ACT-PRESTO: biologisch weefsel Clearing en immunokleuring Methoden voor Volume Imaging

Het algemene doel van deze procedure is om het opgeruimde, intacte weefsel te verkrijgen en de driedimensionale moleculaire informatie ervan te visualiseren met behulp van immunolabelingmethoden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in de neurowetenschappen en ontwikkelingsbiologie, zoals neuronale verbindingen, moleculaire categorisering en structurele veranderingen tijdens de ontwikkeling. Het grote voordeel van deze techniek is dat weefsel duidelijk analyse op subcellulair niveau van grote specimens mogelijk maakt zonder te snijden.

Om deze procedure te starten, incubeer de gefixeerde organen in A4P0 Hydrogel monomeeroplossing bij vier graden Celsius gedurende 12 tot 24 uur met zacht schudden. Voeg daarna vijf milliliter Hydrogel monomeeroplossing toe aan een ronde bodembuis van 10 milliliter. Breng vervolgens het muizenhersenmonster over en wikkel de bovenkant van de buis met Parafilm.

Laat vervolgens stikstof gedurende één minuut door de vloeistof met het Hydrogel doordrenkte hersenmonster. Sluit snel en stevig de monsterbevattende buis. Breng de buis over naar een waterbad voor twee uur.

Controleer daarna de viscositeit van het Hydrogel en was vervolgens het gepolymeriseerde monster kortstondig met 0.1 X PBS om overtollig Hydrogel te verwijderen. In deze stap brengt u het gepolymeriseerde monster over naar een weefselcontainer. Plaats de weefselcontainer in de ETC-kamer.

Vul vervolgens de ETC-kamer met ETC-buffer met behulp van een peristaltische pomp. Stel de ETC-condities in en zet deze aan. Hersensneden van een tot twee millimeter dikte worden binnen twee uur opgeruimd.

En een hele hersenen worden binnen vijf tot zes uur voldoende opgeruimd. Breng vervolgens het monster over naar een conische buis van 50 milliliter met 45 milliliter 0.1 X PBS. Was het monster meerdere keren met 0.1 X PBS tot er geen bubbels meer zijn wanneer de buis kortstondig wordt geschud om volledige verwijdering van SDS te bevestigen.

Om c-PRESTO uit te voeren, breng een klein monster over in een buis van 1.5 milliliter. Voeg 500 microliter antilichaamverdunningsoplossing toe met een verdunningsfactor van één op 500 voor collageen type vier antilichaam en centrifugeer de buis gedurende twee uur bij 600 keer g. Was daarna het gekleurde monster met 0.1 X PBS door centrifugatie bij 600 keer g gedurende 30 minuten.

Voeg vervolgens 500 microliter antilichaamverdunningsoplossing toe met een verdunningsfactor van één op 500 voor Cy3 geconjugeerd Anti Rabbit secundair antilichaam en centrifugeer deze gedurende twee uur bij 600 keer g. Was vervolgens het gekleurde monster met 0.1 X PBS door centrifugatie bij 600 keer g gedurende 30 minuten. Om s-PRESTO voor groter weefsel uit te voeren, brengt u het monster over in een drieklemklep verbonden spuit in de gesloten kleppositie.

Voeg vijf tot zeven milliliter antilichaamverdunningsoplossing toe met een verdunningsfactor van één op 500 voor collageen type vier antilichaam. Voeg vervolgens de antilichaamoplossing toe aan het monster door de klep te openen. Stel vervolgens in de open kleppositie de spuitpomp in op de positie van 17 milliliter om voldoende ruimte te bieden voor de infuusintrekkingsbeweging.

Sluit vervolgens de drieklemklep nadat de spuitinstelling is voltooid. Plaats de spuit met het monster op een spuitpomp. Stel de spuitpompcondities in op een infuusintrekkingsvolume van tien milliliter per minuut en een pauzetijd van vier minuten in de continue cyclusmodus.

Laat vervolgens de spuitpomp drie tot 24 uur bij kamertemperatuur lopen. Open daarna de drieklemklep en vervang de oplossing door 0.1 X PBS. Was het gekleurde monster twee keer met 0.1 X PBS gedurende een uur per keer, met behulp van de spuitpomp.

Vervolgens vervangt u PBS door de antilichaamverdunningsoplossing met Cy3 geconjugeerd Anti Rabbit secundair antilichaam en laat de spuitpomp drie tot 24 uur lopen. Open daarna de drieklemklep en vervang de oplossing door 0.1 X PBS. Voorafgaand aan beeldvorming, incubeer het gekleurde monster in een geschikte hoeveelheid kubische montageoplossing gedurende één uur bij kamertemperatuur met zacht schudden.

Na een uur vervangt u de oplossing door verse kubische montageoplossing en incubeert u gedurende nog een uur. Aangezien antilichamen niet door diffusie in dicht weefsel kunnen doordringen, zijn PRESTO-immunolabelingmethoden ontworpen om macromoleculen actief te infunderen en reagentia in dicht weefsel af te geven. De toepassing van centrifugale krachten met behulp van een standaard tafelcentrifuge vergemakkelijkte de afgifte van antilichamen aanzienlijk.

Het toepassen van convectiestroom met een spuitpomp verbeterde ook de antilichaamboxtring. Voor s-PRESTO werd een spuitpomp gebruikt om de antilichamen af te geven. De muizenorganen, zoals nieren en lever, werden gelabeld met collageen type 4.

Vergeleken met de conventionele methoden verbeteren drie uur c of s-PRESTO de labeldiepte aanzienlijk. In de nieren en lever bereikt de diepte van de z-as 300 tot 350 micrometer of dieper in PRESTO-monsters, terwijl controlemonsters op een diepte van slechts 40 tot 50 micrometer worden gelabeld. Eenmaal onder de knie, kunnen deze technieken binnen een dag worden uitgevoerd voor duidelijk weefsel als ze correct worden uitgevoerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de tijd van weefselfixatie, Hydrogel monomeer emulsie en elektroforetisch weefsel duidelijk moet worden gehouden. Na de procedure kunnen andere methoden zoals immunolabeling worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals analyse van cellulaire dynamica en identificatie van een neuronaal stopcontact in meerdere organen. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van medische wetenschap om ziektediagnose te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u Hydrogel-inbedding en weefselpolymerisatie uitvo