Kinematische analyse van de celdeling en Expansion: Het kwantificeren van de cellulaire basis van groei en Sampling Developmental Zones in Zea Mays Leaves
December 2nd, 2016
Het kwantificeren van celdeling en expansie is van cruciaal belang voor het begrijpen van de groei van hele planten. Hier presenteren we een protocol om cellulaire parameters te berekenen die de groeisnelheid van maïsbladeren bepalen en benadrukken we het gebruik van deze gegevens voor het onderzoeken van moleculaire groei-regulerende mechanismen door het richten van ontwikkelingsstadium-specifieke bemonsteringsstrategieën.
De algemene doelen van deze analyse zijn om de cellulaire basis van maïsbladgroei te bepalen en deze gegevens te gebruiken om moleculaire groei-regulerende mechanismen te onderzoeken door ontwikkelings-, stadium-specifieke bemonsteringsstrategieën uit te voeren. Deze methode kan helpen om een sleutelvraag in de plantenontwikkelingsbiologie te beantwoorden. Hoe dragen celdeling en celexpansie bij aan verschillen in groei van het hele orgaan?
Deze aanpak maakt de onderzoeking en ruimtelijke kaartlegging van biochemische moleculaire en fysiologische processen mogelijk, die ten grondslag liggen aan de groei van het hele plantenorgaan. Hoewel dit systeem inzicht kan geven in de groei van maïsbladeren, kan de techniek voor andere systemen worden gebruikt. Waaronder andere grassoorten en organen.
Visuele demonstratie van deze methoden is cruciaal. Bij het oogsten, zijn monsters nemen en meetapparaat stappen moeilijk uit te voeren zonder die demonstratie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Katrien Sprangers en Viktoriya Avramova.
Twee PHD studenten uit mijn laboratorium. Om een volledige kinematische analyse van bladgroei in monocotylen uit te voeren, kweek minimaal 15 planten voor elke behandeling en genotype, onder gecontroleerde omstandigheden in een groeikamer. Wanneer een interessant blad verschijnt, gebruik een liniaal om de lengte van het blad dagelijks te meten, dat is de lengte van de grond tot de punt van het blad, totdat het blad volledig is uitgebreid.
In het ontwikkelingsstadium van belang, snij het bovengrondse deel van de plant van ten minste vijf representatieve planten zo dicht mogelijk bij de wortels, om het meristeemgebied intact te houden. Vervolgens, beginnend bij de buitenste bladeren, rol alle bladeren voorzichtig één voor één uit tot aan het geïnteresseerde blad. Verwijder enkele extra millimeters van de basis om de bladeren los te maken indien nodig.
Verwijder vervolgens de top en de kleine bladeren omsloten door het geïnteresseerde blad, en snijd een segment van drie centimeter uit het blad, beginnend vanaf de basis aan één kant van de middennerf. Het is cruciaal om het blad precies daar af te snijden waar het verbonden is met de stengel. Als u te hoog snijdt, leidt dit tot een onderschatting van de grootte van het meristeem.
Bewaar het segment in een 1,5 milliliter testbuisje, gevuld met drie twee een volume per volume absolute ethanol azijnzuur oplossing, bij vier graden Celsius gedurende 24 uur tot enkele maanden. Snijd vanaf de andere kant van de ader een segment van 11 centimeter vanaf de basis, en bewaar dit segment in een 15 milliliter buis gevuld met absolute ethanol, bij vier graden Celsius gedurende ten minste zes uur om de pigmenten te verwijderen. Na een tweede ronde van 24 uur in absolute ethanol bij vier graden Celsius, vervang de ethanol door pure melkzuur, en bewaar het segment bij vier graden Celsius voor nog eens 24 uur, of tot verdere analyse.
Om het meristeem te meten, breng eerst het drie centimeter lange bladsegment over in vers bereide spoelbuffer gedurende 20 minuten. Aan het einde van de incubatie, breng het segment over in een houder met Dapi-kleuroplossing, gedurende twee tot vijf minuten op ijs in het donker. Monteer vervolgens het weefsel snel op een glazen microscoopglaasje en bedek het segment met een dekglas.
Bevestig de fluorescering van de epidermale cellen onder een microscoop met behulp van UV-fluorescentie. Monteer vervolgens het monster in een druppel spoelbuffer op een nieuw microscoopglaasje met een nieuw glasdeksel. Gebruik een 20-voudige vergroting, breng het segment terug naar de microscoop en blader door het monster om proliferatieve mitotische figuren te lokaliseren.
Vermijd enige formatieve celdeling van de zich ontwikkelende stemmata en definieer vervolgens waar de meest distale mitotische figuur zich bevindt. Gebruik een beeldanalysesoftwareprogramma om de volledige lengte van het beeldframe te meten. In dit voorbeeld 645 micrometer.
Tel vervolgens het aantal frames dat de volledige lengte van het meristeem bedekt van de meest distale mitotische figuur tot aan de bladbasis en vermenigvuldig dit aantal met de lengte van één frame om de volledige lengte van het meristeem te verkrijgen. Om een cellengteprofiel te verkrijgen, breng het segment van 11 centimeter van het melkzuur over naar de werkbank en gebruik een scalpel om het weefsel in 10 segmenten van één centimeter te snijden. Monteer de resulterende bladsegmenten op een enkel microscoopglaasje en een kleine druppel melkzuur.
Plaats alle stukken met dezelfde kant naar boven. Breng vervolgens het glaasje onder een microscoop uitgerust met differentieel interferentie contrast optica. Begin met het segment dat het dichtst bij de bladbasis ligt, gebruik een geschikt beeldanalysesoftwareprogramma om de lengte van ten minste 20 gerepliceerde epidermale cellen en bestanden direct naast de stemmatalbestanden te meten, om de consistente selectie van hetzelfde celtype op gelijkmatig verdeelde posities langs elk van de segmenten te garanderen.
Zorg ervoor om de overeenkomstige positie voor elke meting door het blad heen te schrijven. Bepaal vervolgens de gemiddelde cellengte op elke millimeter langs de bladas met behulp van een lokale polynoomsmoothingprocedure geïmplementeerd in R-script dat beschikbaar is als aanvullend bestand één. Wees voorzichtig om niet te veel te smoothen.
De smoothing moet het ruis in de celgegevens verwijderen, maar niet de algehele vorm van de curve beïnvloeden. Hier wordt een vergelijking getoond tussen goed bewaterde planten en planten die zijn onderworpen aan droogtestresscondities in termen van hun bladgroei. De uiteindelijke bladlengte van de controleplanten was 40 procent lager dan die van de droogtebelastte planten, vanwege een lagere bladverlengingssnelheid.
De bladverlengingssnelheid van de droogtebelastte planten is 73 procent lager dan die van goed bewaterde controles, vanwege een verminderde celproductie. Die op zijn beurt voornamelijk wordt veroorzaakt door een verminderde celdelingssnelheid. Kinematische analyse biedt een kaart van de lokalisatie van de bladgroeizone, waardoor bemonstering met een subzonale resolutie mogelijk is voor moleculaire en biochemische analyse.
MDA-kwantificering langs de groeizone van het m
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het kwantificeren van celdeling en expansie in maïsbladeren, cruciaal voor het begrijpen van de groei van de hele plant. De aanpak maakt onderzoek mogelijk naar moleculaire groei-regulerende mechanismen door middel van ontwikkelingsfase-specifieke bemonsteringsstrategieën.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Plantenontwikkelingsbiologie
- Cellulaire groeimechanismen
- Maïsbladgroei
Achtergrond
- Het begrijpen van celdeling en expansie is essentieel voor plantengroei.
- Deze studie richt zich op maïs als modelorganisme.
- De methode kan worden toegepast op andere gras-soorten en plantenorganen.
- De verkregen inzichten kunnen belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie beantwoorden.
Doel van het onderzoek
- Om de cellulaire basis van maïsbladgroei te bepalen.
- Om moleculaire groei-regulerende mechanismen te onderzoeken.
- Om ontwikkelingsfase-specifieke bemonsteringsstrategieën uit te voeren.
Gebruikte methoden
- Kwantificering van celdeling en expansie.
- Ontwikkelingsfase-specifieke bemonstering.
- Ruimtelijke kaart van biochemische en fysiologische processen.
- Toepassing van de methode op verschillende plantensystemen.
Belangrijkste resultaten
- Celdeling en expansie dragen bij aan verschillen in orgaangroei.
- De methode biedt inzichten in groeimechanismen.
- Toepasbaar op andere gras-soorten en plantenorganen.
- Bijdragen tot het begrijpen van de dynamischen van de groei van de hele plant.
Conclusies
- Het protocol verbetert het begrip van maïsbladgroei.
- Het kan worden aangepast voor gebruik in andere plantensystemen.
- De bevindingen dragen bij aan het veld van de plantenontwikkelingsbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Kinematic analysis quantifies cell division and expansion to link molecular data with defined cellular developmental stages, enabling targeted sampling in plant systems. This approach supports mechanistic de-risking in early discovery by clarifying how cellular processes drive phenotypic variation. It provides a reproducible framework for aligning biochemical measurements with spatial growth zones, improving predictive confidence in target validation workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Quantifies cellular contributions to organ growth, enabling hypothesis testing of growth regulatory mechanisms.
- Operational Value: Defines meristem length and developmental zones using DAPI staining and DIC microscopy for precise staging.
- Predictive Value: Correlates molecular changes (e.g., MDA levels) to specific cellular developmental stages, reducing ambiguity in target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative cell length profiles along the leaf axis using image analysis and local polynomial smoothing.
- Operational Value: Enables standardized sampling of epidermal cells at equally spaced positions for reproducible phenotypic screening.
- Scalability: Processes a single sample in four hours post-mastery, supporting medium-throughput applications in discovery biology.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maps developmental zones to allow zone-specific comparison of biochemical markers across conditions (e.g., well-watered vs. drought).
- Mechanistic De-risking: Isolates cellular drivers of growth differences (e.g., reduced cell division under drought) to inform target prioritization.
- Predictive Confidence: Supports data interpretation of high-spatial-resolution molecular assays by anchoring them to validated cellular stages.
Pipeline & Workflow Integration
Kinematic analysis fits within early discovery to inform lead identification by providing cellular resolution to growth phenotypes, particularly in grass species models.
- Discovery Biology: Tests hypotheses on how cell division and expansion contribute to whole-organ growth differences.
- Screening: Delivers quantitative, spatially resolved cell length measurements to standardize compound or genotype evaluation.
- Analytics: Outputs meristem length and cell length profiles that enable statistical comparison of growth conditions.
- Translational Research: Connects molecular biomarkers (e.g., lipid peroxidation) to defined developmental zones for continuity across validation stages.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable method for growth zone mapping applicable across monocot systems and organs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by quantifying cellular basis of growth, increasing confidence in target hypotheses.
- Operational Value: Standardizes developmental staging via meristem length and cell length profiling, improving reproducibility across labs.
- Strategic Value: Enables focused, stage-specific sampling to optimize resource use in molecular and biochemical studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by linking cellular phenotypes to molecular mechanisms, improving go/no-go decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microscopy (DIC, UV fluorescence) and image analysis for meristem and cell length measurement.
- Needs instrumentation for tissue sectioning, staining (DAPI, lactic acid), and controlled storage (ethanol-acetic acid, lactic acid solutions).
- Demands cross-team standardization of sampling protocols to ensure consistent developmental zone definition.
- Must account for tissue-specific adaptation when applying to non-monocot systems or organs with different growth zone sizes.
- Limited to emerged leaves with growth zones spanning several centimeters during steady-state growth, per protocol constraints.
