Een eenvoudige manier om Veranderingen Meet in Reward-zoekend gedrag Met behulp

Het algemene doel van deze procedure is om de zelftoediening van ethanol bij fruitvliegen te meten als een proxy voor veranderingen in beloningsstatussen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de neurowetenschappen, zoals de vraag hoe ervaring in de hersenen wordt gecodeerd en leidt tot een aanpassing van het gedrag. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze relatief eenvoudig is en geen complexe opstelling vereist.

Het protocol bestaat uit twee afzonderlijke delen. Het eerste deel betreft het blootstellen van de vliegen aan belonende en niet-belonende ervaringen, en het tweede deel is het analyseren van de vrijwillige ethanolconsumptie als maatstaf voor de motivatie om een drug-beloning te verkrijgen. De twee delen van het protocol kunnen onafhankelijk van elkaar worden gebruikt.

Om de modulatie van ervaring te induceren als eerste stap voor verdere downstream-assays, of als een onafhankelijke voedingsassay met twee keuzes. De procedure zal worden gedemonstreerd door Shir Zer, een masterstudent, en Julia Ryvkin, een promovendus, beiden uit mijn laboratorium. Om te beginnen met de constructie van de capillaire voeder, neem eerst een standaard vliegenflesje met kleine gaatjes langs de zijkant van het flesje.

Gebruik een scheermesje om de stop van het flesje dwars doormidden te snijden. Markeer vier punten op het oppervlak van de stop, in de vorm van een vierkant, om de houders voor de capillairen te positioneren. Maak met een naald van 18-gauge vier gaatjes door de stop op de posities van de markeringen.

Maak de gaten vervolgens breder met een micropipet. Snijd met een scheermes vier micropipetten af, zodat ze vijf microliter glazen capillairen stevig vasthouden. Plaats deze in de gaten van de voorbereide plug.

Markeer de positie op de stop van de twee capillairen die ethanol zullen bevatten. Plaats vervolgens glazen vials in microcentrifugerekken. Smelt vliegenvoeding en giet daarna twee milliliters in elk van de vials.

Laat het voedsel uitharden en dek de vials vervolgens af met vershoudfolie. Begin met het nemen van mannelijke vliegen die apart in kleinere vials in isolatie zijn gehuisvest. Verdeel deze willekeurig over twee groepen.

Degenen die belonende versus niet-belonende paringservaringen zullen ondergaan. Begin met de niet-belonende groep en voeg aan elk buisje een reeds gepaarde vrouwtje toe. Ga vervolgens over naar de beloningsgroep en voeg aan elk buisje een maagdelijk vrouwtje toe.

Houd de paringsontmoetingen in de gaten om te bevestigen dat mannetjes die interactie hebben met maagdelijke vrouwtjes binnen het eerste uur succesvol paren. Controleer daarnaast dat mannetjes die interactie hebben met vrouwtjes die reeds gepaard zijn, niet paren. Het is essentieel om zorgvuldig te observeren om er zeker van te zijn dat de gepaarde cohort inderdaad een paring ondergaat en dat de afgewezen cohort niet in staat is om te paren.

Verwijder na één uur alle mannetjes uit de afgewezen cohort die erin slaagden om te paren, en de mannetjes uit de gepaarde cohort die aan het einde van de eerste trainingssessie niet zijn gepaard. Sluit de conditioneringssessie af door de eerder gepaarde vrouwtjes uit de niet-belonende conditie weg te aspireren en deze individuen te bewaren voor latere proeven. Verwijder tot slot de vrouwtjes uit de groep met gepaarde mannetjes en gooi deze weg.

Laat de vliegen een uur rusten en herhaal vervolgens de conditioneringstest van een uur nog twee keer, met telkens een rustperiode van een uur ertussen. Deze trainingssessies moeten gedurende nog drie dagen elke dag worden herhaald. Na de laatste conditioneringssessie op dag vier worden de solitaire mannetjes opgezogen en in groepen van zes tot acht in de capillaire voedingsbuisjes geplaatst, waarbij vliegen uit dezelfde beloningsgroep bij elkaar worden gehouden.

Gebruik een zachte dop om de mannetjes op hun plaats te houden tijdens de overplaatsing. Zodra alle vliegen zijn ingebracht, vervangt u de zachte dop door de dop van de capillaire voeder. Bevochtig de doppen door voorzichtig vijf milliliters water bovenop elke dop toe te voegen, waarbij u dient te voorkomen dat er water in het flesje morst.

Bereid de voedingsoplossingen van ethanol en water voor en breng vervolgens druppels van 5 µL hiervan aan op een strook laboratoriumfolie. Laat de oplossing de capillaire vullen tot het merkteken van 5 µL is bereikt. Tik vervolgens voorzichtig op de strook om de oplossing precies op de vooraf gemarkeerde lijn te positioneren.

Sluit de uiteinden van de capillairen af door ze in kleine druppels minerale olie te dopen. Plaats vervolgens de twee capillairen, waarvan één ethanol bevat en één geen ethanol bevat, in de adapters in de stop. De blootgestelde zijden moeten één millimeter of minder uitsteken boven het oppervlak van de stop.

Door de opening van de capillairen dicht bij de natte prop te houden, wordt de verdamping verminderd en is het voedsel gemakkelijk toegankelijk, aangezien vliegen normaal gesproken op de proppen zitten en naar beneden klimmen over de blootgestelde capillaire om te vreten. Bereid daarnaast één mock-vial zonder vliegen voor, die als controle zal dienen om de natuurlijke verdamping te beoordelen. Noteer tenslotte de relatieve positie van de vloeistof in elk van de capillairen in de vials ten opzichte van de zwarte lijn in millimeters.

Plaats de vials gedurende 24 uur in de experimentele incubator. Meet en noteer de vloeistofstanden in elke verwijderde capillair ten opzichte van de zwarte lijn. Zodra het experiment is gestart, vervangt u de capillair dagelijks op een vastgesteld tijdstip.

Maak de stoppen opnieuw vochtig met twee milliliters water en plaats de vials vervolgens terug in de incubator. Mannelijke fruitvliegen van het wild-type Canton S-stam, verzameld bij het uitkomen en verouderd tot vier dagen oud, werden gedurende vier dagen getest op hun aangeboren voorkeur voor de consumptie van alcohol. Analyse van de geconsumeerde volumes van ethanol- en niet-ethanolbevattende oplossingen laat zien dat de vliegen een significante voorkeur vertoonden voor de voedingsbron met 15% ethanol.

Het CAFE-experiment werd herhaald met gepaarde versus afgewezen mannetjes. Beide groepen waren voorheen individueel gehuisvest en blootgesteld aan vrouwtjes die paring ofwel accepteerden of afwezen. Na introductie in groepen in de CAFE-buisjes consumeerde de afgewezen groep meer uit de ethanolcapillairen.

Dit suggereerde dat een waargenomen gebrek aan beloning leidde tot een toename van beloningszoekend gedrag. Omgekeerd verhoogt succesvolle paring de interne beloningsniveaus, wat op zijn beurt het ethanolverbruik verlaagt. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om gedurende het gehele experiment een goed bevochtigde omgeving te handhaven, met extra nadruk op het consumptiegedeelte, door de proppen dagelijks te bevochtigen en de uiteinden van de capillairen dicht bij de natte proppen te houden.