Een protocol voor het gebruik van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensors te meten mechanische krachten over de Nuclear LINC Complex

Het algemene doel van deze procedure is om krachten op de linker van het nucleoskelet cytoskelet, of LINC-complex, te bepalen door middel van FRET-microscopie in levende cellen via een biosensor die is ontworpen voor het LINC-complex eiwit, nesprin-2G. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutel vragen op het gebied van mechanotransductie, zoals de krachten die op eiwitten in de kern van levende cellen worden uitgeoefend, en hoe deze krachten veranderen onder verschillende omstandigheden. Het grote voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om zeer kleine krachten op eiwitten en levende cellen te meten.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode problemen ondervinden bij het vastleggen van beelden. Het optimaliseren van de laservermogen en versterking van de microscoop om een goed signaal tussen alle experimentele groepen te ontvangen is moeilijk. Om te beginnen, laat NIH 3T3 vezelblastcellen groeien tot tussen 70% en 90% confluentie in een zes-puts celkweekschaal in een standaard celkweekincubator met temperatuur- en CO2-regeling.

In een celkweekhood, verwijder het medium en spoel elke put met ongeveer 1 milliliter van een gereduceerd serumcelmedium. Voeg 800 microliters van gereduceerd serumcelmedium toe aan elke put, en plaats de zes-putskamerde in de incubator. Pipet vervolgens 700 microliters van gereduceerd serumcelmedium in een 1,5 milliliter buis gelabeld met L met 35 microliters van lipidedraagvloeistofoplossing om de lipo mix te vormen.

Meng de suspensie door te pipetteren. Pipet vervolgens 100 microliters van het gereduceerde serumcelmedium in elk van de zes 1,5 milliliter buizen gelabeld van één tot zes. Pipet het plasma DNA voor nesprin spanningssensor, nesprin headless nulkrachtcontrole, mTFP1, en venus in buizen één tot zes, zoals beschreven in het tekstprotocol.

Gebruik geen herbruikbare pipettepunten bij het pipetteren van verschillende soorten DNA. Pipet vervolgens 100 microliters van de lipo mix uit de L buis in elke gelabelde buis, en meng door herhaald pipetteren, met gebruik van een schone pipet voor elke buis. Incubeer de suspensie gedurende 10 tot 20 minuten.

Voeg vervolgens 200 microliters uit elke gelabelde buis toe aan een put van de voorbereide zes-putskamerde die cellen bevat. Label de bovenkant van elke put met het overeenkomstige DNA dat is toegevoegd. Plaats vervolgens de zes-putskamerde in een incubator gedurende vier tot zes uur.

Na incubatie, zuigt het medium af, en voeg een tot twee milliliter gereduceerd serumcelmedium toe om te spoelen. Zuig het gereduceerde serumcelmedium af, en voeg twee milliliter trypsine toe aan elke put voordat de zes-putsschaal in de incubator wordt geplaatst gedurende vijf tot vijftien minuten. Terwijl de cellen loslaten in de incubator, coat zes glasbodem bekijkschotels met een laag fibronectine bij een concentratie van 20 microgram per milliliter opgelost in fosfaatgebufferde zoutoplossing.

Laat de schotels het oppervlak coaten in de celkweekhood. Neutraliseer de trypsine door twee milliliter DMEM toe te voegen zodra de cellen loslaten. Breng vervolgens de inhoud van elke put over naar een gelabelde 15 milliliter centrifugebuis en centrifugeer deze gedurende vijf minuten bij 90 keer g in een draaiende rotor centrifuge.

Zuig het supernatant af en suspendeer elk celpellet opnieuw in 1.000 microliters DMEM met behulp van een pipet. Zuig het fibronectinemengsel uit de glazen schotels en pipet 1.000 microliters van elke celsuspensie op de schotels. Nadat de cellen zich op de bodem van de glazen schotels hebben gezet, voeg nog eens één milliliter medium toe aan elke put.

Laat de cellen zich aanhechten en de sensor gedurende ten minste 18 tot 24 uur in de cellenincubator tot expressie brengen. Om de transfectie-efficiëntie te verifiëren, gebruik een fluorescente microscoop uitgerust met een excitatiefrequentie dicht bij 462 nanometer voor mTFP1, of 525 nanometer voor venus. Gebruik een emissiefilter gecentreerd dicht bij 492 nanometer voor mTFP1, of 525 nanometer voor venus.

Ongeveer 18 tot 24 uur na het voltooien van de transfectie, gebruik een omgekeerde fluorescente microscoop om de efficiëntie van transfectie te onderzoeken door het aantal fluorescerende cellen te vergelijken met het totale aantal cellen in zicht. Als levende cellen niet binnen 48 uur na transfectie kunnen worden afgebeeld, fixeer de cellen in 4% paraformaldehyde gedurende vijf minuten. Laat cellen de sensor gedurende 24 tot 48 uur tot expressie brengen voordat ze worden gefixeerd.

Bewaar de cellen in PBS en bekijk na 48 uur. In een celkweekhood, vervang het celmedium met beeldvormingsmedium gesupplementeerd met 10% foetaal bovien serum. Plaats de bekijkschotels op een temperatuur gecontroleerde confocale microscooptafel.

Plaats de glazen bekijkschotel met mTFP1 getransfecteerde cellen boven de olie objectief bij 60X vergroting met een numerieke apertuur van 1,4. Lokaliseer mTFP1-expresserende cellen in de wijdveld fluorescente modus. Met een fluorescerende cel in het gezichtsveld, selecteer de spectrale detectiemodus en vang het spectrale beeld op.

Neem alle frequenties voorbij 458 nanometer op met incrementen van 10 nanometer. Selecteer een helder fluorescerend gebied op de cel. Voeg de gemiddelde fluorescente ROI toe als de genormaliseerde intensiteit aan de spectrale database door op Opslaan Spectra naar Database te klikken.

Optimaliseer de laservermogen en versterking zodat een goede signaal-ruisverhouding wordt bereikt. Instellingen zullen variëren voor verschillende apparatuur. Herhaal het proces voor venus-expresserende cellen en blijf in spectrale modus.

Gebruik een excitatiefrequentie van 488 nanometer in plaats van 458 nanometer. Pas de vermogensinstellingen aan zoals nodig, maar verander de emissiefrequenties niet. Selecteer een helder fluorescerend ROI van ongeveer een straal van 20 pixels.

Voeg de gemiddelde fluorescente ROI toe als de genormaliseerde intensite