Name: Een protocol voor het gebruik van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensors te meten mechanische krachten over de Nuclear LINC Complex (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Leer hoe je FRET-microscopie gebruikt om mechanische krachten op het LINC-complex te meten in levende NIH 3T3-fibroblasten. Deze methode biedt inzicht in mechanotransductieprocessen op nucleair niveau.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Thomas F. en Kate Miller Jeffress Memoria Trust (DEC) en NIH-subsidie ​​R35GM119617 (DEC). De confocale microscoop beeldvorming werd uitgevoerd bij de VCU nanomaterialen karakterisering Core (NCC) Facility.

1. Haal Nesprin-2G Sensor DNA en andere Plasmid DNA <ol><li> Verkrijgen Nesprin-2G TS (spanningssensor), Nesprin-2G HL (headless) controle, mTFP1, venus en TSmod uit een commerciële bron. Propageren alle DNA- plasmiden en zuiveren ze met behulp van standaard E. coli-stammen, zoals DH5-α, zoals eerder 12, 13 beschreven. </li></ol> 2. Transfecteren Cellen met Nesprin-2G en andere Plasmide DNA <ol><li> Groeien NIH 3T3 fibroblastcellen tot 70-90% confluentie in 6-well celcultuur schotel in een standaard celkweek incubator met temperatuur (37 ° C) en CO2 (5%) regulering. Voor het celkweekmedium gebruikt Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum. </li><li> In een celkweek kap Verwijder het medium en spoel elk putje met ongeveer 1 ml van een verlaagde serum celmedium. Voeg 800 ul van verlaagde serum cel medium aan elk putjeen plaats de 6-well kamer in de incubator. </li><li> Pipetteer 700 ul van verlaagde serum-celmedium in een 1,5 ml buis met 35 pl lipide drageroplossing van &quot;lipomix&quot; vormen. Meng door pipetteren. Label de buis met een &quot;L&quot; </li><li> Verzamel zes 1,5 ml buisjes en labelen van 1 tot 6. Pipetteer 100 ul van verlaagde serum-celmedium in elke buis. <ol><li> Met het plasmide-DNA-concentratie van stap 1, pipet 2 ug Nesprin 2G-TS in buizen 1 en 2. Pipetteer 2 ug Nesprin-HL in buisjes 3 en 4. Pipetteer 1 ug mTFP in buis 5. Pipetteer 1 ug mVenus in de buis 6. niet hergebruiken pipet tips bij het pipetteren verschillende soorten DNA. </li></ol></li><li> Pipetteer 100 ul van de lipomix van de &quot;L&quot; buis in elk gemerkt buis (1-6) en meng door herhaald pipetteren. Met een schone pipet voor elke buis. Incubeer gedurende 10-20 min. </li><li> Voeg 200 pi van elk gemerkt buis een putje in 6-well kamer met 70-90% confluentcellen. Label de top van elk putje met de bijbehorende DNA toegevoegd. Plaats de 6-well kamer in een incubator gedurende 4-6 uur. </li><li> Zuig het medium en voeg 1-2 ml gereduceerd-serum celmedium te spoelen. Zuig het verminderde serum-celmedium, voeg 2 ml trypsine aan elk putje en plaats de 6 putjes in de incubator (5-15 min). </li><li> Terwijl de cellen los in de incubator, laag 6 glazen bodem weergave gerechten met een laag van fibronectine in een concentratie van 20 ug / ml opgelost in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Laat de gerechten het bekleden van het oppervlak in de celkweek kap (ongeveer 20 min). </li><li> Neutraliseer de trypsine door toevoeging van 2 ml DMEM wanneer de cellen worden losgemaakt. </li><li> De inhoud van elk putje een label 15 ml centrifugebuis en spin neer op 90 g gedurende 5 minuten in een swinging rotor centrifuge. Zuig het supernatant en resuspendeer elke cel pellet in 1000 pi DMEM pipet mengen. </li><li> Zuig het fibronectine mengsel vanglazen schalen en pipetteer 1000 pi van elke celsuspensie op de glazen schalen. </li><li> Nadat de cellen naar de bodem van de glazen schalen (~ 15 minuten), voeg nog 1 ml DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep aan elk putje en plaats in de celincubator. De cellen te laten hechten en een automatische sensor voor ten minste 18-24 uur. OPMERKING: Cellen worden getransfecteerd met gebruikmaking van commerciële kationische lipiden transfectie reagens (zie de Tabel Materials). Als alternatief kunnen stabiele cellijnen worden geselecteerd met een plasmide met een gen dat resistentie tegen een toxine (het pcDNA plasmiden voor Nesprin-TS en -HL zijn op een DNA repository website (zie tabel of Materials) leveren cellen die geneticineresistentie ). Daarnaast kunnen virale infectie methoden (lentivirus, retrovirus of adenovirus) worden gebruikt om de sensor in cellen die moeilijk te transfecteren drukken. </li><li> Naast Nesprin-TS, transfecteren aanvullende cellen met de Nesprin HL nul voorce controle, zoals beschreven in stap 2,1-2,12; TSmod kan ook worden gebruikt als een nul-krachtregeling en moeten vergelijkbaar FRET vertonen Nesprin-HL. </li><li> Transfecteren cellen met mTFP1 en Venus spectrale fingerprints (zie stap 4) te genereren. OPMERKING: mTFP1 en venus gewoonlijk tot expressie op hogere niveaus dan Nesprin-TS, en als zodanig, kunnen kleinere hoeveelheden DNA moeten worden getransfecteerd vergelijkbare expressieniveaus te bereiken. </li></ol> 3. Controleer Transfectie efficiëntie <ol><li> Ongeveer 18-24 uur na afloop van de transfectie gebruikt een omgekeerde fluorescentiemicroscoop om de efficiëntie van transfectie onderzocht door het aantal fluorescerende cellen in vergelijking met het totale aantal cellen gezien (gewoonlijk 5-30%). <ol><li> Gebruik een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een excitatie frequentie nabij 462 nm (mTFP1) of 525 nm (venus) en een emissie filter gecentreerd nabij 492 nm (mTFP1) of 525 nm (venus). OPMERKING: U zal GFP filter sets een combinatie van mTFP1 vangen en venus emissies en zal de bevestiging van de transfectie-efficiëntie mogelijk te maken. </li></ol></li><li> Afbeelding levende cellen binnen 48 uur na transfectie. <ol><li> Alternatief fix cellen in 4% paraformaldehyde (in PBS met calcium en magnesium) gedurende 5 minuten bewaren in PBS en bekijken na 48 uur 8. OPMERKING: Beyond 48 h, de signaalkwaliteit en kracht vergaat. Het bevestigen van de cellen behouden hun toestand, met inbegrip van de FRET uitgedrukt 8; evenwel moeten de cellen alleen afgebeeld in PBS, als fixeermiddel FRET 14 kunnen beïnvloeden. Gefixeerde cellen kan alleen vergeleken met andere gefixeerde cellen, omdat er een verandering in expressie kan worden. Let op: Paraformaldehyde is giftig. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM). </li></ol></li></ol> 4. Capture Spectral Fingerprints of mTFP1 en Venus Fluoroforen voor de spectrale componenten voor elke pixel <ol><li> In een celcultuur kap, vervangt de cel medium met imaging medium (HEPES-buffer) aangevuld met 10% foetaal runderserum. </li><li> Leg het zichtbare schotels in een temperatuurgecontroleerde (37 ° C) confocale microscoop podium. </li><li> Plaats de glazen schaaltje met bezichtiging mTFP1 getransfecteerde cellen via olie doelstelling op 60X vergroting met een numerieke apertuur van 1,4. OPMERKING: De olie wordt gebruikt op een laserscanning microscoop op de 60X objectief nauw lijken op de brekingsindex van het glazen substraat. De olie wordt bovenop de objectieflens en komt in direct contact met het glas dekglaasje. </li><li> Lokaliseren mTFP1 expressie brengende cellen met 458 nm excitatie bron en een emissie banddoorlaatfilter gecentreerd bij 500 nm. </li><li> Met een fluorescerende cel in het gezichtsveld, selecteert de spectrale detectiemodus ( &quot;Lambda Mode&quot; in de software gebruikt) en vastleggen van de spectraal beeld (figuur 3-1); inclusief alle frequenties boven 458 nm met gebruikmaking van 10 nm stappen (figuur 3-3). Kies een heldere tlent gebied (ROI) van de cel (20 pixelradius). LET OP: De spectrale vorm van de mTFP1 expressie ROI moet relatief constant over de cel blijven. Als de vorm aanzienlijk varieert, past de laser en versterkingsinstellingen de signaal-ruisverhouding te verbeteren. </li><li> Voeg de fluorescerende ROI betekenen, genormaliseerde intensiteit van de spectrale-database door te klikken op &quot;save spectra database.&quot; </li><li> Optimaliseer het laservermogen en krijgen zodanig dat een goede signaal-ruisverhouding wordt bereikt. Instellingen zal variëren voor verschillende apparatuur. Met niet-fluorescerende, niet-getransfecteerde cellen als achtergrondinformatie, verhoging van de versterking en energie tot de cellen zijn helder, maar niet buiten het dynamisch bereik van de detector (verzadigingspunt). Achtergrondcellen niet detecteerbare fluorescentie na middeling. </li><li> Herhaal dit proces voor het venus-getransfecteerde cellen met de volgende uitzonderingen: <ol><li> Waarborgen dat de excitatiefrequentie wordt bij 515 nm en dat het banddoorlaatfilter is centered nabij 530 nm bij het lokaliseren venus tot expressie brengende cellen. </li><li> In &quot;Spectral Mode&quot; gebruikt een excitatiefrequentie van 515 nm in plaats van 458 nm. </li></ol></li></ol> 5. Capture Unmixed Images <ol><li> Schakel de opnamefunctie op &quot;Spectral componenten voor elke pixel.&quot; </li><li> Voeg de spectrale fingerprints van Venus en mTFP1 in de ontmenging kanalen (figuur 3, Arrow-2). </li><li> Stel de excitatielaser naar een 458 nm argon bron. </li><li> Plaats de Nesprin-TS bekijken schotel boven de olie objectief 60X. </li><li> Scherp op een fluorescerende cel met voldoende heldere expressie, de versterking aanpassen laservermogen en de signaal-ruisverhouding te optimaliseren. Opmerking: omdat de efficiëntie van FRET Nesprin-TS nabij 20%, zou het de ongemengde venus hoofdzaak dimmer beeld onvermengde mTFP1 zijn dan. Zodra een aanvaardbare kracht en gain-instelling zijn iteratief is vastgesteld, moeten deze parameters constant voor alle beelden capt blijvenreerd. </li><li> Vang minimaal 15-20 afbeeldingen Nesprin TS-cellen met relatief even helder en vermijd buitensporige pixel verzadiging (alle verzadigde pixels worden verwijderd tijdens beeldverwerking). </li><li> Herhaal beeldvastlegbewerking met Nesprin HL-cellen onder toepassing identieke beeldvormingsparameters. </li></ol> 6. Beeldverwerking en Ratio beeldanalyse <ol><li> Het gebruik van open-source ImageJ (Fiji) software (http://fiji.sc/), open eigen formaat beelden met behulp van BioFormats Reader. </li><li> Voorbewerking van de beelden en het berekenen verhoudingsafbeeldingen toepassing van eerder vastgestelde protocollen 15. </li></ol>

<ol><li>Conway, D. E., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+cellular+mechanotransduction+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis.</a> J Cell Sci. 126, Pt 22 5101-5109 (2013).</li>
<li>Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin-2G%2C+a+Component+of+the+Nuclear+LINC+Complex%2C+Is+Subject+to+Myosin-Dependent+Tension%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension.</a> Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).</li>
<li>Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li>
<li>Austen, K., Ringer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+rigidity+sensing+by+talin+isoform-specific+mechanical+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages.</a> Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).</li>
<li>Meng, F., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dynamic+cytoplasmic+forces+with+a+compliance-matched+FRET+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor.</a> J Cell Sci. 124, Pt 2 261-269 (2011).</li>
<li>Borghi, N., Sorokina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+is+under+constitutive+actomyosin-generated+tension+that+is+increased+at+cell-cell+contacts+upon+externally+applied+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).</li>
<li>Cai, D., Chen, S. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Feedback+through+E-Cadherin+Promotes+Direction+Sensing+during+Collective+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration.</a> Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).</li>
<li>Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+Shear+Stress+on+Endothelial+Cells+Modulates+Mechanical+Tension+across+VE-Cadherin+and+PECAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Bio+CB%22%5BJournal%5D)">Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1.</a> Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).</li>
<li>Brenner, M. D., Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+Silk+Peptide+Is+a+Compact%2C+Linear+Nanospring+Ideal+for+Intracellular+Tension+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing.</a> Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).</li>
<li>Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/282499670_Controlling_Cell_Geometry_Affects_the_Spatial_Distribution_of_Load_Across_Vinculin">Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin.</a> Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).</li>
<li>Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+molecular+interactions+of+linker+of+nucleoskeleton+and+cytoskeleton+%28LINC%29+complex+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins.</a> J Cell Sci. 122, Pt 22 4099-4108 (2009).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> J Vis Exp. (6), e247(2007).</li>
<li>Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation%2C+mounting+and+sealing+with+nail+polish+of+cell+specimens+lead+to+incorrect+FRET+measurements+using+acceptor+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching.</a> Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).</li>
<li>Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+activity+in+live+embryos+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).</li>
<li>Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+and+deformation+of+the+nucleus+in+micropipette+aspiration+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment.</a> J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).</li>
<li>Wang, N., Naruse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+behavior+in+living+cells+consistent+with+the+tensegrity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).</li>
<li>Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+fibers+stabilize+the+position+of+intranuclear+DNA+through+mechanical+connection+with+the+nucleus+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells.</a> FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).</li>
<li>Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+arrays+of+nuclear+envelope+proteins+harness+retrograde+actin+flow+for+nuclear+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement.</a> Science. 329 (5994), New York, N.Y. 956-959 (2010).</li>
<li>Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spectral+FRET+imaging+microscopy+for+monitoring+nuclear+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions.</a> J Microsc. 228, Pt 2 139-152 (2007).</li>
<li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction%2C+imaging%2C+and+analysis+of+FRET-based+tension+sensors+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells.</a> Methods Cell Biol. , (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Werkwijze en demonstratie van live cell imaging van mechanische spanning in Nesprin-2G, een eiwit in de kern LINC complex werd hierboven beschreven. Voorafgaand aan dit werk verschillende technieken, zoals micropipet aspiratie, magnetische-kraal cytometrie en microscopische laser-ablatie, gebruikt om spanning toe te passen op de celkern en de bulk materiaaleigenschappen 16, 17, 18 te meten. Echter, tot onze recente...

Kracht-gevoelige, zijn genetisch gecodeerde FRET sensoren recentelijk naar voren gekomen als een belangrijk instrument voor het meten van treksterkte gebaseerde krachten in levende cellen, inzicht in hoe mechanische krachten in eiwitten 1, 2, 3, 4 aangebracht. Met deze tools, kunnen onderzoekers het niet-invasief intracellulaire krachten in levende cellen met behulp van conventionele tl-microscopen. Deze sensoren bestaan uit een FRET-paar (donor en acceptor fluorescerende eiwitten, meestal een blauwe donor en acceptor geel) gescheiden door een elastisch peptide 3. In tegenstelling tot de C- of N-terminale tagging, wordt deze sensor ingebracht in een interne plaats van een eiwit om de mechanische kracht overgebracht in het eiwit te meten, gedraagt ​​als een moleculaire spanningsmeter. Verhoogde mechanische spanning over de sensor resulteert in een grotere afstand tussen de FRET-plucht, wat resulteert in verminderde FRET 3. Hierdoor wordt de FRET omgekeerd evenredig met trekkracht. Deze fluorescerende gebaseerde sensoren zijn ontwikkeld voor focale adhesie-eiwitten (vinculin 3 en talin 4), cytoskeletproteïnen (α-actinine 5) en cel- junction eiwitten (E-Cadherine 6, 7, VE-cadherine 8 en PECAM 8). De meest gebruikte en goed gekarakteriseerde elastische linker in deze biosensoren heet TSmod en bestaat uit een herhaalde sequentie van 40 aminozuren, (GPGGA) 8, die was afgeleid van de spin zijdeproteïne flagelliform. TSmod is aangetoond gedragen als een lineaire elastische nano-veer, met FRET reactiviteit op 1-5 pN trekkracht 3. Verschillende lengten flagelliform kan worden gebruikt om de dynamische r wijzigenange van TSmod FRET-force gevoeligheid 9. Naast flagelliform, spectrine herhalingen 5 en villin kopstuk peptide (bekend als HP35) 4 werden gebruikt als elastisch peptiden tussen FRET-paren soortgelijke werking biosensoren 4. Tot slot, een recent rapport bleek dat TSmod ook kan worden gebruikt om drukkrachten 10 detecteren. We hebben onlangs een krachtsensor de linker van de nucleo-cytoskelet (LINC) complex eiwit Nesprin2G ontwikkeld door TSmod ingebracht in een eerder ontwikkelde afgeknot eiwit Nesprin2G zogenaamde mini-Nesprin2G (figuur 2C), die eveneens gedraagt endogene Nesprin-2G 11. LINC complex bevat meerdere eiwitten die leiden vanaf de buitenzijde naar de binnenzijde van de kern, die de cytoplasmatische cytoskelet de nucleaire lamina. Nesprin-2G is een structureel eiwit bindt aan zowel deactine cytoskelet in het cytoplasma en SUN eiwitten in de perinucleaire ruimte. Met behulp van onze biosensor, waren we in staat om aan te tonen dat Nesprin-2G is onderworpen aan actomyosine-afhankelijke spanning in NIH3T3 fibroblasten 2. Dit was de eerste keer dat kracht werd direct gemeten over een eiwit in de nucleaire LINC complex, en het is waarschijnlijk een belangrijk instrument om de rol van kracht op de kern in Mechanobiology begrijpen geworden. Onderstaande protocol geeft een gedetailleerde methodologie van de Nesprin-2G krachtsensor gebruiken en het uiten van de Nesprin spanningssensor (Nesprin-TS) in zoogdiercellen, en het verzamelen en analyseren van FRET afbeeldingen cellen die Nesprin- TS. Behulp van een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met een spectrale detector, een beschrijving van het gesensibiliseerde emissie gemeten FRET gebruikt spectrale ontmenging en ratiometrische FRET beeldvorming verschaft. De output ratiometrische beelden kunnen worden gebruikt om de relatieve qua makenntitative kracht vergelijkingen. Hoewel dit protocol is gericht op de expressie van Nesprin-TS in fibroblasten is gemakkelijk aan andere zoogdiercellen, waaronder beide cellijnen en primaire cellen. Bovendien kan dit protocol als het gaat om beeldacquisitie en FRET analyse gemakkelijk worden aangepast aan andere FRET-gebaseerde biosensoren kracht die zijn ontwikkeld voor andere eiwitten.

<table><tbody><tr><td>Nesprin-TS DNA</td><td>Addgene</td><td>68127</td><td>Retrieve from https://www.addgene.org/68127/</td></tr><tr><td>Nesprin-HL DNA</td><td>Addgene</td><td>68128</td><td>Retrieve from https://www.addgene.org/68128/</td></tr><tr><td>mTFP1 DNA</td><td>Addgene</td><td>54613</td><td>Retrieve from https://www.addgene.org/54613/</td></tr><tr><td>mVenus DNA</td><td>Addgene</td><td>27793</td><td>Retrieve from https://www.addgene.org/27793/</td></tr><tr><td>TSmod DNA</td><td>Addgene</td><td>26021</td><td>Retrieve from https://www.addgene.org/26021/</td></tr><tr><td>Competent Cells</td><td>Bioline</td><td>BIO-85026</td><td></td></tr><tr><td>Liquid LB Media</td><td>ThermoFisher</td><td>10855001</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001</td></tr><tr><td>Solid LB Bacterial Culture Plates</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5667</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&amp;region=US</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Biorad</td><td>273 BR 07335</td><td>SmartSpec Plus</td></tr><tr><td>quartz cuvette</td><td>Biorad</td><td>1702504</td><td>Cuvette for SmartSpec Plus</td></tr><tr><td>DNA isolation kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740412.5</td><td>NucleoBond Xtra Midi Plus</td></tr><tr><td>6-well cell culture dish</td><td>Falcon-Corning</td><td>353046</td><td>Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>DMEM(1x)</td></tr><tr><td>Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16170-078</td><td></td></tr><tr><td>reduced serum cell media</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Reduced Serum Medium, "optimem"</td></tr><tr><td>Lipid Carrier Solution</td><td>invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000"</td></tr><tr><td>1.5 mL sterile plastic tube</td><td>Denville</td><td>c2170</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td></tr><tr><td>glass-bottom microscope viewing dish</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>ThermoFisher</td><td>33016015</td><td>fibronectin human protein, plasma</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td></tr><tr><td>15 mL sterile centrifuge tube</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>swinging rotor centrifuge&nbsp;</td><td>Thermo electron</td><td>Centra CL2</td><td>Swinging rotor thermo electron 236</td></tr><tr><td>cell culture biosafety hood</td><td>Forma Scientific</td><td>1284</td><td></td></tr><tr><td>climate controlled cell culture incubator</td><td>ThermoFisher</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>inverted LED widefield fluorescent microscope</td><td>Life technologies</td><td>EVOS FL</td><td></td></tr><tr><td>Clear HEPES buffered imaging media</td><td>Molecular Probes</td><td>A14291DJ</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine Serum</td><td>Life technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>&nbsp;LSM 710-w/spectral META detector</td><td></td></tr><tr><td>Outgrowth Media</td><td>Newengland Biolabs</td><td>B9020s</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 Fibroblasts</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr></tbody></table>

een protocol voor het gebruik van förster resonance energy transfer (fret) -force biosensors te meten mechanische krachten over de nuclear linc complex

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

Het LINC-complex wordt verondersteld de cruciale structuur te zijn die de overdracht van mechanische krachten van het cytoskelet naar de kern medieert. Nesprin-2G is een belangrijk onderdeel van het LINC-complex dat het actine-cytoskelet verbindt met membraaneiwitten (SUN-domeineiwitten) in de perinucleaire ruimte. Deze membraaneiwitten verbinden zich met laminen in de kern. Onlangs werd een Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-krachtsonde gekloond in mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (trekkingssensor)) en gebruikt om spanning over Nesprin-2G in levende NIH3T3-fibroblasten te meten. Dit artikel beschrijft het proces van het gebruik van Nesprin-TS om LINC-complexkrachten in NIH3T3-fibroblasten te meten. Om FRET-informatie uit Nesprin-TS te extraheren, wordt ook een overzicht gegeven van hoe ruwe spectrale beelden spectraal ontmengd kunnen worden in acceptor- en donorfluorescentiekanalen. Met behulp van open-source software (ImageJ) worden beelden voorverwerkt en omgezet in ratiometrische beelden. Ten slotte worden FRET-gegevens van Nesprin-TS gepresenteerd, samen met strategieën om gegevens te vergelijken tussen verschillende experimentele groepen.

Volgens het protocol dat hierboven werd plasmide-DNA verkregen uit de DNA-gegevensbank en getransformeerd in E. coli-cellen. E. coli tot expressie sensor DNA werden geselecteerd uit LB / ampicilline-platen en geamplificeerd in vloeibaar LB-bouillon. Na de amplificatie van de vectoren werden DNA plasmiden gezuiverd in Tris-EDTA-buffer met een standaard, commercieel verkrijgbare DNA isolatie kit. Met behulp van een spectrofotometer werd gezuiverd DNA gekwantificeerd in ee...

Er is onlangs een aantal FRET-gebaseerde krachtbiosensoren ontwikkeld, waardoor de proteïne-specifieke resolutie van intracellulaire kracht mogelijk is. In dit protocol laten we zien hoe een van deze sensoren, ontworpen voor de linker van het nucleoskelet-cytoskelet (LINC) complex-eiwit Nesprin-2G kan worden gebruikt om actomyosinekrachten op het nucleaire LINC-complex te meten.

Een protocol voor het gebruik van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensors te meten mechanische krachten over de Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Het algemene doel van deze procedure is om krachten op de linker van het nucleoskelet cytoskelet, of LINC-complex, te bepalen door middel van FRET-microscopie in levende cellen via een biosensor die is ontworpen voor het LINC-complex eiwit, nesprin-2G. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutel vragen op het gebied van mechanotransductie, zoals de krachten die op eiwitten in de kern van levende cellen worden uitgeoefend, en hoe deze krachten veranderen onder verschillende omstandigheden. Het grote voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om zeer kleine krachten op eiwitten en levende cellen te meten.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode problemen ondervinden bij het vastleggen van beelden. Het optimaliseren van de laservermogen en versterking van de microscoop om een goed signaal tussen alle experimentele groepen te ontvangen is moeilijk. Om te beginnen, laat NIH 3T3 vezelblastcellen groeien tot tussen 70% en 90% confluentie in een zes-puts celkweekschaal in een standaard celkweekincubator met temperatuur- en CO2-regeling.In een celkweekhood, verwijder het medium en spoel elke put met ongeveer 1 milliliter van een gereduceerd serumcelmedium. Voeg 800 microliters van gereduceerd serumcelmedium toe aan elke put, en plaats de zes-putskamerde in de incubator. Pipet vervolgens 700 microliters van gereduceerd serumcelmedium in een 1,5 milliliter buis gelabeld met L met 35 microliters van lipidedraagvloeistofoplossing om de lipo mix te vormen.Meng de suspensie door te pipetteren. Pipet vervolgens 100 microliters van het gereduceerde serumcelmedium in elk van de zes 1,5 milliliter buizen gelabeld van één tot zes. Pipet het plasma DNA voor nesprin spanningssensor, nesprin headless nulkrachtcontrole, mTFP1, en venus in buizen één tot zes, zoals beschreven in het tekstprotocol.Gebruik geen herbruikbare pipettepunten bij het pipetteren van verschillende soorten DNA. Pipet vervolgens 100 microliters van de lipo mix uit de L buis in elke gelabelde buis, en meng door herhaald pipetteren, met gebruik van een schone pipet voor elke buis. Incubeer de suspensie gedurende 10 tot 20 minuten.Voeg vervolgens 200 microliters uit elke gelabelde buis toe aan een put van de voorbereide zes-putskamerde die cellen bevat. Label de bovenkant van elke put met het overeenkomstige DNA dat is toegevoegd. Plaats vervolgens de zes-putskamerde in een incubator gedurende vier tot zes uur.Na incubatie, zuigt het medium af, en voeg een tot twee milliliter gereduceerd serumcelmedium toe om te spoelen. Zuig het gereduceerde serumcelmedium af, en voeg twee milliliter trypsine toe aan elke put voordat de zes-putsschaal in de incubator wordt geplaatst gedurende vijf tot vijftien minuten. Terwijl de cellen loslaten in de incubator, coat zes glasbodem bekijkschotels met een laag fibronectine bij een concentratie van 20 microgram per milliliter opgelost in fosfaatgebufferde zoutoplossing.Laat de schotels het oppervlak coaten in de celkweekhood. Neutraliseer de trypsine door twee milliliter DMEM toe te voegen zodra de cellen loslaten. Breng vervolgens de inhoud van elke put over naar een gelabelde 15 milliliter centrifugebuis en centrifugeer deze gedurende vijf minuten bij 90 keer g in een draaiende rotor centrifuge.Zuig het supernatant af en suspendeer elk celpellet opnieuw in 1.000 microliters DMEM met behulp van een pipet. Zuig het fibronectinemengsel uit de glazen schotels en pipet 1.000 microliters van elke celsuspensie op de schotels. Nadat de cellen zich op de bodem van de glazen schotels hebben gezet, voeg nog eens één milliliter medium toe aan elke put.Laat de cellen zich aanhechten en de sensor gedurende ten minste 18 tot 24 uur in de cellenincubator tot expressie brengen. Om de transfectie-efficiëntie te verifiëren, gebruik een fluorescente microscoop uitgerust met een excitatiefrequentie dicht bij 462 nanometer voor mTFP1, of 525 nanometer voor venus. Gebruik een emissiefilter gecentreerd dicht bij 492 nanometer voor mTFP1, of 525 nanometer voor venus.Ongeveer 18 tot 24 uur na het voltooien van de transfectie, gebruik een omgekeerde fluorescente microscoop om de efficiëntie van transfectie te onderzoeken door het aantal fluorescerende cellen te vergelijken met het totale aantal cellen in zicht. Als levende cellen niet binnen 48 uur na transfectie kunnen worden afgebeeld, fixeer de cellen in 4% paraformaldehyde gedurende vijf minuten. Laat cellen de sensor gedurende 24 tot 48 uur tot expressie brengen voordat ze worden gefixeerd.Bewaar de cellen in PBS en bekijk na 48 uur. In een celkweekhood, vervang het celmedium met beeldvormingsmedium gesupplementeerd met 10% foetaal bovien serum. Plaats de bekijkschotels op een temperatuur gecontroleerde confocale microscooptafel.Plaats de glazen bekijkschotel met mTFP1 getransfecteerde cellen boven de olie objectief bij 60X vergroting met een numerieke apertuur van 1,4. Lokaliseer mTFP1-expresserende cellen in de wijdveld fluorescente modus. Met een fluorescerende cel in het gezichtsveld, selecteer de spectrale detectiemodus en vang het spectrale beeld op.Neem alle frequenties voorbij 458 nanometer op met incrementen van 10 nanometer. Selecteer een helder fluorescerend gebied op de cel. Voeg de gemiddelde fluorescente ROI toe als de genormaliseerde intensiteit aan de spectrale database door op Opslaan Spectra naar Database te klikken.Optimaliseer de laservermogen en versterking zodat een goede signaal-ruisverhouding wordt bereikt. Instellingen zullen variëren voor verschillende apparatuur. Herhaal het proces voor venus-expresserende cellen en blijf in spectrale modus.Gebruik een excitatiefrequentie van 488 nanometer in plaats van 458 nanometer. Pas de vermogensinstellingen aan zoals nodig, maar verander de emissiefrequenties niet. Selecteer een helder fluorescerend ROI van ongeveer een straal van 20 pixels.Voeg de gemiddelde fluorescente ROI toe als de genormaliseerde intensite

a-protocol-for-using-frster-resonance-energy-transfer-fret-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit artikel beschrijven we het gebruik van magnetische pincet om het effect van geweld op enzymatische proteolyse studeren aan de enkel molecuul niveau in een zeer parallelizable manier.

Multiplexed Single-molecule force Proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet

Deze paper toont een protocol om de mechanische eigenschappen van levende cellen te karakteriseren door middel van microindentation gebruik van een Atomic Force Microscope (AFM).

Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

Cellulosomen zijn multi-enzymcomplexen die zijn ontworpen voor het verteren van cellulose. AFM-gebaseerde SMFS werd gebruikt om de mechanische eigenschappen en vouwconfiguratie van cellulosome-geassocieerde eiwitassemblages te bestuderen. We presenteren een complete workflow voor eiwit-immobilisatie, dataverzameling en data-analyse om de interacties van individuele receptor-ligandcomplexen te bestuderen die betrokken zijn bij cellulosome-assemblage.

Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie

Een beschrijving van hoe je Förster Resonance Energy Transfer geïntegreerde biologische sensoren (FIBS) kalibreren voor in situ metabool profiel wordt gepresenteerd. De FIBS kan worden gebruikt om de intracellulaire niveaus van metabolieten invasief leveren aan de ontwikkeling van metabole modellen en hoge doorvoer screening van bioproces omstandigheden te meten.

FIBS-enabled Noninvasive metabole

We beschrijven een techniek voor het gelijktijdig meten van kracht-gereguleerde enkele receptor-ligand bindingskinetica en real-time beeldvorming van calciumsignalering in een enkele T-lymfocyt.

Fluorescentie biomembraan Force Probe: Concurrent kwantificering van Receptor-ligand Kinetics en-Binding geïnduceerde intracellulaire signalering op een enkele cel

In dit protocol beschrijven we een micropipet-methode om een gecontroleerde kracht direct toepassen in de kern in een levende cel. Deze bepaling laat ondervraging van nucleaire mechanische eigenschappen in de cel levend, aanhangend.

Een directe kracht sonde voor het meten van de mechanische integratie tussen de kern en het cytoskelet

Hier presenteren we een protocol voor het gelijktijdig gebruik van Förster resonance energie overdracht gebaseerde spanning sensoren voor het meten van eiwit belasting en fluorescentie herstel na photobleaching voor het meten van de dynamiek van de eiwitten waardoor de meting van kracht-gevoelige eiwit dynamiek binnen levende cellen.

Meting van de kracht-gevoelige eiwitten Dynamics in levende cellen met behulp van een combinatie van Fluorescent technieken

Hier wordt een uitgebreid protocol gepresenteerd om ultrasnelle krachtklemexperimenten uit te voeren op processieve myosine-5-motoren, die gemakkelijk kunnen worden uitgebreid naar de studie van andere klassen processieve motoren. Het protocol beschrijft alle noodzakelijke stappen, van de opstelling van het experimentele apparaat tot monstervoorbereiding, gegevensverzameling en analyse.

Het ontleden van mechano-enzymatische eigenschappen van processieve myosinen met ultrasnelle krachtklemspectroscopie

De studie beschrijft de methodologie van FRET-mapping, inclusief de selectie van etiketteringslocaties, keuze van kleurstoffen, acquisitie en data-analyse. Deze methodologie is effectief bij het bepalen van bindingsplaatsen, conformatieveranderingen en dynamische bewegingen in eiwitsystemen en is het meest nuttig als deze wordt uitgevoerd in combinatie met bestaande 3D-structurele informatie.

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: een nieuwe methodologie om wereldwijde structurele kenmerken op te helderen

Ensemble force spectroscopy (EFS) is een robuuste techniek voor mechanische ontvouwing en real-time detectie van een ensemble set van biomoleculaire structuren in biofysische en biosensing velden.

Ensemble Force Spectroscopie door Shear Forces

Leer hoe je FRET-microscopie gebruikt om mechanische krachten op het LINC-complex te meten in levende NIH 3T3-fibroblasten. Deze methode biedt inzicht in mechanotransductieprocessen op nucleair niveau.

Een protocol voor het gebruik van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensors te meten mechanische krachten over de Nuclear LINC Complex (Video) | JoVE Journal

Een protocol voor het gebruik van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensors te meten mechanische krachten over de Nuclear LINC Complex

Meer video's verkennen