Met behulp van Linear Agarose kanalen om te studeren Drosophila Larvale Crawling Behavior
26 november 2016
De Drosophila larven is een krachtig modelsysteem om neuronale controle van gedrag te bestuderen. Deze publicatie beschrijft het gebruik van lineaire agarose kanalen om aanhoudende aanvallen van lineaire kruipen en methoden te lokken om de dynamiek van larvale structuren te kwantificeren tijdens repetitieve kruipen gedrag.
Het algemene doel van deze procedure is om larven van Drosophila te observeren die in een lineaire agarose kanaal kruipen om de ontwikkeling van neurale circuits te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van neuro ethologie en ontwikkelingsbiologie, zoals het begrijpen van de neurale codes die motorische patronen genereren en het identificeren van belangrijke genetische en cellulaire processen die neuronale circuits voor bewegingscontrole vormen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het het gedragsrepertoire van de larven beperkt, zodat onderzoekers een enkel veelvoud patroon in detail kunnen bestuderen.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Zarion Marshall, een technicus uit mijn laboratorium. Eerst is het belangrijk om de gezondheid van de larve te beoordelen. Drie tot vier dagen voor de opname, vervang de verzamelplaat van de volwassen kooi.
Ga dagelijks en op hetzelfde tijdstip verder met dit proces. Tel de eieren en pas uitgekomen larven op de plaat. Het verwachte aantal eieren is tussen de 500 en 2.000.
Pas het aantal volwassenen in de kooi aan naar behoefte. We onderzoeken de plaat 24 uur later om te bepalen of de larven gezond zijn. De meeste eieren zouden moeten zijn uitgekomen tot larven, en de larven zouden in de gistpasta moeten zijn gekropen.
Tekenen van slechte gezondheid zijn een groot aantal onuitgekomen eieren, dode larvale lichamen ver weg van de gistpasta en larven met ongewoon donkere vlekken in de buik, wat een indicator is van een immuunreactie. Als de larven ongezond lijken, verander dan de kooi met vers bereide platen en controleer het genotype van de volwassenen. Verzamel voor het experiment pas uitgekomen tweede instar larven van één tot twee dagen oude platen.
Alle stadia kunnen worden gebruikt in de analyse. Voor dit protocol, beschik over een lineair kanaal PDMS-afgietselvorm. Reinig de vorm met isopropylalcohol.
Zodra het is gedroogd, plaats de mal in een tien centimeter deksel of een soortgelijke container. Vul vervolgens de mal met drie procent agarose gekoeld tot 55 graden Celsius. Giet de agarose voorzichtig om luchtbellen in de mal te voorkomen.
De mal moet net worden bedekt door de agarose. Eenmaal gestold, verwijder de agarose kanalen uit de mal. Snijd de randen van de schijfvormige kanalen af en dompel vervolgens de kanalen in water.
Ze kunnen maximaal zeven dagen in water worden bewaard bij vier graden Celsius. Laat de kanalen voor gebruik opwarmen tot kamertemperatuur. Selecteer een kanaal dat overeenkomt met de breedte van de larve.
De kanalen variëren van 100 tot 300 micron in breedte en zijn allemaal 150 micron diep. Gebruik vervolgens een schone scheermes om een enkel kanaal uit de voorbereide schijf te snijden. Overbreng het kanaal met een pincet naar een geschikte glazen dekglas of dia met de gegroefde kant omhoog.
Gebruik vervolgens fijne pincetten om voorzichtig een larve op te pakken zonder hem te knijpen. Een fijngetipt penseel werkt ook goed. Als er wordt geknepen, kunnen pijnreflexen zoals rollen of hurken het gedrag van de larve in het kanaal domineren.
Was nu de larve door deze kort in water te dompelen en plaats hem voorzichtig in het gesneden kanaal door hem er voorzichtig in te leggen. Eenmaal in het kanaal, pas de oriëntatie van de larve aan om de structuur van belang gemakkelijk te beeld te maken. Plaats vervolgens een of twee druppels water aan beide uiteinden van het kanaal om het kanaal met water te vullen.
Als er luchtbellen vast komen te zitten, til dan voorzichtig de zijden van het kanaal op om ze te verwijderen. Om de oriëntatie van de larve verder aan te passen, duw het kanaal voorzichtig om de larve rond te laten rollen. De larve is nu klaar om te worden geïmageed.
Larven in lineaire kanalen voeren aanhoudende reeksen van ritmisch kruipen uit. Fluorescerende sondes worden gemakkelijk onderzocht. Bijvoorbeeld, larven die GFP uitdrukken in hun neuronen vanuit de GAL4-driver, tonen dynamische veranderingen in fluorescentie-intensiteiten die afkomstig zijn van de zenuwstreng tijdens de kruipcyclus.
Het centrale zenuwstelsel beweegt ongeveer tegelijkertijd met het hoofd en de staart van de larve, terwijl een golf van spiercontractie langs de lichaamsas passeert. Het centrale zenuwstelsel beweegt in en uit het scherpstelvlak, waardoor de fluorescentie van de zenuwstreng verandert. De veranderingen in fluorescentie werden gekwantificeerd uit drie kruipgangen voor drie larven. De dynamiek van de zenuwstreng fluorescentie over de stapcyclus volgde een reproduceerbaar patroon dat kon worden gebruikt voor fenotypering.
Na het bekijken van deze video, zou u een begrip moeten hebben van hoe u larven verzamelt voor gedrag, hoe u agarose kanalen voorbereidt en hoe u de larven in de kanalen laadt om het lineaire kruipgedrag te visualiseren. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de larven voorzichtig te hanteren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie maakt gebruik van Drosophila-larven als model om de neurale aansturing van gedrag te onderzoeken via lineair kruipen in agarosekanalen. De methodologie maakt gedetailleerde observatie van de beweging van de larven en de dynamiek van de neurale circuits die betrokken zijn bij de motorische controle mogelijk.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neuroethologie
- Ontwikkelingsbiologie
- Neurowetenschappen
Achtergrond
- Drosophila-larven zijn effectieve modellen voor het bestuderen van gedrag.
- Het begrijpen van neurale codes is cruciaal voor de generatie van motorische patronen.
- Het identificeren van genetische en cellulaire processen helpt bij het in kaart brengen van neuronale circuits.
- Het beperken van het gedrag maakt een gerichte studie naar specifieke motorische patronen mogelijk.
Doel van de studie
- Om het kruipgedrag van larven in een gecontroleerde omgeving te observeren.
- Om de ontwikkeling van neurale circuits die betrokken zijn bij beweging te bestuderen.
- Om kernvragen in de neuroethologie en ontwikkelingsbiologie te beantwoorden.
Gebruikte methoden
- Gebruik van lineaire agarosekanalen voor het observeren van kruipgedrag.
- Beoordeling van de gezondheid van de larven voorafgaand aan de experimenten.
- Kwantificering van de dynamiek tijdens repetitief kruipgedrag.
- Demonstratie van de procedure door een laboratoriumtechnicus.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle uitlokking van aanhoudende krupcycli bij larven.
- Gedetailleerde observatie van de dynamiek van de larvale structuur tijdens beweging.
- Inzichten in de neurale mechanismen die motorische patronen aansturen.
- Vestiging van een betrouwbare methode voor het bestuderen van larvaal gedrag.
Conclusies
- De methode biedt een platform om neurale circuits in detail te bestuderen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van bewegingscontrole bij Drosophila.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze techniek om verdere vragen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Lineaire agarosekanaal-assays voor kruipende Drosophila-larven maken een nauwkeurige dissectie mogelijk van de neurale circuitfunctie die ten grondslag ligt aan ritmisch motorisch gedrag. Deze benadering ondersteunt targetvalidatie met een hoge betrouwbaarheid en mechanische risicoreductie in de vroegste stadia van drug discovery gedreven door neurobiologie. De reproduceerbaarheid van de methode en de kwantitatieve resultaten positioneren deze als een herbruikbaar platform voor fenotypische screening en translationeel onderzoek in studies naar neuro-ontwikkeling en motorische controle.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt gedetailleerd onderzoek mogelijk naar de mechanismen van neurale circuits die motorische patronen aansturen.
- Ondersteunt functionele target-validatie door genetische perturbaties te koppelen aan kwantificeerbare gedragstypes.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door ritmisch kruipen te isoleren van storende gedragingen.
- Biedt een platform voor hypothese-gestuurde exploratie van neuro-ontwikkelingspaden.
Screening & assayontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare gedragsassays voor downstream screening van verbindingen of genetische factoren.
- Genereert kwantitatieve read-outs op segment- en spierniveau voor robuuste fenotypering.
- Maakt schaalbare preparatie mogelijk van ziekterelevante systemen voor high-content analyse.
- Ondersteunt de assay-gereidheid voor het evalueren van neurale of musculaire modulatoren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door in vivo beeldvorming van neurale activiteit tijdens gedrag mogelijk te maken.
- Biedt continuïteit van genetische ontdekking naar preklinische validatie in een hanteerbaar model.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde vooruitgang door moleculaire interventies te koppelen aan functionele uitkomsten.
- Faciliteert voorspellende risicoreductie voor portfolio's van neuroactieve verbindingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypothesetoetsing tot lead-identificatie en preklinische validatie voor neurobehaviorale targets.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten over de functie van neurale circuits en pathway-mapping in een genetisch hanteerbaar systeem.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve gedragsresultaten voor assay-ontwikkeling en de evaluatie van verbindingen.
- Analytica: Maakt meting van fluorescentiedynamiek en pascyclusparameters mogelijk voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinisch werk door in vivo monitoring van neurale activiteit tijdens gedrag mogelijk te maken.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Biedt een flexibel, genotype-agnostisch platform dat aanpasbaar is aan diverse onderzoeks- en screeningsbehoeften.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van neurobehaviorale targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert gedragsassays voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over verschillende onderzoeksteams heen.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go beslissingen en de kapitaalefficiëntie door robuuste, kwantitatieve fenotypering te bieden.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van neuroactieve targets en interventies.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van Drosophila, gedragsanalyse en fluorescentie-imaging.
- Toegang tot gietvormen, imagingplatforms en instrumenten voor kwantitatieve analyse is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van kanaaldimensies en imagingprotocollen tussen teams.
- Aanpasbaar aan diverse genotypen en door onderzoekers ontworpen kanaalgeometrieën.
- Praktische beperkingen omvatten zorgvuldige hantering van larven om stress-geïnduceerde artefacten te voorkomen.
