+a+reevaluation+of+bystander+activation+during+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection.</a> Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
<li>Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+repertoire%3A+broadening+the+scope+of+peptide-MHC+multimer+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis.</a> Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).</li>
<li>Walker, B., McMichael, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T-cell+response+to+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">The T-cell response to HIV.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).</li>
<li>Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-specific+CD8%2B+cytotoxic+T-lymphocyte+activity+associated+with+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection.</a> J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).</li>
<li>Koup, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+association+of+cellular+immune+responses+with+the+initial+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome.</a> J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).</li>
<li>Gray, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+class+I+HLA-restricted+anti-HIV+CD8%2B+T+cells+in+individuals+receiving+highly+active+antiretroviral+therapy+%28HAART%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART).</a> J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).</li>
<li>Papagno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+HIV-+and+CMV-specific+T+cell+responses+in+long-term+HIV+infected+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors.</a> Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).</li>
<li>Spiegel, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1-+and+cytomegalovirus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+can+persist+at+high+frequency+for+prolonged+periods+in+the+absence+of+circulating+peripheral+CD4%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells.</a> J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).</li>
<li>Loffredo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+CD8%2B+immunodominance+may+influence+the+ability+of+Mamu-B%2A08-positive+macaques+to+naturally+control+simian+immunodeficiency+virus+SIVmac239+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication.</a> J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).</li>
<li>Migueles, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+B%2A5701+is+highly+associated+with+restriction+of+virus+replication+in+a+subgroup+of+HIV-infected+long+term+nonprogressors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).</li>
<li>Valentine, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+with+%22escaped%22+virus+variants+impairs+control+of+simian+immunodeficiency+virus+SIVmac239+replication+in+Mamu-B%2A08-positive+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Infection with "escaped" virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques.</a> J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).</li>
<li>Day, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+expression+on+HIV-specific+T+cells+is+associated+with+T-cell+exhaustion+and+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression.</a> Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+PD-1+expression+on+HIV-specific+CD8%2B+T+cells+leads+to+reversible+immune+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction.</a> Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).</li>
<li>Mudd, P. A., Watkins, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+animal+models+of+elite+control%3A+windows+on+effective+immune+responses+against+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+HIV+AIDS%22%5BJournal%5D)">Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses.</a> Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).</li>
<li>Valentine, L. E., Watkins, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+studying+T+cell+responses+in+SIV-infected+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques.</a> Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).</li>
<li>Allen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+peptide+binding+motif+of+a+rhesus+MHC+class+I+molecule+%28Mamu-A%2A01%29+that+binds+an+immunodominant+CTL+epitope+from+simian+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus.</a> J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).</li>
<li>Allen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%28%2B%29+lymphocytes+from+simian+immunodeficiency+virus-infected+rhesus+macaques+recognize+14+different+epitopes+bound+by+the+major+histocompatibility+complex+class+I+molecule+mamu-A%2A01%3A+implications+for+vaccine+design+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing.</a> J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).</li>
<li>Kaizu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+typing+of+major+histocompatibility+complex+class+I+alleles+in+the+Indian+rhesus+macaque+which+restrict+SIV+CD8%2B+T+cell+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes.</a> Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).</li>
<li>Loffredo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+seventeen+new+simian+immunodeficiency+virus-derived+CD8%2B+T+cell+epitopes+restricted+by+the+high+frequency+molecule%2C+Mamu-A%2A02%2C+and+potential+escape+from+CTL+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition.</a> J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).</li>
<li>Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Mamu-A%2A01%2B+Indian+Rhesus+Macaques%3A+Continued+Discovery+of+New+MHC+Class+I+Molecules+that+Bind+Epitopes+from+the+Simian+AIDS+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22HIV+mol+immunol%22%5BJournal%5D)">Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses.</a> HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).</li>
<li>Loffredo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+MHC+class+I+molecules+associated+with+elite+control+of+immunodeficiency+virus+replication%2C+Mamu-B%2A08+and+HLA-B%2A2705%2C+bind+peptides+with+sequence+similarity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity.</a> J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).</li>
<li>Mothe, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+peptide-binding+specificity+of+Mamu-B%2A17+and+identification+of+Mamu-B%2A17-restricted+epitopes+derived+from+simian+immunodeficiency+virus+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins.</a> J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).</li>
<li>Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+an+epitope+and+MHC+class+I+molecule+recognized+by+gag-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+in+SIVmac-infected+rhesus+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys.</a> J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).</li>
<li>Kuroda, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Gag-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+in+simian+immunodeficiency+virus-infected+rhesus+monkeys+by+cell+staining+with+a+tetrameric+major+histocompatibility+complex+class+I-peptide+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex.</a> J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).</li>
<li>Otting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unparalleled+complexity+of+the+MHC+class+I+region+in+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).</li>
<li>Martins, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine-Induced+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8%2B+T-Cell+Responses+Focused+on+a+Single+Nef+Epitope+Select+for+Escape+Variants+Shortly+after+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection.</a> J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).</li>
<li>Mudd, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine-induced+CD8%2B+T+cells+control+AIDS+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication.</a> Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).</li>
<li>Lissina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+inhibitors+substantially+improve+the+physical+detection+of+T-cells+with+peptide-MHC+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers.</a> J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).</li>
<li>Weatherall, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeatherall%2C+D+%22The+use+of+non-human+primates+in+research.+A+working+group+report%22">The use of non-human primates in research. A working group report</a>. , 152(2006).</li>
<li>Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+mechanism+of+the+reaction+of+sodium+azide+with+hypochlorite+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hazard+Mater%22%5BJournal%5D)">Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution.</a> J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).</li>
<li>Picker, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+induces+CD4+effector+memory+T+cell+production+and+tissue+emigration+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates.</a> J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).</li>
<li>Dolton, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+tricks+with+tetramers%3A+a+practical+guide+to+staining+T+cells+with+peptide-MHC+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers.</a> Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).</li>
<li>Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricks+with+tetramers%3A+how+to+get+the+most+from+multimeric+peptide-MHC%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC.</a> Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).</li>
<li>Roederer, M., et al. FACS Analysis of Leukocyes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoederer%2C+M+%22Weir%27s+Handbook+of+Experimental+Immunology%2C+5th+ed%22">Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th ed</a>. Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C. , Blackwell Science. Boston. 1-49 (1996).</li>
<li>Colantonio, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR+polymorphisms+modulate+peptide-dependent+binding+to+an+MHC+class+I+ligand+with+a+Bw6+motif%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif.</a> PLoS Pathog. 7 (3), e1001316(2011).</li>
<li>Schafer, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+a+Natural+Killer+Cell+Response+by+Simian+Immunodeficiency+Virus+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides.</a> PLoS Pathog. 11 (9), 1005145(2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Een paar stappen in deze procedure verdienste discussie als ze zijn van cruciaal belang voor een optimaal resultaat opleveren. Ten eerste, omdat de kwaliteit van de biologische monsters is een sterke voorspeller van het succes van elke flowcytometrische bepaling 38, reinigings- moet worden gezorgd dat de cellen levensvatbaar zijn en in suspensie tijdens de kleuringsprocedure. Dit is met name van belang bij het werken met gecryopreserveerde monsters omdat ze meer vatbaar voor klonteren en typisch hogere aantal...

CD8 + T-cellen een belangrijke component van het adaptieve immuunsysteem voor deelname tumor immune surveillance en dragen bij aan de uitroeiing van intracellulaire pathogenen 1. Eenvoudig gezegd, CD8 + T-cellen brengen T-celreceptoren (TCR&#39;s) die specifiek herkennen peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) moleculen aanwezig op het plasmamembraan van gastheercellen. Omdat deze peptiden zijn afgeleid van de proteolyse van endogeen gesynthetiseerde eiwitten, celoppervlak pMHC-I complexen een venster in de intracellulaire omgeving. Na virusinfectie, bijvoorbeeld geïnfecteerde cellen MHC-I moleculen die virus afgeleide peptiden die als liganden voor door TCR patrouilleren CD8 + T-cellen tot expressie kunnen dienen weergeven. Bij een virus-specifieke CD8 + T-cel tegenkomt een geïnfecteerde cel presenteert het pMHC-I ligand, zal TCR betrokkenheid resulteren in CD8 + T-cel activatie en ultiveer leiden tot cellysis richten. Gezien het grote belang van deze TCR / pMHC-I interacties bepalen de grootte, specificiteit en fenotype reageren CD8 + T-cellen vaak kunnen belangrijke aanwijzingen over menselijke ziektes. Tot begin 1990 kwantificering van Ag-specifieke CD8 + T-cellen gebruikt de technisch veeleisende beperkende verdunningstest (LDA) 2,3. Niet alleen heeft de LDA vereisen een aantal dagen worden afgerond, maar ook nagelaten om cellen die proliferatieve potentiële ontbrak op te sporen. Hierdoor LDA sterk onderschat de werkelijke frequentie van antigeen (Ag) -specifieke CD8 + T-cellen die aan een immuunrespons. Hoewel de ontwikkeling van ELISPOT en intracellulaire cytokine kleuring assays sterk het vermogen om cellulaire immuniteit meten verbeterde Deze methoden verzet in vitro stimulatie te kwantificeren Ag-specifieke T-cellen 4. Het was pas in 1996 dat Altman, Davis, en colleagues publiceerden hun landmark artikel rapporteren van de ontwikkeling van de pMHC-I tetrameer technologie 5. Cruciaal voor het succes van deze techniek was de multimerisatie van pMHC-I moleculen die de halfwaardetijd van TCR / pMHC-I interacties uitgebreid, waardoor de kans op pMHC-I tetrameren vallen tijdens de wasstappen van flowcytometrische assays verminderen. Het belangrijkste voordeel van pMHC-I tetrameren via voornoemde assays is de mogelijkheid om direct ex vivo nauwkeurige opsporing Ag-specifieke CD8 + T-cellen zonder de noodzaak van in vitro her-stimulatie. Bovendien is de combinatie van pMHC-I tetrameer kleuring met multi-color flowcytometrie heeft gedetailleerde analyse van het differentiatiestadium, geheugen fenotype en activeringsstatus van Ag-specifieke CD8 + T-cellen 2-4 toegestaan. In het licht van de recente technische ontwikkelingen voor het karakteriseren van CD8 + T-cel repertoire pMHC-I multimeer kleuring 6, de breedte van de aanvragen for deze methode zal waarschijnlijk blijven uitbreiden. Er zijn maar weinig gebieden in het biomedisch onderzoek zijn meer geprofiteerd van pMHC-I tetrameer kleuring dan het gebied van HIV immunologie 7. Hoewel CD8 + T-cellen waren tijdelijk geassocieerd met de eerste controle van HIV viremie ten tijde van de publicatie door Altman, Davis en collega 8,9, het gebruik van pMHC-I tetrameren in de daaropvolgende jaren aanzienlijk uitgebreid inzicht in de HIV-specifieke CD8 + T-celrespons. Zo pMHC-I tetrameer kleuring geholpen bevestigen de robuuste afmetingen van virus-specifieke CD8 + T-cel responsen in de meeste HIV-geïnfecteerden 10-12. Deze werkwijze vergemakkelijkt eveneens de karakterisering van HIV en SIV-specifieke CD8 + T-celresponsen beperkt door MHC-I-moleculen geassocieerd met spontane controle van virale replicatie in de afwezigheid van antiretrovirale therapie-depressiviteit en &quot;elite control&quot; <sup&gt; 13-15. Verder pMHC-I tetrameren waren instrumentaal bij de vaststelling van de geprogrammeerde dood 1 (PD-1) / PD ligand 1 (PD-L1) as als een omkeerbare route voor de disfunctionele fenotype van HIV-specifieke CD8 + T-cellen in ongecontroleerde chronische infectie 16,17. Tezamen zijn deze studies onderstrepen het nut van pMHC-I tetrameren toezicht CD8 + T-celresponsen tegen het AIDS-virus. Experimentele SIV infectie van rhesus makaken (Macaca mulatta) blijft de beste diermodel voor het evalueren van immune interventies tegen HIV / AIDS 18,19. In de afgelopen 25 jaar is aanzienlijke vooruitgang geboekt in de identificatie en karakterisering van SIV-specifieke CD8 + T-cellen in deze apensoorten, waaronder de ontdekking van MHC-I-allelen en de definitie van de peptide binding motieven 13,20-27 . Als gevolg daarvan hebben pMHC-I tetrameren ontwikkeld voor de analyse van SIV-specifieke CD8 + T-cellreacties in dit diermodel 28. De meeste van deze sera worden gemaakt van de genproducten van vier rhesus macaque MHC-I allelen: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, en Mamu-B * 017: 01. Van de nota, doe resusapen geen MHC-C locus 29 te drukken. De overgrote meerderheid van de pMHC-I tetrameren gebruikt in de onderhavige experimenten werden geproduceerd op de NIH tetrameer Core Facility Emory University. Toch heeft een aantal van deze reagentia, met inbegrip van Mamu-A1 * 001 tetrameren gebonden aan de immunodominante Gag CM9 epitoop, kan alleen worden verkregen uit commerciële bronnen te wijten aan licentieovereenkomsten. Gebruik pMHC-I tetrameren van de vier rhesus macaque allelen bovenstaande, hebben we met succes genoemde CD8 + T-cellen tegen een totaal van 21 epitopen SIV (tabel 1), die werden geïnduceerd door vaccinatie of primaire SIV infectie 30,31 (Martins et al., ongepubliceerde waarnemingen). De huidige manuscript voorziet in eengeoptimaliseerde pMHC-I tetrameer kleuring protocol voor het bepalen van de frequentie en het geheugen fenotype van SIV-specifieke CD8 + T-cellen in rhesus makaken. De bepaling begint met een verkozen 30 min incuberen met een proteïne kinase remmer (PKI, hier Dasatinib wordt gebruikt) om TCR internalisatie verlagen en zo verbeteren pMHC-I tetrameer kleuring 32. Zoals hieronder beschreven, deze behandeling is vooral nuttig bij gebruik Mamu-B * 017: 01 tetrameren. Instructies over hoe de cellen met fluorochroom-geconjugeerde pMHC-I tetrameren en monoklonale antilichamen (mAbs) te labelen zijn ook aanwezig. Dit protocol een cel permeabilisatie stap voor de intracellulaire detectie van de cytolyse-geassocieerde molecule granzyme B (GZM B). Het mAb tegen CD3 toegevoegd in deze stap ook de detectie van deze TCR signaalmolecuul verbeteren. Als referentie zijn alle fluorochromen die in deze kleuring paneel weergegeven.

<table><tbody><tr><td>Dasatinib</td><td>Axon medchem</td><td>Axon&nbsp;1392</td><td>Moet worden gesuspendeerd in DMSO en onmiddellijk bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>RPMI met Glutamax</td><td>gibco/ Life Technologies</td><td>61870-036</td><td>Moet worden bewaard bij 4 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>Heat Inactivated FBS</td><td>gibco/ Life Technologies</td><td>10082-147</td><td>Moet worden bewaard bij 4 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycinep-Amphotericin B</td><td>Lonza</td><td>17-745E</td><td>Moet worden bewaard bij 4 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>DMSO, Anhydrous</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td>Bewaar bij kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>5 ml Round-Bottom Polypropylene Tubes</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>Fluorochrome-geconjugeerde pMHC-I tetramers</td><td>NIH Tetramer Core of MBL, Inc.</td><td></td><td>Moet worden bewaard en onderhouden bij&nbsp; 4 &deg;C. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 15 min voor gebruik. Niet invriezen.</td></tr><tr><td>Fluorochrome-geconjugeerde mAbs</td><td>Verschillende bedrijven</td><td></td><td>Moet worden bewaard en onderhouden bij&nbsp; 4 &deg;C. Niet invriezen.</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD&nbsp;Fixable Aqua&nbsp;Dead&nbsp;Cell Stain Kit</td><td>Life Technologies</td><td>l34957</td><td>Moet worden bewaard bij -20 &deg;C. Suspendieer elke aliquot in 50 &mu;l van DMSO voor gebruik.</td></tr><tr><td>Brilliant Stain Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>563794</td><td>Moet worden bewaard bij&nbsp; 4 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfaatbuffer met zout</td><td>VWR</td><td>97064-158</td><td>Bewaar bij kamertemperatuur</td></tr><tr><td>Bovine Albumine</td><td>VWR</td><td>700011-230</td><td>Moet worden bewaard bij&nbsp; 4 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumaziet</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>Bewaar bij kamertemperatuur. Giftige stof. Niet mengen met bleekmiddel.</td></tr><tr><td>Bleekmiddel</td><td>VWR</td><td>89501-620</td><td>Corrosieve chemische stof, mag niet worden gemengd met natriumaziet. Omzichtig behandelen</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td>Ontvlambare, corrosieve en giftige reagens. Omzichtig behandelen</td></tr><tr><td>Polysorbaat 20 (Tween-20)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L15029</td><td>Bewaar bij kamertemperatuur</td></tr><tr><td>Permeabilisatieoplossing 2&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>340973</td><td>Giftige en corrosieve reagens. Omzichtig behandelen</td></tr><tr><td>Sarsdet Tubes 1,5 ml schroefdop</td><td>VWR</td><td>72.692.005</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml DNA/RNA Low bind Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td>Het gebruik van steriele microbuisjes heeft de voorkeur&nbsp;</td></tr><tr><td>Vortexmixer</td><td>Naar discretie van wetenschapper</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioveiligheidskast&nbsp;</td><td>Naar discretie van wetenschapper</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli Q Intergral Water Purification system</td><td>EMD Millipore</td><td>ZRXQ010WW</td><td>Water van moleculaire biologie kwaliteit van elke leverancier mag worden gebruikt</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Naar discretie van wetenschapper</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Naar discretie van wetenschapper</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg;C&nbsp; koelkast</td><td>Naar discretie van wetenschapper</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow cytometer moet lasers en filters bevatten die compatibel zijn met het gebruikte kleuringspaneel.</td></tr><tr><td>Gedeïoniseerd water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>VWR SCIENTIFIC INC.</td><td>89068-738</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td>Moet in staat zijn om 37 &deg;C&nbsp; interne temperatuur te handhaven</td></tr><tr><td>FACS Diva-software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowjo-software versie 9.6</td><td>Flowjo</td><td></td><td>Wordt gebruikt om FCS-bestanden te analyseren die zijn gegenereerd door FACS Diva-software</td></tr><tr><td>Micropijptipjes</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van simian immunodeficiency virus-specifieke cd8 + t-cellen in resusapen door peptide-mhc-i tetrameer kleuring

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex klasse I (pMHC-I) tetrameren heb een waardevol instrument om CD8 + T-cel reacties te bestuderen. Omdat deze reagentia direct binden aan T-cel receptoren op het oppervlak van CD8 + T-lymfocyten, fluorochroom gemerkte pMHC-I tetrameren kan de nauwkeurige detectie van antigeen (Ag) -specifieke CD8 + T-cellen zonder de noodzaak van in vitro re -stimulation. Bovendien, in combinatie met multi-color flowcytometrie kan pMHC-I tetrameer kleuring blijkt sleutelaspecten van Ag-specifieke CD8 + T-cellen, waaronder differentiatiestadium, geheugen fenotype en activeringsstatus. Deze soorten analyses vooral nuttig op het gebied van HIV immunologie is wanneer CD8 + T-cellen progressie beïnvloeden AIDS. Experimentele infectie van rhesus makaken met simian immunodeficiency virus (SIV) biedt een waardevol instrument om cellulaire immuniteit tegen het AIDS-virus te bestuderen. Daardoor aanzienlijke progress is gemaakt bij het bepalen en karakteriseren van T-cel responsen in dit diermodel. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor sommen SIV-specifieke CD8 + T-cellen in rhesus makaken door pMHC-I tetrameer kleuring. De assay maakt de gelijktijdige kwantificering en geheugen fenotypering van twee pMHC-I tetrameer + CD8 + T-celpopulaties per test, die bruikbaar zijn voor het bijhouden van SIV-specifieke CD8 + T-cel responsen opgewekt door vaccinatie of SIV infectie kan zijn. Gezien het belang van niet-menselijke primaten in biomedisch onderzoek, deze methode is toepasbaar voor het bestuderen van CD8 + T-cel responsen in meerdere instellingen ziekte.

De hier beschreven protocol is gebruikt om de omvang en geheugen fenotype van vaccinatie, Gag CM9-specifieke CD8 + T-celresponsen bepalen een Mamu-A1 * 001 + rhesus macaque. Voor deze analyse werd een APC-geconjugeerd Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 tetrameer gebruikt in een 8-kleuren flowcytometrische kleuring panel. Figuur 1A - F toont de gating strategie gebruikt om de gegevens, die moeten worden toegepast voor beide in elke test tetramere...

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor het opsommen en karakteriseren rhesus macaque CD8 + T cellen tegen het AIDS-virus. Dit artikel is niet alleen nuttig voor het gebied van immunologie HIV, maar ook op andere gebieden van biomedisch onderzoek waarbij CD8 + T cel responsen is bekend dat de ziekte uitkomst beïnvloeden.

Analyse van Simian Immunodeficiency Virus-specifieke CD8 + T-cellen in resusapen door peptide-MHC-I tetrameer kleuring

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Het algemene doel van deze test is om Simian Immunodeficiency Virus-specifieke CD8 positieve T-celpopulaties te tellen en te karakteriseren die worden gegenereerd door vaccinatie of primaire infectie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van T-cel-immunologie, zoals wat de frequentie is van antigeen-specifieke CD8 T-cellen die worden geïnduceerd door vaccinatie of infectie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het antigeen-specifieke CD8 T-cellen in biologische monsters kan kwantificeren die direct ex vivo worden verkregen zonder de noodzaak van in vitro herstimulatie.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de evaluatie van incisie-specifieke CD8 T-cellen in de rhesus makaak, en voor het bestuderen van CDB T-celreacties in meerdere ziekteomstandigheden. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen vanwege de onvolledige kennis die beschikbaar is voor rhesus makaak MHC-genetica, en omdat de flowcytometrische kleuring nauwkeurige antilichaamtoepassing vereist. Begin met het opnieuw oplossen van de rhesus PBMC in R10-medium.Voeg een 1,6 maal 10 tot de zevende cellen per milliliter conce

analysis-simian-immunodeficiency-virus-specific-cd8-t-cells-rhesus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze procedure toont de zuivering en in vitro expansie van antigeen specifieke CD4 + T-cellen uit heel het perifere bloed en de visualisatie met behulp van MHC klasse II tetrameren. Tetrameren toestaan ​​dat de directe visualisatie van T-cellen met een enkel antigen specificiteit en gedefinieerd MHC klasse II beperking.

Visualiseren van antigeen specifieke CD4 + T-cellen met behulp van MHC klasse II tetrameren

Een techniek combineert in situ tetrameer vlekken en in situ hybridisatie (ISTH) maakt visualisatie, in kaart brengen en analyseren van de ruimtelijke nabijheid van virus-specifieke CD8 + T-cellen om hun virus-geïnfecteerde targets, en de bepaling van de kwantitatieve relaties tussen deze immuun-effectoren en doelstellingen voor infecties resultaten.

Een techniek om tegelijkertijd Visualiseer virus-specifieke CD8 + T-cellen en virus-geïnfecteerde cellen In situ</em

Tonen we het nut van multicolor flowcytometrie voor gedetailleerde fenotypische en functionele karakterisering van het totaal en als het geheugen subsets van CD4 + en CD8 + T-cellen in rhesus makaken, het ideale model voor HIV / AIDS-vaccin studies.

Multicolor Flow Cytometry Analyses van de cellulaire immuunreactie in resusmakaken

Dit protocol beschrijft het gebruik van peptide: MHC tetrameren en magnetische microbolletjes voor laagfrequente populaties van epitoop-specifieke T-cellen isoleren en analyseren door flowcytometrie. Deze methode maakt de directe bestudering van endogene T-celpopulaties plaats...

Peptide: MHC tetrameer-gebaseerde verrijking van epitoop-specifieke T-cellen

This video demonstrates a method for characterizing CD8+ memory T cells specific to simian immunodeficiency virus (SIV) using peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers. A pMHC-I tetramer is a complex of four MHC-I molecules bound to SIV-specific peptides and conjugated to a fluorophore. These tetramers selectively bind to T cell receptors (TCRs) on SIV-specific CD8+ T cells, facilitating the characterization of these cells.

A Peptide-MHC-I Tetramer Staining Technique to Analyze SIV-Specific CD8+ Memory T Cells

Hier beschrijven we een methode die in situ MHC-tetrameer kleuring combineert met immunohistochemistry lokalisatie, fenotype, en hoeveelheid van antigeen-specifieke T-cellen in weefsels te bepalen. Dit protocol wordt gebruikt om te bepalen van de ruimtelijke en fenotypische kenmerken van antigeen-specifieke CD8 T-cellen ten opzichte van andere celtype en structuren in de weefsels.

In Situ MHC-tetrameer kleuring en kwantitatieve analyse om te bepalen van de locatie, overvloed en fenotype van CD8 Antigen-specifieke T-cellen in weefsels

Beschreven is een methode om te kwantificeren van de expressie van genen die 96 en 18 oppervlakte eiwitten door afzonderlijke cellen ex vivo, waardoor voor de identificatie van differentially uitgedrukte genen en proteïnen in virus-geïnfecteerde cellen ten opzichte van niet-geïnfecteerde cellen. Passen we de aanpak van de studie SIV-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van rhesus makaken.

Eencellige kwantificatie van mRNA en oppervlak eiwituitdrukking in Simian Immunodeficiëntie Virus-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van Rhesus Makaken

Hier presenteren we een protocol voor de ex vivo kwalitatieve detectie van antigeen-specifieke CD8+ T cellen. Analyse is mogelijk met eencellige schorsingen van organen of van kleine hoeveelheden bloed. Een breed scala van studies vereisen de analyse van de reacties van de cytotoxische T-cel (vaccinatie en kanker immunotherapie studies).

Gelijktijdige kwantificering van anti-vector en Anti-transgenic-specifieke CD8+ T cellen Via MHC ik tetrameer kleuring na vaccinatie met een virale Vector

We bieden een gedetailleerd protocol voor het isoleren en identificeren van zeldzame antigeenspecifieke T-celpopulaties in muizenlongen door middel van T-celverrijking op basis van magnetische kralen en peptide:major histocompatibility complex (MHC)-tetrameren.

Identificatie van zeldzame antigeenspecifieke T-cellen uit muizenlongen met peptide: belangrijke histocompatibiliteitscomplextetrameren

Het chromium afgifte assay, een gemeenschappelijke test voor het detecteren cytotoxische T-celactiviteit, heeft verschillende beperkingen. Gebruikmakende van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen en humane borsttumor lijn, SKBR3, in dit artikel is een impedantie-gebaseerde aanpak onderzocht kan detecteren celdoding.

Het bepalen van optimale cytotoxische activiteit van de mens Her2neu Specifieke CD8 T cellen door vergelijking van de Cr51 afgifte test aan de xCELLigence System

Leer CD8+ T-cellen kwantificeren tegen SIV in resusapen met peptide-MHC-I tetrameer kleuring. Deze ex vivo methode zonder in vitro herstimulatie helpt vaccinresponsen en infectie-evaluaties bestuderen.

Analyse van Simian Immunodeficiency Virus-specifieke CD8⁺ T-cellen in resusapen door peptide-MHC-I tetrameer kleuring

Meer video's verkennen