Studie van endoplasmatisch reticulum en mitochondriën interacties door In Situ Proximity Ligatie Assay in gefixeerde cellen
10 december 2016
Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren en kwantificeren gevoeligheid een endogene interacties tussen het endoplasmatisch reticulum en mitochondria in gefixeerde cellen. Het protocol is voorzien van een geoptimaliseerde in situ nabijheid ligation assay gericht op de inositol 1,4,5-trifosfaat receptor / glucose-gereguleerd eiwit 75 / voltage-afhankelijke anion kanaal / cyclofiline D-complex aan de mitochondria bijbehorende membraan interface.
Het algemene doel van dit experiment is om interacties tussen endoplasmatisch reticulum en mitochondriën te visualiseren en te kwantificeren met behulp van een in situ proximity ligatie assay in gefixeerde cellen.Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het biomedische veld te beantwoorden om ER mitochondriën interacties in gefixeerde cellen beter te analyseren met behulp van een eenvoudige immunofluorescentietechniek.Hopelijk suggererend nieuwe behandelingsstrategieën.Het grote voordeel van deze techniek is dat we ER mitochondriën interacties in gefixeerde cellen kunnen visualiseren en kwantificeren en deze techniek kan worden toegepast op in paraffine ingebedde weefselbiopsieën van patiënten.Met behulp van de in situ proximity ligatie assay die in deze video wordt gedemonstreerd, combineren een muis primaire antilichaam gericht tegen VDAC1 aan de buitenmembraan van de mitochondriën en een konijn primaire antilichaam gericht tegen IP3R1 aan het endoplasmatisch reticulum membraan naar hun epitopen in de nabijheid van de mitochondriën geassocieerde membraaninterface.Proximity ligatie sondes met DNA-eindstaarten die zijn gericht tegen muis en konijn IgG worden toegevoegd en kunnen sjablonen vormen voor de ligatie van connector oligo's en kunnen worden versterkt en gevisualiseerd met behulp van Texas Red Oligonucleotiden.Dit kan alleen gebeuren als de twee doelwitten zich op een afstand van minder dan 40 nanometer bevinden.In overeenstemming met de afstand tussen beide orgaanmembraan, op de mitochondriën geassocieerde membraaninterface.Om cellen te fixeren en te blokkeren voor de in situ proximity ligatie assay, plateer menselijke H7 cellen bij 150.000 cellen per ongecodeerde 35 mm glazen bodemschaal.Verwijder de volgende dag het kweekmedium en gebruik 1 ml PBS om de cellen te wassen.Zuig vervolgens de buffer op en voeg 1 ml tien procent formaldehyde toe.Incubeer de schalen bij kamertemperatuur met agitatie gedurende 10 minuten om de cellen te fixeren.Om de reactie te stoppen, voeg 1 ml 1 M glycine toe en meng de schalen door rotatie.Verwijder de glycine-oplossing en voeg 1 ml 1XPBS toe.Agiteer vervolgens kort de schalen en zuig de buffer op.Voeg vervolgens 1 ml 100 mM glycine toe aan de cellen.Incubeer de schalen bij kamertemperatuur met agitatie gedurende 15 minuten.Na het verwijderen van de oplossing, permeabiliseer de cellen door 1 ml 0,1% triton-X100 in PBS toe te voegen.Herhaal de incubatie.Zuig het detergent op en voeg 1 ml PBS toe om de cellen te wassen.Na het verwijderen van de buffer, voeg 40 microliter blokkeringsoplossing toe aan elke schaal met cellen en incubeer de monsters in een vochtige kamer bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.Tik vervolgens de blokkeringsoplossing van de schalen, probeer gelijke restvolumes buffer voor elke dia te verkrijgen zonder de dia's te laten drogen.Om de proximity ligatie assay uit te voeren, gebruik PBS om de primaire antilichamen te verdunnen.Vortex en voeg de oplossing toe aan de schalen.Incubeer de monsters bij 4
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een procedure voor het visualiseren en kwantificeren van de interacties tussen het endoplasmatisch reticulum en mitochondriën in gefixeerde cellen met een hoge gevoeligheid. De methode maakt gebruik van een geoptimaliseerde in situ proximity ligation assay om specifieke proteïnecomplexen bij de interface van het mitochondria-geassocieerde membraan te targeten.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
- Biochemie
Achtergrond
- Het endoplasmatisch reticulum en de mitochondriën spelen een cruciale rol in het cellulaire metabolisme.
- Het begrijpen van hun interacties is essentieel voor het ontrafelen van cellulaire functies.
- Proximity ligation assays bieden een gevoelige methode voor het bestuderen van eiwitinteracties.
- Deze studie richt zich op een specifiek eiwitcomplex dat betrokken is bij deze interacties.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het visualiseren van interacties tussen het endoplasmatisch reticulum (ER) en mitochondriën.
- Het kwantificeren van deze interacties met een hoge gevoeligheid.
- Het verbeteren van het inzicht in het cellulaire metabolisme en signalering.
Gebruikte methoden
- In situ proximity ligation assay
- Targeting van inositol 1,4,5-trifosfaatreceptor
- Betrokkenheid van glucose-gereguleerd proteïne 75
- Analyse van het voltage-afhankelijk anionkanaal en cyclofilines D complex
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van interacties tussen het ER en mitochondria.
- Kwantificering van proteïnecomplexen op de membraaninterface.
- Demonstratie van een hoge gevoeligheid bij het detecteren van interacties.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol maakt een gedetailleerde studie van cellulaire interacties mogelijk.
- De verkregen inzichten kunnen bijdragen aan het begrip van metabole processen.
- Deze methode kan worden toegepast op diverse biologische onderzoeksgebieden.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het kwantificeren van endogene interacties tussen het ER en mitochondria is van cruciaal belang voor het verminderen van risico's bij vroege ontdekkingshypotheses met betrekking tot cellulaire signalering en metabole regulatie. De in situ proximity ligation assay maakt gevoelige, gemultiplexte detectie van organelcontactplaatsen mogelijk zonder eiwitoverexpressie, wat het voorspellende vertrouwen in ziekterelateerde systemen ondersteunt. Deze mogelijkheid versterkt portfoliobeslissingen op het snijvlak van targetvalidatie en mechanistische pathway-analyse.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe visualisatie en kwantificering van ER-mitochondriëncontacten op moleculair niveau mogelijk.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door de nabijheid van endogene eiwitten in gefixeerde cellen en weefselbiopten te bevestigen.
- Faciliteert functionele doelwitvalidatie voor signaalpaden die betrokken zijn bij calciumsignalering en interacties tussen organellen.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen bij het verder ontwikkelen van doelwitten die betrokken zijn bij metabole en signaleringsstoornissen.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerde, reproduceerbare assay voor het kwantificeren van eiwit-eiwitinteracties met een resolutie op sub-organelniveau.
- Maakt testen onder meerdere condities mogelijk om de impact van verbindingen of genetische perturbaties op ER-mitochondriale contacten te beoordelen.
- Levert kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor vergelijkende analyse tussen experimentele groepen.
- Ondersteunt de schaalbaarheid van de assay en hergebruik van het platform voor bredere screening-initiatieven.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelateerde systemen door analyse in weefselbiopten van patiënten mogelijk te maken.
- Handhaaft translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van targets voor organel-interacties.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde vooruitgang door mechanisch bewijs van pathway-activatie te leveren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze in situ proximity ligation assay slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinisch onderzoek door een robuuste kwantificering van ER-mitochondriën-interacties in gefixeerde cellen en weefsels mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en verduidelijking van signaalpaden voor mechanismen van organel-interacties.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor screeningscampagnes van verbindingen of genetische variabelen.
- Analytics: Biedt gevoelige detectie van proteinnabijheid onder de 40 nm, wat statistische vergelijking van interactiefrequenties mogelijk maakt.
- Translational Research: Faciliteert de afstemming van biomarkers en mechanistische validatie in ziekterelateerde monsters.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar platform voor diverse proteïne-interactiestudies over meerdere R&D-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert de detectie van endogene eiwitinteracties met een hoge sensitiviteit en specificiteit.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen mogelijk door vroeg in de pipeline robuuste mechanistische gegevens te verschaffen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering en het verder ontwikkelen van targets met gevalideerde organelinteractieprofielen.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in protocollen voor immunofluorescentie en proximity ligation assay.
- Toegang tot hoogwaardige antilichamen en infrastructuur voor fluorescentiebeeldvorming is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbare kwantificering over verschillende studies heen.
- Aanpasbaar voor zowel cellijnen als paraffin-ingebedde weefselbiopten voor translationele relevantie.
- Beperkt tot gefixeerde monsters; niet geschikt voor studies naar dynamische interacties in levende cellen.
