De combinatie van natte en droge Lab Technieken om de kristallisatie van grote opgerolde-coil bevattende eiwitten Gids

Het algemene doel van deze procedure is om mogelijkelijke domeingrenzen binnen grote coiled-coil eiwitten snel te identificeren en te testen om de kans op het vinden van een intrinsiek fragment dat zal kristalliseren te verbeteren. Deze methode kan onderzoekers helpen het kristallisatieproces voor grote coiled-coil eiwitten te stroomlijnen, wat berucht bekend staat als moeilijk te kristalliseren. Het voordeel van deze techniek is dat het zowel experimentele als computationele methoden integreert om snel waarschijnlijke kandidaten voor kristallisatie te identificeren en te screenen, waardoor hun kansen op succes worden verbeterd.

Jenna Zalewski, een afgestudeerde student in mijn lab, en Keith O'Conor, een onderzoeker aan de universiteit in mijn lab, zullen deze techniek demonstreren. Om te beginnen, combineer output van gevestigde webgebaseerde tools om voorspellingen van mogelijke coiled-coil domeingrenzen te genereren zoals beschreven in het tekstprotocol. Na het genereren van expressieplasmiden en het testen van hun expressieniveaus zoals beschreven in de tekst, begin met de zuivering van elke stam die met succes Ruby-gelabeld eiwit heeft geëxpresseerd.

Om de cellen te lyseren, hersuspendeer eerst elke ontdooid cel pellet in 1,5 milliliter lyse buffer die is aangevuld met proteaseremmers. Voeg 30 microliter lysozym toe bij een concentratie van 10 milligram per milliliter en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur, daarna soniceer, volgens de instructies voor het gebruikte instrument. Centrifugeer het monster in een tafelcentrifuge gedurende 30 minuten bij 14.000 keer G om onoplosbare materialen of ongelyseerde cellen te pelleteren.

Bewaar zowel het supernatant als het pellet voor verdere analyse via SDS-PAGE. Om nikkelaffiniteitszuivering uit te voeren, incubeer eerst 100 microliter van de nikkel NTA-kralen, voorgewassen in lyse buffer met het oplosbare lysate gedurende vijf tot 10 minuten. Draai de suspensie meerdere keren om de kralen te mengen.

Centrifugeer het monster gedurende 30 seconden bij 800 keer G in een tafelcentrifuge om de kralen te pelleteren. Volg dit door het pellet drie tot vijf keer te wassen met lyse buffer om niet-specifieke verontreinigingen te verwijderen. Eluteer ten slotte het Ruby-fusie-eiwit van de kralen met lyse buffer, aangevuld met één molair imidazool.

Gebruik een spectrofotometer ingesteld op 280 nanometer om de concentratie van het Ruby-fusie-eiwit te meten, en beoordeel vervolgens de homogeniteit van het monster door één tot vijf microgram fusie-eiwit op een native PAGE-gel te laden. Laat de 10%native PAGE-gel 140 minuten bij 175 volt en vier graden Celsius lopen. Beeld de native PAGE af met behulp van een beeldvormingssysteem uitgerust om fluorescentie te visualiseren en observeer waar de Ruby-gelabelde fusie in deze test migreert.

Voer beperkte proteolyse uit om stabiel gevouwen domeinen te identificeren door eerst 95 microliter van de Ruby-Shroom SD2-fusie te incuberen met vijf microliter van 0,025 Subtilisin A. Bemonster de reactie op tijdstippen van nul, 0,5, twee, vijf, 15, 60 en 120 minuten, verwijder 10 microliter van de reactie voor elk tijdstip en visualiseer de voortgang van de reactie via SDS-PAGE met behulp van een 15%acrylamide gel. Kleur de gel met Coomassie blauw om te evalueren of een protease-resistente soort kan worden geïdentificeerd. Integreer de gegevens van de zuiveringsefficiëntie, gedrag in native PAGE en beperkte proteolyse op de gedeeltelijk gezuiverde mRuby2-Shroom-fusie-eiwitten in een uitgebreide beoordeling van het algemene gedrag van deze eiwitten in oplossing.

Voer grootschalige expressies uit met twee liter culturen van mRuby2-Shroom SD2 met als doel vijf tot 20 milligram volledig gezuiverd monster te bereiken. Na celgroei, pellet de cellen door centrifugatie bij 8.000 keer G gedurende 10 minuten. Het resulterende celpellet kan worden bewaard bij min 80 graden Celsius tot het nodig is.

Hersuspendeer vervolgens het pellet in ongeveer acht milliliter lyse buffer per gram bevroren celpellet. Lyse de hersuspendeerde cellen met behulp van een homogenisator. Na cellyse, pellet de cellulaire deeltjes via centrifugatie bij 30.000 keer G gedurende 30 minuten.

Bind vervolgens de oplosbare fractie in batches met behulp van 10 milliliter voorgewassen nikkel NTA-hars. Giet de suspensie van kralen in een geschikte zwaartekrachtkolom en laat ongebonden eiwitten afvloeien, was vervolgens de hars drie tot vijf keer met 40 milliliter lyse buffer, gevolgd door een wassing met lyse buffer aangevuld tot één molair natriumchloride. Voer een laatste wassing van de hars uit met 40 milliliter lyse buffer aangevuld met 80 millimolair imidazool.

Elueer het Ruby-Shroom-fusie-eiwit met 40 milliliter lyse buffer bevattende één molair imidazool. Fractioneer het elueerde eiwit handmatig in vier tot 10 milliliter fracties. Bevestig fracties die Ruby-Shroom-fusie-eiwit bevatten met behulp van een 10%SDS-PAGE gel.

Voeg één milligram TEV-protease toe voor elke 25 tot 50 milligram fusie-eiwit om de Ruby-tag te verwijderen. Dialyseer vervolgens de geschikte fracties in TEV-splitsbuffer met behulp van dialysebuisjes met een molecuulgewicht van zes tot acht kilodalton. Dialyseer het eiwit 's nachts bij kamertemperatuur met langzaam roeren.

Herhaal na dialyse de nikkelaffiniteitszuiveringstappen. Het Shroom-SD2-domein zou door de ongebonden fractie moeten stromen terwijl de Ruby-tag aan de hars blijft gebonden. Concentreer de piekfracties met behulp van een spinconcentrator tot ongeveer 10 milligram per milliliter, en voer vervolgens uitsluitingschromatografie uit waarbij de piekfracties worden geanalyseerd via een 12%SDS-PAGE gel.

Na het poolen van de piekfracties, dialyseer de oplossing in kristallisatiebuffer, en concentreer vervolgens het gedialyseerde eiwit tot 10 milligram per milliliter vóór kristallisatie. Screen een kleine array van 12 omstandigheden om een optimale eiwitconcentratie voor kristallisatieproeven te identificeren met behulp van 24-