Name: ACT-PRESTO: biologisch weefsel Clearing en immunokleuring Methoden voor Volume Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Leer ACT-PRESTO voor weefselclearing en immunokleuring in de neurowetenschap met muizeweefsels. Deze methode maakt subcellulaire analyse van grote monsters zonder sneden mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd ondersteund door het Brain Research Program via de National Research Foundation (NRF) gefinancierd door het Koreaanse Ministerie van Wetenschap, ICT en Toekomstplanning (NRF-2015M3C7A1028790).

Dierproeven moeten voldoen aan alle relevante gouvernementele en institutionele regelgeving. 1. Bereiding van reagentia <ol><li> Voor de hydrogel monomeeroplossing (A4P0) Voeg 20 g acrylamide tot 450 ml 0,1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en het volume op 500 ml met 0,1x PBS passen. LET OP: Acrylamide monomeren zijn giftig. Voer alle procedures in een zuurkast met persoonlijke beschermingsmiddelen, met inbegrip van een vizier, een laboratorium jas, handschoenen en dichte schoenen. <ol><li> Onmiddellijk voor gebruik, voeg 100 mg 2,2&#39;-azobis [2- (2-imidazoline-2-yl) propaan] dihydrochloride 40 ml hydrogel monomeeroplossing (A4P0) in een 50 ml conische buis onder een afzuigkap . </li></ol></li><li> Voor de elektroforetische weefsel clearing (ETC) buffer: Voeg 40 g natriumdodecylsulfaat (SDS) en 12,37 g boorzuur tot 800 ml gedeïoniseerd H2O (dH 2 O). Breng de pH op 8,5 met NaOH en het volume aan te passen1 L met extra dH 2 O. LET OP: SDS is een schadelijke chemische stof; Daarom, omgaan met zorg. </li><li> Voor de kubische-mount oplossing: Voeg 250 g sucrose, 125 g ureum en 125 g N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethyleendiamine en 150 ml dH 2 O en breng het volume tot 500 ml met dH 2 O. </li></ol> 2. Monstervoorbereiding &amp; Fixation <ol><li> Euthanasie van de muis. <ol><li> Bereid de alfaxalon (1 mg / kg) en xylazine (0,5 mg / kg) in dezelfde spuit. </li><li> Intraperitoneaal injecteren van het mengsel van alfaxalon en xylazine en laat 3 min voor de muis om bewusteloos raken. </li><li> Wacht tot de verdoofde muis niet meer reageert op pijnprikkels, zoals een staart knijpen, alvorens verder te gaan. LET OP: Volg de juiste institutionele richtlijnen voor de behandeling van dieren. </li></ol></li><li> Transcardially perfuseren de muis met 100 ml 0,9% NaCl (pH 7,4-7,5) -oplossingmet heparine (100 U / ml) exsanguinate, gevolgd door 100 ml 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS (pH 7,4) 14. LET OP: PFA oplossing is giftig. De voorbereiding van de PFA-oplossing en alle daaropvolgende behandeling moet worden uitgevoerd in een zuurkast en met persoonlijke beschermingsmiddelen. </li><li> Snijd de muis hoofd, het openstellen van de huid, en breek de schedel tussen de ogen met behulp van een klein schaartje. </li><li> Verwijder stukken van de schedel met behulp van kleine, gebogen tang. </li><li> Haal de hersenen of het gewenste organen. </li><li> Incubeer de hersenen en organen in post-fix 4% PFA oplossing bij 4 ° C overnacht. LET OP: Voor specifieke-regio weefsel clearing, ontleden de specifieke regio of trimmen het weefsel na fixatie van het weefsel. LET OP: PFA oplossing is giftig. De transcardial perfusie en alle daaropvolgende behandeling muis moet worden uitgevoerd in een zuurkast en met persoonlijke beschermingsmiddelen. </li></ol> 3. Hydrogel Monomeer Infusion en Polymerization <ol><li> Incubeer de vaste organen A4P0 hydrogel monomeeroplossing bij 4 ° C gedurende 12-24 uur onder zacht schudden. </li><li> Hydrogel-monomeer gegoten polymerisatie weefsel. <ol><li> Breng het monster een 10 ml ronde bodem buis met 5 ml hydrogel monomeeroplossing. Wikkel de top van de ronde-bodem buis met Parafilm. </li><li> Verwijder de zuurstof uit de rondbodem buis die het hydrogel geïnfundeerd geheel muizenhersenen monster door stikstof door de vloeistof gedurende 1 min. Snel en strak sluit de-monster met buis. </li></ol></li><li> Breng de buis een waterbad (37 ° C) gedurende 2 uur. </li><li> Was het gepolymeriseerde monster kort met 0,1x PBS om overtollig hydrogel te verwijderen. LET OP: Hydrogel monomeren zijn giftig. Om huidcontact met hydrogel monomeer te voorkomen, voeren alle procedures in een zuurkast en met persoonlijke beschermingsmiddelen, met inbegrip van een vizier, een laboratoriumjas en handschoenen. LET OP: gepolymeriseerde weefselskunnen worden opgeslagen in 0,1X PBS met natriumazide langer dan 2 weken bij 4 ° C. LET OP: Natriumazide is sterk en acuut giftig. Voer alle procedures in een zuurkast en met persoonlijke beschermingsmiddelen, met inbegrip van een vizier, een laboratoriumjas en handschoenen. </li></ol> 4. Elektroforetische Tissue Clearing (ETC) <ol><li> Breng het gepolymeriseerde monster aan een weefsel container en plaats het weefsel container in de ETC kamer. </li><li> Vul het ETC kamer met ETC buffer met behulp van peristatic pomp. </li><li> Stel de ETC voorwaarden en voer de ETC. Gebruik de volgende instellingen. <ol><li> Voor de ETC-instellingen voor hele organen, gebruik de volgende instellingen: (1,5 amp), temperatuur (37 ° C), looptijd (6,0 uur), toerental van de pomp (30 rpm). </li><li> Voor de ETC-instellingen voor 1 tot 2 mm dik muizenhersenen plakken, gebruik de volgende instellingen: de huidige (1,5 amp), temperatuur (37 ° C), looptijd (2,0 uur), toerental van de pomp (30 rpm). </li></ol></li><li> Transfer tHij schraapte monster een 50-ml conische buis met 45 ml 0,1x PBS. Was de ontruimde meerdere malen monster met 0,1x PBS totdat er geen luchtbellen worden gezien wanneer de buis kort wordt geschud (om de volledige verwijdering van SDS te bevestigen). </li></ol> 5. immunokleuring van ACT-bewerkte Tissues <ol><li> Voor muizen volledige hersenen: Incubeer het monster in een 3-ml volume antilichaamoplossing bestaande uit 1x PBS, 6% runderserumalbumine (BSA), 0,1% Triton X-100 en 0,01% natriumazide (antilichaamverdunning oplossing) met een verdunning factor 1/500 voor tyrosine hydroxylase (TH) antilichaam gedurende 4 dagen bij 37 ° C onder mild schudden. Vervang de antilichaamoplossing aan het eind van dag 2. <ol><li> Was het monster in een 50-ml conische buis met 45 ml 0,1x PBS gedurende 3-5 uur en veranderen de buffer per uur. </li><li> Incubeer het monster in een 3-ml volume antilichaam verdunningsoplossing met een verdunningsfactor van 1/500 van ezel anti-konijn secundair antilichaam 488 gedurende 4 dagen bij 37 ° C onder mild schudden. Replace de verdunde antilichaam-oplossingen op dag 2. </li></ol></li><li> 1- tot 2 mm dik gesneden hersenweefsel: overnight of maximaal 1 dag in een 0,5- tot 1-mL volume antilichaam verdunningsoplossing met een verdunningsfactor van 1/500 collageen type IV antilichaam bij 37 Incubeer het monster ° C onder mild schudden. <ol><li> Was het monster in een 15-ml conische buis met een 12 ml volume van 0,1 x PBS gedurende 1-2 uur. Verander de buffer elk uur. </li><li> Incubeer het monster in een 0,5- tot 1-mL volume antilichaam verdunningsoplossing met een verdunningsfactor van 1/500 voor Cy3-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam nachts of maximaal 1 dag bij 37 ° C onder mild schudden. </li></ol></li><li> Was het monster in 0.1x PBS gedurende 3-5 uur; veranderen de buffer elk uur. </li><li> Voorafgaand aan beeldvorming, incubeer het monster in een geschikte hoeveelheid kubieke mount oplossing 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden. Vervang met verse CUBIC-mount-oplossing en incubeer gedurende een extra 1 uur. NOTITIE: </b&gt; 76 soort van antilichamen werkte goed in de muis-ACT verwerkt weefsel, met inbegrip van 31 monoklonale antilichamen 14. Gelabelde weefsel kan worden gecombineerd met de immunokleuring van twee fluorochromen in ACT-bewerkte weefsel. </li></ol> 6. immunokleuring van Dense Tissues (PRESTO) <ol><li> c-PRESTO OPMERKING: c-PRESTO is geschikt voor kleine monsters, zoals hele testis, nier geheel of kleine gedeelten van grotere organen. <ol><li> Breng het monster in een 1,5 ml buis, voeg 500 ul van antilichaamverdunning oplossing met een verdunningsfactor van 1/500 collageen type IV antilichaam en centrifugeer de buis bij 600 x g gedurende 2 uur. </li><li> Was de gekleurde monster met 0,1x PBS door centrifugatie bij 600 xg gedurende 30 min. </li><li> Voeg 500 ul van antilichaamverdunning oplossing met een verdunningsfactor van 1/500 voor Cy3-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam en centrifugeer bij 600 xg gedurende 2 uur. </li><li> Was de gekleurde monster met 0.1x PBS door centrifugatie bij 600 xg gedurende 30 min. </li></ol></li><li> s-PRESTO OPMERKING: s-PRESTO is geschikt voor grotere weefsels. <ol><li> Bereid een injectiespuit (30 ml volume) en sluit deze aan op een 3-weg klep (figuur 1A). Lijm de klep met een lijmpistool voor hoge-drukomstandigheden (Figuur 1B). </li><li> Breng het monster in de 3-weg-klep verbonden spuit in de gesloten klepstand. </li><li> Voeg 5-7 ml antilichaam verdunning oplossing met een verdunningsfactor van 1/500 voor collageen type IV antilichaam. Laat de antilichaamoplossing in het monster door het openen van de klep. </li><li> Stel de spuit zuiger naar de 17-mL positie om voldoende ruimte voor infusie / terugtrekking laat bewegen. Dit kan in de open klepstand. Sluit de 3-wegklep naar de spuit instelling is voltooid. </li><li> Zet de spuit met het monster op een injectiepomp. Stel de spuit pomp voorwaarden aan een infuus / terugtrekking volume van 10 ml / min en een 4-min pauzetijd op continue cyclus mode (figuur 1C). OPMERKING: De pomp blaast totdat het doelvolume (10 ml), en vervolgens de stromingsrichting verandert na een korte pauze (4 min) bereikt. </li><li> Run de injectiepomp voor 3-24 uur bij kamertemperatuur (Figuur 1F). </li><li> Open de 3-wegklep en vervang de oplossing met 0.1x PBS. </li><li> Was het monster gekleurd tweemaal met 0,1x PBS gedurende 1 uur elke keer met behulp van de injectiepomp. </li><li> Verander met antilichaam verdunning oplossing met Cy3-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam (verdunningsfactor van 1/500) en laat de spuit pomp voor 3-24 uur. </li><li> Open de 3-wegklep en vervang de oplossing met 0.1x PBS. </li></ol></li><li> Voorafgaand aan beeldvorming Incubeer de gekleurde monster in een geschikte hoeveelheid kubieke mount oplossing 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden. Vervang met verse CUBIC-mount-oplossing en incubeer gedurende een extra 1 uur. </li></ol> 7. Imaging <ol><li> Plaats de gelabelde weefsel in een confocale schotel en voeg CUBIC-mount oplossing totdat het weefsel is bedekt. Plaats een dekglaasje op het weefsel. Gebruik een confocale microscoop om de afbeelding van het weefsel 14 onder de 10x doelstelling. </li></ol>

<ol><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li>
<li>Dodt, H. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22NATURE%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> NATURE. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li>
<li>Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159, 896-910 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li>
<li>Kim, S. -Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cogn+Sci%22%5BJournal%5D)">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends Cogn Sci. 17, 596-599 (2013).</li>
<li>Yushchenko, D. A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+for+optical+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing for optical anatomy.</a> Angew Chem Int Edit. 52, 10949-10951 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li>
<li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACT-PRESTO%3A+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+%283D%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Sci Rep. 6, 18631(2016).</li>
<li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163, 1500-1514 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Slechte fixatie of hydrogel onderdompeling in weefsels kunnen het verlies van eiwitten en de vervorming van weefsel tijdens het weefsel clearing proces veroorzaken. De totale volwassen muizenhersenen moet worden overnacht geïncubeerd in 4% paraformaldehyde, gevolgd door onderdompeling in een minimaal volume van 20 ml hydrogel monomeeroplossing voor 12-18 uur onder voorzichtig schudden. Voor grote weefsel zoals humaan weefsel zoals de hersenen en het ruggenmerg plakjes uitgebreid inweektijd in de hydrogel monomeeroplossing vereist. De ACT-protocol is gemakkelijk van toepassing op de clearing van de vaste weefsels, omdat het weefsel fixatie en polymeer infuus stappen worden gescheiden. Na weefsel clearing, werden menselijke weefsels goed gekleurd met verschillende antilichamen. Merk op dat de ACT zuiveringstechniek is niet compatibel met fixatieven alcohol, zoals ethanol en methanol. Het weefsel-hydrogel polymerisatie stap is ook van cruciaal belang voor een goede kwaliteit weefsel te produceren na de clearing proces. Omdatzuurstof remt de polymerisatie van acrylamide, moet worden verwijderd door ontgassing het weefsel bevattende oplossing onder een stikstofgas infusiesysteem. Als alternatief kan de-zuurstof worden uitgevoerd met behulp van een vacuümkamer met een warmte-blok voor 23 uur. De clearing tarief is afhankelijk van tal van factoren, waaronder het orgel grootte, de inhoud van lipiden of ECM vezelachtige eiwitten, de toestand van de fixatie, enz. De meeste volwassen muis weefsels kunnen &#39;s nachts worden gewist door ETC. Er bestaat echter een gevaar van onnodige over- clearing en weefsel zwelling; dus de verschillen in clearing tijd zijn belangrijke overweging. Tissue-clearing voorwaarden moeten empirisch worden bepaald. Belangrijker is echter dat de inhoud van de ECM het uiterlijk van het weefsel vrijgemaakt beïnvloeden. De kleur van de weefsels blijft wit of ondoorzichtig, zelfs na de ACT in ETC buffer, omdat ACT niet dichte eiwitvezels te wissen. Wanneer deze organen werden ondergedompeld in RI passende oplossing, dey werd transparant. De snelheid van delen zwelling wordt afhankelijk van de inhoud van de ECM weefsel en zachte organen, zoals de hersenen zijn vertonen een grotere zwelverhouding dan dichte organen. Omdat verhoogde weefsel zwelling zal helpen de tissue-clearing procedure, ACT routinematig maakt gebruik van gedestilleerd water gebaseerde buffer in de meeste gevallen. In sommige gevallen, wanneer delen zwelling of voorbijgaande vervorming is niet wenselijk, zoals in embryo&#39;s, buffer die 0,1 x PBS kunnen worden toegepast voor hoge-resolutie beeldvorming. Ook moet worden opgemerkt dat hogere zoutconcentraties in de buffer de krimp van weefsel kunnen veroorzaken. De ACT werkwijze kan hele organen en zelfs het hele lichaam van een muis 14 verduidelijken. Echter, deep-tissue beeldvorming van transparante weefsel vereist speciale microscopen en doelstellingen. Aldus hersenweefsel 1 tot 2 mm dik is het meest effectief voor beeldvorming met een conventionele confocale microscoop. In onze handen, het verwijderen van het labeled antilichamen van ACT-verwerkte weefsels antilichaamafhankelijke en rondes van verschillende antilichaam labeling wordt afgeraden. Verschillende antilichamen, zoals TH en GFAP, werkte vooral goed voor de hersenen als geheel immunokleuring 14. Anderzijds, wat antilichamen, zoals Tuj1 of Map2, vaak aangeduid alleen het oppervlak van het weefsel. Dit kan worden verbeterd door andere werkwijzen, zoals SWITCH 15. Een andere potentiële beperking is dat het moeilijk kan zijn om fijne eiwitstructuren in-ACT verwerkte weefsel behouden vanwege de weefselzwelling en krimp tijdens het weefsel clearing stap. De PRESTO techniek is toepasbaar op een grote verscheidenheid aan weefsel-labeltechnieken. Bijvoorbeeld, in weefsel-transparante methoden waarbij gelabelde weefsel, zoals SeeDB 4 en iDISCO 7, immunokleuring van dicht weefsel vereist incubatieperioden langer dan enkele dagen tot weken. Echter PRESTO kan de incubatietijd te verkorten tot enkele uren, enabling de voltooiing van het gehele proces binnen een dag 1 mm dik dicht weefsel. PRESTO kan de effectiviteit van deep-labeling dikke, dichte weefsel, of zelfs niet-ontruimde dikke weefsels te verbeteren. Omdat PRESTO gebruikt een tafelblad centrifuge of spuitpomp en geen speciale apparatuur nodig is het relatief gemakkelijk om deze techniek routine laboratorium procedures.

Een van de uitdagingen in neurologie is de visualisatie van neuronale bedrading en individuele cellen in intacte hersenweefsel. Tot voor kort, het aantonen van de verbindingen tussen neuronen in deze manier vereist 1) seriële snijden van de weefsels; 2) de moleculaire kenmerken van specifieke doelen, zoals axonen of eiwitten; en 3) visualisatie van 3D-reconstructie van de hele hersenen via computationele registreren of aanpassing van de 2D-serie beelden 1. Deze stappen zijn omslachtig, vergen veel tijd, en zijn onderhevig aan informatie te verliezen tijdens het snijden en de etikettering, het maken van neurale netwerk in kaart brengen buitengewoon moeilijk. Maar veel methoden die het mogelijk maken de visualisatie van intact weefsel, zonder snijden ontwikkeld. Biologische weefsels kunnen optisch transparant worden gemaakt door het weefsel-clearing technieken 2-10. Een van de belangrijkste methoden is het brekingsindex verschil tussen de intacte weefsel en de onderdompeling oplossing om verminderenlichtverstrooiing te verminderen in het intacte weefsel, waardoor het weefsel rendering transparante en waardoor de waarneming van diepe structuren. Sommige soorten onderdompeling oplossingen hydrofobe eigenschappen, die resulteren in snelle quenching fluorescerende tijdens de dehydratatie procedure. Daarom deze methoden zijn niet compatibel met fluorescerende beeldvorming over een lange tijdsperiode 11,12. In plaats van hydrofobe reagentia andere manieren hydrofiele reagentia voor weefsel clearing, zoals SeeDB 4 en Sca l e 6, waarbij de structurele informatie en de fluorescentie van het biologisch weefsel 4,6,8 handhaven. Echter, macromoleculen, met inbegrip van antilichamen, kan niet de kern van het intacte weefsel alleen te bereiken door diffusie. Daarom is de pre-etikettering van doelmoleculen in diepe gebieden van opeengepakt weefsels is technisch uitdagend. In een recent ontwikkelde weefsel-clearing methode, CLARITY 3, een hydrogel ingebed biologisch weefsel is gevormd met acrylamide en lipiden worden verwijderd door elektroforese onder natriumdodecylsulfaat (SDS) bevattende oplossing. Het monster wordt dan ondergedompeld in een oplossing met een bijpassende brekingsindex lichtverstrooiing 3 verminderen. Het lipide verwijdering systeem werd later gewijzigd in geavanceerde DUIDELIJKHEID 13 en PACT (passieve duidelijkheid techniek) 10. Na polymerisatie acrylamide kettingen verknopen van eiwitten, vormen hydrogel-weefsel. Lipidecomponenten kan verknopen met acrylamide; derhalve kunnen lipiden worden geëlimineerd door elektroforese onder SDS-bevattende buffer. Door de actieve verwijdering van lipiden, hersenweefsel sterk vergroot transparantie 9. Echter, deze werkwijzen niet de onmogelijkheid van diepe etiketteren door vrije diffusie. Om deze beperking te overwinnen, zijn technieken voor actief transport van reagentia in de diepste delen van dikke weefsels vereist. Hoewel DUIDELIJKHEID maakt weefsel clearing en deep-tissuevisualisatie, het is geen makkelijke of snelle procedure. Het kan enkele weken duren om een hele hersenen van muizen 7,14 wissen. Rapid clearing van weefsels is essentieel voor de toepassing van dergelijke methoden om basis- of klinisch laboratorium instellingen voor biowetenschappelijk onderzoek of volume diagnose. Het huidige protocol voorziet in een vereenvoudigde procedure voor biologisch weefsel klaring en de daaropvolgende eiwit detectie door druk bijgestaan ​​levering immuno-kleuring. Het is geschikt voor high-resolution volume beeldvorming van grote ingediend en 3D-systemen voor de verwerking door de combinatie met beeldvormende methoden.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Lugen SCI&nbsp;</td><td>LGB-1175-4B</td><td>sample fixation&nbsp;</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Affymetrix</td><td>75820</td><td>Hydrogel monomer solution&nbsp;</td></tr><tr><td>2,2&rsquo;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride</td><td>Wako Pure Chemical Industries&nbsp;&nbsp;</td><td>VA-044</td><td>Hydrogel monomer solution&nbsp;</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Affymetrix</td><td>76324</td><td>ETC buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Affymetrix</td><td>18220</td><td>ETC buffer</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide pellets</td><td>Junsei chemical</td><td>1310-73-2</td><td>ETC buffer</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2323A</td><td>Immunolabeling</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Immunolabeling</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Immunolabeling</td></tr><tr><td>Tyrosine hydroxylase (TH)</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>Antibody/immunolabeling</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>Secondary antibody/ immunolabeling</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life Technologies - Molecular Probes</td><td>A21206</td><td>Secondary antibody/ immunolabeling</td></tr><tr><td>Confocal dish</td><td>SPL lifesciences</td><td>101350</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Junsei chemical</td><td>31365-0301</td><td>CUBIC-mount solution&nbsp;</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Affymetrix</td><td>23036</td><td>CUBIC-mount solution&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N,N&rsquo;,N&rsquo;-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>122262</td><td>CUBIC-mount solution&nbsp;</td></tr><tr><td>ECT chamber</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10101</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>ECT chamber controller</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10201</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Temperature probe</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12101</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Peristatic pump</td><td>Baoding longer precision pump Co., Ltd</td><td>YZ1515X</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Buffer reservoir</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10401</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Tissue container&nbsp;</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12001</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Container holder for 1 tissue container</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12002</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Mouse brain slice holder</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12004</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Whole rat brain holder</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12007</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Peristaltic pump tubing</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12104</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Tabletop-centrifuge</td><td>Hanil science industrial Co., Ltd</td><td>MICRO 12</td><td>c-PRESTO</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Baoding longer precision pump Co., Ltd</td><td>LSP02-1B</td><td>s-PRESTO</td></tr><tr><td>Syringe (30 mL)</td><td>Korea vaccine Co., Ltd.</td><td>KV-S30</td><td>s-PRESTO</td></tr><tr><td>3-way stopcock</td><td>Hyupsung medical Co.,Ltd.</td><td>HS-T-01N</td><td>s-PRESTO</td></tr></tbody></table>

act-presto: biologisch weefsel clearing en immunokleuring methoden voor volume imaging

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

De identificatie en onderzoek van de gedetailleerde organisatie van organen of van het gehele lichaam op cellulair niveau belangrijke uitdagingen in de biologie. Overgangsmethoden vereisen een aanzienlijke hoeveelheid tijd en moeite om een ​​3D-beeld te verkrijgen en met het intacte weefsel snijden, immunokleuring en imaging serieel doorgesneden weefsel, dat een verlies van informatie levert bij elke stap van het proces. In recent ontwikkelde methoden voor hoge-resolutie beeldvorming binnen intact weefsel, is moleculaire karakterisering beperkt tot de etikettering van eiwitten. Echter momenteel beschikbare protocollen voor orgel clearing vereisen een aanzienlijk lange procestijd, waardoor het moeilijk uitvoerbaar weefsel clearing technieken in het laboratorium. We hebben onlangs een snelle en zeer reproduceerbare protocol genoemd ACT-PRESTO (a ctive c matigheid t echnique- p ressure r uitgelaten e fficient en s tafel t ransfervan macromoleculen in o rgans), die zorgt voor goedkeuring weefsel binnen enkele uren. Bovendien ACT-PRESTO maakt een snelle immunokleuring met conventionele methoden en versnelt antilichaam penetratie in de diepe laag van dicht gevormde, dikke exemplaren door het toepassen van druk of convectie flow. We beschrijven hoe weefsels, hoe om te wissen door lipide verwijderen met behulp van elektroforese voor te bereiden, en hoe immuno-vlekken door een druk bijgestaan ​​levering. De snelheid en de consistentie van het protocol zullen de prestaties van 3D-histologisch onderzoek en op basis van volume diagnoses te bespoedigen.

ACT-weefsel Clearing Een belangrijke factor die van invloed weefsel clearing is weefsel fixatie. PFA fixatie en acrylamide infuus zijn afzonderlijke stappen in dit protocol. Nadat het weefsel-hydrogel polymerisatiestap wordt het vrije A4P0 oplossing gepolymeriseerd, hoewel weefsel geïnfundeerd hydrogelen verknoopt met endogene macromoleculen. Derhalve geen gel buiten het weefsel (Figuur 2A) te vormen. De ACT procedure resulteert in minder verknoping tussen eiwitten en acrylamide vergelijking met de CLARITY protocol. Dienovereenkomstig, de weefsel-hydrogel monster poreuzer. Deze functie maakt het mogelijk een snelle winning van lipiden en de verspreiding van macromoleculen. Delen van muizenhersenen 1 tot 2 mm dikke voldoende was afgewikkeld binnen 1-2 uur (figuur 2B), en 5-6 uur ETC volstond om clearance hele muizenhersenen (figuur 2C). Hydrogel-gemedieerde weefsel clearing veroorzaakte de uitbreiding van het weefsel na de ETC stap, maar het weefsel terug naar zijn oorspronkelijke grootte in reflecterende-index aangepaste oplossing. Het weefsel-monster hydrogel gevormd in het ACT procedure is zeer poreus en dus kunnen kleine verbindingen en macromoleculen efficiënt penetreren en gemakkelijker diffunderen (figuur 3). Na een 2-uur incubatie van 1 mm hersencoupes met tyrosine hydroxylase (TH) en collageen type IV antilichaam, een volgende 2 uur incubatie met een secundair antilichaam was voldoende om dopaminerge neuronen in een 500-um diepte label (figuur 3) . PRESTO-weefsel immunokleuring Dichte organen algemeen hoge concentraties van ECM vezels, die de penetratie van antilichamen in de weefsels beïnvloedt. Antilichamen Penetgeschikt tot een diepte van slechts 20-30 urn in dichte weefsels zoals nierweefsel, na 12 uur incubatie. Om deze beperking te overwinnen, ontwierpen we actieve macromolecuul penetratie werkwijzen die toelaten reagentia in diepe weefsels, namelijk PRESTO (drukgerelateerde efficiënte en stabiele overdracht van macromoleculen in de organen) (figuur 4) mogelijk. In vergelijking met de statische incubatie van ACT verwerkte nierweefsel met antilichaamoplossingen de toepassing van centrifugale krachten (600 xg) met een tafelmodel centrifuge (centrifugale PRESTO, c-PRESTO) sterk verbeterde uitvoering antilichaam in diepe weefsels (Figuur 5). Wanneer we de c-PRESTO procedure dichte weefsels toegepast, 3 uur incubatie was voldoende om een ​​label 250 tot 300 urn dieptestructuur. Het weefsel vervorming zonder significante weefselschade verbeteren, ontwierpen we ook een machine die convectie stroming met een spuitpomp (syringe PRESTO, s-PRESTO) verschaft. Dit proces evenzo verbeterd antilichaam penetration vergelijking met passieve diffusie (Figuur 5). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig1.jpg" /> Figuur 1. Bereiding van de s-PRESTO inrichting. A. Een injectiespuit (30 ml) en driewegkraan. B. De driewegkraan verbonden en gelijmd op de spuit. C. De spuit met het monster en antilichaamoplossing en de spuit geplaatst op de injectiepomp. D. De spuit pomp en werkende staat setup. E. De pomp giet een oplossing die de labeling reagentia in het monster. Wanneer het aangewezen volume wordt bereikt, de pompen richtingsveranderingen en trekt de oplossing na een bepaalde periode van tijd. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Figuur 2. ACT weefsel clearing van de hersenen van muizen. A. Na de polymerisatie, worden gratis A4P0 oplossingen niet gepolymeriseerd; -Weefsel infuus hydrogels worden gegeleerd door cross-linking met endogene macromoleculen. B. 1 tot 2 mm dikke hersenen plakken werden vrijgemaakt voor 1-2 uur, en de mate van expansie en de grootte herstel van de brekingsindex (RI) -Matching oplossing werden geregistreerd. C. De dikte van de gehele muizenhersenen ongeveer 0,8 cm en 5-6 uur ETC werd voldoende volledig duidelijk de hersenen. Na 3 h ETC, was er een significante hoeveelheid niet-gewist weefsel. Door 6 uur van ETC, echter, clearing van de hele hersenen had plaatsgevonden. De kleur van de weefsels na ACT in de ETC buffer is wit of ondoorzichtig. Door RI aanpassing, weefsels transparant worden. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">Klik op haar</a>e voor een grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig3.jpg" /> Figuur 3. immunokleuring met ACT ontruimd muis hersenweefsel. Beelden van ACT-bewerkte 1 mm muizenhersenen plakjes toont muizenhersenen cortex gekleurd met een antilichaam tegen collageen type IV en een deel van de middenhersenen gekleurd met een antilichaam tegen hydroxylase (TH) tyrosine. Schaal bar, 100 micrometer. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig4.jpg" /> Figuur 4. PRESTO immunokleuring methoden. Antilichamen kunnen niet doordringen in dichte weefsels door diffusie. PRESTO immunokleuring methoden werden ontworpen om actief te trekken macromoleculen en reagentia te leveren indichte weefsels. De toepassing van centrifugale krachten met behulp van een standaard tafelblad centrifuge (centrifugale PRESTO, c-PRESTO) aanzienlijk vergemakkelijkt de levering van antilichamen. Appling convectie stroom met een injectiepomp (spuit PRESTO, s-PRESTO) verbeterde antilichaam penetratie. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig5.jpg" /> Figuur 5. PRESTO immunokleuring van ACT ontruimde dichte weefsel. Voor c-PRESTO werden weefsels gecentrifugeerd bij 600 g gedurende 3 h en een standaard tafelblad centrifuge teneinde de penetratie van primaire en secundaire antilichamen versnellen. Voor s-PRESTO, werd een injectiepomp gebruikt om de antilichamen te leveren. Muis organen, zoals de nieren en de lever werden gelabeld met collageen type IV. In vergelijking met conventionele werkwijzen, 3 hc- of s-PRESTO aanzienlijk verhoogt de etikettering diepte. In de nier en lever, de diepte van de Z-as bereikt 300-350 urn of dieper in PRESTO monsters (rechts), terwijl controlemonsters worden gelabeld op een diepte van slechts 40 - 50 urn (links). Een beeld 3D gereconstrueerde werd verkregen met een confocale microscoop. Schaal bar, 100 micrometer. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

ACT-PRESTO (actieve duidelijkheid techniek drukgerelateerde efficiënte en stabiele overdracht van macromoleculen in organen) maakt een snelle, efficiënte, maar goedkope weefsel clearing en snelle antilichaam penetratie in de weefsels ontruimd door passieve diffusie of druk bijgestaan ​​levering. Met behulp van deze methode, kan een breed scala van weefsels worden gewist, immunolabeled door meerdere antilichamen en volume-afgebeeld.

ACT-PRESTO: biologisch weefsel Clearing en immunokleuring Methoden voor Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Het algemene doel van deze procedure is om het opgeruimde, intacte weefsel te verkrijgen en de driedimensionale moleculaire informatie ervan te visualiseren met behulp van immunolabelingmethoden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in de neurowetenschappen en ontwikkelingsbiologie, zoals neuronale verbindingen, moleculaire categorisering en structurele veranderingen tijdens de ontwikkeling. Het grote voordeel van deze techniek is dat weefsel duidelijk analyse op subcellulair niveau van grote specimens mogelijk maakt zonder te snijden.Om deze procedure te starten, incubeer de gefixeerde organen in A4P0 Hydrogel monomeeroplossing bij vier graden Celsius gedurende 12 tot 24 uur met zacht schudden. Voeg daarna vijf milliliter Hydrogel monomeeroplossing toe aan een ronde bodembuis van 10 milliliter. Breng vervolgens het muizenhersenmonster over en wikkel de bovenkant van de buis met Parafilm.Laat vervolgens stikstof gedurende één minuut door de vloeistof met het Hydrogel doordrenkte hersenmonster. Sluit snel en stevig de monsterbevattende buis. Breng de buis over naar een waterbad voor twee uur.Controleer daarna de viscositeit van het Hydrogel en was vervolgens het gepolymeriseerde monster kortstondig met 0.1 X PBS om overtollig Hydrogel te verwijderen. In deze stap brengt u het gepolymeriseerde monster over naar een weefselcontainer. Plaats de weefselcontainer in de ETC-kamer.Vul vervolgens de ETC-kamer met ETC-buffer met behulp van een peristaltische pomp. Stel de ETC-condities in en zet deze aan. Hersensneden van een tot twee millimeter dikte worden binnen twee uur opgeruimd.En een hele hersenen worden binnen vijf tot zes uur voldoende opgeruimd. Breng vervolgens het monster over naar een conische buis van 50 milliliter met 45 milliliter 0.1 X PBS. Was het monster meerdere keren met 0.1 X PBS tot er geen bubbels meer zijn wanneer de buis kortstondig wordt geschud om volledige verwijdering van SDS te bevestigen.Om c-PRESTO uit te voeren, breng een klein monster over in een buis van 1.5 milliliter. Voeg 500 microliter antilichaamverdunningsoplossing toe met een verdunningsfactor van één op 500 voor collageen type vier antilichaam en centrifugeer de buis gedurende twee uur bij 600 keer g. Was daarna het gekleurde monster met 0.1 X PBS door centrifugatie bij 600 keer g gedurende 30 minuten.Voeg vervolgens 500 microliter antilichaamverdunningsoplossing toe met een verdunningsfactor van één op 500 voor Cy3 geconjugeerd Anti Rabbit secundair antilichaam en centrifugeer deze gedurende twee uur bij 600 keer g. Was vervolgens het gekleurde monster met 0.1 X PBS door centrifugatie bij 600 keer g gedurende 30 minuten. Om s-PRESTO voor groter weefsel uit te voeren, brengt u het monster over in een drieklemklep verbonden spuit in de gesloten kleppositie.Voeg vijf tot zeven milliliter antilichaamverdunningsoplossing toe met een verdunningsfactor van één op 500 voor collageen type vier antilichaam. Voeg vervolgens de antilichaamoplossing toe aan het monster door de klep te openen. Stel vervolgens in de open kleppositie de spuitpomp in op de positie van 17 milliliter om voldoende ruimte te bieden voor de infuusintrekkingsbeweging.Sluit vervolgens de drieklemklep nadat de spuitinstelling is voltooid. Plaats de spuit met het monster op een spuitpomp. Stel de spuitpompcondities in op een infuusintrekkingsvolume van tien milliliter per minuut en een pauzetijd van vier minuten in de continue cyclusmodus.Laat vervolgens de spuitpomp drie tot 24 uur bij kamertemperatuur lopen. Open daarna de drieklemklep en vervang de oplossing door 0.1 X PBS. Was het gekleurde monster twee keer met 0.1 X PBS gedurende een uur per keer, met behulp van de spuitpomp.Vervolgens vervangt u PBS door de antilichaamverdunningsoplossing met Cy3 geconjugeerd Anti Rabbit secundair antilichaam en laat de spuitpomp drie tot 24 uur lopen. Open daarna de drieklemklep en vervang de oplossing door 0.1 X PBS. Voorafgaand aan beeldvorming, incubeer het gekleurde monster in een geschikte hoeveelheid kubische montageoplossing gedurende één uur bij kamertemperatuur met zacht schudden.Na een uur vervangt u de oplossing door verse kubische montageoplossing en incubeert u gedurende nog een uur. Aangezien antilichamen niet door diffusie in dicht weefsel kunnen doordringen, zijn PRESTO-immunolabelingmethoden ontworpen om macromoleculen actief te infunderen en reagentia in dicht weefsel af te geven. De toepassing van centrifugale krachten met behulp van een standaard tafelcentrifuge vergemakkelijkte de afgifte van antilichamen aanzienlijk.Het toepassen van convectiestroom met een spuitpomp verbeterde ook de antilichaamboxtring. Voor s-PRESTO werd een spuitpomp gebruikt om de antilichamen af te geven. De muizenorganen, zoals nieren en lever, werden gelabeld met collageen type 4.Vergeleken met de conventionele methoden verbeteren drie uur c of s-PRESTO de labeldiepte aanzienlijk. In de nieren en lever bereikt de diepte van de z-as 300 tot 350 micrometer of dieper in PRESTO-monsters, terwijl controlemonsters op een diepte van slechts 40 tot 50 micrometer worden gelabeld. Eenmaal onder de knie, kunnen deze technieken binnen een dag worden uitgevoerd voor duidelijk weefsel als ze correct worden uitgevoerd.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de tijd van weefselfixatie, Hydrogel monomeer emulsie en elektroforetisch weefsel duidelijk moet worden gehouden. Na de procedure kunnen andere methoden zoals immunolabeling worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals analyse van cellulaire dynamica en identificatie van een neuronaal stopcontact in meerdere organen. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van medische wetenschap om ziektediagnose te onderzoeken.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u Hydrogel-inbedding en weefselpolymerisatie uitvo

act-presto-biological-tissue-clearing-immunolabeling-methods-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om de afbeelding fluorescent gelabelde cellen in semi-dikke hersenen plakken. Door de vaststelling van, snijden, en optisch clearing hersenweefsel beschrijven we hoe standaard epifluorescerende of confocale beeldvorming kan worden gebruikt om individuele cellen en neuronale netwerken binnen intact zenuwweefsel te visualiseren.

Een snelle aanpak van High-Resolution Imaging fluorescentie in Semi-Dik Brain Slices

Om beelden met hoge resolutie te verkrijgen van fluorescerend gelabelde cellen binnen grote weefsels, zouden de biologische monsters ideaal geïmagingd moeten worden zonder te snijden. 3DISCO is een eenvoudige weefselklaringsprocedure gebaseerd op sequentiële incubatie met organische oplosmiddelen. Na klaring worden de organen transparant, waardoor een volledige laserscan van het specimen mogelijk is.

Imaging Ontruimde Intact Biological Systems op cellulair niveau door 3DISCO

Ex vivo geheel-orgaan beeldvorming is een snelle werkwijze voor het bepalen van de relatieve concentraties van fluorescent gelabelde verbindingen binnen en tussen weefsels of behandelingsgroepen. Omgekeerd kwantitatieve fluorescentie histologie, terwijl arbeidsintensiever, maakt de kwantificering van de absolute weefselconcentraties van gelabelde moleculen.

Het gebruik van Ex Vivo Whole-orgel imaging en kwantitatieve Tissue histologie van de Bio-verdeling van fluorescent gelabelde moleculen te bepalen

Hier beschrijven we een microscopie-aanpak van lichte lakens om het cardiale CD45 + leukocyten infiltraat te visualiseren in een muizenmodel van aseptische fulminante myocarditis, die wordt geïnduceerd door de intratracheale difterie toxine behandeling van CD11c.DTR muizen.

Kwantitatieve visualisatie van leukocytinfectiet in een muizenmodel van Fulminant-myocarditis door middel van lichte microscopie

Deze studie geeft een protocol voor het omkeerbare weefsel clearing, immunokleuring, 3D-rendering en analyse van vasculaire netwerken in menselijke placenta villi monsters over de volgorde van 1-2 mm,3.

Driedimensionale weergave en analyse van Immunolabeled, verduidelijkt menselijke placenta Villous vasculaire netwerken

De combinatie van antilichaam etikettering, optische clearing en geavanceerde Lichtmicroscopie maakt een driedimensionale analyse van complete structuren of organen mogelijk. Hier beschreven is een eenvoudige methode om immunolabeling van dikke nierschijfjes te combineren, optische clearing met ethyl CINNAMAAT, en confocale beeldvorming die visualisatie en kwantificering van driedimensionale nierstructuren mogelijk maakt.

Optische clearing en beeldvorming van Immunolabeled nierweefsel

We beschrijven een snelle kleuringsmethode om multispectrale beeldvorming op bevroren weefsels uit te voeren.

Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties

Het protocol biedt een gedetailleerde methode van neuronale beeldvorming in hersensegmenten met behulp van een weefselzuiveringsmethode, ScaleSF. Het protocol omvat hersenweefselvoorbereiding, weefselverheldering, behandeling van gewiste plakjes en confocale laserscanmicroscopie beeldvorming van neuronale structuren van mesoscopische tot microscopische niveaus.

Een weefselzuiveringsmethode voor neuronale beeldvorming van mesoscopische tot microscopische schalen

Het huidige protocol biedt een stapsgewijze procedure voor snelle en gelijktijdige optische clearing, multi-round labeling en 3D volumetrische reconstructie van tientallen postmortale menselijke hersensecties door de (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT weefseltransformatietechniek te combineren met light-sheet fluorescentiemicroscopiebeeldvorming in een routinematig high-throughput protocol.

Optische opheldering en etikettering voor lichtbladfluorescentiemicroscopie in grootschalige beeldvorming van het menselijk brein

Dit protocol introduceert een snelle methode voor kwantitatieve driedimensionale vasculaire beeldvorming op de hele berg met behulp van light-sheet fluorescentiemicroscopie. De werkzaamheid van de methode wordt aangetoond met behulp van het faryngeale boogslagadersysteem van het kuikenembryomodel, waarbij hemodynamische krachten worden gekwantificeerd via computationele vloeistofdynamica.

Snelle beeldvorming met hoge resolutie van de hele berg van het vaatstelsel van kleine dieren voor kwantitatieve studies

Leer ACT-PRESTO voor weefselclearing en immunokleuring in de neurowetenschap met muizeweefsels. Deze methode maakt subcellulaire analyse van grote monsters zonder sneden mogelijk.

ACT-PRESTO: biologisch weefsel Clearing en immunokleuring Methoden voor Volume Imaging

Meer video's verkennen