Optimalisatie van een kwantitatieve micro-neutralisatie assay

Het algemene doel van deze micro-neutralisatietest is om alle typen huidige circulerende griepvirussen en de activiteit van antilichamen en antivirale metingen op een kwantitatieve, hoogdoorlaatbare en zeer gevoelige manier te karakteriseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het virologieveld, zoals antigene karakterisering van griepvirussen, kwantitatieve neutralisatie van antilichamen en antivirale activiteiten. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze het hele geïnfecteerde cellenpopulatie karakteriseert, inclusief zichtbare en onzichtbare plaques en infecties van enkele cellen.

De micro-neutralisatietest zal worden gedemonstreerd door Dr. Yipu Lin, adjunct-directeur van het WHO Collaborating Center for Influenza in Londen. Het bioveiligheidsniveau, of BSL, voor het volgende protocol is BSL 2 voor seizoensgebonden griepvirussen en BSL 3+voor potentieel pandemisch griepvirussen. Om te beginnen, verdeel voldoende cellen in 96-wells platen.

Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5%CO2 gedurende twee tot drie dagen om confluentie te bereiken. Steriliseer een multi-well plate washer met 70%ethanol en spoel deze met PBS of VGM. Gebruik vervolgens 200 microliters virus groeimedium, of VGM, om de confluente cellen te wassen.

Aspirateer het VGM uit de cellen en voeg onmiddellijk 50 microliters VGM toe aan elke put. Voeg vervolgens 900 microliters VGM toe aan elk van de zes steriele buisjes. Pipet vervolgens 100 microliters virus in het eerste buisje en meng goed.

Bereid seriële verdunningen van het virus, beginnend met het eerste buisje, en verwissel de tips tussen elke verdunning. Voeg 50 microliters van elke virusverdunning toe, beginnend met de hoogste verdunning, aan dubbele putten van een 96-wells plaat. Plaats vervolgens de plaat gedurende twee tot drie uur bij 37 graden Celsius om het virus toe te laten de cellen te infecteren.

Na het voorbereiden van de overlay volgens het tekstprotocol, verwijder het inoculum uit de putten. Voeg vervolgens 200 microliters overlay toe aan elke put en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende de nacht ongestoord. Voeg 200 microliters ijskoud 4%PFA in PBS A toe aan de putten en incubeer bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten of kamertemperatuur gedurende 20 minuten.

Na de incubatie, aspirateer de PFA en gebruik 200 microliters per put van PBS A om de plaat twee keer te wassen. Voeg 100 microliters permeabilisatiebuffer toe aan de plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Was vervolgens de plaat twee keer met PBS A.

Voeg vervolgens 50 microliters per put van een muis monoklonaal antilichaam tegen influenza type A toe aan de putten en incubeer bij kamertemperatuur met schudden gedurende een uur. Na de incubatie, gebruik 300 microliters wasbuffer om de put drie keer te wassen. Voeg vervolgens 50 microliters van een HRP geconjugeerd geiten secundair antilichaam toe aan de monsters en incubeer bij kamertemperatuur gedurende een uur.

Na het wassen van de putten drie keer zoals eerder, voeg 50 microliters substraat per put toe en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten of totdat de ontwikkeling van een blauwe kleur duidelijk zichtbaar is. Om de reactie te stoppen, gebruik 200 microliters gedistilleerd water om de putten twee keer te wassen. Droog vervolgens de plaat aan de lucht en bewaar deze op een donkere plaats.

Plaats een puttenplaat in het scangebied van een flatbed scanner, gebruik de L-vormige positiebegrenzer om ervoor te zorgen dat een optimale en herhaalbare beeldvormingslocatie kan worden verkregen. Scan de plaat met de hier getoonde instellingen. Voer vervolgens de well plate reader software uit om de vereiste virusconcentratie te berekenen door op de knop Laad Afbeelding te klikken om een ​​afbeelding te laden.

Schuif vervolgens in het tabblad Globale drempelwaarde de rode balk in de histogram om de bemonsteringsdrempelwaarde aan te passen. Klik vervolgens op de knop Update om het effect op een afbeelding te bekijken. Schakel nu het vakje Bereken Neutralisatie/Titratie in.

Klik op de knop Bemonstering om de geïnfecteerde celpopulatie, of ICP, te kwantificeren. Klik vervolgens op de knop Opslaan wanneer u hierom wordt gevraagd om de bemonsteringsresultaten op te slaan. Om de titratieresultaten te verkrijgen, laadt u de definitiekaart van de puttenplaat of voert u deze in.

Geef in Titratie: Optimale Viruspopulatie de drempelwaarde aan. Selecteer het tabblad Titratieproces om de titratieresultaten te berekenen. Controleer vervolgens de titratieresultaten voordat u op de knop Opslaan en Sluiten klikt om de resultaten op te slaan.

Raadpleeg het supplement S1 voor meer gedetailleerde instructies van de software. Om virusneutralisatie uit te voeren, bereid de cellenlaag twee of drie dagen van tevoren voor. Voeg vervolgens 50 microliters VGM toe aan elke put van de plaat.

Gebruik kolom 11 en 12 respectievelijk voor de viruscontrole en celcontrole. Voeg 50-microliters aliquots van een verdunning van één op twintig van receptor vernietigend enzym, of RDE, behandeld serum toe aan de eerste rij van kolommen een tot 10. Voer tweevoudige seriële verdunningen uit door 50 microliters van rij A over te brengen naar rij H en 50 microliters van rij H weg te gooien. Voeg vervolgens 50 microliters verdunningsmiddel toe aan elke put van de celcontrolekolom.

Voeg 50 microliters van het virus toe aan elke put van de plaat, behalve de celcontrolekolom. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende twee tot drie uur. Verwijder vervolgens het inoculum en voeg de overlay toe aan elke put.

Incubeer de plaat gedurende de nacht bij 37 graden Celsius ongestoord. Fixeer en kleuring de platen zoals eerder in deze video is gedemonstreerd. Om neutralisatie te kwantificeren, plaats een puttenplaat in het scangebied van een flatbed scanner zoals eerd