Name: Optimalisatie van een kwantitatieve micro-neutralisatie assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Leer een micro-neutralisatie assay voor virologisch onderzoek naar influenza virussen. Deze methode karakteriseert geïnfecteerde cellen en kwantificeert antilichaamneutralisatie met behulp van een flatbed scanner.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Dr. M. Matrosovich voor het verstrekken van de ouder-MDCK en MDCK-SIAT1 cellijnen en Roche Pharmaceuticals voor het leveren van het oseltamivir carboxylaat. We waarderen ook Dr. Anne Weston voor waardevolle suggesties over het manuscript. Dit onderzoek was afhankelijk van de waardevolle samenwerking van de WHO National Influenza Centres en de WHO CC's binnen het WHO GISRS, die de gebruikte influenzavirussen leverden. Dit werk werd gefinancierd door de Medical Research Council via Programma U117512723.

LET OP: De bioveiligheidsniveau (BSL) voor de volgende protocol is BSL 2 voor seizoensgebonden influenza virussen en BSL 3+ voor potentiële pandemische griepvirussen. Virale titratie is vereist voordat een neutralisatie experiment beslist de virale concentratie van de virale controle (VC). 1. Virus titratie Opmerking: Afhankelijk van het aantal virussen en het aantal duplicaten, kan een plaat worden ingesteld met de volgende flexibiliteit: (1) De virale verdunning kan worden aangebracht langs ofwel de rijen of de kolommen (figuur 1). Elk virus moet een aparte rij / kolom te bezetten. (2) De virale verdunning increment is flexibel, maar het moet beginnen met de hoogste virale concentratie op de linker bovenhoek. (3) Er is geen beperking op het aantal duplicaten. LET OP: Madin Darby hond (MDCK) en MDCK-SIAT1 (SIAT) cellen werden vriendelijk verschaft door Dr. M. Matrosovich, Marburg, Gervele 10. SIAT cellen MDCK-cellen stabiel getransfecteerd met de humane CMP-N-acetylneuraminate: P-galactoside α-2,6- sialyltransferase-gen voor verhoogde expressie van siaalzuur (SA) α2-6Gal beëindigde oligosacchariden. <ol><li> Aliquot voldoende MDCK-cellen of MDCK-cellen SIAT 8 naar 96-well platen (200 ul / putje). Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 2 of 3 dagen tot confluentie bereiken. Propageren cellen in DMEM aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS) en antibiotica (100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine). Incubeer de SIAT cellen bij 37 ° C met 5% CO2 en 1 mg / ml G418 sulfaat. NB: De verdunningsfactor is afhankelijk van de ervaring en de gebruikte cellijn. De eencellige laag moet confluent (dwz, geen celwand of toegankelijk schets voor MDCK cellen en een dicht gepakte layout voor MDCK-cellen SIAT1) bij de virusinoculatie. Voorbeelden van verdunningen op basis vande subcultuur van confluente flessen van MDCK of MDCK-cellen SIAT1 zijn vermeld in tabel 1. </li><li> Was de cellen 3 maal met 200 ul virus groeimedium (VGM) per putje. Steriliseer de meerwandige plaat ring met 70% EtOH gedurende 30 min, en spoel vervolgens in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of VGM voor de was. </li><li> Zuig het VGM onmiddellijk voeg 50 ul van VGM aan elk putje. </li><li> Voeg 900 ul van VGM aan elk van 6 steriele buizen (of minder, afhankelijk van het aantal testvirussen en duplicaten). Pipet 100 ul van virus in de eerste buis, meng goed, en serieel verdunnen, het veranderen van de tips tussen elke verdunning. Herhaal dit voor elk virus te worden getitreerd. LET OP: Dit zal virus verdunningen van 10 -1 tot 10 -6 geven. </li><li> Voeg 50 ul van elk virus verdunning, beginnend bij de hoogste verdunning (1 x 10 -5 in figuur 1), om dubbele putjes (kolommen 9 en 10 in figuur 1) van een 96-wells plaat. </li><li> Plaats de plaat bij 37 ° C gedurende 2-3 uur om het virus aan de cellen te infecteren. OPMERKING: A 2-3 uur incubatie moet voor worden gezorgd dat de virussen in het inoculum voldoende tijd om de monolaag te bereiken. </li><li> Bereid de overlay (10 ml / plaat) LET OP: De bekleding bestaat uit 5 ml 2x DMEM, trypsine (2 ug / ml uiteindelijke concentratie), 20 ui van 1 mg / ml bouillon en 5 ml van cellulose katoenlinters (zie Materials List). </li><li> Verwijder het inoculum. </li><li> Voeg de overlay (200 ul aan elk putje). Incubeer overnacht bij 37 ° C, ongestoord. Opmerking: Het virus ontluikende vindt plaats na ongeveer 4 uur, dus is het belangrijk dat de plaat niet verstoord na deze tijd. </li><li> Zuig het overlay uit de putjes. </li><li> Voeg ijskoude 4% paraformaldehyde in PBS A (200 pl / putje). Plaats ze bij 4 ° C gedurende 30 min en bij kamertemperatuur gedurende 20 min. LET OP: Een PBS is natuurlijke pH-fosfaat-gebufferde zoutoplossing met 10 gof NaCl, 0,25 g KCl, 1,437 g Na 2 HPO 4, 0,25 g KH 2 PO 4, en 1 liter gedestilleerd water (zie Materials List). LET OP: Paraformaldehyde is schadelijk bij inademing en kan brandwonden veroorzaken. Er is ook weinig bewijs van een kankerverwekkende effect, en het kan overgevoeligheid veroorzaken na contact met de huid. </li><li> Zuig het paraformaldehyde en was de platen tweemaal met PBS A (200 gl / putje). </li><li> Bewaar de platen in PBS A bij 4 ° C voor toekomstig gebruik, of doorgaan met de volgende stappen. </li><li> Voeg permeabilisatie buffer (100 ul / putje). Laat het bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Was plaat tweemaal met PBS A (200 pl / putje). </li><li> Voeg 50 ul van het eerste antilichaam, MAb tegen influenza type A (1: 1000 in ELISA-buffer) per putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur (of 4 ° C overnacht), onder schudden. </li><li> Was het 3 keer in 100 pl wasbuffer (0,05% Tween 80 in PBS A, v / v) per ook. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten tussen wasbeurten. Anders, 3 keer wassen zonder incubatie met behulp van 300 ul per putje. </li><li> Voeg 50 ul van het tweede antilichaam, geit anti-muis IgG (H + L) HRP conjugaat (1: 1000 in ELISA-buffer) per putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder schudden. </li><li> Was het 3 keer beschreven in stap 1.17. </li><li> Voeg het substraat (50 gl / putje). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten of totdat de ontwikkeling van een blauwe kleur duidelijk zichtbaar. </li><li> Om de reactie te stoppen was de plaat tweemaal met 200 gl gedestilleerd water per well, incuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 min -3 tussen de wasbeurten. </li><li> Air-droog de plaat en bewaar het op een donkere plaats (bv, wikkel het in aluminiumfolie). </li></ol> 2. Titratie Kwantificering <ol><li> Plaats een plaat in het scangebied van een flatbed scanner, zie figuur 2a. Gebruik de positie L-vorm grens aanzorgen voor een optimale en reproduceerbare beeldvorming locatie. LET OP: Het is mogelijk om het beeld twee goed platen in één scan. </li><li> Een afbeelding scannen. OPMERKING: De instellingen worden getoond in tabel 2. </li><li> Voer het &quot;Wellplate Reader&quot; software om de gewenste virusconcentratie (figuur 3) te berekenen. <ol><li> Klik op de &quot;Load image&quot; knop om een ​​afbeelding te laden. Schuif de rode balk in het histogram van het tabblad &#39;Global Threshold &quot;om het sampling drempel aan te passen. Klik op de knop &quot;Update&quot; om het effect op het beeld te onderzoeken. </li><li> Vink het vakje &#39;Bereken Neutralisatie / titratie &quot;. Klik op de knop &quot;Sampling&quot; om de ICP te kwantificeren. Klik op de knop &quot;Save&quot; om de sampling resultaten op te slaan wanneer dat wordt gevraagd. OPMERKING: Nadat de sampling proces wordt een nieuw venster met de naam &quot;neutralisatie &amp; titratie Berekening&quot; verschijnt automatisch als het vakje &quot;Bereken Neutralisatie / titratie&quot; is aangevinkt. </li><li>Belasting of het invoeren van de goed-plaat definition kaart. Geef de drempel (bijvoorbeeld 30%) in &quot;Titratie: Optimal Virus Bevolking (%)&quot;. Selecteer het tabblad &#39;titratie Process &quot;om de titratie resultaten te berekenen. Controleer de titratie resultaten. Klik op de knop &quot;Opslaan en sluiten&quot; om de titratie resultaten op te slaan. OPMERKING: Raadpleeg Aanvullende S1 voor meer gedetailleerde instructies over de software. Een kopie van de op maat gemaakte software is beschikbaar op aanvraag. LET OP: Typisch, de beste virus verwatering voor de plaque-reductie assay levert ongeveer 50% (20-85%) ICP van de totale cellen in elk putje 11. </li></ol></li></ol> 3. Virus neutralisatie OPMERKING: Bereken het aantal platen nodig voor de neutralisatie assay. Elke plaat is geschikt voor een virus en een aantal antisera. Opmerking: Afhankelijk van het aantal antisera en het aantal duplicaten, een plaat kan worden ingesteld met the flexibiliteit volgende: (1) Het serum verdunning kan worden aangebracht langs volgens rij of kolom (figuur 4). Elk serum moet een aparte rij of kolom te bezetten. (2) De toename van serumverdunning is flexibel, maar het moet beginnen met de hoogste serumconcentratie de linkerbovenhoek van een plaat. (3) Het aantal duplicaten balanceert het aantal antisera. Meer duplicaten kunnen helpen om glad te strijken experimentele variaties. (4) Het aantal VC en het aantal van de celcontrole (CC) duplicaten zijn flexibel, maar ze moeten ook in afzonderlijke rijen of kolommen. Verwacht wordt dat het aantal VC duplo aanzienlijk groter dan die van de antisera. <ol><li> Bereid de cel monolaag, net als in de stappen 1,1-1,3, 2 of 3 dagen van tevoren. </li><li> Voeg 50 ul van VGM aan elk putje van de plaat. </li><li> Gebruik kolommen 11 en 12 voor VC en CC resp. Voeg 50 ul aliquots van 01:20-receptorvernietigend enzym (RDE) behandeld serum aan de eerste rij (A) van Columns 1-10. Opmerking: Voor elk virus en serum combinatie wordt de assay in duplo uitgevoerd, zodat een plaat kan bijvoorbeeld bevatten een virus getoetst vijf antisera. </li><li> Voer 2-voudige opeenvolgende verdunningen door het overdragen van 50 ul van rij A tot H Row (Kolommen 1-10 in figuur 4) en weggooien 50 pl van rij H. </li><li> Voeg 50 ul van verdunning elk putje van de CC kolom (kolom 12 in Figuur 4). </li><li> Voeg 50 ul van het virus aan elk putje van de plaat, behalve de CC kolom (1-11 kolommen, rijen AH in figuur 4). </li><li> Incubeer het op 37 ° C gedurende 2-3 uur. Verwijder het inoculum. Voeg de overlay (200 ui) aan elk putje. Incubeer het &#39;s nachts bij 37 ° C, ongestoord. Fix en vlekken op de platen als voor het virus titratie (stappen 1,11-1,22). </li></ol> 4. neutralisatie kwantificering <ol><li> Plaats een plaat in het scangebied van een flatbed scanner, zie Figure 2a. Gebruik de positie L-vorm te beperken om een ​​optimale en reproduceerbare beeldvorming locatie te waarborgen. LET OP: Het is mogelijk om het beeld twee goed platen in één scan. </li><li> Scan de plaat, zoals beschreven in stap 2.2. </li><li> Voer het &quot;Wellplate Reader&quot; software om de vereiste virale titers (figuur 3, stap 2,3) berekend. <ol><li> Klik op de &quot;Load image&quot; knop om een ​​afbeelding te laden. Schuif de rode balk in &quot;Global Threshold&quot; om het sampling drempel aan te passen. Klik op de knop &quot;Update&quot; om het effect te onderzoeken. </li><li> Vink het vakje &#39;Bereken Neutralisatie / titratie &quot;. Klik op de knop &quot;Sampling&quot; om de ICP te kwantificeren. Klik op de knop &quot;Save&quot; om de sampling resultaten op te slaan wanneer dat wordt gevraagd. OPMERKING: Nadat de sampling proces wordt een nieuw venster met de naam &quot;neutralisatie &amp; titratie Berekening&quot; verschijnt automatisch als het vakje &quot;Bereken Neutralisatie / titratie&quot; is aangevinkt. </li><li> Belasting of het invoeren van de goed plaat kaart. Geef de drempel (bijvoorbeeld 50%) in &quot;Neutralisatie:. Infectie aftrek (%)&quot; </li><li> Selecteer &quot;Neutralisatie&quot; gebruiken de titers berekend. Controleer de titers en klik op de knop &quot;Opslaan en sluiten&quot; om de neutralisatie resultaten op te slaan. OPMERKING: Neutralisatie wordt gerapporteerd als de reciproke van de hoogste verdunning van serum met voorgedefinieerde ICP reductie (bijvoorbeeld 50% of 80%) ten opzichte van de VC (het gemiddelde van kolom 11 in Figuur 4). Een 50% reductie ICP werd gebruikt in de Representatieve resultaten. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Walker, D. L., Horsfall, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+identity+in+neutralizing+and+hemagglutination-inhibiting+antibodies+against+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses.</a> J Exp Med. 91, 65-86 (1950).</li>
<li>Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+residues+of+recent+human+A%28H3N2%29+influenza+viruses+that+contribute+to+the+inability+to+agglutinate+chicken+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes.</a> Virology. 289, 74-85 (2001).</li>
<li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuraminidase+receptor+binding+variants+of+human+influenza+A%28H3N2%29+viruses+resulting+from+substitution+of+aspartic+acid+151+in+the+catalytic+site%3A+a+role+in+virus+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment.</a> J Virol. 84, 6769-6781 (2010).</li>
<li>Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+response+in+humans+to+influenza+virus+type+B+host-cell-derived+variants+after+vaccination+with+standard+%28egg-derived%29+vaccine+or+natural+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection.</a> J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).</li>
<li>Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+antibody+to+avian+influenza+A+%28H5N1%29+virus+in+human+serum+by+using+a+combination+of+serologic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol.37%22%5BJournal%5D)">Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays.</a> J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).</li>
<li>Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+focus+reduction+neutralization+test+of+influenza+A+and+B+viruses+in+microtiter+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system.</a> J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).</li>
<li>Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus%3A+a+novel+method+to+assess+viral+and+neutralizing+antibody+titers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro.</a> J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol J. 3, 63-70 (2006).</li>
<li>Comley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+-+Emerging+importance+of+novel+reagents%2Fprobes+and+pathway+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+World+Summer+2005%22%5BJournal%5D)">High content screening - Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis.</a> Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+alpha-2%2C+6-sialyltransferase+in+MDCK+cells+increases+influenza+virus+sensitivity+to+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors.</a> J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).</li>
<li>Sullivan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+virus+plaque+quantitation+using+a+flatbed+scanner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner.</a> J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).</li>
<li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+micro-neutralization+assay+and+its+application+in+antigenic+characterization+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Other+Respir+Viruses%22%5BJournal%5D)">Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses.</a> Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze studie beschrijven we een imaging-gebaseerde MN test de werkelijke antigene relatie tussen virussen kwantificeren. In vergelijking met andere plaque-reductie assays, benadrukt de methode het meten van de ICP van een heel goed, het waarborgen van de volledige dekking van de infectieuze bevolking. De onafhankelijkheid van plaquevorming vergroot tevens de toepassing van de bepaling voor virussen die hoofdzakelijk onzichtbaar kleine plaques kan vormen of die slechts beheerder eencellige infectie. Aldus was de zuiverheid kan onderzoeken vermenigvuldigen en de effecten van een groter aantal antilichamen dan HI, en het helpt om uitgebreider weerspiegelen de antigene overeenkomsten of verschillen tussen virussen 12. Wanneer bijvoorbeeld oseltamivircarboxylaat is opgenomen, de MN test wordt minder beïnvloed door NA-afhankelijke binding, die de antigene verschillen nauwkeuriger. Tijdens de ontwikkeling van de test werden grote inspanningen geleverd om het experiment consistentie, snelheid en detectie verbeterengevoeligheid, onder meer door het beheersen ingang virussen door middel gekwantificeerd titratie, beeldvorming in high throughput met een flatbed scanner, en implementeren van een gebruiksvriendelijke data processing platform. De resultaten zijn over het algemeen in overeenstemming met geweest en bevestigde die van HI. Met name de resultaten bleek ook antigene verschillen tussen antigene drift varianten recente type A en B vaccin virussen en antigene veranderingen veroorzaakt door kweek geselecteerde of incidenteel veranderingen, zoals G155E vervanging HA1 bepaalde A (H1N1) pdm09 virussen 12. Het protocol paste het virustype of subtype met de selectie van cellijnen die de sterkste infectie, die de beeldvorming sterk verbeterd signaal gaf. Experimentele variant werd glad gemaakt met het ontwerp van duplicaten dat evenwicht met het aantal geteste antisera. Onzekerheden komen ook de beeldkwaliteit, die voornamelijk wordt beïnvloed door de beeldvormingsinrichting. Een fatsoenlijke kleur flatbed scanner kan Significantly verbetering van het imago contrast en het lawaai te verminderen. De hoeveelheid toegevoegd virus in de neutralisatie, kwantitatief worden bepaald tevoren in de overeenkomstige titratie terwijl de virussen niettemin van hetzelfde te behouden. Tijdens neutralisatie, het antiserum reactie op een infectie wordt genormaliseerd tegen het verschil tussen de referentie-virus (VC) en het achtergrondniveau (CC). Nauwkeurige metingen van VC en CC zijn essentieel voor een neutralisatie experiment. Meer duplicaten aanbevolen (acht duplo werden in de Representatieve resultaten). Tenslotte begrijpen van de software is essentieel voor het succes van een experiment. De software is getest op routine virus karakterisering van de WHO Influenza Centrum, het UK voor meer dan twee jaar. Gedetailleerde instructies voor het omgaan met verschillende situaties is voorzien in het aanvullend S1. Dit MN test is geschikt voor toepassingen waar de monsters beslaan een extremely groot gezichtsveld, maar vereisen slechts een matige beeldvorming resolutie. De lage kosten en eenvoudige setup maken het systeem gemakkelijk beschikbaar voor de meeste virologie laboratoria. De variatie in de metingen van hetzelfde monster minder dan 3%, wat ruwweg de onzekerheid die tijdens het scannen 11 definieert. Dergelijke reproduceerbaarheid volstaat vele virologische studies en kan verder worden gereduceerd door het middelen beelden van meerdere scans. Samenvattend toont dit onderzoek aan een robuust MN test die routinematig worden gebruikt in antigene studie en HI data in gedetailleerde analyses van momenteel circulerende influenzavirussen, met name voor de halfjaarlijkse selectie van virussen voor opname in humane influenza vaccins.

Micro-neutralisatie (MN) assays worden in virologie voor de kwantificering van neutraliserende antilichamen en antivirale activiteiten. In plaats van hemagglutinatie inhibitie (HI) assays, MN assays kunnen niet- antigenisch effecten beïnvloed door de veranderingen van receptor-bindende affiniteit van influenzavirussen, die kunnen bemoeilijken de interpretatie van resultaten HI 1,2,3 overwinnen. Tot voor kort waren de meeste MN assays gebaseerd op cytopathische effecten (CPE) of enzymgekoppelde immunosorbent assays (ELISA) 4,5. MN assays op basis van focus en plaquereductie werden ontwikkeld in 1990 6,7,8. Plaquevermindering assays vertrouwen op te tellen zichtbaar plaques om het besmettingsgevaar te kwantificeren. Echter, visuele telt alleen betrekking grote plaques die oplosbaar door menselijke ogen, hoewel de meeste plaques zijn klein en onzichtbaar voor vele huidige circulerende virussen. Dit onvolledige dekking kan aanzienlijke verschillen veroorzaken tussen examinatoren en tussen de experimenten, wat leidt tot incomparable resultaten. Het is ook mogelijk de werkwijze te gebruiken bij sommige virussen vertonen abortieve infectie van enkele cellen of zeer kleine plaques. De arme telresolutie kan worden verbeterd door de introductie van een imaging-gebaseerd protocol. Met de vooruitgang in technologie, optische microscopie en high-throughput kan goed-plaat lezers accurate manier om de geïnfecteerde cellen 9 tellen bieden. Onder een trans-verlichte microscoop, kunnen geïnfecteerde cellen gelabeld met bepaalde markers worden gevisualiseerd door de absorptie of fluorescentie contrast in sub-cellulaire resolutie. Een monster kan vervolgens worden geanalyseerd op een computerscherm. Helaas, vanwege de beperking van het gezichtsveld, meer dan honderd beeldvensters dienen een enkel putje bedekken. Het analyseren van een plaat met 96 wells zou de beeldvorming en de verwerking van ongeveer tienduizend beelden nodig. Dergelijke moeizaam proces is tijdrovend en duur, en de resolutie is opgedaan general onnodig voor routine karakterisering van virale infecties. Laboratoria met een beperkt budget kan vinden dat de aanpak rond een flatbedscanner biedt een kosteneffectieve, high-throughput alternatief. In dit artikel beschrijven we een verbeterd plaquereductie MN test die geschikt is voor het karakteriseren van antigene een groot aantal virussen en voor het kwantitatief meten antivirale activiteiten en neutralisatie antilichamen. De test heeft een aantal voordelen: ten eerste een imaging-gebaseerde test die kan virusinfecties maatregel op cellulair niveau, ongeacht de plaque grootte. Het tellen van de totale geïnfecteerde celpopulatie (ICP) in een put verhoogt de detectiegevoeligheid, waardoor het mogelijk om de virussen te karakteriseren met lage infectiviteit. Ten tweede wordt een meer accurate kwantitatieve titratie vóór neutralisatie geïntroduceerd om de hoeveelheid toegevoegd virus te bepalen. De kwantitatieve ingang virus vermindert de variatie tussen de verschillende experimenten en maakt de resultaten beter vergelijkbaar tussen laboratoria. Ten derde neutralisatie titers kunnen rechtstreeks door het analyseren beelden, waardoor de kwantificering snelle en gebruikersvriendelijke bepaald. Tenslotte het protocol levert een rendabele hoge-doorvoer alternatief met de vereiste resolutie en nauwkeurigheid. De kwantificering is gebaseerd op een flatbed scanner en vrije data processing software. De hele opzet heeft een kleine footprint en is inzetbaar in de meeste laboratoria. Het protocol in dit document bestaat uit vier belangrijke stappen, met inbegrip van virus titratie titratie kwantificering, virus neutraliseren, en neutralisatie kwantificering. Virustitratie is samengesteld experiment dat bepaalt de hoeveelheid invoer virussen voor gebruik in neutraliseren. Tijdens een titratie, een aantal virale concentraties worden toegepast op de celmonolagen in 96-wells plaat. De geïnfecteerde cellen worden vervolgens gekwantificeerd in deel 2. De viral Dilutie die 20% -85% ICP produceert op zijn beurt toegepast als input virussen de overeenkomstige neutralisatie in sectie 3. De titers van de neutralisatie protocol worden gekwantificeerd met behulp van sectie 4. Experimenten die volgden de bovenstaande protocollen worden gepresenteerd in de Representatieve resultaten. De assay is uitgebreid getest gedurende de afgelopen twee jaar met de meeste van de huidige circulerende influenzavirussen zoals A (H1N1) pdm09, A (H3N2) en B virussen. De resultaten van het influenzavirus karakterisering werden opgenomen in de verslagen van de WHO overleg dat de aanbevelingen over griepvaccins voor gebruik in het zuidelijk halfrond in 2016 en het noordelijk halfrond in 2016-2017 gaf.

<table><tbody><tr><td>VGM</td><td>Sigma</td><td>D6429, P0781</td><td>500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb</td></tr><tr><td>PBS A</td><td></td><td></td><td>Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl 10&nbsp;g, KCl 0.25&nbsp;g, Na2HPO4 1.437 g, KH2PO4 0.25 g, en Dist. Water 1 L.</td></tr><tr><td>Avicell</td><td>FMC</td><td>RC-581F</td><td>2.4 g in 100 ml gedistilleerd water opgelost door 1 uur lang roeren op een magnetische roerder. Steriliseer door autoclaven.</td></tr><tr><td>2x DMEM</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21935-028</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Overlay (10 ml/plaat):</td><td></td><td></td><td>5 ml 2x DMEM, Trypsin 2&nbsp;&mu;g/ml uiteindelijke concentratie, Avicell 5&nbsp;ml</td></tr><tr><td>Triton X- 100e</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T8787</td><td>Permeabilisatie buffer: 0.2% in PBS A (v/v)</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma</td><td>P5188</td><td>Wasbuffer: 0.05% Tween 80 in PBS A (v/v)</td></tr><tr><td>Paarden serum</td><td>PAA Labs Ltd</td><td>B15-021</td><td>ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80</td></tr><tr><td>Muis MAb tegen influenza type A</td><td>Biorad</td><td>MCA 400</td><td>1st Antilichaam: 1:1.000 in ELISA Buffer</td></tr><tr><td>Geit anti-muis IgG (H+L) HRP-conjugaat</td><td>Biorad</td><td>172-1011</td><td>2nd Antilichaam: 1:1.000 in ELISA Buffer</td></tr><tr><td>True Blu peroxidase substraat</td><td>KPL&nbsp;</td><td>50-78-02</td><td>Substraat: True blue +0.03% H2O2g (1:1.000 van 30% oplossing)</td></tr><tr><td>96-wells vlakbodem microtiter platen</td><td>Costar&nbsp;</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>8 kanaals multiwell plaat washer en manifold</td><td>Sigma</td><td>M2656</td><td></td></tr><tr><td>Perfection Plate Scanner</td><td>Epson</td><td>V750 Pro</td><td>De beeldvormingssoftware kan gratis worden gedownload van <a href="http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp;infoType=Downloads">http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp;infoType=Downloads</a>.</td></tr><tr><td>Software operationeel omgeving: LabVIEW</td><td>National Instruments Corporation</td><td>Op Windows gebaseerd met NI Vision builder</td><td>Versie: LabVIEW2012 of hoger</td></tr></tbody></table>

optimalisatie van een kwantitatieve micro-neutralisatie assay

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

De micro-neutralisatie (MN) test is een standaardtechniek voor het meten van de infectiviteit van het influenzavirus en de remming van virusreplicatie. In deze studie presenteren we het protocol van een beeldgebaseerde MN-test om de ware antigene relaties tussen virussen te kwantificeren. In tegenstelling tot typische plaquereductietests die afhankelijk zijn van zichtbare plaques, kwantificeert deze test de volledige geïnfecteerde celpopulatie van elke put. Het protocol matcht het virustype of -subtype met de selectie van cellijnen om maximale infectiviteit te bereiken, wat de steekproefcontrast tijdens beeldvorming en beeldverwerking verbetert. De introductie van kwantitatieve titratie definieert de hoeveelheid inputvirussen van neutralisatie en maakt de resultaten van verschillende experimenten vergelijkbaar. De beeldopstelling met een flatbed scanner en gratis downloadbare software maakt de aanpak hoogdoorvoerig, kosteneffectief, gebruiksvriendelijk en eenvoudig in te zetten in de meeste laboratoria. Onze studie toont aan dat de verbeterde MN-test goed werkt met de huidige circulerende influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2) en B-virussen, zonder significant beïnvloed te worden door aminozuursubstituties in de neuraminidase (NA) van A(H3N2)-virussen. Het is bijzonder nuttig voor de karakterisering van virussen die ofwel een lage HA-titer bereiken en/of een abortieve infectie ondergaan, wat resulteert in een onvermogen om plaques te vormen in gekweekte cellen.

Naar aanleiding van de bovenstaande procedures, presenteren we enkele resultaten uit de recente antigene karakterisering experimenten. De titratie opstelling is ontworpen om acht ingang virussen te onderzoeken, met dubbele duplicaten voor elke verdunning. De virale verdunningen werden getest tussen 1,0 x 10 -1 en 1,0 x 1,0 -6 om de variaties tussen de virussen dekken. De test virussen waren van het H3N2 subtype, waaronder A / Kameroen / 15V-3538/2015, A / Vladivostok / 36/2015, A / Moskou / 103/2015, A / Tomsk / 5/2015 / A / Moskou / 101 / 2015, A / Moskou / 100/2015, A / Moskou / 133/2015 en A / Bratislava / 437/2015. De titratie resultaten zijn weergegeven in figuur 5. Figuur 5d toont de daling van ISP met de toename van virusverdunning. De curven werden genormaliseerd tegen de ISP van dezelfde virussen die infecties bij alle cellen leverden in een put 12 (gedefinieerd als ICP verzadiging). Als de ICP niet verzadiging heeft bereikt met de highest virus concentratie werd de ICP gemiddelde uit overeenkomstige duplicaten in plaats daarvan gebruikt (A / Moskou / 103/2015 in figuur 5d). Het virus verdunningen die 30% verzadiging van ICP geproduceerd werden gekozen als ingang virusverdunning voor neutralisatie (tabel 3). Neutralisatie gericht op één ingang virus tegen vijf antisera, met dubbele duplicaten op elk bord. De referentie-virus aangetoond is H3N2 A / Stockholm / 63/2015. De vijf antisera zijn A / HK 4801/14 Egg F12 / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / Zuid-Afrika R2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / Zwitserse 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, en A / Nederlands 525/14 SIAT F23 / 15. De neutralisatie resultaten zijn weergegeven in figuur 6. Figuur 6d toont de infectie voortgang met de toename van serum verdunning. De genormaliseerde positieve populatie op de vertikale as de verhouding tussen ISP uit de overeenkomstige antisera respons tegen de gemiddelde ICPvan de referentie-virus 12. De achtergrond van ICP ongeïnfecteerde cellen werd afgetrokken controles tijdens de normalisatie. De neutralisatie titers werden bepaald als de reciproque van het antiserum verdunningen overeenkomt met 50% reductie ICP (Tabel 4). Lineaire interpolatie werd gebruikt om titers die tussen twee aangrenzende serumverdunningen schatten. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" /> Figuur 1: Voorbeeld van een goed plaat opstelling in een virus titratie experiment. Testvirussen worden toegewezen aan afzonderlijke lijnen (A tot H). Kolommen zijn voor verschillende virale verdunningen (1 tot 12). Twee kolommen werden als duplo voor elke virale verdunning. Schaal bar = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Figuur 2: Schema van een monster scansysteem. (A) Een 96-well plaat op de afbeeldingspositie van een flatbed scanner (gepubliceerd van referentie 11 met toestemming van Elsevier BV), en (b) de afmetingen van de positiegrens L-vorm getoond in (a). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" /> Figuur 3: Desktop diagram van de &quot;Wellplate Reader&quot; kwantificering software. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> </p&gt; <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" /> Figuur 4: Voorbeeld van een goed plaat opstelling in een neutralisatie experiment. Elk antiserum wordt toegewezen aan twee kolommen met duplicaten (1 tot 10). Rijen zijn voor verschillende serumverdunningen (A tot H). Het virus controle neemt Column 11, met acht duplicaten (A11 tot en met H11). De cel control is in kolom 12, met acht duplicaten (A12 tot H12). Schaal bar = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" /> Figuur 5: Resultaten van een titratie experiment. (A) De goed-plaat setup, (b) een goed-plaat afbeelding gescand, (c) illustratiede kleur gecodeerd, gekwantificeerd, met virus geïnfecteerde celpopulatie en (d) genormaliseerd met virus geïnfecteerde celpopulaties tegen virusverdunningen. 30% ICP werd gebruikt als criterium. De fout bars in (d) zijn standaarddeviaties (SD) van het monster duplicaties (± 1 SD). Schaalbalken in (b) en (c) = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 6" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" /> Figuur 6: Resultaten van een neutralisatie experiment. (A) De goed-plaat setup, (b) het goed plaat, (c) illustratie van de gekwantificeerd, virus-geïnfecteerde cel populatie, en (d) genormaliseerd-virus geïnfecteerde cel bevolking te beschermen tegen de serumverdunning gescand. De ingang virus (VC) is A / Stockholm / 63/2015. 50% ICP werd gebruikt om de titer te berekenen. De fout bars in (d) zijn standaarddeviaties (SD) van het monster duplicaties (± 1 SD). Schaalbalken in (b) en (c) = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Aanvullende S1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> typische verdunning </td></tr><tr><td></td><td> MDCK cellen </td><td> MDCK-cellen SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 dagen </td><td> 1: 5 (1 + 4) </td><td> 01:10 (1 + 9) </td></tr><tr><td> 3 dagen </td&gt; <td> 01:10 (1 + 9) </td><td> 01:20 (1 + 19) </td></tr><tr><td colspan="3"> Typische aantal cellen per ml </td></tr><tr><td></td><td> MDCK cellen </td><td> MDCK-cellen SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 dagen </td><td> 2 x 10 5 </td><td> 1 x 10 5 </td></tr><tr><td> 3 dagen </td><td> 1 x 10 5 </td><td> 5 x 10 4 </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Typische verdunningen op een subcultuur die confluente flessen van MDCK of MDCK-SIAT1 cellen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> mode </td><td> professionele modus </td></tr><tr><td> type document </td><td> Film (met Area Guide Film) </td></tr><tr><td> Automatische belichting </td><td> Foto </td></tr><tr><td> Imleeftijd Type </td><td> 24-bit kleur </td></tr><tr><td> Resolutie </td><td> 1200 dpi </td></tr><tr><td> Opgeslagen afbeelding Format </td><td> TIFF </td></tr></tbody></table> Tabel 2: Typische opstelling van een flatbed scanner. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Rij </td><td> Virus </td><td> Aanbevolen verdunning </td></tr><tr><td> EEN </td><td> A / Cameron / 15V-3538/2016 </td><td> 1,0 x 10 -2 </td></tr><tr><td> B </td><td> A / Vladivostok / 36/2015 </td><td> 1,0 x 10 -3 </td></tr><tr><td> C </td><td> A / Moskou / 103/2015 </td><td> 1,1 x 10 -1 </td></tr><tr><td> D </td><td> A / Tomsk / 5/2015 </td><td> 5.9 x 10 -1 </td></tr><tr><td> E </td><td> A / Moskou / 101/2015 </td><td> 8.3 x 10 -1 </td></tr><tr><td> F </td><td> A / Moskou / 100/2015 </td><td> 1,4 x 10 -2 </td></tr><tr><td> G </td><td> A / Moskou / 133/2015 </td><td> 1,3 x 10 -2 </td></tr><tr><td> H </td><td> A / Bratislava / 437/2015 </td><td> 1,3 x 10 -4 </td></tr></tbody></table> Tabel 3: Virale verdunningen berekend uit een populatie van 30% ICP. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Kolom </td><td> antisera </td><td> Aanbevolen titer </td></tr><tr><td> 1-2 </td><td> A / HK4801 / 2014 </td><td> 110 </td></tr><tr><td> 3-4 </td><td> A / HK7295 / 2014 </td><td> 213,3 </td></tr><tr><td&gt; 5-6 </td><td> A / Zuid-Afrika / R2665 / 2015 </td><td> 2155,8 </td></tr><tr><td> 7-8 </td><td> A / Zwitserland / 9715293/2013 </td><td> 89.4 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td> A / Nederland / 525/2014 </td><td> 78.6 </td></tr></tbody></table> Tabel 4: Titers bij 50% van ICP A / Stockholm / 63/2015 tegen antisera.

Deze studie beschrijft een -Imaging gebaseerde micro-neutralisatietest de antigene relaties tussen virussen te analyseren. Het protocol maakt gebruik van een flatbed scanner en heeft vier stappen, waaronder titratie titratie kwantificering, neutralisatie, en neutralisatie kwantificering. De test werkt goed met de huidige circulerende influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) en B-virussen.

Optimalisatie van een kwantitatieve micro-neutralisatie assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Het algemene doel van deze micro-neutralisatie-assay is om alle typen van de huidige circulerende influenzavirussen en de activiteit van antilichamen en antivirale maatregelen op een kwantitatieve, high-throughput en zeer gevoelige wijze te karakteriseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de virologie, zoals de antigenische karakterisering van influenzavirussen, kwantitatieve neutralisatie van antilichamen en antivirale activiteiten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de gehele geïnfecteerde celpopulatie karakteriseert, inclusief zichtbare en onzichtbare plaques en infecties van enkele cellen.De micro-neutralisatietest zal worden gedemonstreerd door Dr. Yipu Lin, adjunct-directeur van het WHO Collaborating Center for Influenza in Londen. Het biosafety-niveau, of BSL, voor het volgende protocol is BSL 2 voor seizoensgriepvirussen en BSL 3+ voor potentiële pandemische influenzavirussen. Begin met het verdelen van voldoende cellen in aliquots in 96-well platen.Incubeer de cellen gedurende twee tot drie dagen bij 37 °C en 5% CO2 tot confluentie is bereikt. Steriliseer een multi-well plaatwasser met 70% ethanol en spoel deze daarna met PBS of VGM. Was vervolgens de confluente cellen met 200 µL virusgroeimedium (VGM).Aspireer het VGM van de cellen en voeg onmiddellijk 50 µL VGM toe aan elke put. Voeg vervolgens 900 µL VGM toe aan elk van de zes steriele buisjes. Pipetteer daarna 100 µL virus in het eerste buisje en meng dit goed.Bereid seriële verdunningen van het virus voor, beginnend bij de eerste buis, waarbij de tips tussen elke verdunning worden gewisseld. Voeg 50 µL van elke virusverdunning, beginnend met de hoogste verdunning, toe aan dubbele putjes van een 96-wells plaat. Plaats de plaat vervolgens gedurende twee tot drie uur bij 37 °C om het virus de cellen te laten infecteren.Nadat de overlay volgens het tekstprotocol is voorbereid, wordt het inoculum uit de putjes verwijderd. Voeg vervolgens 200 µL overlay toe aan elk putje en incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C zonder verstoring. Voeg 200 µL ijskoude 4% PFA in PBS A toe aan de putjes en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C of 20 minuten bij kamertemperatuur.Zuig na de incubatie de PFA af en was de plaat twee keer met 200 microliters PBS A per well. Voeg 100 microliters permeabilisatiebuffer toe aan de plaat en incubeer dit gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de plaat vervolgens twee keer met PBS A.Voeg vervolgens 50 µL per well van een muis monoklonaal antilichaam tegen influenza type A toe aan de wells en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur onder schudding. Gebruik na de incubatie 300 µL wasbuffer om de well drie keer te wassen. Voeg daarna 50 µL van een HRP-geconjugeerd geit secundair antilichaam toe aan de monsters en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur.Nadat de wells drie keer zijn gewassen zoals voorheen, voegt u 50 microliters substraat per well toe en incubeert u dit gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, of totdat de ontwikkeling van een blauwe kleur duidelijk zichtbaar is. Om de reactie te stoppen, wast u de wells twee keer met 200 microliters gedestilleerd water. Bewaar de plaat vervolgens op een donkere plaats nadat deze aan de lucht is gedroogd.Plaats een wellplaat in het scangebied van een flatbedscanner, waarbij de L-vormige positiebegrenzer wordt gebruikt om een optimale en reproduceerbare beeldlocatie te waarborgen. Scan de plaat met de hier getoonde instellingen. Start vervolgens de software voor de wellplaatlezer om de benodigde virusconcentratie te berekenen door op de knop Load Image te klikken om een afbeelding te laden.Schuif vervolgens in het tabblad 'global threshold' de rode balk in het histogram om de bemonsteringsdrempel aan te passen. Klik daarna op de update-knop om het effect op een afbeelding te bekijken. Vink nu het vakje 'Calculate Neutralization/Titration' aan.Klik op de knop Sampling om de geïnfecteerde celpopulatie, of ICP, te kwantificeren. Klik vervolgens, wanneer u daartoe wordt uitgenodigd, op de knop Save om de bemonsteringsresultaten op te slaan. Om de titratieresultaten te verkrijgen, laadt u de definitiekaart van de wellplaat of voert u deze in.Geef bij Titratie:Optimale Viruspopulatie de drempelwaarde aan. Selecteer het tabblad Titratieproces om de titratieresultaten te berekenen. Controleer vervolgens de titratieresultaten voordat u op de knop Opslaan en Sluiten klikt om de resultaten op te slaan.Raadpleeg supplement S1 voor meer gedetailleerde instructies over de software. Bereid de cellaag twee of drie dagen van tevoren voor om virusneutralisatie uit te voeren. Voeg vervolgens 50 µL VGM toe aan elke put van de plaat.Gebruik kolom 11 en 12 respectievelijk voor de viruscontrole en de celcontrole. Voeg aliquots van 50 µL van een 1:20 verdunning van serum behandeld met receptor-destructie-enzym, of RDE, toe aan de eerste rij van kolom 1 tot en met 10. Voer tweevoudige seriële verdunningen uit door 50 µL over te brengen van rij A naar rij H en 50 µL uit rij H te verwijderen. Voeg vervolgens 50 µL verdunningsvloeistof toe aan elke put van de kolom voor de celcontrole.Voeg 50 µL van het virus toe aan elke well van de plaat, behalve aan de kolom met de celcontrole. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende twee tot drie uur. Verwijder vervolgens het inoculum en voeg de overlay toe aan elke well.Incubeer de plaat gedurende de nacht ongestoord bij 37 °C. Fixeer en kleur de platen vervolgens zoals eerder in deze video is gedemonstreerd. Om de neutralisatie te kwantificeren, plaatst u een wellplaat in het scangebied van een flatbedscanner, zoals eerder in deze video is gedemonstreerd.Scan de plaat en start de software van de wellplaatlezer om de vereiste virustiters te bereken zoals eerder beschreven. Na het laden of invoeren van de wellplaatkaart geeft u in Neutralization:Infection Deduction de drempelwaarde aan. Selecteer vervolgens Neutralization Process om de titers te berekenen.Controleer tot slot de titers en klik op de knop Opslaan en Sluiten om de neutralisatieresultaten op te slaan. Hier worden titratieresultaten getoond van recente antigenische karakteriseringsexperimenten van acht inputvirussen met verdunningen tussen 1,0 × 10⁻¹ en 1,0 × 10⁻⁶. De grafiek illustreert dat ICP's afnemen bij een toename van de virusverdunning.De curven werden genormaliseerd ten opzichte van de ICP's van dezelfde virussen die infecties veroorzaakten in alle cellen binnen een putje. In deze tabel staan de virusverdunningen die 30% van de ICP-verzadiging produceerden en die werden gekozen als de input-virusverdunning voor neutralisatie. Deze figuur toont de resultaten van een neutralisatie-experiment waarbij één input-virus werd gebruikt tegen vijf antisera.De grafiek illustreert het infectieproces bij een toenemende serumverdunning. De genormaliseerde positieve populatie op de verticale as vertegenwoordigt de ratio van ICP's uit de overeenkomstige antisera-respons ten opzichte van de gemiddelde ICP van het referentievirus. Tot slot werden de neutralisatietiters bepaald als de reciproque waarden van de antisera-verdunningen die overeenkomen met een 50% ICP-reductie.Deze assay richt zich op consistentie, snelheid en detectiegevoeligheid, inclusief gekwantificeerde titratie van inputvirussen, high-throughput imaging en gegevensverwerking. Het is kosteneffectief, gebruiksvriendelijk en wordt routinematig gebruikt in studies naar virale antigenen.

optimization-of-a-quantitative-micro-neutralization-assay

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates Microneutralization assays to measure neutralizing antibodies using Madin-Darby Canine Kidney cells overexpressing α2,6-linked sialic acid in human sera. This assay is often used for influenza human...

A Microneutralization Assay to Measure Neutralizing Antibody Titers in Human Serum

This video demonstrates the imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relations between influenza A and B viruses. It provides a quantitative and visual way to assess the effectiveness of antibodies or other treatments in preventing viral infection.

Analyzing the Antigenic Relationship between Viruses using an Image-Based Microneutralization Assay

We beschrijven een digitale eindpuntassay voor het kwantificeren van nucleïnezuren met een vereenvoudigde (analoge) uitlezing. We meten bulkfluorescentie van druppelgebaseerde digitale assays met behulp van een standaard qPCR-machine in plaats van gespecialiseerde instrumenten en bevestigen onze resultaten door middel van microscopie.

Eenvoudige Bulk uitlezing van Digital nucleïnezuur kwantificering Testen

Een protocol voor de bepaling van de relatieve anti-apoptotic activiteit van een anti-TNFα mAb een neutralisatie-mechanisme met WEHI 164 cellen wordt hier gepresenteerd. Dit protocol is handig voor het vergelijken van de sterkte van de neutralisatie van verschillende moleculen met dezelfde biologische functionaliteit.

Bepaling van de relatieve sterkte van een Anti-TNF monoklonaal antilichaam (mAb) door Neutralizing TNF met behulp van een In Vitro Bioanalytical methode

Een capillair gebaseerde-immunoassay met een commercieel platform om te meten doel eiwitten uit totaal eiwit preparaten wordt aangetoond. Daarnaast zijn assay parameters van blootstellingstijd, eiwitconcentratie en verdunning van de antilichamen geoptimaliseerd voor een model van de celcultuur.

Procedure en belangrijkste optimalisatie strategieën voor een geautomatiseerde capillaire elektroforetische gebaseerde Immunoassay-methode

Influenza neutraliserende antilichamen correleren met bescherming van influenza-infecties. Microneutralization testen meten van neutraliserende antilichamen in menselijke sera en worden vaak gebruikt voor menselijke influenza-serologie. We beschrijven een microneutralization assay cuvetten van de MDCK-SIAT1 voor het meten van neutraliserende antilichamen titers voor hedendaagse 3C.2a en 3C.3a A(H3N2) virussen na griepvaccinatie of infectie.

Meten van Influenza neutraliserende antilichamen reacties op A(H3N2) virussen in menselijke Sera door Microneutralization testen met behulp van MDCK-SIAT1 cellen

Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van de ontwikkeling en validatie van een enkel molecuul matrix digitale Analyse ELISA, waarmee de ultra gevoelige detectie van alle IFN-α subtypen in menselijke specimens.

Ontwikkeling en validatie van een Ultrasensitive enkel molecuul Array digitale Enzyme-linked Immunosorbent Assay voor menselijk Interferon-α

Hier presenteren we een cel-gebaseerde stroom cytometry methode voor het detecteren van neutraliserende antilichamen of andere factoren die met de cellulaire opname van enzym vervangende therapieën in een menselijke matrix, zoals cerebrale spinal fluid (CSF) of menselijk serum interfereren.

Opsporing van antilichamen die de cellulaire opname van enzym vervangende therapieën met een test van cel-gebaseerde neutraliseren

Een stroomanalysesysteem voor op kralen gebaseerde multiplexed-assays dat een twee-reporter-uitlezing biedt, werd gebruikt voor de ontwikkeling van multiplex serologische en antilichaamneutralisatietests die tegelijkertijd neutraliserende IgG- en IgM-antilichamen voor SARS-CoV-2 kunnen meten.

Een Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG en IgM SARS-CoV-2 Neutralisatie assay voor een Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Een uitgebreid laboratoriumprotocol en analyseworkflow worden beschreven voor een snelle, kosteneffectieve en eenvoudige colorimetrische celgebaseerde test om neutraliserende elementen tegen AAV6 te detecteren.

Een stapsgewijze methode om neutraliserende antilichamen tegen AAV te detecteren met behulp van een colorimetrische celgebaseerde test

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het bepalen van nucleïnezuurmetaboliserende enzymen, met behulp van voorbeelden van ligase-, nuclease- en polymerase-enzymen. De test maakt gebruik van fluorescerend gelabelde en niet-gelabelde oligonucleotiden die kunnen worden gecombineerd om duplexen te vormen die RNA- en/of DNA-schade of tussenproducten van de route nabootsen, waardoor het enzymgedrag kan worden gekarakteriseerd.

Gebruik van gemodificeerde synthetische oligonucleotiden om nucleïnezuurmetaboliserende enzymen te testen

Leer een micro-neutralisatie assay voor virologisch onderzoek naar influenza virussen. Deze methode karakteriseert geïnfecteerde cellen en kwantificeert antilichaamneutralisatie met behulp van een flatbed scanner.

Optimalisatie van een kwantitatieve micro-neutralisatie assay

Meer video's verkennen