Name: Kinematische analyse van de celdeling en Expansion: Het kwantificeren van de cellulaire basis van groei en Sampling Developmental Zones in Zea Mays Leaves (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Leer kinematische analyse van celdeling en expansie in maïsbladeren voor plantenontwikkelingsbiologie. Deze methode kwantificeert groeizones en regelmechanismen in Zea mays.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een PhD-beurs van de Universiteit van Antwerpen naar VA; een PhD beurs van de Vlaamse Science Foundation (FWO, 11ZI916N) naar KS; projectsubsidies van het FWO (G0D0514N); een gezamenlijke onderzoeksactiviteiten (GOA) onderzoek subsidie, &quot;een systeembiologische benadering van bladmorfogenese&quot; uit het onderzoek van de Raad van de Universiteit van Antwerpen; en de interuniversitaire attractiepolen (IUAP VII / 29, MARS), &quot;maïs en Arabidopsis Root en Schiet groei&quot; van het Federaal Wetenschapsbeleid (BELSPO) naar GTSB Han Asard, Bulelani L. Sizani en Hamada Abdelgawad allemaal bijgedragen tot de video .

LET OP: De volgende protocol voor kinematische analyse is alleen geldig voor bladeren tijdens de groei van steady-state. Dit impliceert een stabiele blad reksnelheid en ruimtelijke patronen van cellengte en expansie in een blad gedurende enkele dagen 6. 1. Plant Groei en Metingen van Leaf Rek Rate (LER) <ol><li> Kies een blad in de groei steady-state en een ontwikkelingsstadium van belang. NB: Er is een verschil tussen de groei van steady-state en repetitieve groei, die soortgelijke ruimtelijke patronen houdt op achtereenvolgende bladeren op dezelfde as. Tijdens de vroege stadia van zaailingsgroei opeenvolgende bladeren groeien typisch steeds sneller door de toenemende grootte van de groeizone 7. Hoewel enkele hogere blad kijkrichtingen groeipatroon 8 kan hebben, is een overgangsfase die kunnen worden beïnvloed door behandelingen onderzocht. Het is daarom belangrijk om lijnen en tr vergelijken<html> eatments strikt dezelfde bladpositie, ook al kan ontwikkelen op een ander tijdstip. Zelfs met een constante reksnelheid, de groei profiel is niet noodzakelijk in verschillende ontwikkelingsstadia. Daarom is het belangrijk om bladeren analyseren in hetzelfde ontwikkelingsstadium 8, kenmerkend bepaald door het aantal dagen na het opkomen. </li><li> Een volledige analyse van kinematische bladgroei uitvoeren eenzaadlobbigen groeien tenminste 15 planten per behandeling en genotype onder gecontroleerde omstandigheden in een kweekkamer. </li><li> Op het moment dat het blad van belang verschijnt (opkomst van de werveling van omliggende bladeren), beginnen met het meten van de lengte van het blad dagelijks met een liniaal totdat het blad volledig is uitgebreid (Figuur 1i). Bladlengte betekent de lengte vanaf grondniveau tot de top van het blad. Wees voorzichtig niet te breken of schade aan het blad, omdat dit de groei zou kunnen veranderen. </li></ol>re 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54887 / 54887fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1:. Schematisch overzicht van een kinematische analyse maïs bladeren Blad van belang wordt gemeten met een liniaal gedurende drie opeenvolgende dagen te berekenen Leaf reksnelheid (LER). Daarna wordt het blad geoogst en drie centimeter segment wordt gebruikt voor het bepalen van het meristeem grootte. Dit gebeurt door de lengte vanaf de basis tot aan het meest distale mitotische figuur na DAPI kleuring. (A) Voorbeelden van proliferatieve mitotische figuren en (B) vormende mitotische figuren. De eerste elf cm van de bladbasis aan de andere zijde van het midden ader worden gebruikt om 1001 centimeter segmenten cel lengtemetingen gesneden. Deze metingen vormen de basis voor het creëren van de cel lengteprofiel, die dient om de rijpe cel lengte (l mat) en de lengte van cellen waardoor de meristeem (l div) te bepalen. De <em&gt; l LER en mat worden gebruikt om de cel productiesnelheid (P) te berekenen, terwijl l div en L mer worden gebruikt om het aantal cellen in het meristeem (N mer) berekenen. Op zijn beurt, P en N mer worden gebruikt om de gemiddelde celdelingssnelheid (D), welke de inverse van celcyclus duur (Tc) berekenen. Pijlen van dezelfde kleur geven parameters die worden gebruikt om de parameter te berekenen volgende op deze pijlen. Schaalbalken = 40 urn. Romeinse cijfers worden gebruikt om te verwijzen naar specifieke in het protocol beschreven experimentele procedures. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 2. Oogsten <ol><li> Aan het ontwikkelingsstadium van belang (bijvoorbeeld, de derde dag na opkomst), minstens vijf representatieve pnten van de partij waarop de kinematische analyse uit te voeren. Continue meting van de rest van de planten zoals beschreven in stap 1.3 tot de uiteindelijke blad lengte te bepalen. </li><li> Snijd het bovengrondse deel van de plant. Het meristeem deel intact, snijden zo dicht mogelijk bij de wortels (Figuur 1ii). </li><li> Vanaf de buitenste bladeren, verwijder alle bladeren tot aan het blad van de rente door ze voorzichtig afrollen één voor één. Verwijder indien nodig een paar extra millimeters van de basis naar de bladeren los te maken. Verwijder ook de apex en kleine blaadjes omsloten door het blad van belang (figuur 1iii). </li><li> Snijd een segment 3 cm, te beginnen vanaf de basis aan de ene kant van het midden van de ader, en bewaar het op een 1,5 ml reageerbuis gevuld met 3: 1 (v: v) absolute ethanol: azijnzuur-oplossing (LET OP: draag handschoenen) bij 4 ° C gedurende 24 uur tot enkele maanden (Figuur 1iv). Dit segment wordt later gebruikt om de lengte van het meristeem bepalen. </li><li> Van deandere kant van de ader, snijd een 11 cm segment van de basis (figuur 1 v) en plaats deze in een 15 ml buis gevuld met absolute ethanol bij 4 ° C gedurende ten minste 6 uur pigmenten (figuur 1 vi) verwijderen. LET OP: Later, gebruik dan alleen de eerste 10 cm aan de cel lengte profiel te bepalen (zie Discussie). </li><li> Vernieuwen van de absolute ethanol voor een nieuwe ronde van reiniging bij 4 ° C gedurende ten minste 24 uur (Figuur 1vi). </li><li> Tenslotte wordt vervangen absolute ethanol met zuiver melkzuur (NB: handschoenen) voor reiniging en opslag bij 4 ° C gedurende 24 uur en tot verder gebruik (figuur 1vi). </li></ol> 3. Meristem Lengte Metingen <ol><li> Bereid een spoelbuffer met 50 mM natriumchloride (NaCl), 5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA; LET handschoenen) en 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethaan-waterstofchloride (TRIS-HCl, pH 7). </li><li> Neem het segment 3 cm uit paragraaf 2.4 en zoak in de buffer gedurende 20 minuten (Figuur 1vii). </li><li> Afwachting Gebruik de spoelbuffer een 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleuring oplossing van 1 ug / ml te bereiden, houden het op ijs en in het donker. </li><li> Vlekken op de kernen door het plaatsen van de meristeem segment voor 2-5 min in de DAPI kleuring oplossing. Werk aan ijs en in het donker (figuur 1vii). </li><li> Controleer op fluorescentie-signaal door het snel monteren van het segment op een microscopie glas en het te bedekken met een deksel glas. De epidermale cellen moet fluorescentie vertonen, terwijl de onderliggende cellagen niet moeten doen. </li><li> Indien kleuring onvoldoende, zet het segment terug in de DAPI kleuring oplossing extra minuten. </li><li> Om de kleuring te stoppen, de segmenten in een daling van de spoelbuffer op een microscopie glijbaan en dekken met een deksel glas te monteren. </li><li> Gebruik een microscoop met UV-fluorescentie op 20x vergroting, waardoor visualisatie van ongeveer 1000 epidermisal cellen tegelijk. Scroll in het hele segment en kijk voor proliferatieve mitotische figuren (metafase, anafase, telofase en cytokinese), maar vermijd vormende celdeling van de ontwikkeling van huidmondjes (figuur 1viii) 9. Definieer waar de meest distale mitotische cijfer ligt. </li><li> Bepaal de lengte van het meristeem door de afstand tussen de onderkant van het blad en de meest distale epidermale mitotische figuur. Met een beeld-analyse-software (bijvoorbeeld ImageJ) de volledige lengte van het beeldframe meten. <ol><li> Tel het aantal frames dat de volledige lengte meristeem (van de bladbasis de meest distale mitotische figuur) omvatten en vermenigvuldigt dit getal met de lengte van de frames het meristeem volledige lengte (Figuur 1ix) te verkrijgen. </li></ol></li></ol> 4. Cell Lengte Profiel <ol><li> Neem het segment dat is opgeslagen in melkzuur (stap 2,5) en plaats deze voorzichtig op de bank. Snijd de segmenten witha scalpel in 10 segmenten van 1 cm per (figuur 1x). </li><li> Monteer de opeenvolgende blad segmenten op een microscopie dia in een kleine daling van melkzuur. Zorg ervoor dat u altijd kijken uit op de adaxial of abaxiale kant naar boven. In principe is er geen voorkeur voor een bepaalde kant. </li><li> Gebruik een microscoop uitgerust met differentiële interferentie contrast (DIC) optiek om de segmenten te analyseren, vanaf de bladvoet. Meten met een beeldanalyse software de lengte van ten minste 20 repliceren epidermale cellen in bestanden direct naast de stomatale bestanden om consequent te selecteren hetzelfde celtype. <ol><li> Doe dit op gelijke afstand van elkaar plaatsen langs elk van de segmenten (4 standen per segment volstaan), en zorg ervoor dat op te schrijven van de overeenkomstige positie voor elke meting gedurende het blad (Figuur 1xi). </li></ol></li><li> Bepaal de gemiddelde celgrootte lengte bij elke mm langs de vleugelas door een lokale polynoom p smoothingROCEDURE, geïmplementeerd in een R-script (figuur 1xii; aanvullend bestand 1). OPMERKING: De R-script bevat een reeks gegevens met toenemende smoothing. De hoeveelheid gladmakende nodig is, is enigszins arbitrair en idealiter moet gewoon verwijderen van de lokale lawaai, maar geen invloed op de algemene curve. Zorg ervoor dat u hetzelfde bedrag te gebruiken van het effenen voor alle monsters binnen een experiment. </li><li> Middel de lengte cel op elke positie tussen planten en bereken de standaardfout aan een cel lengteprofiel langs de vleugelas maken. </li></ol> 5. Berekeningen van kinematische parameters (zie aanvullend bestand 2) <ol><li> Bereken de LER Door de verandering in bladlengte tussen twee opeenvolgende tijdstippen (bijvoorbeeld, 24 uur, zoals in stap 1,3) te delen door het tijdsinterval. </li><li> Bereken de lengte van de groeizone (L gz) overeenkomt met de stand distaal van de basis waar cellen bereikt 95% van de volwassen cell lengte aan de smoothened cel lengteprofiel. <ol><li> Neem voor elke positie op het smoothened cel lengteprofiel 95% van de gemiddelde lengte van alle cellen na die positie (figuur 2). </li><li> Vergelijk het smoothened cel lengtes (stap 4.4) met de berekende 95% cel lengte op elke positie. Vanaf de basis van het blad, de groei zone eindigt op de plaats waar de werkelijke cel lengte bedraagt 95% van de volgende cel lengte (Figuur 2; zie aanvullende gegevens 2). </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54887/54887fig2.jpg" /> Figuur 2:. Bepalen het einde van de groeizone Meristem: Voor deze aangegeven met een rode sterpositie de werkelijke celgrootte kleiner is dan 95% (rode stippellijn) van de gemiddelde celgrootte van alle cellen na deze positie (rode vaste stof lijn). Het einde van de groei zone (L gz; aangeduid met ablue sterren) is gelegen waar 95% (gestippelde blauwe lijn) van de gemiddelde celgrootte van alle cellen na deze positie (stevige blauwe lijn) is gelijk aan de werkelijke cel grootte. Division zone (D), rek zone (E), en volwassen zone (M). Binnen de pijlen geven de convergentie tussen de lokale grootte en 95% van de gemiddelde grootte over het distale gedeelte van het blad bij het verplaatsen van de basale posities aan het uiteinde van het blad. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="3"><li> Bereken de lengte van elongatiezone (L el) als het verschil tussen de lengte van de groeizone (L gz) en het meristeem grootte (L mer, bepaald in stap 3). </li><li> Bereken de volwassen cel lengte (l mat) als de gemiddelde cel lengte in de mature zone. </li><li> Verdeel de LER door l mat aan te verkrijgencell productie snelheid (P). </li><li> Bereken het aantal cellen in de elongatiezone (N el) als het verschil tussen N en N gz mer. Het aantal cellen in het meristeem (N mer) gelijk aan het totaal aantal cellen in het interval overeenkomend met de meristeem. Het aantal cellen in de groei zone (N gz) gelijk aan het totaal aantal cellen in het interval overeenkomend met de groeizone. </li><li> Bereken de gemiddelde celdeling rate (D) als P / N mer. De celcyclus duur (Tc) is gelijk aan ln (2) / D. </li><li> Bereken de tijd in de rek zone (T el) door te delen N el door P. De tijd in de divisie zone is gelijk aan log 2 (N mer) * T c. De lengte van cellen waardoor de meristeem (l div)gelijk aan de lengte van de cel smoothened cel lengteprofiel aan het eind van het meristeem. </li><li> Bereken de gemiddelde celexpansie (R el) met behulp van volgende formule: ln (l mat) -ln (l div)] / T el. </li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Een volledige analyse van kinematische maïsblaadjes maakt de bepaling van de cellulaire basis van bladgroei en maakt het ontwerp van efficiënte bemonsteringsstrategieën. Hoewel het protocol is relatief eenvoudig is enige voorzichtigheid bij de volgende belangrijke stappen: (1) Het is belangrijk dat de jongere, afgesloten bladeren (stap 2,3) los te maken zonder beschadiging van de meristeem, aangezien meristeem lengte bepalen (stap 3) vereist een totale meristeem aanwezig te zijn. Wat oefening op voorhand nodig zou zijn....

Groei analyse is afhankelijk van een set van tools die vaak worden gebruikt door planten wetenschappers om genotype bepaald groei verschillen en / of fenotypische reacties op milieu-factoren te beschrijven. Ze beschikken over de grootte en het gewicht metingen van de hele plant of een orgaan en berekeningen van groeicijfers om de onderliggende mechanismen van de groei te verkennen. Orgaangroei wordt bepaald door celdeling en expansie op cellulair niveau. Daarmee ook de kwantificering van deze twee processen in groeianalyses is essentieel voor het begrijpen van verschillen in groei 1 whole-orgaan. Bijgevolg is het cruciaal om een ​​geschikte methodologie celgroei parameters die relatief eenvoudig te gebruiken door niet-gespecialiseerde laboratoria te bepalen. Kinematische analyse reeds ingevoerd als een benadering die een krachtige kader voor de ontwikkeling van orgaangroei modellen 2. De techniek is geoptimaliseerd voor lineaire systemen,zoals Arabidopsis thaliana wortels en bladeren monocotyle, maar ook voor niet-lineaire systemen, zoals tweezaadlobbige bladeren 3. Tegenwoordig wordt deze methode steeds vaker gebruikt om te onderzoeken hoe genetische, hormonale, ontwikkelings- en milieufactoren invloed celdeling en groei in diverse organen (tabel 1). Bovendien biedt een raamwerk om cellulaire processen te verbinden met de onderliggende biochemische, moleculaire en fysiologische voorschriften (tabel 2), hoewel beperkingen door orgaangrootte en ruimtelijke organisatie kan worden opgelegd technieken die grotere hoeveelheden plantenmateriaal vereisen (bijv metaboliet metingen, proteomics, etc.). Eenzaadlobbige bladeren, zoals maïs (Zea mays) bladeren vertegenwoordigen lineaire systemen waarbij cellen zich van de basis van het blad naar de punt, achtereenvolgens door het meristeem en elongatiezone de rijpe bereikenzone. Dit maakt het een ideaal modelsysteem voor kwantitatieve studies van de ruimtelijke patronen van de groei 4. Bovendien, maïs bladeren hebben grote groei zones (meristeem en rek zone verspreid over enkele centimeters 5) en bieden mogelijkheden om studies bij andere organisatieniveaus. Dit maakt het mogelijk voor het onderzoek naar de (vermeende) regulerende mechanismen die celdeling en expansie, gekwantificeerd door kinematische analyse door middel van een reeks van moleculaire technieken, fysiologische metingen, en celbiologie benaderingen (tabel 2). Hier bieden we een protocol voor het uitvoeren van een kinematische analyse in eenzaadlobbige bladeren. Eerst wordt uitgelegd hoe een goede analyse van zowel celdeling en elongatie voeren als functie van positie langs de vleugelas en hoe kinematische parameters berekenen. Ten tweede hebben wij laten ook zien hoe deze kan worden gebruikt als basis voor de steekproef. Hier bespreken we twee gevallen: high-resolution sampling eend gerichte steekproeven, waardoor betere interpretatie van gegevens en de besparing van tijd / geld, respectievelijk. Tabel 1. Overzicht van kinematische analysemethoden voor kwantificeren van celdeling en groei in diverse organen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> orgaan </td><td> referentie </td></tr><tr><td> eenzaadlobbige bladeren </td><td> 16, 20, 21, 22 </td></tr><tr><td> Root tips </td><td> 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 </td></tr><tr><td> tweezaadlobbige bladeren </td><td> 21, 30, 31 </td></tr><tr><td> schieten topmeristeem </td><td> 32 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Overzicht van kinematische analysemethoden voor kwantificeren van celdeling en groei in diverse organen. Tabel 2. Verband tussen cellulaire processen gekwantificeerd door de kinematische analyse om de regulering op moleculair niveau. Verwijzingen naar verscheidene studies die de kwantificering van cellulaire processen om resultaten van biochemische en moleculaire assays verschillende soorten en organen. Xyloglucan endotransglucosylase (XET), malondialdehyde (MDA), cycline-afhankelijke kinasen (CDK). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887table2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Pots</td><td>Any</td><td>Any</td><td>We gebruiken potten met de volgende afmetingen, maar deze kunnen verschillen afhankelijk van de behandeling/studie: bodemdiameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, hoogte: 12 cm. We laten één maïsplant per pot groeien.</td></tr><tr><td>Plantsubstraat</td><td>Any</td><td>Any</td><td>We gebruiken potmedium (Jiffy, Nederland), maar andere substraten kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de behandeling/studie.</td></tr><tr><td>Liniaal</td><td>Any</td><td>Any</td><td>Een uitbreidbare liniaal die minimaal 1,5 meter dekt, is nodig om de uiteindelijke bladlengte van de planten te meten.</td></tr><tr><td>Zaden</td><td>Any</td><td>NA</td><td>Zaden kunnen worden besteld bij een veredelaar.</td></tr><tr><td>Schelp</td><td>Any</td><td>Any</td><td>De schelp wordt gebruikt tijdens het oogsten van bladeren om het gewenste blad los te maken van de omringende bladeren en meteen na het oogsten om een goed monster te snijden voor metingen van cellengte en meristemlengte. </td></tr><tr><td>15 mL falconbuisjes</td><td>Any</td><td>Any</td><td>De 15 mL falconbuisjes worden gebruikt voor het opslaan van monsters die worden gebruikt voor cellengtemeten tijdens het verduidelijken van monsters met absoluut ethanol en melkzuur.</td></tr><tr><td>Eppendorfbuisjes</td><td>Any</td><td>Any</td><td>De eppendorfbuisjes worden gebruikt voor het opslaan van monsters die worden gebruikt voor meristemlengtemeten in ethanol:azijnzuur 3:1 (v:v) oplossing.</td></tr><tr><td>Handschoenen</td><td>Any</td><td>Any</td><td>Latex handschoenen, die beschermen tegen corrosief reagens.</td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Any</td><td>Any</td><td>VOORZICHTIG: Corrosief voor metalen, categorie 1 Huidcorrosie, categorieën 1A,1B,1C Ernstige oogbeschadiging, categorie 1; Ontvlambare vloeistoffen, categorieën 1,2,3</td></tr><tr><td>Absoluut ethanol</td><td>Any</td><td>Any</td><td>VOORZICHTIG: Gevaarlijk in geval van contact met de huid (irriterend), met de ogen (irriterend), door inademing. Licht gevaarlijk in geval van contact met de huid (permeator), van inslikken</td></tr><tr><td>Melkzuur>98%</td><td>Any</td><td>Any</td><td>VOORZICHTIG: Corrosief voor metalen, categorie 1 Huidcorrosie, categorieën 1A,1B,1C Ernstige oogbeschadiging, categorie 1</td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Any</td><td>Any</td><td>VOORZICHTIG: Acute toxiciteit (oraal, dermaal, inademing), categorie 4 Huidirritatie, categorie 2 Oogirritatie, categorie 2 Huidsensibilisatie, categorie 1 Specifieke doelorgaantoxiciteit – Enkelvoudige blootstelling, categorie 3</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethaanhydrochloride (Tris-HCl)</td><td>Any</td><td>Any</td><td>Dit materiaal kan irriterend zijn, contact met ogen en huid moet worden vermeden. Inademing van stof kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken.</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidine-2&prime;-fenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Any</td><td>Any</td><td>Celpermeabele fluorescente minor groove-binding sonde voor DNA. Veroorzaakt huidirritatie. Kan een allergische huidreactie veroorzaken. Kan luchtwegirritatie veroorzaken.</td></tr><tr><td>IJs</td><td>Any</td><td>NA</td><td>De DAPI-oplossing moet op ijs worden bewaard.</td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 van Zeiss of andere</td><td></td><td>Elke fluorescentiemicroscoop kan worden gebruikt om de lengte van het meristem te bepalen.</td></tr><tr><td>Microscoopglaasje</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>Dekglaasje</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Any</td><td>Any</td><td>Pincet is nodig om het opgerolde maïsblad direct na het oogsten uit te vouwen om een goed monster te snijden voor metingen van cellengte en meristemlengte. </td></tr><tr><td>Beeldanalysesoftware</td><td>Axiovision (Release 4.8) van Zeiss</td><td>NA</td><td>De software kan worden gedownload op: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Andere software zoals ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) kan ook worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Microscoop uitgerust met DIC</td><td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 van Zeiss of andere</td><td></td><td>Elke microscoop, uitgerust met differentieel interferentie contrast (DIC), kan worden gebruikt om cellengtes te meten.</td></tr><tr><td>R statistische analysesoftware</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>NA</td><td>Open source; Kan worden gedownload op https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>R script</td><td>NA</td><td>NA</td><td>We gebruiken de kernel smoothing functie locpoly van de Kern Smooth-pakket (Wand MP, Jones MC.  Kernel Smoothing: Chapman &amp; Hall/CRC (1995)). Het script is beschikbaar voor Mac en Windows op verzoek bij de corresponderende auteur.</td></tr></tbody></table>

kinematische analyse van de celdeling en expansion: het kwantificeren van de cellulaire basis van groei en sampling developmental zones in<em&gt; zea mays</em&gt; leaves

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Groeianalyses worden vaak gebruikt in de plantkunde om contrasterende genotypen en de effecten van omgevingscondities te onderzoeken. Het cellulaire aspect van deze analyses is van cruciaal belang, omdat groei wordt aangedreven door celdeling en celallenging. Kinematische analyse vertegenwoordigt een methodologie om deze twee processen te kwantificeren. Bovendien is deze techniek eenvoudig te gebruiken in niet-gespecialiseerde laboratoria. Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een kinematische analyse in monocotyledonaire maïsbladeren (Zea mays). Twee aspecten worden gepresenteerd: (1) de kwantificering van celdelings- en expansieparameters, en (2) de bepaling van de locatie van de ontwikkelingszones. Dit zou kunnen dienen als basis voor ontwerp van bemonstering en/of zou nuttig kunnen zijn voor gegevensinterpretatie van biochemische en moleculaire metingen met hoge ruimtelijke resolutie in de bladgroeigebied. De groeizone van maïsbladeren wordt geoogst tijdens stationaire groei. Individuele bladeren worden gebruikt voor meristemlengtebepaling met behulp van een DAPI-kleurstof en cellengteverloop met behulp van DIC-microscopie. Het protocol is geschikt voor uitgekomen monocotyledonaire bladeren die tijdens stationaire groei worden geoogst, met groeizones die minstens enkele centimeters beslaan. Om het begrip van plantengroei-regulatie te verbeteren, moeten gegevens over groei en moleculaire studies worden gecombineerd. Daarom is een belangrijk voordeel van kinematische analyse de mogelijkheid om veranderingen op moleculair niveau te correleren met goed gedefinieerde stadia van cellulaire ontwikkeling. Verder maakt het een meer gerichte bemonstering van gespecificeerde ontwikkelingsstadia mogelijk, wat nuttig is in geval van beperkt budget of tijd.

Hier tonen we een vergelijking tussen goed bewaterd planten (controle, 54% bodem water inhoud, (SWC)) en planten blootgesteld aan droogtestress omstandigheden (droogte, 34% SWC) in termen van hun bladgroei. Alle planten werden gekweekt in een groeikamer onder gecontroleerde omstandigheden (16 uur dag / 8 uur nacht, 25 ° C / 18 ° C dag / nacht, 300-400 μEm -2 -1 sec fotosynthetisch actieve straling (PAR). De droogte werden opgericht door inhouding water totdat de jui...

Het kwantificeren van celdeling en expansie is van cruciaal belang voor het begrijpen van de groei van hele planten. Hier presenteren we een protocol om cellulaire parameters te berekenen die de groeisnelheid van maïsbladeren bepalen en benadrukken we het gebruik van deze gegevens voor het onderzoeken van moleculaire groei-regulerende mechanismen door het richten van ontwikkelingsstadium-specifieke bemonsteringsstrategieën.

Kinematische analyse van de celdeling en Expansion: Het kwantificeren van de cellulaire basis van groei en Sampling Developmental Zones in<em&gt; Zea Mays</em&gt; Leaves

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

De algemene doelen van deze analyse zijn het bepalen van de cellulaire basis van de bladgroei van maïs, en het gebruiken van deze gegevens om moleculaire groeiregulerende mechanismen te onderzoeken door het uitvoeren van ontwikkelings- en stadiumspecifieke bemonsteringsstrategieën. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een kernvraag in de plantontwikkelingsbiologie: hoe dragen celdeling en celexpansie bij aan verschillen in de groei van het gehele orgaan?Deze benadering maakt het mogelijk om biochemische moleculaire en fysiologische processen die ten grond liggen aan de groei van het volledige plantorgaan te onderzoeken en ruimtelijk in kaart te brengen. Hoewel dit systeem inzicht kan geven in de groei van maïsbladeren, kan de techniek ook worden toegepast op andere systemen, waaronder andere grassoorten en organen.Een visuele demonstratie van deze methoden is essentieel. Bij het oogsten zijn de stappen voor monsterbi-blatie en meting moeilijk uit te voeren zonder die demonstratie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Katrien Sprangers en Viktoriya Avramova.Twee promovendi uit mijn laboratorium. Om een volledige kinematische analyse van de bladgroei bij monocotylen uit te voeren, kweekt u ten minste 15 planten per behandeling en genotype onder gecontroleerde omstandigheden in een groeikamer. Wanneer een relevant blad verschijnt, gebruikt u een liniaal om dagelijks de lengte van het blad te meten — gedefinieerd als de afstand van de bodem tot de bladpunt — totdat het blad volledig is uitgegroeid.Snijd in het gewenste ontwikkelingsstadium het bovengrondse deel van ten minste vijf representatieve planten zo dicht mogelijk bij de wortels af, om het meristeemgebied intact te houden. Rol vervolgens, beginnend bij de buitenste bladeren, alle bladeren één voor één voorzichtig af tot aan het blad van belang. Verwijder indien nodig enkele extra millimeters van de basis om de bladeren los te maken.Verwijder vervolgens de apex en de kleine bladeren die omsloten zijn door het betreffende blad, en snijd een segment van drie centimeter uit het blad, beginnend bij de basis aan één zijde van de middennerf. Het is cruciaal om het blad precies daar door te snijden waar het met de stengel is verbonden. Te hoog snijden zou namelijk leiden tot een onderschatting van de grootte van het meristeem.Bewaar het segment in een reageerbuis van 1,5 milliliter, gevuld met een absolute ethanol-azijnzuuroplossing in een volumeverhouding van drie-twee-één, bij vier graden Celsius gedurende 24 uur tot meerdere maanden. Snijd aan de andere zijde van de ader een segment van 11 centimeter vanaf de basis af en bewaar dit segment in een buis van 15 milliliter gevuld met absolute ethanol, bij vier graden Celsius gedurende ten minste zes uur om de pigmenten te verwijderen. Na een tweede ronde van 24 uur in absolute ethanol bij vier graden Celsius, vervangt u de ethanol door zuiver melkzuur en bewaart u het segment bij vier graden Celsius voor nog eens 24 uur, of tot aan verdere analyse.Om het meristeem te meten, wordt het bladsegment van drie centimeter eerst gedurende 20 minuten overgebracht naar vers bereide spoelbuffer. Na afloop van de incubatie wordt het segment gedurende twee tot vijf minuten op ijs in het donker overgebracht naar een container met Dapi-kleuringsoplossing. Monteer het weefsel vervolgens snel op een glazen microscoopdia en dek het segment af met een dekglas.Bevestig de fluorescentie van de epidermale cellen onder een microscoop met behulp van UV-fluorescentie. Monteer het monster vervolgens in een druppel spoelbuffer op een nieuwe objectglas met een nieuw dekglas. Plaats het segment bij een 20-voudige vergroting terug onder de microscoop en scan het monster om proliferatieve mitotische figuren te lokaliseren.Vermijd elke formatieve celdeling van de ontwikkelende stemmata en bepaal vervolgens waar de meest distale mitotische figuur zich bevindt. Meet met behulp van een programma voor beeldanalyse de volledige lengte van het beeldframe. In dit voorbeeld is dat 645 micrometer.Tel vervolgens het aantal frames dat de volledige meristeemlengte beslaat, van de meest distale mitotische figuur tot de bladbasis, en vermenigvuldig dit aantal met de lengte van één frame om de totale meristeemlengte te bepalen. Om een cellengteprofiel te verkrijgen, verplaatst u het segment van 11 centimeter vanuit het melkzuur naar de werkbank en gebruikt u een scalpel om het weefsel in 10 segmenten van één centimeter te snijden. Monteer de resulterende bladsegmenten op één microscoopglas met een kleine druppel melkzuur.Plaats alle stukjes met dezelfde zijde naar boven. Breng het objectglas vervolgens over naar een microscoop die is uitgerust met differential interference contrast-optiek. Begin bij het segment dat het dichtst bij de bladbasis ligt en gebruik een geschikt programma voor beeldanalyse om de lengte van ten minste 20 herhaalde epidermale cellen en rijen direct grenzend aan de stemmatale rijen te meten, om een consistente selectie van hetzelfde celtype op gelijkmatig verdeelde posities langs elk van de segmenten te waarborgen.Noteer de overeenkomstige positie voor elke meting over het gehele blad. Bepaal vervolgens de gemiddelde cellengte per millimeter langs de blaasas met behulp van een procedure voor lokale polynomiale afvlakking, geïmplementeerd in het R-script dat beschikbaar is als aanvullend bestand één. Let erop dat er niet te veel wordt afgevlakt.De afvlakking moet de ruis in de celgegevens verwijderen, zonder de algemene vorm van de curve te beïnvloeden. Hier wordt een vergelijking getoond tussen goed bewaterde planten en planten die zijn blootgesteld aan droogtestress, met betrekking tot hun bladgroei. De uiteindelijke bladlengte van de controleplanten was 40 procent lager dan die van de planten met droogtestress, als gevolg van een lagere bladelongatiesnelheid.De bladsnelheid van de door droogte gestresste planten is 73 procent lager dan die van de goed bewaterde controles, als gevolg van een verminderde celproductie. Dit wordt op zijn beurt hoofdzakelijk veroorzaakt door een verminderde celdelingsnelheid. Kinematische analyse biedt een kaart van de lokalisatie van de bladgroeizone, waardoor bemonstering met een subzonale resolutie mogelijk is voor moleculaire en biochemische analyse.Bijvoorbeeld, de kwantificering van MDA langs de groeizone van het maïsblad in planten die zijn blootgesteld aan goed bewaterde controlecondities en droogtecondities, laat een significante toename zien van dit product van lipidafbraak over de gehele groeizone als reactie op watertekort. Vanwege de verkorting van het blad als reactie op de droogte, kwamen de ontwikkelingszones in dit experiment niet overeen tussen de controleplanten en de gestreste planten. Met behulp van het cellengteprofiel kan de lengte van de ontwikkelingszones echter worden bepaald, waardoor de MDA-niveaus in de individuele zones vergeleken kunnen worden.Zodra de methode onder de knie is, kan één monster in vier uur worden verwerkt, mits de techniek correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het meristeem intact moet blijven tijdens de oogst. Na deze procedure kunnen andere technieken worden toegepast, zoals de bepaling van moleculaire en biochemische parameters, om hun betrokkenheid bij de groeiregulatie te bestuderen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u celdeling en celuitbreiding in een groeiend maïsblad kunt kwantificeren, de grootte van de verschillende groeizones kunt bepalen en moleculaire en biochemische gegevens dienovereenkomstig kunt interpreteren. Vergeet niet dat het werken met melk- en azijnzuur en EDTA gevaarlijk kan zijn. Daarom moeten er bij het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het dragen van handschoenen en het reinigen van de microscoop na elke fase van het gebruik.

kinematic-analysis-cell-division-expansion-quantifying-cellular-basis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een protocol met behulp van dia's kamer en de media te planten zaadlobben voor confocale beeldvorming van de opperhuid te immobiliseren over meerdere dagen van de ontwikkeling, het documenteren van stomata differentiatie. Fluorofoor-gemerkte eiwitten kan dynamisch worden gevolgd door expressie en subcellulaire lokalisatie, het verhogen van het inzicht in de mogelijke rollen tijdens de celdeling en cel-type differentiatie.

Lange termijn, hoge resolutie Confocale Time Lapse Imaging van<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis Bij het ontkiemen

Hier wordt getoond hoe ontwikkelingsprocessen in C. elegans kunnen worden gevolgd en gekwantificeerd. De gepresenteerde methoden zijn gebaseerd op open-source tools die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd. Het wordt gedemonstreerd hoe 3D-celvormmodellen kunnen worden gereconstrueerd, hoe subcellulaire structuren handmatig kunnen worden gevolgd en hoe corticaal contractiele stroom kan worden geanalyseerd.

Tracking en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Het gebruik van open-source tools

Mitose is cruciaal voor elk levend organisme en defecten leiden vaak tot kanker en ontwikkelingsstoornissen. Met behulp van dit beeldvormingsprotocol en zebravissen als modelsysteem, kunnen onderzoekers mitose visualiseren in een levend gewerveld organisme en de veelvoud aan defecten die ontstaan wanneer mitotische processen defect zijn.

Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo

Veel ontwikkelingsbelangrijke genen hebben cel- of weefselspecifieke expressiepatronen. Dit artikel beschrijft LM RNA-seq experimenten om genen te identificeren die differentieel tot expressie worden gebracht op de grens tussen het blad en de schede van maïs en in lg1-R mutanten in vergelijking met het wildtype. De experimentele overwegingen die hier worden besproken, zijn van toepassing op transcriptomische analyses van andere ontwikkelingsverschijnselen.

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessen uit een analyse van maïs Leaf Development

Live confocale imaging biedt biologen met een krachtig hulpmiddel om de ontwikkeling te bestuderen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de live confocale beeldvorming van de ontwikkeling van Arabidopsis bloemen.

Live confocale Imaging van de ontwikkelingslanden Arabidopsis Flowers

Hier wordt een simpele techniek voor de confocal time-lapse beeldvorming van wortel- en hypocotyloplossing met hoge resolutie voor maximaal 3 dagen gegeven met behulp van hoge numerieke diafragma-doelstellingen en perfluorodecaline als onderdompelingsmedium.

Een eenvoudige kamer voor langdurige confocal beeldvorming van wortel- en hypocotylontwikkeling

Dit protocol presenteert hoe te leven van beeld en analyseren van de shoot apicale meristems van verschillende plantensoorten met behulp van laser scanning confocal microscopie.

Confocale Live beeldvorming van Shoot apicale Meristems van verschillende plantensoorten

Hier beschrijven we een protocol voor live celbeeldvorming van de corticale microtubuliercytoskelet bij de shoot apicale meristem en het toezicht op de reactie op veranderingen in de fysieke krachten.

Live Cell Imaging van Microtubule Cytoskeleton en Micromechanische Manipulatie van de Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Optische helderheid is een groot voordeel voor celbiologisch en fysiologisch werk bij zebravissen. Robuuste methoden voor het meten van celgroei bij individuele dieren worden beschreven die nieuwe inzichten mogelijk maken in hoe de groei van skeletspieren en naburige weefsels worden geïntegreerd met de groei van het hele lichaam.

Real-time en herhaalde meting van skeletspiergroei in individuele levende zebravissen die worden blootgesteld aan veranderde elektrische activiteit

Maïsblad primordia zijn diep verwarmd en gerold, waardoor ze moeilijk te bestuderen zijn. Hier presenteren we methoden voor het voorbereiden van dwarsdoorsneden en ontrolde hele bergen van maïsblad primordia voor fluorescentie en confocale beeldvorming.

Verbeterde methoden voor het voorbereiden van dwarsdoorsneden en het uitrollen van hele bergen van primordia van maïsbladeren voor fluorescentie en confocale beeldvorming

Dit proces maakt gebruik van confocale microscopie in combinatie met een fluorescerend gelabelde kern- en chromatinemarkerlijn in Arabidopsis thaliana om gelijktijdig de kern- en chromatinedynamiek in Arabidopsis-wortels vast te leggen en veranderingen in deze dynamiek te onderzoeken als reactie op ontwikkelings- en omgevingssignalen.

Kwantitatieve levende celbeeldvorming van kernvorm en chromatinedynamiek tijdens ontwikkeling en omgevingsstress bij Arabidopsis thaliana-wortel

Leer kinematische analyse van celdeling en expansie in maïsbladeren voor plantenontwikkelingsbiologie. Deze methode kwantificeert groeizones en regelmechanismen in Zea mays.

Kinematische analyse van de celdeling en Expansion: Het kwantificeren van de cellulaire basis van groei en Sampling Developmental Zones in Zea Mays Leaves (Video) | JoVE Journal

Kinematische analyse van de celdeling en Expansion: Het kwantificeren van de cellulaire basis van groei en Sampling Developmental Zones in

Meer video's verkennen