Een eenvoudige manier om Veranderingen Meet in Reward-zoekend gedrag Met behulp Drosophila melanogaster

Het algemene doel van deze procedure is om ethanol zelftoediening bij fruitvliegen te meten als proxy voor veranderingen in beloningstoestanden. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de neurowetenschappen te beantwoorden, zoals hoe ervaring in de hersenen wordt gecodeerd en hoe dit leidt tot gedragsverandering. Het grote voordeel van deze techniek is dat het relatief eenvoudig is en geen ingewikkelde opstelling vereist.

Het protocol bestaat uit twee afzonderlijke delen. De eerste is het blootstellen van de vliegen aan belonende en niet-belonende ervaringen, en de tweede is het meten van vrijwillige ethanolconsumptie als maatstaf voor de motivatie om een ​​drugsbeloning te verkrijgen. De twee delen van het protocol kunnen onafhankelijk van elkaar worden gebruikt.

Om de modulatie van ervaring te induceren als eerste stap voor verdere downstream-assays, of als een onafhankelijke twee-keuze voedingstest. Het demonstreren van de procedure zullen Shir Zer, een masterstudent, en Julia Ryvkin, een afgestudeerde student, beide uit mijn lab, zijn. Om te beginnen met de constructie van de capillaire feeder, neem eerst een standaard vliegbuisje met kleine gaatjes langs de zijkant van de buis.

Gebruik een scheermes om de plug van de buis in het midden door te snijden. Markeer vier punten op het oppervlak van de plug, waardoor een vierkant ontstaat om de capillaire houders te positioneren. Maak met een 18-gauge naald vier gaten door de plug op de positie van de markeringen.

En maak de gaten breder met behulp van een micropipet. Gebruik een scheermes om vier micropipetten te snijden zodat ze vijf microliter glazen capillairen stevig vasthouden. Plaats deze in de gaten in de voorbereide plug.

Markeer de positie op de plug van de twee capillairen die ethanol zullen bevatten. Schik vervolgens glazen buisjes in microcentrifuge-rekken. Smelt vliegvoer en giet vervolgens twee milliliter in elk van de buisjes.

Laat het voer hard worden en bedek vervolgens de buisjes met plasticfolie. Begin met mannelijke vliegen die apart in kleinere buisjes zijn ondergebracht in afzondering. Wijs deze willekeurig toe aan twee groepen.

Degenen die belonende versus niet-belonende paringservaringen zullen ondergaan. Begin met de niet-belonende groep, voeg een eerder gepaarde vrouwelijke toe aan elk buisje. Ga verder naar de beloningsgroep en voeg een maagdelijke vrouwelijke toe aan elk buisje.

Bekijk de paringsscènes om ervoor te zorgen dat mannetjes die interactie hebben met maagdelijke vrouwtjes binnen het eerste uur met succes paren. En dat mannetjes die interactie hebben met eerder gepaarde vrouwtjes niet paren. Het is essentieel om zorgvuldig te observeren om er zeker van te zijn dat de gepaarde cohort inderdaad paart, en dat de afgewezen cohort niet in staat is om te paren.

Na een uur, verwijder uit het experiment alle mannetjes van de afgewezen cohort die erin slaagden te paren, en mannetjes van de gepaarde cohort die niet zijn gepaard aan het einde van de eerste trainingssessie. Beëindig de conditioneringssessie door de eerder gepaarde vrouwtjes uit de niet-belonende conditie te aspireren, houd deze individuen voor latere proeven. Verwijder en gooi ten slotte de vrouwtjes uit de gepaarde mannelijke groep.

Laat de vliegen een uur rusten en herhaal vervolgens de conditioneringssessie van een uur nog twee keer met een uur rust ertussen. Deze trainingssessies moeten nog eens drie dagen per dag worden herhaald. Na de laatste conditioneringssessie op dag vier, aspireer de enkele mannetjes en plaats ze in groepen van zes tot acht in de capillaire feederbuisjes, houd de vliegen in dezelfde beloningsgroep bij elkaar.

Gebruik een zachte plug om de mannetjes tijdens het overbrengen op hun plaats te houden. Zodra alle vliegen zijn geplaatst, vervang de zachte plug door de capillaire feeder plug. Bevochtig de pluggen door voorzichtig vijf milliliter water toe te voegen aan de bovenkant van elke plug, zonder morsen in het buisje.

Bereid de ethanol en water voedingsoplossingen voor en plaats vervolgens vijf microliter druppels hiervan op een strook laboratoriumfilm. Laat de oplossing de capillair vullen totdat deze de vijf microliter markering bereikt. Tik vervolgens voorzichtig op de strook om de oplossing precies op de vooraf gemarkeerde lijn te positioneren.

Versluit de uiteinden van de capillairen door ze in kleine druppels mineraal olie te dopen. Plaats ten slotte de twee ethanol bevattende en niet-ethanol bevattende capillairen in de adapters in de plug. De blootgestelde zijden moeten niet meer dan één millimeter uitsteken van het oppervlak van de plug.

Door de opening voor de capillairen dicht bij de natte plug te houden, wordt de verdamping verminderd en is er eenvoudige toegang tot het voedsel, aangezien vliegen normaal op de pluggen zitten en op de blootgestelde capillair afdalen om te voeden. Bereid bovendien een mockbuisje zonder vliegen voor, dat zal worden gebruikt als controle om de natuurlijke verdamping te beoordelen. Noteer ten slotte de relatieve positie van de vloeistof in elk van de capillairen in de buisjes met betrekking tot de zwarte lijn in millimeters.

Plaats de buisjes 24 uur in de experimentele incubator. Meet en noteer de niveaus van de vloeistof in elk verwijderd capillair ten opzichte van de zwarte lijn. Zodra het experiment aan de gang is, vervang het capillair op een vast tijdstip, elke dag.

Herbevochtig de pluggen met twee milliliter water en plaats de buisjes vervolgens terug in de incubator. Mannelijke fruitvliegen van de wilde type Canton S-stam die bij uitkomst werden verzameld en tot vier dagen oud werden, werden gedurende vier dagen onderzocht op hun aangeboren voorkeur voor alcoholconsumptie. Analyse van de volumes die werden geconsumeerd uit ethanol en niet-ethanol bevattende oplossingen, toont aan dat de vliegen een significante voorkeur vertoonden voor de 15% ethanol voedselbron.

Het CAFE-experiment werd herhaald met gepaarde versus afgewezen mannetjes. Beide groepen waren eerder individueel gehuisvest en blootgesteld aan vrouwtjes die paring accepteerden of afwezen. Bij introductie in groepen in de CAFE-buisjes, consumeerde de afgewezen groep meer van