Rapid neuronale differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het meten van het netwerk activiteit op micro-electrode arrays
8 januari 2017
We wijzigen en implementeren van een eerder gepubliceerd protocol beschrijft de snelle, reproduceerbare en efficiënte differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) in prikkelende corticale neuronen 12. Specifiek onze modificatie maakt regeling van neuronale celdichtheid en gebruik op micro-electrode arrays elektrofysiologische eigenschappen op netwerkniveau meten.
Het algemene doel van dit neuronale differentiatieprotocol is om neuronale netwerken te genereren van de menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen die op micro-elektrode-arrays groeien op een snelle en gecontroleerde manier. Deze methode kan worden gebruikt om kernvragen in de neurowetenschapsvelden aan te pakken. Het kan worden gebruikt om biologische mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan neurologische stoornissen, maar het kan ook worden gebruikt om meer fundamentele neurobiologische vragen te beantwoorden.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de snelle differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen in neuronen op een gecontroleerde manier. Op dag één, warm DMEM/F12, CDS en E8-medium met 1% penicilline-streptomycine op tot kamertemperatuur. Voeg vervolgens doxycycline toe aan E8-medium om een uiteindelijke concentratie van vier microgram per milliliter te maken en voeg vervolgens rock-remmer toe aan het mengsel.
Aspireer het gebruikte medium van de RTTANGN2 positieve hiPSC's en voeg een milliliter CDS toe aan de cellen. Incubeer vervolgens de cellen gedurende drie tot vijf minuten in een bevochtigde 37 graden Celsius incubator. Controleer onder de microscoop of de cellen zich losmaken van elkaar.
Voeg vervolgens twee milliliter DMEM/F12 toe in de put. Suspeneer de cellen voorzichtig met een 1.000 microliter pipette en breng ze over naar een 15 milliliter buis. Voeg vervolgens zeven milliliter DMEM/F12 toe aan de celsuspensie en centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 200 x g.
Na vijf minuten aspireer het supernatant en voeg twee milliliter van het bereide E8-medium toe. Dissocieer hiPSC's door de punt van een 1.000 microliter pipette tegen de zijkant van de 15 milliliter buis te plaatsen en de cellen voorzichtig te resuspenderen. Controleer onder de microscoop of de cellen gedissocieerd zijn.
Bepaal vervolgens het aantal cellen per milliliter met behulp van een hemocytometer. Voor de zes wel MEA's, verdun de cellen om een celsuspensie van 7,5 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter te verkrijgen. Voor de dekglasjes, verdun de cellen om een celsuspensie van vier keer 10 tot de vierde cellen per milliliter te verkrijgen.
Aspireer de verdunde laminine van de dekglasjes en de zes wel MEA's. Voor de zes wel MEA's, plateer de cellen door 100 microliter celsuspensie toe te voegen aan het actieve elektrodegebied in elke put. Plateer vervolgens de cellen door 500 microliter celsuspensie toe te voegen aan elke put van de 24 wel plaat.
Plaats vervolgens de zes wel MEA's of de 24 wel plaat in een bevochtigde 37 graden Celsius incubator. Voeg na twee uur voorzichtig 500 microliter van het bereide E8-medium toe aan elke put van de zes wel MEA's. Plaats vervolgens de zes wel MEA's een nacht in een bevochtigde 37 graden Celsius incubator.
Op dag drie, warm 0,05% Trypsin-EDTA op tot kamertemperatuur. Warm DPBS en DMEM/F12 met 1% penicilline-streptomycine op tot 37 graden Celsius. Aspireer vervolgens het gebruikte medium van de ratten-astrocytcultuur.
Was de cultuur door vijf milliliter DPBS toe te voegen en zwaai het voorzichtig rond. Aspireer vervolgens DPBS en voeg vijf milliliter 0,05% trypsin-EDTA toe. Zwaai de trypsin-EDTA voorzichtig rond.
Incubeer vervolgens de cellen in een bevochtigde 37 graden Celsius incubator gedurende vijf tot tien minuten. Controleer vervolgens onder de microscoop om te onderzoeken of de cellen loslaten. Los de laatste cellen op door de fles een paar keer te slaan.
Voeg vervolgens vijf milliliter DMEM/F12 toe aan de fles. Probeer de cellen voorzichtig in de fles te raten met een 10 milliliter pipette. Verzamel vervolgens de celsuspensie in een 15 milliliter buis.
Centrifugeer de buis gedurende acht minuten bij 200 x g. Aspireer vervolgens het supernatant en resuspendeer de cellen in één milliliter DMEM/F12. Bepaal het aantal cellen per milliliter met behulp van een hemocytometer.
Voeg vervolgens 7,5 keer 10 tot de vierde astrocyten toe aan elke put van de zes wel MEA's. En voeg twee keer 10 tot de vierde astrocyten toe aan elke put van de 24 wel plaat. Incubeer de cellen een nacht in een bevochtigde 37 graden Celsius incubator.
Verkrijg de gegevens met 1.200 keer versterking en sample het signaal bij 10 kilohertz met behulp van de MCS data-acquisitiekaart. Neem 20 minuten van elektrofysiologische activiteit op van hiPSC-afgeleide neuronen gekweekt op MEA's. Houd tijdens de opname de temperatuur op 37 graden Celsius en voorkom mediumverdamping en pH-veranderingen door een constante langzame stroom bevochtigd gas op de MEA's te leveren.
Analyseer vervolgens de gegevens met behulp van een aangepast softwarepakket. Deze figuur toont de expressieveranderingen van neuronale markers MAP2 in synapsine tijdens het differentiatieproces, wat aangeeft dat neuronale maturatie plaatsvindt. Deze grafiek toont dat synapsine-expressie gemeten voor individuele cellen toeneemt tijdens het differentiatieproces.
De synapsine die in de cellen tot expressie wordt gebracht na drie weken differentiatie, co-lokaliseerde met PSD-95, wat wijst op de aanwezigheid van functionele synapsen. Hier werd whole cell patch clamp uitgevoerd op verschillende tijdstippen tijdens het differentiatieproces om de elektrofysiologische activiteit van de cellen te meten. De cellen waren in staat om actiepotentialen te genereren op de verschillende tijdstippen.
En het percentage spikkende cellen nam in de loop van de tijd toe, wat aantoont dat de meeste cellen in staat zijn om actiepotentialen te genereren, zelfs in de vroege fase van differentiatie. Patch clamp werd ook gebruikt om de excitatoire postsynaptische stromingen te meten die door de cellen worden ontvangen. Het aantal inputs dat de cellen ontvangen, nam toe tijdens het differentiatieproces.
Zowel de frequentie als de amplitude van de excitatoire posts
Overzicht
Dit artikel presenteert een aangepast protocol voor de snelle differentiatie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) tot excitatoire corticale neuronen. De methode maakt een gecontroleerde neuronale celconcentratie mogelijk en is compatibel met micro-elektrodearrays voor het meten van elektrofysiologische eigenschappen.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Stamcelbiologie
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) kunnen differentiëren tot verschillende neuronale typen.
- Het begrijpen van neuronale netwerken is cruciaal voor het bestuderen van neurologische aandoeningen.
- Micro-elektrodearrays (MEAs) vergemakkelijken de meting van neuronale activiteit.
- Snelle differentieprotocollen verhogen de efficiëntie van het onderzoek.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het genereren van neuronale netwerken uit hiPSCs.
- Om de studie van neurobiologische mechanismen en neurologische aandoeningen mogelijk te maken.
- Om een protocol te bieden dat controle over de celdichtheid behoudt.
Gebruikte methoden
- Bereiding van kweekmedia en technieken voor celdissociatie.
- Uitplaten van hiPSCs op micro-elektrodenarrays.
- Monitoring van markers voor neuronale differentiatie en rijping.
- Elektrofysiologische opnames om de neuronale activiteit te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle differentiatie van hiPSCs tot functionele neuronen.
- Verhoogde expressie van neuronale markers tijdens de differentiatie.
- Aangetoonde actiepotentialen en synaptische activiteit in gedifferentieerde neuronen.
- De activiteit van het neuronale netwerk nam in de loop van de tijd toe, wat duidt op rijping.
Conclusies
- Het aangepaste protocol maakt een efficiënte generatie van neurale netwerken mogelijk.
- Deze techniek kan worden toegepast om diverse neurobiologische vraagstukken te bestuderen.
- Het handhaven van steriele omstandigheden en een voorzichtige behandeling is cruciaal voor het succes.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
De snelle en gecontroleerde differentiatie van hiPSCs tot functionele neuronale netwerken lost een kritiek knelpunt op in drug discovery gericht op neurobiologie. Dit protocol maakt de reproduceerbare generatie van mature, excitatoire menselijke neuronen mogelijk die geschikt zijn voor high-content elektrofysiologische assays, wat het voorspellende vertrouwen in onderzoek naar neurologische aandoeningen in een vroeg stadium ondersteunt. Deze aanpak verbetert de besluitvorming over portfolio's door schaalbare, ziekte-relevante menselijke modellen te leveren voor mechanistische en farmacologische analyse.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar ziekterelevante neuronale mechanismen mogelijk met behulp van excitatoire neuronen van menselijke oorsprong.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door het meten van elektrofysiologische output op netwerkniveau.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door middel van gecontroleerde, homogene neuronale populaties.
- Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie en triage van neurologische targets.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde, reproduceerbare neuronale culturen voor downstream compound-screening.
- Levert kwantitatieve elektrofysiologische read-outs via micro-elektrodearrays.
- Maakt schaalbaarheid van assays en vergelijkbaarheid tussen studies mogelijk door expliciete controle van de celdichtheid.
- Ondersteunt een betrouwbare evaluatie van farmacologische interventies in menselijke neuronale netwerken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt in vitro neuronale netwerkactiviteit uit met functionele eindpunten die relevant zijn voor de ziekte.
- Slaat een brug tussen discovery en preklinische validatie door mechanistische studies in patiëntafgeleide lijnen mogelijk te maken.
- Vermindert het translationele risico door dysfuncties van menselijke neuronale netwerken te modelleren die worden waargenomen bij neurologische aandoeningen.
- Faciliteert de ontdekking van biomarkers via longitudinale elektrofysiologische metingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door het mogelijk maken van de snelle generatie van functionele menselijke neuronale netwerken voor targetvalidatie, screening en mechanistische studies.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden in menselijke neuronale systemen.
- Screening: Biedt assay-klare, reproduceerbare neuronale culturen met kwantitatieve outputs van netwerkactiviteit.
- Analytics: Levert elektrofysiologische metingen en statistische analyses voor het vergelijken van condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt in vitro bevindingen met ziektemechanismen en potentiële biomarkers.
- Bedrijfsmatig Hergebruik: Vestigt een schaalbaar, herbruikbaar platform voor diverse neurologische onderzoeksprogramma's.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van neurologische targets.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van neuronale assays.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door het mogelijk maken van robuuste datageneratie in een vroeg stadium.
- Portfolio-impact: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en het verder ontwikkelen van programma's voor neurologische aandoeningen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stamcellenkweek, neuronale differentiatie en elektrofysiologische analyse.
- Toegang tot micro-elektrode-array instrumentatie en gespecialiseerde software voor data-analyse is noodzakelijk.
- Strikte standaardisatie tussen teams voor celdichtheid en differentiatieprotocollen is vereist.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende hiPSC-lijnen of ziektemodellen.
- Beperkingen omvatten de noodzaak van steriele technieken en voorzichtig beheer van de cellen om reproduceerbaarheid te garanderen.
