Analyse van Simian Immunodeficiency Virus-specifieke CD8 ⁺ T-cellen in resusapen door peptide-MHC-I tetrameer kleuring

Het algemene doel van deze test is om Simian Immunodeficiency Virus-specifieke CD8 positieve T-celpopulaties te tellen en te karakteriseren die worden gegenereerd door vaccinatie of primaire infectie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van T-cel-immunologie, zoals wat de frequentie is van antigeen-specifieke CD8 T-cellen die worden geïnduceerd door vaccinatie of infectie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het antigeen-specifieke CD8 T-cellen in biologische monsters kan kwantificeren die direct ex vivo worden verkregen zonder de noodzaak van in vitro herstimulatie.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de evaluatie van incisie-specifieke CD8 T-cellen in de rhesus makaak, en voor het bestuderen van CDB T-celreacties in meerdere ziekteomstandigheden. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen vanwege de onvolledige kennis die beschikbaar is voor rhesus makaak MHC-genetica, en omdat de flowcytometrische kleuring nauwkeurige antilichaamtoepassing vereist. Begin met het opnieuw oplossen van de rhesus PBMC in R10-medium.

Voeg een 1,6 maal 10 tot de zevende cellen per milliliter concentratie toe. Pipetteer 50 microliter cellen in de juiste aantallen flowcytometriebuizen en voeg 50 microliter proteïnekinase-remmer toe aan elke buis. Vortex elke buis en incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.

De juiste hoeveelheid getitreerd peptide MHC tetrameer moet worden verdund in voldoende mastermix om alle experimentele buizen te kleuren. Daarom is het belangrijk om een 15% overschot van de mastermix te bereiden om rekening te houden met fouten bij het pipetten. Terwijl de cellen incuberen, peletteer de eiwitaggregaten in de tetrameeroplossing door centrifugatie om de achtergrondkleuring te minimaliseren.

Verdun vervolgens de tetrameren in voldoende kleuringsbuffer, zodat 25 microliter van de tetrameer mastermix aan elke flowcytometriebuis kan worden toegevoegd. Vortex vervolgens de monsterbuizen en incubeer de PBMC tetrameeroplossingen in het donker, bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten. Voeg aan het einde van de incubatie 50 microliter kleuringsmastermix toe aan de juiste monsterbuizen.

En meng de buizen voor het vortexen. Na 25 minuten in het donker bij kamertemperatuur, was de cellen met wasbuffer, pellet de cellen door centrifugatie en decanteer voorzichtig de supernatanten zonder de pellets te verstoren. Vortex de cellen in de overgebleven buffer in elke buis en fixeer de monsters met 250 microliter 2% paraformaldehyde per buis.

Vortex onmiddellijk en incubeer de buizen in het donker bij 4 graden Celsius. Was de cellen na 20 minuten in verse wasbuffer. Pellet de cellen door centrifugatie en decanteer de supernatant zonder de pellet te verstoren.

Re-suspendeer de cellen in 500 microliter permeabilisatiebuffer, vortex en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in het donker. Was en pellet vervolgens de cellen. Decanteer vervolgens de supernatanten zoals eerder beschreven.

Ga verder met het toevoegen van 50 microliter intracellulaire kleuringsmastermix aan de juiste buizen. Vortex elke monster en incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 30 minuten. Na het incuberen was en pellet de cellen.

De monsters zijn nu klaar om in een flowcytometer te worden verkregen. Mamu-B017.01 tetrameren leveren doorgaans een zwakke kleuring op, die aanzienlijk kan worden verbeterd door de cellen voor te behandelen met een proteïnekinase-remmer. Om achtergrondkleuring te voorkomen, moeten MHC klasse één gekoppeld cellen die wel of niet de antigeen-specifieke CD8 positieve T-celpopulatie van belang bevatten, worden gelabeld met het relevante tetrameer en meerdere verdunningsreeks om de optimale hoeveelheid te bepalen die resulteert in de beste scheiding tussen tetrameer positieve en negatieve CD8 positieve T-cellen.

In deze grafieken wordt de gebruikte gatingstrategie getoond om de omvang en het geheugenfenotype van vaccin-geïnduceerde Gag CM9 specifieke CD8 positieve T-celreacties in een Mamu-A 01 positieve rhesus makaak te analyseren. Merk op dat de tetrameer positieve CD8 positieve T-celpopulatie goed is gescheiden met minimale achtergrondkleuring. En met de geheuengebieden duidelijk afgebakend door hun CD28, CCR7 en Granzyme B expressie binnen de tetrameer gate.

Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in ongeveer drie uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de juiste reagentia toe te voegen aan elke antilichaam- of tetrameer mastermix en om elke keer met de experimentele buizen te werken zoals gedemonstreerd. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van immunologie om de specificiteit en het fenotype van antigeen-specifieke CD8 T-cellen te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een MHC klasse één tetrameerkleuring instelt in de test van het rhesus makaak model van menselijk HIV-1 AIDS onderzoek. Vergeet niet dat het werken met biologische specimens van rhesus makaken speciale voorzorgsmaatregelen vereist, zoals het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen tijdens de monsterverwerking.