Ontwerp en implementatie van een Automated Verlichten, kweken, en Sampling System voor Microbiële optogenetische Applications
February 19th, 2017
We ontwierpen een continu kweken inrichting voor gebruik met systemen optogenetic aan kweken van microben en regelmatig afbeeldingscellen branden in het effluent met een omgekeerde microscoop. Het kweken, sampling, beeldvorming en beeldanalyse zijn volledig geautomatiseerd, zodat dynamische reacties op de verlichting kan worden gemeten over meerdere dagen.
Het algemene doel van deze procedure is om een continu kweekvat samen te stellen, waarin de respons op verlichting van optogenetische microben automatisch in real time en gedurende meerdere dagen met een microscoop kan worden gemeten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de cellulaire biologie en metabole techniek, zoals hoe dynamische genexpressie reacties kan veroorzaken die verschillen van statische genexpressie. Het grote voordeel van deze methode is dat continue cultuur metingen gedurende meerdere dagen mogelijk maakt.
Om te beginnen, soldeer de aardlijn, de datalijn en de positieve spanningslijn van de digitale thermometer op het printplaatje. Knip een pin af van een vrouwelijk drie-pins header en knijp de resterende twee pinnen bij. Soldeer dit in de paar gaten gelabeld R2, en verbind de twee gesoldeerde pinnen door een 4,7 kilo ohm weerstand in de pin header te plaatsen.
Verbind vervolgens de resterende componenten met het circuitbord. Leg het circuitbord op de micro controller. Zet de lichtdichte behuizing op en installeer alle software zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.
Plaats eerst het lange uiteinde van de aluminium poort door de pakking in het kweekvat en schroef de dop erop. Bedek een korte uitlaat van de aluminium poort met siliconen slang van middelbare diameter. Verbind het distilleerdeel door een vrouwelijke luer-lock in te steken en verbind vervolgens een mannelijke luer-lock plug.
Deze uitlaat is aanvullend en zal niet worden gebruikt. Verbind twee korte segmenten van siliconen slang met middelbare diameter met mannelijke en vrouwelijke luer-locks. Verbind vervolgens een uiteinde met een korte uitlaat van de aluminium poort en verbind het distilleerdeel.
Het vat zal via deze buis worden geïnoculeerd. Verbind vervolgens twee middelste buizen aan de uiteinden van de slang met middelbare diameter en connectoren. Verbind een uiteinde met een korte aluminium poort en verbind de andere uiteinde.
Later zal dit worden aangesloten op de mediafles. Verbind een slang met middelbare diameter aan de langste aluminium poort. De slang moet lang genoeg zijn om de mediafles te bereiken.
Verbind een ander kort segment van een paar centimeter lang aan het uiteinde en steek het vervolgens in de rubberen stop op de mediafles. Klem de slang vast. Wanneer later losgeklemd, staat deze verbinding toe dat de cultuur wordt gemengd, geventileerd en onder positieve druk wordt gehouden door de binnenkomende bellen.
Steek een slang met middelbare diameter lang genoeg om de bodem van de fles te bereiken, door de stop waardoor media wordt overgebracht. Verbind een andere slang met middelbare diameter met deze slang en verbind vervolgens een slang met grote diameter aan het einde. Verbind het distilleerdeel.
Vul het derde gat in de stop met een kort segment van slang met middelbare diameter, verbonden met twee andere segmenten van slang met middelbare diameter en aangesloten aan het distilleerdeel. Dit zal worden aangesloten op een vacuümpomp en later op een aquariumpomp. Steek een mannelijke luer-lock in een segment van siliconen slang met smalle diameter en steek vervolgens stevig PTFE-buis erop.
Bevestig vervolgens een vrouwelijke luer-lock aan een slang met middelbare diameter. Draai de vrouwelijke lock langs de PTFE-buis om de locks en de andere aan een korte aluminium poort te verbinden. Zorg ervoor dat de PTFE-buis binnenin het kweekvat onder de tweede langste aluminium buis hangt en boven de bodem.
Trim indien nodig. Media zal hier worden bemonsterd tot het beeldvormingskanaal, en de smalle buis minimaliseert het tussenliggende volume. Verbind vervolgens de blootgestelde smalle siliconenbuis met de smalle peristaltiekbuis en connectoren.
Verbind hieraan drie segmenten van slang met smalle diameter en twee segmenten van PTFE-buis, afwisselend. Verbind dit met de effluentfles, via slang met middelbare diameter. Verbind vervolgens een uiteinde van een slang met middelbare diameter aan de tweede langste buis van de aluminium poort aan de andere kant van de effluentfles.
Deze aluminium buis bepaalt het cultuurvolume en overtollig cultuur stroomt over in de effluentcontainer. Wikkel de deksels van de fles met aluminiumfolie en steriliseer de assemblage vervolgens 30 minuten bij 121 graden Celsius en 15 PSI. Bevestig de vacuümfilter aan een fles van 100 milliliter.
Verwijder de nippelafdekking en verwijder vervolgens de witte plug van de nippel van de vacuümfilter met steriele pincetten. Verbind de brede siliconen slang met de nippel, de andere vrije buis van de mediafles met een vacuümpomp en zorg ervoor dat de derde buis die de mediafles met het kweekvat verbindt, geklemd is. Vul de filter met media, zet de vacuümpomp aan en filter vervolgens de rest van de media.
Klem de siliconen slang met media die met de vacuüm is verbonden en zet de vacuümpomp uit. Verwijder de luers van het tussenliggende segment van siliconen slang met middelbare diameter dat met de vacuümpomp is verbonden en steek het blauwe uiteinde van een steriele spuit luchtfilter in deze buis. Klem vervolgens de brede siliconenbuis en koppel de mannelijke luer ervan los.
Koppel de plug los van de vrouwelijke luer van de media inlaatbuis van het kweekvat. Verbind deze luers om media in het kweekvat te kunnen pompen. Verwijder vervolgens de filter van de fles van 100 milliliter en bevestig de flesdop.
Gebruik deze media om een startercultuur te bereiden. Plaats de continue kweekassemblage in de buurt van een microscoop met de mediafles hoger dan het kweekvat en de effluentfles lager dan het kweekvat om terugstroming te voorkomen. Bevestig de rubberen stoppen op de media- en effluentflessen stevig met plakband.
Ontkoppel vervolgens de uiteinden van de PTFE-buis van de smalle siliconenbuis die ze verbindt en steek deze uiteinden in de inlaat en uitlaat van een voorbereide microfluïdische inrichting. Duw vervolgens media in het kweekvat door de witte kant van de spuit luchtfilter aan te sluiten op de aquariumpomp. Wanneer media het niveau van de effluentpoort bereikt, wikkel de media inlaatbuis en connectoren rond de langzame peristaltiekpomp en de smalle monsteruitlaatbuis en connectoren rond de snelle peristaltiekpomp.
Beluchtuur de media door de luchtbuis tussen de mediafles en het kweekvat los te koppelen. Bevestig vervolgens de verwarmingspad en thermometer aan het kweekvat zodat de temperatuur kan worden gecontroleerd. Draai de mediabuis rond het kweekvat
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een continu kweekapparaat ontworpen voor optogenetische systemen, dat de verlichting van microbiële culturen en geautomatiseerde beeldvorming van cellen gedurende meerdere dagen mogelijk maakt. Het systeem staat real-time meting van dynamische reacties op lichtblootstelling toe.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Cellulaire biologie
- Metabolische techniek
- Optogenetica
Achtergrond
- Het begrijpen van dynamische genexpressie is cruciaal in de cellulaire biologie.
- Statische genexpressiereacties kunnen aanzienlijk verschillen van dynamische reacties.
- Continue kweeksystemen vergemakkelijken langdurige observatie van microbiële reacties.
- Geautomatiseerde beeldvorming verbetert de efficiëntie van dataverzameling.
Doel van de studie
- Om de reactie van optogenetische microben op verlichting te meten.
- Om de verschillen tussen dynamische en statische genexpressie te onderzoeken.
- Om een volledig geautomatiseerd systeem voor kweek en beeldvorming te ontwikkelen.
Gebruikte methoden
- Samenstelling van een continu kweekvat.
- Integratie van een digitale thermometer voor temperatuurbewaking.
- Gebruik van een omgekeerde microscoop voor beeldvorming.
- Automatisering van kweek-, bemonsterings- en beeldanalyseprocessen.
Belangrijkste resultaten
- Het apparaat verlichtte succesvol culturen en beeldde cellen automatisch af.
- Dynamische reacties op verlichting waren meetbaar gedurende meerdere dagen.
- De verzamelde data leverde inzichten op in genexpressiedynamiek.
- De methode toonde voordelen in het bestuderen van microbieel gedrag.
Conclusies
- Het continue kweekapparaat is effectief voor real-time studies.
- Geautomatiseerde systemen kunnen onderzoek in de cellulaire biologie verbeteren.
- Deze methode opent nieuwe wegen voor het verkennen van metabolische techniek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This automated culturing system enables prolonged, real-time monitoring of optogenetic microbial responses, addressing a key challenge in metabolic engineering: linking dynamic gene expression to phenotypic outcomes over extended periods. By integrating programmable illumination with continuous culture and automated imaging, the platform supports mechanistic de-risking of synthetic biology constructs before scale-up. The ability to quantify fluorescence and morphology across thousands of cells over multiple days enhances predictive confidence in strain performance under industrially relevant conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking optogenetic induction to dynamic protein production in yeast.
- Operational Value: Supports functional target validation through real-time, quantitative fluorescence tracking of gene expression dynamics.
- Predictive Value: Measures how temporal patterns of illumination affect cellular output, informing dose-response modeling for inducible systems.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated microbial systems for downstream screening by stabilizing culture conditions in a chemostat format.
- Quantitative Output: Generates standardized, time-resolved fluorescence and morphology data from effluent sampling for assay optimization.
- Scalability: Automated sampling and imaging enable high-content, reproducible data collection across multiple conditions without manual intervention.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses Saccharomyces cerevisiae as a disease-relevant system for studying conserved eukaryotic signaling pathways.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by providing dynamic phenotypic data not accessible in batch or plate-based assays.
- Mechanistic De-risking: Clarifies how dynamic versus static gene expression influences metabolic burden and product yield, reducing uncertainty in strain selection.
Pipeline & Workflow Integration
The system fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing in early discovery, assay readiness in screening, and phenotypic validation in translational research through real-time, longitudinal data capture.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification by linking optogenetic stimulation to temporal changes in gene expression and cellular morphology.
- Screening: Ensures assay reproducibility through automated effluent sampling and standardized imaging of cells in microfluidic channels.
- Analytics: Enables comparison of conditions via quantitative fluorescence intensity measurements from over 30,000 images across 70 hours.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by correlating optogenetic induction with measurable changes in YFP expression as a proxy for pathway activity.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for testing various optogenetic constructs, promoters, or metabolic pathways under controlled dynamic conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in how dynamic stimuli affect microbial cell factories.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility through fully automated culturing, sampling, and image analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early identification of strains with favorable dynamic response profiles.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing longitudinal data that better predict performance in fed-batch or industrial fermentation settings.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial culturing, optogenetics, and microfluidic integration.
- Needs instrumentation including peristaltic pumps, LED matrix, microscope, and bioreactor control software.
- Demands cross-team standardization for consistent setup of light exposure regimes and sampling intervals.
- Involves adaptation considerations when applying the system to different microbial hosts or optogenetic tools.
- Includes practical limitations such as the need for sterile technique and careful tubing configuration to prevent contamination or backflow.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:41
Electronics Setup and LED Calibration
1:23
Prepare the Culturing Vessel
2:25
Prepare the Media Flask
5:01
Media Flask Filling
6:16
Apparatus Assembly at the Microscope
7:55
Culture Vessel Inoculation and Microbe Imaging
9:05
Results: Optogenetic Activation of S. cerevisiae
3:30
Prepare the Effluent Flask
10:19
Conclusion
