Name: Ontwerp en implementatie van een Automated Verlichten, kweken, en Sampling System voor Microbiële optogenetische Applications (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Leer een geautomatiseerd continue kweeksysteem voor optogenetische microben met real-time microscopie en beeldanalyse. Deze methode maakt dynamische genexpressiestudies over meerdere dagen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Molly Lazar en Verónica Delgado erkennen voor hulp bij het testen van het protocol, Kieran Sweeney voor nuttige discussies en bewerken, en Taylor Scott, My An-adirekkun en Stephanie Geller voor kritische lezing van het manuscript. Megan Nicole McClean, Ph.D. behaalde een Carrière Award op het Wetenschappelijk Interface van de Burroughs Wellcome Fonds.

<ol><li>Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-mediated+control+of+DNA+transcription+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Light-mediated control of DNA transcription in yeast.</a> Methods. 58 (4), 385-391 (2012).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Light-inducible+spatiotemporal+control+of+gene+activation+by+customizable+zinc+finger+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors.</a> J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+A+light-inducible+CRISPR-Cas9+system+for+control+of+endogenous+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).</li>
<li>Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-inducible+organelle-targeting+system+for+dynamically+activating+and+inactivating+signaling+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast.</a> Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).</li>
<li>Lee, S., Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+protein+inactivation+by+optogenetic+trapping+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells.</a> Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).</li>
<li>Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).</li>
<li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).</li>
<li>Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-induced+dimerization+of+a+bacterial+LOV-HTH+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein.</a> Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).</li>
<li>Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+LOV2+Domain-Based+Optogenetic+Tool+to+Control+Protein+Degradation+and+Cellular+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function.</a> Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).</li>
<li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+the+chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Description of the chemostat.</a> Science (New York, N.Y.). 112 (2920), 715-716 (1950).</li>
<li>Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79 (4), 390-410 (1950).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).</li>
<li>Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7, 973-975 (2010).</li>
<li>Olson, E. J., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+characterization+methods+overcome+key+challenges+in+synthetic+and+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology.</a> Nature chemical biology. 10 (7), 502-511 (2014).</li>
<li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast%3A+An+experimental+organism+for+21st+century+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Yeast: An experimental organism for 21st century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li>
<li>Galanie, S., Smolke, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+yeast-based+production+of+medicinal+protoberberine+alkaloids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+cell+factories%22%5BJournal%5D)">Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids.</a> Microbial cell factories. 14 (1), 144(2015).</li>
<li>Gerngross, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+production+of+human+therapeutic+proteins+in+yeasts+and+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi.</a> Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).</li>
<li>van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+fermentation+of+carbon+sources+in+biomass+hydrolysates+by+Saccharomyces+cerevisiae%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 90 (4), 391-418 (2006).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+%C2%B5Manager%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using µManager.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).</li>
<li>Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.jbmethods.org/jbm/article/view/36/0">Advanced methods of microscope control using µManager software.</a> Journal of biological methods. 1 (2), (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/1438429/">Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).</li>
<li>Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+homeostasis+in+batch+and+steady-state+culture+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).</li>
<li>Boer, V. M., Tai, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+responses+of+Saccharomyces+cerevisaie+to+preferred+and+nonpreferred+nitrogen+sources+in+glucose-limited+chemostat+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures.</a> FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).</li>
<li>Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+genotype+and+nutrition+on+survival+and+metabolism+of+starving+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).</li>
<li>Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+rate%2C+cell+cycle%2C+stress+response+and+metabolic+activity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).</li>
<li>Gresham, D., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enduring+utility+of+continuous+culturing+in+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution.</a> Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).</li>
<li>Liu, H., Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoexcited+CRY2+interacts+with+CIB1+to+regulate+transcription+and+floral+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis.</a> Science (New York, N.Y.). 322 (5907), 1535-1539 (2008).</li>
<li>McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+gene+expression+perturbation+systems+with+rapid%2C+tunable%2C+single-gene+specificity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast.</a> Nucleic Acids Research. 41 (4), 1-10 (2013).</li>
<li>McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation-based+analysis+and+modeling+of+combinatorial+regulation+in+the+yeast+sulfur+assimilation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway.</a> Molecular biology of the cell. 23 (15), 2993-3007 (2012).</li>
<li>McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).</li>
<li>Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optogenetic+control+of+intracellular+protein+concentration+in+microbial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).</li>
<li>Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+rate%2C+cell+cycle%2C+stress+response%2C+and+metabolic+activity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li>
<li>Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth-limiting+intracellular+metabolites+in+yeast+growing+under+diverse+nutrient+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations.</a> Molecular biology of the cell. 21 (1), 198-211 (2010).</li>
<li>Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/j.2050-0416.1967.tb03043.x/pdf">Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast.</a> Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).</li>
<li>Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+phosphate+scarcity+on+pharmaceutical+protein+production+in+S.+cerevisiae%3A+linking+transcriptomic+insights+to+phenotypic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+cell+factories%22%5BJournal%5D)">The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses.</a> Microbial cell factories. 10 (1), 104(2011).</li>
<li>Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+Systems+of+Bacteria+such+as+Escherichia+coli+in+Response+to+Nutrient+Limitation+and+Environmental+Stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses.</a> Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).</li>
<li>Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+bacterial+gene+circuit+dynamics+with+optically+programmed+gene+expression+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals.</a> Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We hebben dit apparaat met flexibiliteit in het achterhoofd. Al het gebruikte code is gratis en open-source. Het beeld standaard analyseproces naar segment cellen is eenvoudig en loopt snel op. Custom analyse kan worden uitgevoerd door het opnemen van input van de gebruiker, terwijl het analyseren van een representatief beeld van de Fiji-grafische user interface, het omzetten van de input voor een BeanShell script, en dan het instellen van de plugin om het script te bellen. Wanneer het wordt genoemd, zal dit script een ...

Optogenetische systemen gebruiken licht om een groeiende lijst van cellulaire processen, waaronder genexpressie, 1, 2, 3, 4, 5 eiwit lokalisatie, 6 eiwitactiviteit, 6, 7, 8 eiwitbinding, 8, 9, 10 en eiwitafbraak controleren. 11 Werkwijze voor het kweken van cellen in een gecontroleerde omgeving met geprogrammeerde optische stimulatie en het meten van hun reactie op biologisch relevante tijdschalen moet het potentieel van deze instrumenten benutten voor onderzoek in de celbiologie en biotechnologie. Onze methode maakt gebruik van chemostatische een constante celgroei handhaven in een goed gemengde, aegewaardeerd en temperatuurregeling glazen kweekvat 12, 13 dat is blootgesteld aan verlichting geprogrammeerd. We afbeelding individuele cellen in de kweek effluent met een omgekeerde microscoop om de respons van de cultuur geprogrammeerde belichting te meten. Het kweken, sampling, beeldvorming en beeldanalyse zijn volledig geautomatiseerd, zodat de fluorescentie-intensiteit en cellulaire morfologie van het effluent celkweek kan worden gemeten over meerdere dagen zonder input van de gebruiker. Dit protocol kan in de meeste laboratoria vertrouwd groeiende celkweek en microscopie uitgevoerd, en de gebruikte apparatuur is goedkoop en van gemakkelijk beschikbare componenten. Een transparante kweekvat wordt boven een matrix van licht-emitterende diodes (LEDs) kan uitzenden 1 uW / cm 2 -10 mW / cm2 licht geplaatst. Microben worden gekweekt in het kweekvat continu; een peristaltische pomp wordt gebruikt om media aan deverdunning, andere wordt gebruikt om de cultuur intrekken een lager aan de microscoop, en het verschil ontsnapt via een overloop. Een verwarmingselement handhaaft de temperatuur. Lucht wordt continu gepompt in het kweekvat om een ​​positieve druk te handhaven en te mengen en beluchten cultuur. Met uitzondering van de luchtpomp, wordt het vermogen deze worden geregeld door een microcontroller die ook ontvangt input van een thermometer en een aangesloten computer. Het effluent celkweek wordt gepompt naar een microfluïdische apparaat op het podium van een omgekeerde microscoop. Non-tl en tl-beelden worden automatisch overgenomen. De cellen in de afbeeldingen worden gekenmerkt door een algoritme dat elke cel lokaliseert een interessegebied (ROI) en meet de eigenschappen van elke ROI. Als u een toepassing van dit protocol aan te tonen, we meten de respons op wisselende lichtintensiteiten van Saccharomyces cerevisiae cellen ontworpen met een blauw licht verantwoorve optogenetic systeem dat de transcriptie van fluorescerend eiwit regelt. S. cerevisiae, algemeen bekend als bakkersgist, werd geselecteerd omdat meerdere optogenetic systemen voor het reguleren van genexpressie in dit systeem bestaan 14, 15, 16. Bovendien is deze modelorganisme gebruikt voor studies in systeembiologie 17 en een chassis voor biotechnologische toepassingen 18, 19, 20. De representatieve resultaten tonen aan dat dit protocol kan worden gebruikt om transcriptie van een kweek over meerdere dagen regelen door het variëren ingang lichtintensiteiten en het meten van de productie van een fluorescerende reporter.

<table><tbody><tr><td>Extensive lab manual</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>An extensive, regularly updated lab manual is available in the &ldquo;Optogenetic Chemostat Files&rdquo; GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results.</td></tr><tr><td>Fritzing Design Viewer</td><td>Fritzing</td><td>NA</td><td>The free, open-sourced software to view and edit the.fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/"</td></tr><tr><td>Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled)</td><td>Adafruit</td><td>50</td><td>Microcontroller. 1 required.</td></tr><tr><td>Arduino Stackable Header Kit</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10007</td><td>Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required.</td></tr><tr><td>Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V</td><td>Adafruit</td><td>180</td><td>For making electrical connections to the PCB. 1 required.</td></tr><tr><td>Soldering iron stand</td><td>Adafruit</td><td>150</td><td>For making electrical connections to the PCB. 1 required.</td></tr><tr><td>Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter - 100g</td><td>Adafruit</td><td>145</td><td>For making electrical connections to the PCB. 1 required.</td></tr><tr><td>0.1 µF capacitor</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-08375</td><td>Stabilizes voltage in PCB. 1 required.</td></tr><tr><td>10 µF capacitor</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-00523</td><td>Stabilizes voltage in PCB. 1 required.</td></tr><tr><td>MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219</td><td>Maxim</td><td>MAX7219CNG</td><td>LED driver. 1 required.</td></tr><tr><td>8 pin IC Socket</td><td>Mouser Electronics</td><td>575-144308</td><td>16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix.</td></tr><tr><td>24 Pin IC socket</td><td>Mouser Electronics</td><td>535-24-3518-10</td><td>Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB.</td></tr><tr><td>Digital multimeter</td><td>Adafruit</td><td>2034</td><td>For troubleshooting electronics. 1 required.</td></tr><tr><td>Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1")</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT-12693</td><td>Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required.&nbsp;</td></tr><tr><td>Flush diagonal wire cutters</td><td>Adafruit</td><td>152</td><td>For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required.</td></tr><tr><td>Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12" (300mm)</td><td>Adafruit</td><td>793</td><td>Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required.</td></tr><tr><td>Half-size breadboard</td><td>Adafruit</td><td>64</td><td>The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it.</td></tr><tr><td>Miniature 8x8 Blue LED Matrix</td><td>Adafruit</td><td>956</td><td>Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white.</td></tr><tr><td>Stackable header-3 pin</td><td>SparkFun Electronics</td><td>13875</td><td>8 required.</td></tr><tr><td>Resistor Kit - 1/4W (500 total)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10969</td><td>For electronics. 1 required.</td></tr><tr><td>&nbsp;IRL520N MOSFET</td><td>International Rectifier</td><td>IRL520N</td><td>Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required.</td></tr><tr><td>Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT 11367</td><td>Wire for electronics. 1 required.</td></tr><tr><td>5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed</td><td>Adafruit</td><td>276</td><td>Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required.</td></tr><tr><td>12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed</td><td>Adafruit</td><td>798</td><td>For peristaltic pumps. 2 required.</td></tr><tr><td>Electric Heating Pad - 10cm x 5cm</td><td>Adafruit</td><td>1481</td><td>For heating the bioreactor. 1 required.</td></tr><tr><td>Low flow variable flow peristaltic pump</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td>For pumping media. 1 required</td></tr><tr><td>Medium flow variable flow peristaltic pump</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td>For pumping culture. 1 required.</td></tr><tr><td>9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed</td><td>Adafruit</td><td>63</td><td>For microcontroller power supply. Order 1.</td></tr><tr><td>High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras</td><td>Adafruit</td><td>642</td><td>Thermometer for the bioreactor. 1 required.</td></tr><tr><td>Micromanager</td><td>Micromanager</td><td>NA</td><td>The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td>NA</td><td>The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/"</td></tr><tr><td>Arduino Integrated Development Environment</td><td>Arduino</td><td>NA</td><td>The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"</td></tr><tr><td>Custom code</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the &ldquo;Optogenetic Chemostat Files&rdquo; GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>USB Cable A to B - 6 Foot</td><td>SparkFun Electronics</td><td>CAB-00512</td><td>Used to download data to microcontroller. 1 required.</td></tr><tr><td>bioreactorTimecourse_example.csv</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the &ldquo;Optogenetic Chemostat Files&rdquo; GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>Tota-frost gels (diffusion paper)</td><td>B&amp;H</td><td>B&amp;H # LOFSFTL MFR # T1-72</td><td>For LED matrix. 1 required.</td></tr><tr><td>Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in</td><td>Grainger, inc</td><td>20JL37</td><td>Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required.</td></tr><tr><td>Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>S120VC</td><td>For measuring light intensity. 1 required.</td></tr><tr><td>Labelling Tape</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015N</td><td>For labelling and securing loose components. 1 required.</td></tr><tr><td>Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>For measuring light intensity. 1 required.</td></tr><tr><td>100mL GL45 hybridization glass bottle</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>(7910-40150)</td><td>Bioreactor vessel. 1 required.</td></tr><tr><td>Six port assembly</td><td>Bellco Glass,

ontwerp en implementatie van een automated verlichten, kweken, en sampling system voor microbiële optogenetische applications

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Optogenetische systemen maken gebruik van genetisch gecodeerde eiwitten die conformatie veranderen als reactie op specifieke golflengten van licht om cellulaire processen veranderen. Er is behoefte aan het kweken en meetsystemen die gebruik geprogrammeerd verlichting en stimulering van optogenetic systemen. We presenteren een protocol voor het bouwen en gebruiken van een continue kweekapparaat microbiële cellen met geprogrammeerde doses van licht verlichten en automatisch verkrijgen en afbeeldingen van cellen in het effluent geanalyseerd. De werking van deze inrichting een chemostat kan de groeisnelheid en de cellulaire omgeving goed te regelen. Het effluent van de continue celkweek wordt regelmatig bemonsterd en de cellen worden afgebeeld door multi-channel microscopie. Het kweken, sampling, beeldvorming en beeldanalyse zijn volledig geautomatiseerd, zodat dynamische reacties in de fluorescentie-intensiteit en cellulaire morfologie van de cellen in de steekproef uit de kweek effluent worden gemeten over meerdere dagenzonder gebruikersinvoer. We tonen de bruikbaarheid van deze kweken inrichting door het dynamisch induceren eiwitproductie in een stam van Saccharomyces cerevisiae vervaardigd met een optogenetic systeem dat transcriptie activeert.

Deze inrichting werd gebruikt om een kweek van S. cerevisiae tot expressie geel fluorescerend eiwit (YFP) als reactie op blauw licht stimuleren via een induceerbare optogenetic transcriptiesysteem basis van de Cry2 / CIB1 eiwit pair 30. De cellen werden gekweekt in chemostatically-fosfaat beperkte media met een gemiddelde verwatering van 0,2 ± 0,008. Fosfaat beperking wordt vaak gebruikt in S. cerevisiae chemostat experimenten om de groei te rege...

We ontwierpen een continu kweken inrichting voor gebruik met systemen optogenetic aan kweken van microben en regelmatig afbeeldingscellen branden in het effluent met een omgekeerde microscoop. Het kweken, sampling, beeldvorming en beeldanalyse zijn volledig geautomatiseerd, zodat dynamische reacties op de verlichting kan worden gemeten over meerdere dagen.

Ontwerp en implementatie van een Automated Verlichten, kweken, en Sampling System voor Microbiële optogenetische Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Het algemene doel van deze procedure is om een continu kweekvat samen te stellen, waarin de respons op verlichting van optogenetische microben automatisch in real time en gedurende meerdere dagen met een microscoop kan worden gemeten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de cellulaire biologie en metabole techniek, zoals hoe dynamische genexpressie reacties kan veroorzaken die verschillen van statische genexpressie. Het grote voordeel van deze methode is dat continue cultuur metingen gedurende meerdere dagen mogelijk maakt.Om te beginnen, soldeer de aardlijn, de datalijn en de positieve spanningslijn van de digitale thermometer op het printplaatje. Knip een pin af van een vrouwelijk drie-pins header en knijp de resterende twee pinnen bij. Soldeer dit in de paar gaten gelabeld R2, en verbind de twee gesoldeerde pinnen door een 4,7 kilo ohm weerstand in de pin header te plaatsen.Verbind vervolgens de resterende componenten met het circuitbord. Leg het circuitbord op de micro controller. Zet de lichtdichte behuizing op en installeer alle software zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.Plaats eerst het lange uiteinde van de aluminium poort door de pakking in het kweekvat en schroef de dop erop. Bedek een korte uitlaat van de aluminium poort met siliconen slang van middelbare diameter. Verbind het distilleerdeel door een vrouwelijke luer-lock in te steken en verbind vervolgens een mannelijke luer-lock plug.Deze uitlaat is aanvullend en zal niet worden gebruikt. Verbind twee korte segmenten van siliconen slang met middelbare diameter met mannelijke en vrouwelijke luer-locks. Verbind vervolgens een uiteinde met een korte uitlaat van de aluminium poort en verbind het distilleerdeel.Het vat zal via deze buis worden geïnoculeerd. Verbind vervolgens twee middelste buizen aan de uiteinden van de slang met middelbare diameter en connectoren. Verbind een uiteinde met een korte aluminium poort en verbind de andere uiteinde.Later zal dit worden aangesloten op de mediafles. Verbind een slang met middelbare diameter aan de langste aluminium poort. De slang moet lang genoeg zijn om de mediafles te bereiken.Verbind een ander kort segment van een paar centimeter lang aan het uiteinde en steek het vervolgens in de rubberen stop op de mediafles. Klem de slang vast. Wanneer later losgeklemd, staat deze verbinding toe dat de cultuur wordt gemengd, geventileerd en onder positieve druk wordt gehouden door de binnenkomende bellen.Steek een slang met middelbare diameter lang genoeg om de bodem van de fles te bereiken, door de stop waardoor media wordt overgebracht. Verbind een andere slang met middelbare diameter met deze slang en verbind vervolgens een slang met grote diameter aan het einde. Verbind het distilleerdeel.Vul het derde gat in de stop met een kort segment van slang met middelbare diameter, verbonden met twee andere segmenten van slang met middelbare diameter en aangesloten aan het distilleerdeel. Dit zal worden aangesloten op een vacuümpomp en later op een aquariumpomp. Steek een mannelijke luer-lock in een segment van siliconen slang met smalle diameter en steek vervolgens stevig PTFE-buis erop.Bevestig vervolgens een vrouwelijke luer-lock aan een slang met middelbare diameter. Draai de vrouwelijke lock langs de PTFE-buis om de locks en de andere aan een korte aluminium poort te verbinden. Zorg ervoor dat de PTFE-buis binnenin het kweekvat onder de tweede langste aluminium buis hangt en boven de bodem.Trim indien nodig. Media zal hier worden bemonsterd tot het beeldvormingskanaal, en de smalle buis minimaliseert het tussenliggende volume. Verbind vervolgens de blootgestelde smalle siliconenbuis met de smalle peristaltiekbuis en connectoren.Verbind hieraan drie segmenten van slang met smalle diameter en twee segmenten van PTFE-buis, afwisselend. Verbind dit met de effluentfles, via slang met middelbare diameter. Verbind vervolgens een uiteinde van een slang met middelbare diameter aan de tweede langste buis van de aluminium poort aan de andere kant van de effluentfles.Deze aluminium buis bepaalt het cultuurvolume en overtollig cultuur stroomt over in de effluentcontainer. Wikkel de deksels van de fles met aluminiumfolie en steriliseer de assemblage vervolgens 30 minuten bij 121 graden Celsius en 15 PSI. Bevestig de vacuümfilter aan een fles van 100 milliliter.Verwijder de nippelafdekking en verwijder vervolgens de witte plug van de nippel van de vacuümfilter met steriele pincetten. Verbind de brede siliconen slang met de nippel, de andere vrije buis van de mediafles met een vacuümpomp en zorg ervoor dat de derde buis die de mediafles met het kweekvat verbindt, geklemd is. Vul de filter met media, zet de vacuümpomp aan en filter vervolgens de rest van de media.Klem de siliconen slang met media die met de vacuüm is verbonden en zet de vacuümpomp uit. Verwijder de luers van het tussenliggende segment van siliconen slang met middelbare diameter dat met de vacuümpomp is verbonden en steek het blauwe uiteinde van een steriele spuit luchtfilter in deze buis. Klem vervolgens de brede siliconenbuis en koppel de mannelijke luer ervan los.Koppel de plug los van de vrouwelijke luer van de media inlaatbuis van het kweekvat. Verbind deze luers om media in het kweekvat te kunnen pompen. Verwijder vervolgens de filter van de fles van 100 milliliter en bevestig de flesdop.Gebruik deze media om een startercultuur te bereiden. Plaats de continue kweekassemblage in de buurt van een microscoop met de mediafles hoger dan het kweekvat en de effluentfles lager dan het kweekvat om terugstroming te voorkomen. Bevestig de rubberen stoppen op de media- en effluentflessen stevig met plakband.Ontkoppel vervolgens de uiteinden van de PTFE-buis van de smalle siliconenbuis die ze verbindt en steek deze uiteinden in de inlaat en uitlaat van een voorbereide microfluïdische inrichting. Duw vervolgens media in het kweekvat door de witte kant van de spuit luchtfilter aan te sluiten op de aquariumpomp. Wanneer media het niveau van de effluentpoort bereikt, wikkel de media inlaatbuis en connectoren rond de langzame peristaltiekpomp en de smalle monsteruitlaatbuis en connectoren rond de snelle peristaltiekpomp.Beluchtuur de media door de luchtbuis tussen de mediafles en het kweekvat los te koppelen. Bevestig vervolgens de verwarmingspad en thermometer aan het kweekvat zodat de temperatuur kan worden gecontroleerd. Draai de mediabuis rond het kweekvat

design-implementation-an-automated-illuminating-culturing-sampling

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Optogenetica is een krachtig hulpmiddel geworden voor gebruik in gedragsneurowetenschappelijke experimenten. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het ontwerp en de installatie van lasersystemen en biedt een volledig protocol voor het uitvoeren van meerdere en gelijktijdige in vivo optogenetische stimulaties die compatibel zijn met de meeste gedragstestparadigma's bij knaagdieren.

In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

Hier presenteren we een protocol te analyseren van cel naar cel overdracht van oscillerende informatie door optogenetic control en live monitoring van genexpressie. Deze aanpak biedt een uniek platform om te testen een functionele betekenis van dynamische gen expressie programma's in meercellige systemen.

Een Optogenetic methode te controleren en analyseren van gen expressiepatronen in cel-naar-cel interacties

Dit protocol beschrijft hoe optogenetische experimenten kunnen worden uitgevoerd voor het beheersen van genexpressie met rood en verrood licht met behulp van PhyB en PIF3. Inbegrepen zijn stapsgewijze instructies voor het bouwen van een eenvoudig en flexibel verlichtingssysteem, dat de controle van genexpressie of andere optogenetica met een computer mogelijk maakt.

Het bouwen van een eenvoudig en veelzijdig verlichtingssysteem voor optogenetische experimenten

Het betrouwbaar controleren van lichtgevoelige zoogdiercellen vereist de standaardisatie van optogenetische methoden. In de richting van dit doel schetst deze studie een pijplijn van gencircuitconstructie, celtechnologie, optogenetische apparatuur en verificatietests om de studie van door licht geïnduceerde genexpressie te standaardiseren met behulp van een negatief feedback optogenetisch gencircuit als casestudy.

Betrouwbare engineering en controle van stabiele optogenetische gencircuits in zoogdiercellen

Bioluminescentie - licht uitgezonden door een luciferase-enzym dat een substraat met kleine moleculen oxideert, een luciferine - kan worden gebruikt om fotosensorische eiwitten te activeren, waardoor een andere dimensie wordt toegevoegd aan lichtstimulatie en de manipulatie van een veelheid aan lichtgemedieerde functies in cellen op temporele en ruimtelijke schalen mogelijk wordt.

Bioluminescente optogenetica 2.0: Bioluminescentie benutten om fotosensorische eiwitten in vitro en in vivo te activeren

Optogenetische controle van microbieel metabolisme biedt flexibele dynamische controle over fermentatieprocessen. Het protocol hier laat zien hoe blauw licht-gereguleerde fermentaties voor chemische en eiwitproductie op verschillende volumetrische schalen kunnen worden opgezet.

Lichtgestuurde fermentaties voor microbiële chemische en eiwitproductie

We beschrijven een reproduceerbaar, geautomatiseerd en onbevooroordeeld beeldvormingssysteem voor het karakteriseren van de neuromusculaire junctiefunctie met behulp van menselijk gemanipuleerd skeletspierweefsel en optogenetische motoneuronen. Dit systeem maakt de functionele kwantificering van neuromusculaire connectiviteit in de loop van de tijd mogelijk en detecteert verminderde neuromusculaire functie veroorzaakt door neurotoxinen en myasthenia gravis patiëntenserum.

Engineering en karakterisering van een optogenetisch model van de menselijke neuromusculaire junctie

Dit protocol omvat het transfecteren van cAMP-sensoren en bPAC-nLuc, een optogenetisch eiwit, om nauwkeurig de cellulaire verdeling en respons op lichtstimulatie te volgen. De innovatieve aanpak van het creëren van een cAMP-responskaart met behulp van een puntscansysteem biedt het potentieel om onderzoek met optogenetische eiwitten op verschillende gebieden te bevorderen.

De cellulaire distributie van een optogenetisch eiwit in kaart brengen met behulp van een lichtstimulatieraster

Dit protocol schetst de stappen voor het gebruik van het geautomatiseerde platform Lustro om high-throughput karakterisering van optogenetische systemen in gist uit te voeren.

High-throughput optogenetica-experimenten in gist met behulp van het geautomatiseerde platform Lustro

Dit protocol beschrijft de toepassing van een gemanipuleerd blauw-licht-geactiveerd allosterisch schakelaar (LightR) domein voor omkeerbare spatiotemporele controle van eiwitactiviteit. Door gebruik te maken van Src-tyrosinekinase als model, biedt deze studie een uitgebreid protocol voor het ontwikkelen en karakteriseren van lichtgereguleerde Src (LightR-Src). Het demonstreert de veelzijdigheid van deze aanpak in alle enzymklassen.

Spatiotemporele controle van eiwitactiviteit door optogenetische allosterische regulatie

Deze studie beschrijft een methode voor experimenten met hoge doorvoer met behulp van een 3D-geprinte LED-array om licht-induceerbare genexpressie in HEK293T cellen te optimaliseren.

Snelle optimalisatie van een licht-induceerbaar systeem om de genexpressie van zoogdieren te beheersen

Leer een geautomatiseerd continue kweeksysteem voor optogenetische microben met real-time microscopie en beeldanalyse. Deze methode maakt dynamische genexpressiestudies over meerdere dagen mogelijk.

Ontwerp en implementatie van een Automated Verlichten, kweken, en Sampling System voor Microbiële optogenetische Applications

Meer video's verkennen