Name: De combinatie van natte en droge Lab Technieken om de kristallisatie van grote opgerolde-coil bevattende eiwitten Gids (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T10:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Leer een raamwerk dat computationele voorspellingen combineert met experimentele validatie om domeingrenzen in grote coiled-coil eiwitten te identificeren. Deze methode optimaliseert kristallisatiekansen voor structurele biologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidie NIH R01 GM097204 (APV en JDH). Financiering voor JHM werd geleverd door een HHMI Undergraduate Research Summer Fellowship.

OPMERKING: Een schema van het conceptuele raamwerk of workflow wordt beschreven in figuur 1 voor referentie. Het protocol kan worden onderverdeeld in vier fasen: computational of sequentie gebaseerde voorspellingen, eiwitexpressie en zuivering, biochemische karakterisering en kristallisatie. De getoonde voorbeelden analyseren Shroom SD2 domeinen en / of Shroom Rock-complexen, maar kan worden gebruikt met elk eiwit. 1. Gebruik Gevestigde web-gebaseerde tools om Computational Voorspellingen van Coiled-coil Domain Grenzen Genereer <ol><li> Verzamel een Evolutionarily Diverse Set van Sequence Homologen. <ol><li> Ga naar www.uniprot.org en typ in Shroom in de bovenste zoekbalk. </li><li> Selecteer sequenties te downloaden door het vakje naast hun toetreding nummer. Sequenties met een ster te geven sequenties beoordeeld door Uniprot en zijn over het algemeen betrouwbaarder. Let erop dat alle reeksen volledig en juist zijn. </li><li> Sla de geselecteerde sequences door te klikken op de knop Downloaden. </li><li> Lijn de collectie van Shroom sequenties met behulp van Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Klik op de knop &quot;Browse&quot; om het bestand met de Shroom sequenties te selecteren en druk op Verzenden. </li><li> Nadat de uitlijning is voltooid, klikt u op de &quot;Download Alignment File&quot; knop. </li><li> Open de multiple sequence alignment gegenereerd in 1.1.5 met behulp van Jalview (File | Invoer Alignment | Uit bestand). Binnen de nieuwe uitlijning venster, kleur door identiteit (kleur | Procent Identity). </li></ol></li><li> Bereken voorspellingen van secundaire structuur, voorspellingen van flexibel of wanordelijke sequentie en voorspelde coiled-coil regio&#39;s binnen het eiwit (s) van belang. <ol><li> Ga naar http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, om Opgerold-Coil voorspellingen te berekenen. Kopieer en plak de sequentie in de Sequence Box en klik op Verzenden. LET OP: Deze analyse kan een paar uur duren complete. Aangezien Shroom sequenties vrij groot kunnen de sequenties moeten worden opgesplitst in blokken van minder dan 1000 aminozuren binnen de omvang beperking van de webserver te passen. Bij het analyseren van Shrm2, wordt aanbevolen dat de C-terminale 1000 aminozuren worden gebruikt, omdat dit gedeelte bevat de SHRM SD2 domein waarvan bekend is dat gewonden spiraal gebieden bevatten. Bij herhaling van deze analyse met andere eiwitten, is het raadzaam om het eiwit van volledige lengte sequenties gebruiken indien mogelijk. Als dat geen optie is, gebruik maken van de grootste fragment mogelijk of ontleden de volgorde op basis van bekende biochemische of functionele gegevens. </li><li> Ga naar http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, om Opgerold-Coil voorspellingen te berekenen. Kopieer en plak de sequentie in de Sequence Box en klik op Verzenden. </li></ol></li><li> Combineer de resultaten van de stappen 1.1 tot 1.2.2 in één allesomvattende annotatie van het Shroom reeks. LET OP: Het wordt sterk aangemoedigd om ook de enige en alle relevante i omvattennformatie die kan worden afgeleid uit de literatuur of andere bronnen over eiwitfunctie of zuivering in dit stadium. </li><li> Gebruik van deze uitgebreide geannoteerde sequentie voorspellen domeingrenzen (of een reeks mogelijke grenzen) voor eiwit, probeert behoud maximaliseren en voorspelde structurele kenmerken tegelijk de hoeveelheid ongeordende of flexibele sequentie. Als bekend is, moet het resulterende eiwit de functionele eigenschappen van belang te behouden. </li></ol> 2. Express en Zuiver Eiwitten met het Domain grenzen genoemd in paragraaf 1 LET OP: Het doel van deze sectie is een reeks snelle en eenvoudig te kwantificeren assays gebruiken om hypothetische domeingrenzen gegenereerd in deel 1 te screenen. <ol><li> Middels standaard moleculair biologische technieken, wordt een expressieplasmide met de gewenste coderende sequentie in het raamwerk in de His 10 -mRuby2 XH2-plasmide (zie figuur 3 voor een vector mapnd aanvullende informatie). </li><li> Test expressieniveaus voor elk expressieplasmide via BL21 (DE3) E. coli of andere geschikte expressiestreng in zelfinductie media 1 bij kamertemperatuur gedurende 18-24 uur. <ol><li> Transformeer expressieplasmiden evenals een lege plasmide controle in BL21 (DE3) volgens de instructies die met de cellen kwam of het gebruik van robuuste transformatie protocol, zoals die hier (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -transformation /). </li><li> Vanaf de vers getransformeerd plaat, kies een enkele kolonie en te groeien van een 5 ml startercultuur bij 37 ° C gedurende de nacht in lysogenie bouillon (LB) media met 34 ug / ml kanamycine. </li><li> De volgende dag, pellet de cultuur en was de pellet met verse LB. </li><li> Voeg de starter cultuur tot 50 ml autoinductie media met 34 ug / ml kanamycine. Laat de kweek te groeien tot verzadiging bij ofwel kamertemperatuur of 37 ° C. Gewoonlijk groeien ~ 18-24 uur. </li><li> pellet cels en vries de resulterende celpellets bij -80 ° C voor onbepaalde tijd voorafgaand aan zuivering. </li><li> Vergelijk volledige celextracten van elkaar expressiestreng en de lege vectorcontrole door SDS-PAGE om de stam die het meest efficiënt produceert het gewenste fusie-eiwit te bepalen. Zijn 10 -mRuby2-Shroom SD2 fusieproteïnen, run 10% SDS-PAGE-gels bij 180 V ~ 50 minuten of totdat het kleurstoffront de onderkant van de gel 22 bereikt. </li><li> Vlek gel met Coomassie Blue aan totale cellulaire eiwitten te visualiseren binnen elke stam 23. </li></ol></li><li> Voer een eerste affiniteitschromatografie stap op iedere soort die succesvol tot expressie mRuby2-fusieproteïne. Gewoonlijk voeren zuiveringsstappen 2.3.2-2.3.7 bij kamertemperatuur, tenzij het eiwit kunnen gebruikmaken van veranderde omstandigheden, zoals zuivering bij 4 ° C. <ol><li> Dooi celpellets uit stap 2.2.5. </li><li> Resuspendeer elke cel pellet in 1,5 ml lysis buffer (10% glycerol, 500 mM NaCl, 40mM imidazool, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM beta-mercaptoethanol). Supplement de lysisbuffer met proteaseremmers indien nodig. </li><li> Voeg 30 ul van 10 mg / ml lysozym en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Ultrasone trillingen volgens de instructies voor het instrument wordt gebruikt. </li><li> Over in een 1,5 ml buis en centrifugeer in een tafelblad centrifuge gedurende 30 minuten bij 14.000 xg onoplosbare materiaal of niet-gelyseerde cellen te pelleteren. Bespaart bovendrijvende en pellet voor verdere analyse via SDS-PAGE. </li><li> Voer nikkel affiniteitszuivering, incuberen van de oplosbare fractie met 100 pl Ni-NTA-parels. Incubeer de kralen met oplosbare lysaat gedurende 5-10 min, herhaaldelijk omkeren kralen te mengen. </li><li> Centrifugeren bij 800 g gedurende 30 seconden in een tafelblad centrifuge om de kralen te pelleteren. Volg deze door het wassen van de pellet 3-5 maal met lysisbuffer om niet-specifieke verontreinigingen schoon te maken. </li><li> Elueer Ruby fusie-eiwit van de bolletjes met lysis buffer aangevuld met 1M imidazool. </li><li> Gebruik SDS-PAGE om het gedrag van His-mRuby2-Shroom eiwitten te vergelijken in de &quot;quick and dirty&quot; zuivering hierboven. </li></ol></li></ol> 3. karakteriseren Protein Sample om Degenen met voordelige eigenschappen te identificeren <ol><li> Gebruik een spectrofotometer ingesteld op 280 nm en de concentratie van de Ruby fusieproteïne meten en beoordelen van de homogeniteit van het monster door het laden van 1-5 ug fusieproteïne op een natief PAGE gel 24. Voer het 10% inheemse PAGE gel bij 4 ° C gedurende 140 minuten bij 175 V. <ol><li> Het imago van de inheemse PAGE met behulp van een imager uitgerust om fluorescentie te visualiseren, observeren waar de mRuby-tag fusie migreert in deze test. LET OP: Wees voorzichtig om fusie-eiwit dat zit vast in de put omdat dit eiwit wordt waarschijnlijk samengevoegd observeren. Als een fluorescentie imager niet beschikbaar is, kan men vaak zichtbaar beeld en geconcentreerde monsters Ruby gelabeld eiwit onder een zwart licht of een UV lichtbak. </li></ol></li><li> Voer beperkte proteolyse stabiele gevouwen domeinen te identificeren. Incubeer 95 ui Ruby-SHRM SD2 fusie bij ~ 1 mg / ml met 5 gl van 0,025% subtilisine A. <ol><li> Proef de reactie op tijdstippen van 0, 0,5, 2, 5, 15, 60 en 120 min, het verwijderen van 10 gl van de reactie voor elk tijdstip en visualiseren van de voortgang van de reactie via SDS-PAGE onder toepassing van een 15% acrylamidegel . </li><li> Kleuren met Coomassie Blue volgens stap 2.2.7 en beoordelen of een protease resistente soorten kunnen worden geïdentificeerd. </li></ol></li><li> Integreer gegevens van de zuivering efficiëntie, het gedrag in de moedertaal PAGE, en beperkte proteolyse op het gedeeltelijk gezuiverd mRuby2-Shroom fusie-eiwitten in een uitgebreide evaluatie van het algemene gedrag van deze eiwitten in oplossing. <ol><li> (Optioneel) Als een geschikte functionele test beschikbaar is, controleren of de activiteit op dit punt. </li></ol></li></ol> 4. produceren van hoge kwaliteit Kristallen van de gewonden spiraal SD2Domein uit Shroom Opmerking: Alle stappen in sectie 4.1 wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij het eiwit zouden profiteren van de reiniging bij een andere temperatuur, meestal 4 ° C. <ol><li> Met behulp van de 50 ml gezwellen als een ruwe schatting van meningsuiting en zuivering potentieel, uit te voeren op grote schaal uitingen van mRuby2-Shroom SD2 met als doel het bereiken van 5-20 mg van volledig gezuiverd monster. Normaal 2 L van cultuur biedt voldoende uitgangsmateriaal. Na groei pellet cellen door centrifugeren bij 8000 xg gedurende 10 min. <ol><li> Resuspendeer de pellet van de 2 L groei van lysisbuffer zoals tevoren, met behulp ~ 2 ml lysis per gram bevroren celpellet bij gebruik van lysozym voor lysis. Als alternatief, resuspendeer bij ~ 8 ml / g pellet bij gebruik van een homogenisator of Franse pers. Pellet celresten via centrifugatie bij 30.000 xg gedurende 30 min. </li><li> Batch binden de oplosbare fractie van 4.1.1 10 ml Ni-NTA hars. Giet het mengsel in geschikte zwaartekracht kolomen laat ongebonden eiwitten af ​​te voeren. </li><li> Wassen hars 3-5 maal met 40 ml lysis buffer, gevolgd door een wassing met lysisbuffer aangevuld met 1 M NaCl. </li><li> Wassen hars met 40 ml lysis buffer gesupplementeerd met 80 mM imidazool. </li><li> Elueer het Ruby-Shroom fusie-eiwit met 40 ml lysis buffer aangevuld tot 1 M imidazol. Handmatig fractioneren het geëlueerde eiwit in 4-10 ml fracties. </li><li> Bevestigen fracties die Ruby-Shroom fusieproteïne middels 10% SDS-PAGE. </li><li> Dialyseren geschikte fracties (gewoonlijk fracties 2-4) in 8% glycerol, 250 mM NaCl, 15 mM imidazool, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM β-ME, gebruik 6-8 kDa MWCO dialyseslang. Voeg 1 mg TEV protease voor elke 25-50 mg fusieproteïne. Dialyseer overnacht bij kamertemperatuur onder langzaam roeren. </li><li> Herhaal nikkel affiniteitszuivering stappen 4.1.2. naar 4.1.6. De Shroom SD2 domein moet nu blijven in de ongebonden fractie, terwijl de His 10 -mRuby2 gebonden blijven aanen de hars wordt in de elutiefracties. Bevestigen middels 12% SDS-PAGE kleuring met Coomassie Blue. </li><li> Dialyseren fracties die Shroom SD2 domeinnaam in 8% glycerol, 100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, 5 mM beta-mercaptoethanol buffer &#39;s nachts. </li><li> Voer anionenuitwisselingschromatografie 25 met een FPLC en geëlueerd met een NaCl gradiënt 0,1-1,0 M NaCl. Analyseer fracties middels 12% SDS-PAGE. </li><li> Via een spin concentrator (MWCO van 10 kDa of meer, afhankelijk van het eiwit werd onderzocht), concentreer piekfracties tot ~ 0 mg / ml, en voer gelpermeatiechromatografie 26, analyseren piekfracties via 12% SDS-PAGE. </li><li> Zwembad piekfracties en dialyze in 20 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 2% glycerol, 1 mM β-ME, en concentreer tot 10 mg / ml voorafgaand aan kristallisatie. Optioneel: Tijdens deze stap verwijdert 5 ul monsters in concentraties van 1, 2, 5 en 10 mg / ml tijdens het concentreren van het monster.Voer een natieve PAGE loading 2-5 pi van elk monster te kijken naar het gedrag van het monster tijdens deze stap. </li></ol></li><li> Screenen van een kleine reeks 12 voorwaarden voor een optimale eiwitconcentratie identificeren kristallisatie trials. De samenstelling van deze voorwaarden beschreven in figuur 7. <ol><li> Gebruik 24 putjes zit druppel kristallisatie trays Voer kristallisatie proeven met de damp diffusie methode pipetteren 500 pi van elk van de 12 omstandigheden in afzonderlijke putjes gevolgd door druppels die aanvankelijk bevatten 1 pl goed oplossing en 1 pl eiwitmonster op dekglaasjes . Zie 27 voor meer informatie over deze techniek. </li><li> Snel sluit de lade met duidelijke tape en zet de lade om een ​​geschikte temperatuur gecontroleerde omgeving die trillingsvrij. De toegepaste temperatuur kan variëren, maar 4 ° C, 16 ° C en 20 ° C zijn vrij algemeen. </li><li> Onderzoek de druppels in de bakken in de komende 3 degen behulp van een microscoop bij tot 100X vergroting. Aan het eind van de 3-daagse periode, scoren elke druppel als die geen neerslag (duidelijke), lichte neerslag, zware neerslag (bruin), of kristallen. Een geschikte eiwitconcentratie mag niet meer dan 6 zware neerslag bevatten. </li><li> Met de eiwitconcentratie die in 4,2, screenen van een groot aantal commercieel verkrijgbare kristallisatie schermen. Het gebruik van een vloeistofverwerking of kristallisatie robot aanzienlijk versnelt dit proces maar ook geminimaliseerd fout in de druppels. Het vereist veel minder eiwit ook, zodat de gebruiker meer condities screenen met een enkel monster. </li><li> Verbetering van de initiële voorwaarden geïdentificeerd uit brede schermen door het systematisch variëren van elk van de variabelen in de kristallisatie neer te zetten in 24-well screening trays als voorheen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+clones+and+auto-induction+for+protein+production+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli.</a> Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).</li>
<li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).</li>
<li>Chapman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification%3A+pure+but+not+simple%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein purification: pure but not simple.</a> Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+coiled+coils+from+protein+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Predicting coiled coils from protein sequences.</a> Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).</li>
<li>Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+Crick+equations+for+modeling+noncanonical+coiled+coils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils.</a> J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).</li>
<li>Lupas, A. N., Gruber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+alpha-helical+coiled+coils%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">The structure of alpha-helical coiled coils.</a> Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).</li>
<li>Hernandez Alvarez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+expression+system+for+protein+crystallization+using+trimeric+coiled-coil+adaptors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Des+Sel%22%5BJournal%5D)">A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors.</a> Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).</li>
<li>Slabinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+protein+structure+determination--lessons+from+structural+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics.</a> Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).</li>
<li>Slabinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XtalPred%3A+a+web+server+for+prediction+of+protein+crystallizability%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability.</a> Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).</li>
<li>Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shroom+induces+apical+constriction+and+is+required+for+hingepoint+formation+during+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure.</a> Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).</li>
<li>Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shroom+regulates+epithelial+cell+shape+via+the+apical+positioning+of+an+actomyosin+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).</li>
<li>Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+actin-dependent+localization+modulates+the+evolutionarily+conserved+activity+of+Shroom+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins.</a> J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).</li>
<li>Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+isoforms+of+drosophila+shroom+define+spatial+requirements+for+the+induction+of+apical+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction.</a> Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).</li>
<li>Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shroom2+regulates+contractility+to+control+endothelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis.</a> Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).</li>
<li>Das, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+Shroom3+and+Rho-kinase+is+required+for+neural+tube+morphogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice.</a> Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).</li>
<li>Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+interaction+of+ROCKI+with+the+switch+regions+of+RhoA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA.</a> J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).</li>
<li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+highly+conserved+domain+of+Rock1+required+for+Shroom-mediated+regulation+of+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology.</a> PLoS One. 8 (12), e81075(2013).</li>
<li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Shroom+domain+2+reveals+a+three-segmented+coiled-coil+required+for+dimerization%2C+Rock+binding%2C+and+apical+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction.</a> Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).</li>
<li>Tu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+coiled-coil+domain+from+human+ROCK+I%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I.</a> PLoS One. 6 (3), e18080(2011).</li>
<li>Sievers, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+scalable+generation+of+high-quality+protein+multiple+sequence+alignments+using+Clustal+Omega%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.</a> Mol Syst Biol. 7, 539(2011).</li>
<li>Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+procedure+for+protein+staining+in+polyacrylamide+gels+with+a+new+type+of+Coomassie+Brilliant+Blue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue.</a> Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitations+of+clear-native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitations of clear-native PAGE.</a> Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).</li>
<li>Jungbauer, A., Hahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Ion-exchange chromatography.</a> Methods Enzymol. 463, 349-371 (2009).</li>
<li>Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+analysis+of+the+effects+of+reversible+dimerization+in+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography.</a> J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).</li>
<li>Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+historical+perspective+on+protein+crystallization+from+1840+to+the+present+day%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day.</a> FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).</li>
<li>Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pGenTHREADER+and+pDomTHREADER%3A+new+methods+for+improved+protein+fold+recognition+and+superfamily+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).</li>
<li>Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+protein+domain+assignment+from+amino+acid+sequence+using+predicted+secondary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure.</a> Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).</li>
<li>Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phyre2+web+portal+for+protein+modeling%2C+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis.</a> Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).</li>
<li>Elsliger, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JCSG+high-throughput+structural+biology+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">The JCSG high-throughput structural biology pipeline.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).</li>
<li>Bach, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+maltose-binding+protein+as+a+molecular+chaperone+for+recombinant+intracellular+cytoplasmic+single-chain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies.</a> J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).</li>
<li>Strong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+structural+genomics+of+complexes%3A+crystal+structure+of+a+PE%2FPPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li>
<li>Heras, B., Martin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-crystallization+treatments+for+improving+diffraction+quality+of+protein+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven protocol is ontworpen om de gebruiker domein grenzen te identificeren in grote opgerold-coil eiwitten om hun kristallisatie te vergemakkelijken. Het protocol is gebaseerd op een holistische opname van verschillende gegevens van computersimulaties en andere bronnen om een ​​reeks van potentiële domeingrenzen genereren. Deze worden gevolgd door een aantal biochemische experimenten die snel en goedkoop zijn, en worden gebruikt om deze eerste hypothese te verfijnen. Met deze aanpak kan de gebruiker snel t...

Structuurbepaling via röntgenkristallografie heeft fundamentele bijdragen aan elk gebied van de moderne biologie gemaakt; verschaffen van een atomaire aanzicht van de macromoleculen die het leven en hoe zij met elkaar in diverse situaties; zodat we de mechanismen die leiden tot de ziekte en het bieden van mogelijkheden om rationeel ontwerpen van geneesmiddelen voor de behandeling van de ziekte te begrijpen. Kristallografie is al lange tijd de dominante experimentele techniek voor het bepalen van macromoleculaire structuur, en op dit moment goed voor 89,3% van de structurele database (www.rcsb.org). Deze techniek heeft vele voordelen, waaronder de mogelijkheden voor hoge resolutie, de mogelijkheid om macromoleculen te visualiseren met een breed scala aan formaten relatief eenvoudig gegevensverzameling, en de mogelijkheid te visualiseren hoe het macromolecuul interageert met oplosmiddel en liganden. Ondanks talrijke technologische verbeteringen in recombinante eiwitexpressie 1,2, purification 3, en moleculaire biologie gebruikt om deze systemen 4, de grootste obstakel in het kristallografische proces te genereren blijft de mogelijkheid om diffractie kwaliteit kristallen groeien. Dit is vooral het geval geweest eiwitten die grote coiled-coil domeinen bevatten. Er wordt geschat dat zo&#39;n 5% van alle aminozuren binnen coiled-coils 5,6, waardoor dit een zeer gemeenschappelijk structureel kenmerk 7, maar deze eiwitten zijn vaak moeilijk te zuiveren en kristalliseren dan globulaire eiwitten 8-10 . Dit wordt nog verergerd doordat coiled-coil domeinen vaak gevonden binnen de context van een groter eiwit, dus het correct voorspellen van de grenzen van deze domeinen is cruciaal voor het opnemen van ongestructureerde of flexibele sequentie die vaak schadelijk is voor kristallisatie te voorkomen. Hier presenteren we een conceptueel raamwerk te combineren web-based computational analyses Experimental de gegevens van de bank, te begeleiden gebruikers te helpen door middel van de eerste stadia van het proces, inclusief kristallografische: hoe eiwitten fragment (en) voor structurele studies, en hoe voor te bereiden en te karakteriseren eiwit monsters voorafgaande aan kristallisatie pogingen te selecteren. We richten onze analyse van twee eiwitten met grote opgerolde-coil domeinen, Shroom (SHRM) en Rho-kinase (Rock). Deze eiwitten werden gekozen omdat ze allebei bevatten coiled-coil domeinen en is bekend dat biologisch relevante 11-16 complex vormen. Shroom en Rho-kinase (Rock) wordt voorspeld ~ 200 en 680 residuen van coiled-coil respectievelijk bevatten, veel waarvan gedeelten zijn structureel gekarakteriseerd 17-20. De hier beschreven methode heeft een gestroomlijnde workflow snel fragmenten van coiled-coil bevattend eiwit dat vatbaar is voor kristallisatie identificeren echter de beschreven technieken kunnen gemakkelijk worden aangepast voor de meeste eiwitten of eiwit-complexen of aangepast voor high-throughput approa incorporerenches zoals beschikbaar. Tenslotte zijn deze werkwijzen in het algemeen goedkoop en kan worden uitgevoerd door de gebruikers in bijna alle niveaus.

<table><tbody><tr><td>BL21(DE3) Rosetta</td><td>Emd Millipore</td><td>70954-3</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Codon Plus</td><td>Agilent Technologies</td><td>230245</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Spectrum Chemical Mfg Corp</td><td>L3008-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA resin</td><td>Life Technologies</td><td>25216</td><td></td></tr><tr><td>SubtilisinA</td><td>Spectrum Chemical Mfg Corp</td><td>S1211-10ML</td><td></td></tr><tr><td>24 well Cryschem Plate</td><td>Hampton research</td><td>HR3-160</td><td></td></tr><tr><td>INTELLI-PLATE &nbsp;96:</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Hampton research</td><td>HR2-591</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Hampton research</td><td>HR2-515</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Hampton research</td><td>HR2-603</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4000</td><td>Hampton research</td><td>HR2-605</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-Clover-mRuby2</td><td>Addgene</td><td>49089</td><td></td></tr><tr><td>Overnight Express Autoinduction System 1</td><td>Emd Millipore</td><td>71300</td><td></td></tr><tr><td>Lysogeny Broth powder</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12795027&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

de combinatie van natte en droge lab technieken om de kristallisatie van grote opgerolde-coil bevattende eiwitten gids

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Het verkrijgen van kristallen voor structuurbepaling kan een moeilijke en tijdrovende onderneming zijn voor elk eiwit. Gespiraliseerde eiwitten en domeinen worden in de natuur overal aangetroffen, maar vanwege hun fysische eigenschappen en neiging tot aggregatie, worden ze traditioneel beschouwd als bijzonder moeilijk te kristalliseren. Hier gebruiken we een verscheidenheid aan snelle en eenvoudige technieken die zijn ontworpen om een reeks mogelijke domeingrenzen voor een bepaald gespiraliseerd eiwit te identificeren, en karakteriseren vervolgens snel het gedrag van deze eiwitten in oplossing. Met de toevoeging van een sterk fluorescerend label (mRuby2) is eiwitkarakterisering eenvoudig en rechtlijnig. Het doeleiwit kan gemakkelijk worden gevisualiseerd onder normale verlichting en kan worden gekwantificeerd met behulp van een geschikte imager. Het doel is om snel kandidaten te identificeren die uit de kristallisatiepijplijn kunnen worden verwijderd omdat ze waarschijnlijk niet zullen slagen, waardoor meer tijd wordt geboden voor de beste kandidaten en minder fondsen worden besteed aan eiwitten die geen kristallen produceren. Dit proces kan worden herhaald om informatie uit initiële screeningsinspanningen te integreren, kan worden aangepast voor high-throughput expressie- en zuiveringsprocedures en wordt aangevuld met robotische screening voor kristallisatie.

Een diagram dat de werkstroom gebruikt in dit systeem wordt getoond in figuur 1 en omvat drie hoofdfasen. Geautomatiseerde analyse van de sequentie wordt gebruikt om hypotheses over het domein grenzen van het coiled-coil eiwit van belang te ontwikkelen. Een voorbeeld van een analyse van de geannoteerde Shrm2 SD2 domein is getoond in figuur 2. In dit diagram, was het doel om mogelijke domeingrenzen identificeren een geconserveerd domein aan de C-terminus ...

We beschrijven een kader dat eenvoudige biochemische en computationele analyses combineert om de karakterisering en kristallisatie van grote coiled-coil-domeinen te begeleiden. Dit kader kan worden aangepast voor globulaire eiwitten of worden uitgebreid om een verscheidenheid aan hoogdoorvoertechnieken te integreren.

De combinatie van natte en droge Lab Technieken om de kristallisatie van grote opgerolde-coil bevattende eiwitten Gids

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Het algemene doel van deze procedure is om mogelijkelijke domeingrenzen binnen grote coiled-coil eiwitten snel te identificeren en te testen om de kans op het vinden van een intrinsiek fragment dat zal kristalliseren te verbeteren. Deze methode kan onderzoekers helpen het kristallisatieproces voor grote coiled-coil eiwitten te stroomlijnen, wat berucht bekend staat als moeilijk te kristalliseren. Het voordeel van deze techniek is dat het zowel experimentele als computationele methoden integreert om snel waarschijnlijke kandidaten voor kristallisatie te identificeren en te screenen, waardoor hun kansen op succes worden verbeterd.Jenna Zalewski, een afgestudeerde student in mijn lab, en Keith O'Conor, een onderzoeker aan de universiteit in mijn lab, zullen deze techniek demonstreren. Om te beginnen, combineer output van gevestigde webgebaseerde tools om voorspellingen van mogelijke coiled-coil domeingrenzen te genereren zoals beschreven in het tekstprotocol. Na het genereren van expressieplasmiden en het testen van hun expressieniveaus zoals beschreven in de tekst, begin met de zuivering van elke stam die met succes Ruby-gelabeld eiwit heeft geëxpresseerd.Om de cellen te lyseren, her

combining-wet-dry-lab-techniques-to-guide-crystallization-large

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Evaluatie van twee-dimensionale (2D) kristallisatie onderzoeken voor de vorming van de bestelde membraaneiwit arrays is een zeer kritische en moeilijke taak in elektron kristallografie. Hier beschrijven we onze aanpak in het screenen en identificeren van 2D-kristallen van overwegend kleine membraaneiwitten in de range van 15 - 90kDa.

Het beoordelen van twee-dimensionale Kristallisatie Trials van kleine membraaneiwitten voor Structurele Biologie Studies van Electron Kristallografie

De 3-D structuur van een molecuul zorgt voor een uniek inzicht in hoe het molecuul functies. De belangrijkste methode voor de bepaling van de structuur bijna-atomaire resolutie is X-ray kristallografie. Hier tonen we de huidige methoden voor het verkrijgen van drie-dimensionale kristallen van een bepaalde macromolecuul die geschikt zijn voor de structuur bepaling door X-ray kristallografie.

Eiwitkristallisatie voor X-ray kristallografie

De protocollen beschrijven de essentiële stappen voor het verkrijgen van diffractie kwaliteit kristallen van een membraaneiwit vanaf reconstructie van het eiwit in een lipidische kubieke fase (LCP), het vinden van de eerste voorwaarden met LCP-FRAP pre-kristallisatie assays, het opzetten van LCP kristallisatie onderzoeken en oogsten kristallen .

Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Bicelles zijn lipide / amfifiele mengsels die membraaneiwitten (MP's) te behouden binnen een lipide bilaag, maar hebben een unieke fase gedrag dat high-throughput screening vergemakkelijkt door kristallisatie robots. Deze techniek heeft met succes geproduceerd een aantal hoge resolutie structuren van zowel prokaryotische en eukaryotische bronnen. Deze video beschrijft protocollen voor het genereren van de lipidische bicelle mengsel, waarin parlementsleden in de bicelle mengsel, het opzetten van...

High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten Met behulp van de lipidische Bicelle Method

Structure-based drug design speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van geneesmiddelen. Nastreven van meerdere doelen tegelijkertijd verhoogt de kans op succes voor lood ontdekking. Het volgende artikel belicht hoe de Seattle Structural Genomics Centrum Infectieziektebestrijding maakt gebruik van een multi-target benadering voor gen-tot-structuur bepaling van de PB2 influenza A subunit.

Multi-target Parallel Processing Aanpak voor Gene-to-structuur bepalen van de Influenza Polymerase PB2 Subunit

β-vat buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben veel functies binnen de buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten. Hier hopen we een bekende knelpunt in structurele studies te verlichten door protocollen te presenteren voor de productie van β-vat OMP's in voldoende hoeveelheden voor structuurbepaling door röntgenkristallografie of NMR-spectroscopie.

Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins

Dit is een snel, kosteneffectief protocol voor de productie van uitgescheiden, geglycoseerde zoogdier-eiwitten en daaropvolgende eenstapszuivering met voldoende opbrengsten van homogeen eiwit voor röntgenkristallografie en andere biofysische studies.

Efficiënte zoogdiercelexpressie en Single-step Zuivering van extracellulaire Glycoproteïnen voor kristallisatie

Geautomatiseerde systemen en protocollen voor de routinematige bereiding van een groot aantal schermen en nanoliter kristallisatie druppels voor damp diffusie experimenten zijn beschreven en besproken.

Geautomatiseerd protocollen voor macromoleculaire kristallisatie bij het MRC Laboratory of Molecular Biology

Hier presenteren we een protocol voor gecontroleerde productie van eiwitten microcrystals. Het proces maakt gebruik van een automatische inrichting waarmee gecontroleerde manipulatie van verschillende parameters van de kristallisatie. De eiwit kristallisatie is uitgevoerd-out door gecontroleerde en automatische toevoeging van kristallisatie oplossingen terwijl monitoring en onderzoek naar de RADIUS-verdeling van de deeltjes in de kristallisatie druppel.

Groeiende eiwit kristallen met verschillende afmetingen, met behulp van geautomatiseerde kristallisatie in combinatie met In Situ Dynamische lichtverstrooiing

Het gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige aanpak voor het screenen van eiwitkristallisatieomstandigheden en kristalgroei met behulp van een 96-well high-throughput dialyseplaat. Het gebruik van dialysatorbuizen voor de grootschalige groei van microkristallen wordt ook gedemonstreerd voor seriële kristallografie en MicroED-toepassingen.

High-Throughput Eiwitkristallisatie via microdialyse

Leer een raamwerk dat computationele voorspellingen combineert met experimentele validatie om domeingrenzen in grote coiled-coil eiwitten te identificeren. Deze methode optimaliseert kristallisatiekansen voor structurele biologie.

De combinatie van natte en droge Lab Technieken om de kristallisatie van grote opgerolde-coil bevattende eiwitten Gids

Meer video's verkennen