Name: Rapid neuronale differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het meten van het netwerk activiteit op micro-electrode arrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Leer hoe je hiPSCs snel differentieert naar neuronen voor elektrofysiologische metingen op micro-elektrode arrays. Deze methode maakt gecontroleerde netwerkvorming mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken Jessica Classen voor het uitvoeren van de whole-cell patch-clamp experimenten. De hiPSC's die in onze experimenten werden gebruikt, werden vriendelijk ter beschikking gesteld door Huiqing Zhou en Willem van den Akker van de Radboud Universiteit Nijmegen. De transfervectoren die in dit protocol werden gebruikt, werden vriendelijk ter beschikking gesteld door Oliver Brüstle, Philipp Koch en Julia Ladewig van het University of Bonn Medical Centre.

<ol><li>Ahfeldt, T., Litterman, N. K., Rubin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+human+disease+using+human+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Studying human disease using human neurons.</a> Brain Res. , (2016).</li>
<li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 19 (12), 1129-1133 (2001).</li>
<li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (34), 12543-12548 (2004).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomic+and+functional+analyses+reveal+neuronal+subtype+differentiation+bias+in+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Integrative genomic and functional analyses reveal neuronal subtype differentiation bias in human embryonic stem cell lines.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (34), 13821-13826 (2007).</li>
<li>Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).</li>
<li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).</li>
<li>Maroof, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+and+functional+maturation+of+cortical+interneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).</li>
<li>Johnson, M. A., Weick, J. P., Pearce, R. A., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+neural+development+from+human+embryonic+stem+cells%3A+accelerated+synaptic+activity+via+astrocyte+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional neural development from human embryonic stem cells: accelerated synaptic activity via astrocyte coculture.</a> J Neurosci. 27 (12), 3069-3077 (2007).</li>
<li>Hu, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (6), 695-706 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Odawara, A., Saitoh, Y., Alhebshi, A. H., Gotoh, M., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+electrophysiological+activity+and+pharmacological+response+of+a+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neuron+and+astrocyte+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Long-term electrophysiological activity and pharmacological response of a human induced pluripotent stem cell-derived neuron and astrocyte co-culture.</a> Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1176-1181 (2014).</li>
<li>Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+maturation+and+drug+responses+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neuronal+networks+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture.</a> Sci Rep. 6, 26181(2016).</li>
<li>Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Responses+and+Spontaneous+Activity+of+Human+iPS-Derived+Neuronal+Networks+Characterized+for+3-month+Culture+with+4096-Electrode+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays.</a> Front Neurosci. 10, (2016).</li>
<li>Heikkila, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+neuronal+cells+form+spontaneously+active+neuronal+networks+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived neuronal cells form spontaneously active neuronal networks in vitro.</a> Exp Neurol. 218 (1), 109-116 (2009).</li>
<li>Massobrio, P., Massobrio, G., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-program+approach+for+simulating+recorded+extracellular+signals+generated+by+neurons+coupled+to+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocomputing%22%5BJournal%5D)">Multi-program approach for simulating recorded extracellular signals generated by neurons coupled to microelectrode arrays.</a> Neurocomputing. 70, 2467-2476 (2007).</li>
<li>Wang, L., Riss, M., Buitrago, J. O., Claverol-Tinturé, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+of+microchannel-enabled+neuron-electrode+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Biophysics of microchannel-enabled neuron-electrode interfaces.</a> J Neural Eng. 9 (2), (2012).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> J. Vis. Exp. (71), e50079(2013).</li>
<li>Pacifici, M., Peruzzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+embryonic+neural+cells%3A+a+quick+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol.</a> J Vis Exp. (63), e3965(2012).</li>
<li>Ba, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARHGAP12+functions+as+a+developmental+brake+on+excitatory+synapse+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ARHGAP12 functions as a developmental brake on excitatory synapse function.</a> Cell Rep. 14 (6), 1355-1368 (2016).</li>
<li>Bologna, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+neuronal+activity+by+SPYCODE+multi-channel+data+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Netw%22%5BJournal%5D)">Investigating neuronal activity by SPYCODE multi-channel data analyzer.</a> Neural Netw. 23 (6), 685-697 (2010).</li>
<li>Ba, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIO+loss+of+function+is+associated+with+mild+intellectual+disability+and+affects+dendritic+branching+and+synapse+function%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">TRIO loss of function is associated with mild intellectual disability and affects dendritic branching and synapse function.</a> Hum Mol Genet. 25 (5), 892-902 (2016).</li>
<li>Benevento, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+by+the+Kleefstra+syndrome+protein+EHMT1+mediates+homeostatic+synaptic+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Histone methylation by the Kleefstra syndrome protein EHMT1 mediates homeostatic synaptic scaling.</a> Neuron. 91 (2), 341-355 (2016).</li>
<li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).</li>
<li>Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+dynamics+of+3D+engineered+neuronal+cultures%3A+a+new+experimental+model+for+in-vitro+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology.</a> Sci Rep. 4, 5489(2014).</li>
<li>Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacing+3D+engineered+neuronal+cultures+to+micro-electrode+arrays%3A+an+innovative+in+vitro+experimental+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Interfacing 3D engineered neuronal cultures to micro-electrode arrays: an innovative in vitro experimental model.</a> J Vis Exp. (104), e53080(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier hebben we een efficiënte iPSC-differentiatie protocol gepubliceerd door Zhang et al geïmplementeerd. (2013) 12 voor het meten van de netwerkactiviteit van iPSC-afgeleide neuronale netwerken op MMO&#39;s. We pasten de originele protocol door het creëren van een rtTA / Ngn2 -positieve iPSC lijn voor het induceren van neuronale differentiatie. Deze extra stap kunnen we de neuronale celdichtheid op de MEA regelen. Controle over de neuronale dichtheid was een belangrijke voorwaarde voor de aanpassing van het protocol bij MMO&#39;s en voor het waarborgen van consistentie. Om de activiteit van neuronale netwerken met behulp MEA meten, moet de neuronen dichte netwerken vormen direct op het MEA elektroden 17,18. Deze vereisen geen strakke controle over de plating dichtheid van de neuronen. De rtTA / Ngn2 -positieve iPSC lijn zorgt voor de controle van neuron dichtheid, omdat deze tactiek niet afhankelijk is van acute lentivirale transductie van hiPSCs voorafgaand aan differentiatie;de rtTA / Ngn2 -positieve iPSC stippellijn hierdoor vrijwel elimineert variaties in de uiteindelijke opbrengst als gevolg van, bijvoorbeeld, lentivirale toxiciteit en variabele infectie-efficiëntie. Een andere belangrijke stap van de experimentele procedure is het aantal ratten astrocyten die worden gekweekt samen met de differentiërende hiPSCs. Astrocyten actief bijdragen aan de verfijning ontwikkelen neurale circuits door het regelen synapsvorming, onderhoud en verwijdering, die allemaal belangrijke processen voor neuronale functioneren. Het protocol in dit document is zeer astrocyten-afhankelijke: volledig volwassen en vormen functionele synapsen, de neuronen vereisen steun van de astrocyten. We ondervonden dat het aantal astrocyten ongeveer gelijk aan het aantal iPSC-afgeleide neuronen moet zijn om de rijping van de neuronen en de vorming van neuronale netwerken vertonen spontane activiteit te ondersteunen. Sinds onze astrocyten protocol opbrengsten primaire cel culturen met een beperkte levensduur, de isolatie van rat astrocyten moet regelmatig worden uitgevoerd. Onze aanpassing van een door Zhang et al protocol. (2013) 12 voor gebruik bij MEA technologie zal waarschijnlijk aanzienlijk beter in staat om de netwerkactiviteit van iPSC-afgeleide netwerken bestuderen. Voorheen gebruikte protocollen voor het bestuderen van iPSC-afgeleide neuronale netwerken met MEA ingeroepen tijdrovende procedures differentiatie 13-16. Het protocol van Zhang et al. (2013) verschaft een snel alternatief, en onze modificatie verwijdert een bron van variabiliteit, waardoor het nu mogelijk om iPSC-afgeleide neuronen in combinatie met MEA technologie, met name in high-throughput of farmacologische studies. Bovendien, omdat de methode gepubliceerd door Zhang et al. (2013) 12 levert een homogene populatie van upper-layer corticale neuronen, onze aangepaste protocol maakt het mogelijk om gericht onderzoek naar het netwerk eenctivity van deze specifieke neuronale deelverzameling. Desondanks heeft deze benadering ook een aantal beperkingen. Ten eerste, de homogeniteit van de kweken kan worden nadelig beschouwd omdat de kweken minder waarschijnlijk lijken in vivo netwerken, waarbij verschillende soorten neuronen (bijv remmende en exciterende neuronen) vormen een heterogeen netwerk. Om nog meer gebruik van de iPSC-afgeleide neuronen met MEA technologie, is het belangrijk om snelle (-transgen based) differentiatie protocollen voor andere neuronale celpopulaties ontwikkelen. Als protocollen beschikbaar komen, zou het in vitro netwerken nauwer na te bootsen in vivo netwerken. Tweede momenteel rat astrocyten worden toegevoegd aan de iPSC-afgeleide neuronen groei ondersteunen, en dus de resulterende neuronale netwerk geen menselijke neurale netwerk sensu stricto. Betrouwbare protocollen voor differentiëren hiPSCs in kan astrocyten in de toekomst solve dit probleem 26. Derde tweedimensionale neuronale netwerken, zoals hier beschreven, een beperkt model voor de studie van complexe driedimensionale in vivo neuronale netwerken. Gelukkig protocollen beschrijven driedimensionale culturen van de rat primaire neuronen in combinatie met MEA technologie reeds beschikbaar 27,28. Prospectief, moet de combinatie van snelle differentiatie protocollen voor het verkrijgen van iPSC-afgeleide neuronen en astrocyten met driedimensionale kweektechnieken en MEA technologie nieuw inzicht in de biologische mechanismen onderliggende neurologische stoornissen.

De ontwikkeling van de menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) differentiatie protocollen voor de menselijke neuronen in vitro een krachtige nieuwe tool voor het bestuderen van neurologische aandoeningen heeft verstrekt te genereren. Tot voor kort werd de studie van dergelijke aandoeningen ernstig belemmerd door het gebrek aan modelsystemen met menselijke neuronen. Hoewel knaagdieren kunnen worden gebruikt om neurologische aandoeningen te bestuderen, de resultaten van deze studies niet gemakkelijk vertaald mens 1. Gezien deze beperkingen iPSC-afgeleide neuronen zijn een veelbelovend alternatief model dat kan worden gebruikt om de moleculaire mechanismen te ontrafelen onderliggende neurologische aandoeningen en in vitro screenen van geneesmiddelen. In de afgelopen tien jaar een aantal protocollen om te zetten hiPSCs tot neuronen zijn ontwikkeld 2-8. Echter, deze protocollen nog beperkt op vele manieren. Ten eerste, de protocollen vaak tijdrovend: het genereren van neuronen met voldoende rijping (dwz synapse vorming) en functionele activiteit vereist maanden van het kweken van procedures, die op grote schaal studies moeilijk 9 maakt. Bovendien iPSC naar neuron omzettingsrendement laag. Protocollen leiden steeds een heterogene populatie van neuronen, en dus niet onderzoeken specifieke subsets van neuronale cellen mogelijk. Bovendien zijn de protocollen niet reproduceerbaar, waarbij verschillende resultaten voor verschillende iPSC lijnen 10,11. Tenslotte de rijpingsfase en functionele eigenschappen van de resulterende neuronen zijn ook variabel 10. Om deze problemen, Zhang et al pakken. (2013) 12 een protocol ontwikkeld die snel en reproduceerbaar genereert menselijke neuronen van hiPSCs door overexpressie de transcriptiefactor Neurogenine-2. Zoals gerapporteerd door de auteurs, differentiatie treedt relatief snel (slechts 2-3 weken na inductie van expressie Neurogenine-2), het protocol reproduceerbaar (neuronale eigenschappen onafhankelijk zijn van de starting iPSC lijn) en de iPSC naar neuron conversie is zeer efficiënt (bijna 100%). De populatie van neuronen gegenereerd met hun protocol homogene (die lijkt bovenlaag corticale neuronen), waardoor het onderzoek celtype specifiek bijdragen aan neuronale aandoeningen. Bovendien hebben zij iPSC afgeleide neuronen vertoonden oudere eigenschappen (bijvoorbeeld de mogelijkheid om synapsen en robuuste functionele activiteit vormen) na 20 d. Karakteriseren van de elektrofysiologische eigenschappen van iPSC-afgeleide neuronen op netwerkniveau is een belangrijke voorwaarde voor iPSC technologie kan worden benut voor de studie van ziekten bij de mens. Om deze reden hebben veel onderzoeksgroepen onlangs begonnen met stamcellen afgeleide neuronen op netwerkniveau met behulp van micro-elektrode-array (MEA) apparaten (Multichannel Systems, Reutlingen, Duitsland) 13-16 te onderzoeken. De elektroden van een MEA worden ingebed in een substraat waarop neuronale cellen kunnen worden gekweekt.MEA kan worden gebruikt om de elektrofysiologische eigenschappen van neuronale netwerken en de in vitro ontwikkeling van hun activiteit te ontdekken. Op dit moment, MEA worden alleen gebruikt in combinatie met differentiatie protocollen die enkele maanden duren tot volwassen netwerken leveren. Daarom combineren MEA met een snelle differentiatie protocol moet het gebruik van deze technologie in grootschalige studies neurologische aandoeningen vergemakkelijken. Hier presenteren we een modificatie van de Zhang et al. (2013) 12 protocol en aan te passen voor gebruik op MMO&#39;s. In het bijzonder, in plaats van te vertrouwen op een acute lentivirale transductie, we in plaats daarvan gemaakt iPSC lijnen stabiel tot expressie rtTA / Ngn2 voor het induceren van differentiatie. We hebben deze hoofdzakelijk reproduceerbare controle over de neuronale celdichtheid, aangezien de neuronale celdichtheid is essentieel voor neuronale netwerkvorming en goed contact tussen de neuronen en de elektroden van de MEA 17,18. although de Zhang et al. protocol is zeer efficiënt met betrekking tot omzetting van getransduceerde hiPSCs is inherent variabel ten opzichte van de uiteindelijke opbrengst van neuronen uit het aantal hiPSCs geplateerde aanvankelijk (zie figuur 2E in Zhang et al.) 12. Met een stabiele lijn, elimineren we vele problemen die variabiliteit, zoals lentivirale toxiciteit en infectie-efficiëntie. Vervolgens hebben we geoptimaliseerd de parameters die betrouwbaar produceren iPSC-afgeleide neuronale netwerken op MMO&#39;s, het verkrijgen van het netwerk rijping (bijvoorbeeld synchrone gebeurtenissen waarbij een meerderheid van de kanalen) door de derde week. Deze snelle en betrouwbare protocol moet directe vergelijkingen tussen neuronen afkomstig van verschillende (dwz patiënt-specifieke) iPSC lijnen evenals bieden robuuste consistentie voor farmacologisch onderzoek mogelijk te maken.

<table><tbody><tr><td>Lebovitz's L-15 medium</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>B-27 supplement</td><td>Gibco</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+-vrij HBSS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>DMEM met hoge glucose</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro;m celzeef</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 lentiviraal verpakkingsvector</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G lentiviraal verpakkingsvector</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12259</td><td></td></tr><tr><td>Basement membrane matrix</td><td>Gibco</td><td>A1413201</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Cell detachment solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>E8 medium</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitor</td><td>Gibco</td><td>A2644501&nbsp;</td><td>Alternatief kunnen ROCK-remmers zoals thiazovivin worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8168-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>6-well MEAs</td><td>Multi Channel Systems</td><td>60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr</td><td></td></tr><tr><td>Glazen dekglasjes</td><td>VWR</td><td>631-0899</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-5G</td><td></td></tr><tr><td>N-2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>NT-3, human recombinant</td><td>Promokine</td><td>C66425</td><td></td></tr><tr><td>BDNF, human recombinant</td><td>Promokine</td><td>C66212</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>L-alanyl-L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine &beta;-D-arabinofuranoside&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Scherpe fijne pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251</td><td></td></tr><tr><td>Fijne spiraalvormige schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid neuronale differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het meten van het netwerk activiteit op micro-electrode arrays

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Neuronen afgeleid van humaan geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) een veelbelovend nieuw instrument voor de studie van neurologische aandoeningen. In het afgelopen decennium, hebben veel protocollen voor hiPSCs differentiëren tot neuronen ontwikkeld. Echter, deze protocollen zijn vaak traag met een hoge variabiliteit, lage reproduceerbaarheid, en de lage efficiëntie. Bovendien, de resultaten verkregen met deze protocollen neuronen vaak onvolwassen en ontbreekt het aan functionele activiteit, zowel bij de enkele-cel en netwerkniveau tenzij de neuronen worden gedurende enkele maanden. Mede door deze beperkingen, de functionele eigenschappen van iPSC-afgeleide neurale netwerken zijn nog niet goed gekarakteriseerd. Hier passen we een onlangs gepubliceerd protocol dat de productie van menselijke neuronen van hiPSCs beschreven door geforceerde expressie van de transcriptiefactor Neurogenine 2-12. Dit protocol is een snelle (waardoor volwassen neuronen binnen 3 weken) en efficiënt, met bijna 100% omzettingsrendement van omvormersed cellen (&gt; 95% DAPI-positieve cellen MAP2 positief). Bovendien bepaalt het protocol levert een homogene populatie van exciterende neuronen die het onderzoek celtype specifiek bijdragen aan neurologische aandoeningen mogelijk maken. We pasten de oorspronkelijke protocol genereren van stabiel getransduceerde cellen iPSC, gaf ons expliciete controle over het totale aantal neuronen. Deze cellen worden vervolgens gebruikt om iPSC-afgeleide neurale netwerken op micro-electrode arrays genereren. Op deze wijze kan de spontane elektrofysiologische activiteit van iPSC-afgeleide neurale netwerken worden gemeten en gekarakteriseerd, met behoud interexperimental consistentie tussen celdichtheid. Het gepresenteerde protocol is breed toepasbaar, vooral voor mechanistische en farmacologische studies over menselijke neuronale netwerken.

Hier hebben we met succes een gemodificeerd protocol waarbij hiPSCs direct in corticale neuronen worden onderscheiden door overexpressie van de transcriptiefactor Neurogenine-2 12 en we hebben het aangepast voor gebruik van MEA. Deze aanpak is snel en efficiënt waardoor wij functionele neuronen en netwerkactiviteit al tijdens de derde week te verkrijgen na de inductie van differentiatie. Tijdens de differentiatie protocol, de cellen morfologisch begon neuronen lijken: kleine processen werden gevormd en neuronen begonnen met elkaar verbinden (figuur 1A). We hebben een neurofysiologische profiel van de neuronen afgeleid van een gezonde-control iPSC lijn, door het meten van hun neuronale morfologie en synaptische eigenschappen tijdens de ontwikkeling. iPSC-afgeleide neuronen gekleurd MAP2 en synapsine-1/2 op verschillende dagen na de startvan differentiatie (figuur 2A). De afgeleide neuronen tonen volwassen neuronale morfologie reeds 3 weken na de inductie van differentiatie. Het aantal synapsine-1/2 puncta (een maat voor het aantal synapsen) werd gekwantificeerd op basis synapsine-1/2 immunocytochemie kleuringen. Het aantal synapsine-1/2 puncta loop der tijd toenemen, wat suggereert dat het niveau van neuronale verbindingen ook toeneemt (figuur 2B). Het aantal synapsine-1/2 puncta 23 dagen na de inductie van differentiatie was vergelijkbaar in beide onafhankelijke IPS lijnen (Figuur 2C). Op 23 DIV meest synapsin1 / 2 puncta werden geplaatst naast PSD-95 puncta, wat indicatief is voor functionele synapsen (figuur 2D). Consistent met de door Zhang et al resultaten. Genereerden wij een populatie van excitatoire corticale neuronen bovenlaag bevestigd door pan-neuronale en subtype-specifieke corticale m<html> arkers zoals BRN2 en SATB2 (layer II / III). We hadden niet neuronen die positief voor diepe laag neuronen CTIP2 (laag V) of FoxP2 (layer VI) (figuur 2E en F) waren te observeren Om de elektrofysiologische activiteit van het iPSC-afgeleide neuronen te karakteriseren, gebruikten we whole-cell stroom en spanning clamp opnames, dwz intrinsieke eigenschappen en prikkelende inbreng op deze neuronen werden gemeten tijdens de ontwikkeling. De neuronen konden actiepotentialen genereert een week reeds na de differentiatie en het percentage cellen spiking toenam in de tijd (Figuur 2G en H). Voorts ontvangen de neuronen prikkelende synaptische grondstoffen was een week na inductie van differentiatie: zowel frequentie als amplitude van de prikkelende synaptische ingang verhoogd tijdens de ontwikkeling (Figuur 2I - K). nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Om een beter begrip eencellige activiteit combineert functies op netwerkniveau vormen, is het noodzakelijk te bestuderen hoe neuronen werken samen In vitro neuronale netwerken gekweekt op MEA. vormen een waardevolle experimenteel model voor het bestuderen van neuronale dynamiek. We registreerden 20 min van elektrofysiologische netwerk activiteit van neuronen afgeleid van een gezonde-control iPSC lijn gekweekt op 6-well MEA (figuur 2 M). een paar weken na de inductie van differentiatie, de neuronen afkomstig van gezonde controle hiPSCs gevormde functioneel actief neuronale netwerken, met spontane gebeurtenissen (0,62 ± 0,05 spike / s Figuur 2N). In deze fase van ontwikkeling (dat wil zeggen 16 d na het begin van de differentiatie) geen synchrone gebeurtenissen waarbij alle kanalen . van de MEA worden gedetecteerd (figuur 2O) het niveau van de netwerkactiviteit verhoogd tijdens de ontwikkeling: tijdens de vierde week na t<html> Hij inductie van differentiatie, neuronale netwerken vertoonden hoge spontane activiteit (2,5 ± 0,1 spike / s Figuur 2N) in alle putjes van de inrichting. De netwerken ook tentoongesteld synchroon netwerk uitbarstingen (4,1 ± 0,1 burst / min, figuur 2O) met een lange looptijd (2100 ± 500 ms). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig1.jpg" /> Figuur 1: iPSC Differentiatie in neuronen. A. Drie tijdstippen van hiPSCs differentiatie in neuronen op dekglaasjes. B. Plating van hiPSCs op MEA. C. Astrocytes bij 100% confluentie in T75 kolf (merk op dat de cellen vormen een mozaïek monolaag). Schaal bars: 150 pm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> e_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig2.jpg" /> Figuur 2. iPSC afgeleide neuronen Karakterisatie. A. iPSC afgeleide neuronen gekleurd voor MAP2 (groen) en synapsine-1/2 (rood) op verschillende dagen na het begin van differentiatie. Schaal bar: 10 pm. B. Kwantificering van synapsin puncta in twee onafhankelijke experimenten. Iedere experimenten werden ten minste 10 cellen geanalyseerd. C. Kwantificering van synapsin puncta op DIV23 in neuronen afkomstig van twee onafhankelijke IPS lijnen. D. iPSC afgeleide neuronen gekleurd voor PSD-95 (groen) en synapsine-1/2 (rood) 23 dagen na het begin van differentiatie. Synapsin puncta worden afgewisseld met PSD-95 puncta. E. iPSC afgeleide neuronen werden gekleurd voor MAP2 (groen) en BRN2 (rood) of SATB2 (rood) 23 d na het begin van differentiatie. F. Percentage MAP2 positieve cellen diewaren positief voor aangegeven markers. G. Representatieve huidige clamp blijkt dat actiepotentialen kan al 7 dagen na het begin van differentiatie worden gegenereerd. H. Percentage van cellen op verschillende dagen na de inductie van differentiatie die een of meer actiepotentialen tonen. I. Vertegenwoordiger sporen van prikkelende postsynaptische stromingen (EPSCs) door iPSC-afgeleide neuronen op verschillende dagen ontvangen na differentiatie. J. Frequentie van prikkelende postsynaptische stroom tijdens de ontwikkeling. K. amplitude van prikkelende postsynaptische stroom tijdens de ontwikkeling. L. Vertegenwoordiger sporen van EPSC opnames zonder (controle) en met CNQX (CNQX). M. Neuronen afgeleid van één iPSC lijn werden gekweekt op 6-putjes MEA en netwerkactiviteit wordt getoond iPSC-afgeleide neurale netwerken 16 en 23 d na de inductie van differentiatie. De activiteit opgenomen vanelk putje (sampling rate van 10 kHz) wordt aangegeven met een andere kleur (5 min van de 20 min van de opname worden weergegeven). N. Firing snelheid 16 en 23 d na de inductie van differentiatie. O. barsten tarief 16 en 23 d na de inductie van differentiatie. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Gezien de resultaten, kan de kwaliteit van de resulterende iPSC afgeleide neuronen worden beoordeeld door een neurofysiologische profiel van de cellen. Dat wil zeggen drie tot vier weken na het begin van de differentiatie, de morfologie, synapsin-1/2 expressie en elektrofysiologie van de neuronen kan worden beoordeeld. Op dat tijdstip, worden de iPSC-afgeleide neuronen wordt naar een neuronale morfologie vertonen, te MAP2, synapsine / PSD-95 positief bij het uitvoeren immunocytochemie zijn, en tentoonstellingent spontane elektrofysiologische activiteit (zowel in de single-cell en netwerkniveau).

We wijzigen en implementeren van een eerder gepubliceerd protocol beschrijft de snelle, reproduceerbare en efficiënte differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) in prikkelende corticale neuronen 12. Specifiek onze modificatie maakt regeling van neuronale celdichtheid en gebruik op micro-electrode arrays elektrofysiologische eigenschappen op netwerkniveau meten.

Rapid neuronale differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het meten van het netwerk activiteit op micro-electrode arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Het algemene doel van dit neuronale differentiatieprotocol is om neuronale netwerken te genereren van de menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen die op micro-elektrode-arrays groeien op een snelle en gecontroleerde manier. Deze methode kan worden gebruikt om kernvragen in de neurowetenschapsvelden aan te pakken. Het kan worden gebruikt om biologische mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan neurologische stoornissen, maar het kan ook worden gebruikt om meer fundamentele neurobiologische vragen te beantwoorden.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de snelle differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen in neuronen op een gecontroleerde manier. Op dag één, warm DMEM/F12, CDS en E8-medium met 1% penicilline-streptomycine op tot kamertemperatuur. Voeg vervolgens doxycycline toe aan E8-medium om een ​​uiteindelijke concentratie van vier microgram per milliliter te maken en voeg vervolgens rock-remmer toe aan het mengsel.Aspireer het gebruikte medium van de RTTANGN2 positieve hiPSC's en voeg een milliliter CDS toe aan de cellen. Incubeer vervolgens de cellen gedurende drie tot vijf minuten in een bevochtigde 37 graden Celsius incubator. Controleer onder de microscoop of de cellen zich losmaken van elkaar.Voeg vervolgens twee milliliter DMEM/F12 toe in de put. Suspeneer de cellen voorzichtig met een 1.000 microliter pipette en breng ze over naar een 15 milliliter buis. Voeg vervolgens zeven milliliter DMEM/F12 toe aan de celsuspensie en centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 200 x g.Na vijf minuten aspireer het supernatant en voeg twee milliliter van het bereide E8-medium toe. Dissocieer hiPSC's door de punt van een 1.000 microliter pipette tegen de zijkant van de 15 milliliter buis te plaatsen en de cellen voorzichtig te resuspenderen. Controleer onder de microscoop of de cellen gedissocieerd zijn.Bepaal vervolgens het aantal cellen per milliliter met behulp van een hemocytometer. Voor de zes wel MEA's, verdun de cellen om een ​​celsuspensie van 7,5 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter te verkrijgen. Voor de dekglasjes, verdun de cellen om een ​​celsuspensie van vier keer 10 tot de vierde cellen per milliliter te verkrijgen.Aspireer de verdunde laminine van de dekglasjes en de zes wel MEA's. Voor de zes wel MEA's, plateer de cellen door 100 microliter celsuspensie toe te voegen aan het actieve elektrodegebied in elke put. Plateer vervolgens de cellen door 500 microliter celsuspensie toe te voegen aan elke put van de 24 wel plaat.Plaats vervolgens de zes wel MEA's of de 24 wel plaat in een bevochtigde 37 graden Celsius incubator. Voeg na twee uur voorzichtig 500 microliter van het bereide E8-medium toe aan elke put van de zes wel MEA's. Plaats vervolgens de zes wel MEA's een nacht in een bevochtigde 37 graden Celsius incubator.Op dag drie, warm 0,05% Trypsin-EDTA op tot kamertemperatuur. Warm DPBS en DMEM/F12 met 1% penicilline-streptomycine op tot 37 graden Celsius. Aspireer vervolgens het gebruikte medium van de ratten-astrocytcultuur.Was de cultuur door vijf milliliter DPBS toe te voegen en zwaai het voorzichtig rond. Aspireer vervolgens DPBS en voeg vijf milliliter 0,05% trypsin-EDTA toe. Zwaai de trypsin-EDTA voorzichtig rond.Incubeer vervolgens de cellen in een bevochtigde 37 graden Celsius incubator gedurende vijf tot tien minuten. Controleer vervolgens onder de microscoop om te onderzoeken of de cellen loslaten. Los de laatste cellen op door de fles een paar keer te slaan.Voeg vervolgens vijf milliliter DMEM/F12 toe aan de fles. Probeer de cellen voorzichtig in de fles te raten met een 10 milliliter pipette. Verzamel vervolgens de celsuspensie in een 15 milliliter buis.Centrifugeer de buis gedurende acht minuten bij 200 x g. Aspireer vervolgens het supernatant en resuspendeer de cellen in één milliliter DMEM/F12. Bepaal het aantal cellen per milliliter met behulp van een hemocytometer.Voeg vervolgens 7,5 keer 10 tot de vierde astrocyten toe aan elke put van de zes wel MEA's. En voeg twee keer 10 tot de vierde astrocyten toe aan elke put van de 24 wel plaat. Incubeer de cellen een nacht in een bevochtigde 37 graden Celsius incubator.Verkrijg de gegevens met 1.200 keer versterking en sample het signaal bij 10 kilohertz met behulp van de MCS data-acquisitiekaart. Neem 20 minuten van elektrofysiologische activiteit op van hiPSC-afgeleide neuronen gekweekt op MEA's. Houd tijdens de opname de temperatuur op 37 graden Celsius en voorkom mediumverdamping en pH-veranderingen door een constante langzame stroom bevochtigd gas op de MEA's te leveren.Analyseer vervolgens de gegevens met behulp van een aangepast softwarepakket. Deze figuur toont de expressieveranderingen van neuronale markers MAP2 in synapsine tijdens het differentiatieproces, wat aangeeft dat neuronale maturatie plaatsvindt. Deze grafiek toont dat synapsine-expressie gemeten voor individuele cellen toeneemt tijdens het differentiatieproces.De synapsine die in de cellen tot expressie wordt gebracht na drie weken differentiatie, co-lokaliseerde met PSD-95, wat wijst op de aanwezigheid van functionele synapsen. Hier werd whole cell patch clamp uitgevoerd op verschillende tijdstippen tijdens het differentiatieproces om de elektrofysiologische activiteit van de cellen te meten. De cellen waren in staat om actiepotentialen te genereren op de verschillende tijdstippen.En het percentage spikkende cellen nam in de loop van de tijd toe, wat aantoont dat de meeste cellen in staat zijn om actiepotentialen te genereren, zelfs in de vroege fase van differentiatie. Patch clamp werd ook gebruikt om de excitatoire postsynaptische stromingen te meten die door de cellen worden ontvangen. Het aantal inputs dat de cellen ontvangen, nam toe tijdens het differentiatieproces.Zowel de frequentie als de amplitude van de excitatoire posts

rapid-neuronal-differentiation-induced-pluripotent-stem-cells-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

This video demonstrates the development of a 3D neuronal culture coupled to a planar microelectrode array with hippocampal neurons. The isolated neurons form a 2D network on the microelectrode array's active area and adhere to glass microbeads in a multi-well plate with a membrane insert. Upon transferring these neuron-coated microbeads to the electrode, they organize into an interconnected 3D neural network.

Building Three-Dimensional Neuronal Networks Coupled to Micro-Electrode Arrays

The video demonstrates a method for generating excitatory cortical neurons from human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Upon doxycycline induction, the hiPSCs overexpress neurogenin-2, a neural-specific transcription factor. By using specific media and co-culturing with astrocytes, this process facilitates the hiPSCs' differentiation into neurons with synaptic connections.

Differentiating Human Induced Pluripotent Stem Cells into Neurons on Micro-Electrode Arrays

The video demonstrates how to use a microelectrode array (MEA) to record the electrophysiological activity of neurons derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Electrophysiological activity from a multiwell MEA containing a neuron-astrocyte co-culture is recorded to detect action potentials from multiple neurons in the network, confirming the successful differentiation of hiPSCs into neurons.

Measuring the Electrophysiological Activity of Neuronal Networks Using Micro-Electrode Arrays

Dit manuscript beschrijft een protocol om te groeien in vitro modulaire netwerken bestaande uit ruimtelijk beperkt, functioneel met elkaar verbonden neuronale circuits. Een polymere masker wordt gebruikt voor het patroon van een eiwit laag om cellulaire adhesie op het kweken substraat te bevorderen. Plated neuronen groeien op gecoat gebieden oprichting spontane verbindingen en vertonen elektrofysiologische activiteit.

Ontwerp, oppervlaktebehandeling, Cellular Plating, en het kweken van Modulair neuronale netwerken Samengesteld uit Functioneel Inter-verbonden Circuits

Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) worden beschouwd als een krachtig instrument voor drugs- en chemische screening en voor de ontwikkeling van nieuwe in vitro modellen voor toxiciteitsonderzoek, inclusief neurotoxiciteit. Hier wordt een gedetailleerd protocol voor de differentiatie van hiPSCs in neuronen en glia beschreven.

Protocol voor de differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in gemengde culturen van neuronen en glia voor het testen van neurotoxiciteit

Muisneuronale cellen die op multi-elektrode arrays worden gekweekt, tonen een toename van de respons na elektrische stimulatie. Dit protocol demonstreert hoe u neuronen kunt cultiveren, hoe u activiteiten opneemt en hoe u een protocol kunt opstellen om de netwerken op te leiden om te reageren op stimuleringspatronen.

Tijdafhankelijke toename in het netwerkrespons bij de stimulatie van neuronale celculturen op micro-elektrode arrays

Dit protocol demonstreert het gebruik van gecompartimenteerde microfluïdische chips, injectie gegoten in een cyclisch olefine copolymeer aan gekweekte neuronen die worden onderscheiden van menselijke stamcellen. Deze chips zijn voorgeassembleerd en gemakkelijker te gebruiken dan traditionele gecompartimentaliseerde poly (dimethylsiloxaan) apparaten. Meerdere gemeenschappelijke experimentele paradigma's worden hier beschreven, met inbegrip van virale labeling, fluidic isolatie, axotomie, en...

Compartimenlise ring van menselijke stamcel-afgeleide neuronen in voorgemonteerde kunststof Microfluïdische chips

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde procedure voor het resuspenderen en kweken van menselijke stamcel afgeleide neuronen die eerder werden onderscheiden van neurale voorlopercellen in vitro voor meerdere weken. De procedure vergemakkelijkt op beeld gebaseerde assays van neurites, synapsen, en laat-uitdrukken neuronale markers in een formaat dat compatibel is met lichte microscopie en High-content screening.

Na differentiatie Herbeplating van menselijke pluripotente stamcel afkomstige neuronen voor het screenen van hoge inhoud van Neuritogenese en Synapse rijping

Dit artikel bevat een set van protocollen voor de ontwikkeling van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hartspier (hipsc-cm) netwerken gekweekt op multi well mea platen om reversibel elektroporate de celmembraan voor actie potentiële metingen. Opnamen met hoge doorvoer worden via dezelfde cellocaties herhaaldelijk over dagen verkregen.

Humane iPSC-afgeleide cardiomyocyte netwerken op multi well micro-elektrode arrays voor terugkerende actie potentiële opnames

We beschrijven een methode voor het differentiëren van door het ruggenmerg geïnduceerde pluripotent-afgeleide astrocyten en neuronen en hun co-cultuur voor elektrofysiologische registratie.

Oprichting van een elektrofysiologisch platform voor het modelleren van ALS met regionaal specifieke menselijke pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten en neuronen

Dit protocol heeft tot doel dorsaal-ventrale gefuseerde assembloids stabiel te plaatsen op multi-elektrode-arrays voor het modelleren van epilepsie in vitro.

Een multi-elektrode array platform voor het modelleren van epilepsie met behulp van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide hersenassemboïden

Leer hoe je hiPSCs snel differentieert naar neuronen voor elektrofysiologische metingen op micro-elektrode arrays. Deze methode maakt gecontroleerde netwerkvorming mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Rapid neuronale differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het meten van het netwerk activiteit op micro-electrode arrays (Video) | JoVE Journal

Rapid neuronale differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het meten van het netwerk activiteit op micro-electrode arrays

Meer video's verkennen