Name: 2D en 3D matrices om Lineaire Invadosome Formatie en Activiteit te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Leer hoe je 2D en 3D matrices bereidt om lineaire invadosoomformatie en matrixdegradatie te bestuderen in primaire cellen en kankercellijnen. Deze methode helpt bij het begrijpen van celinvasie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JDM werd ondersteund door een PhD-fellowship van INSERM / Région Aquitaine en wordt nu ondersteund door een post-doctorale ARC-gemeenschap en het Tischkankerinstituut aan de Sinai School of Medicine. EH wordt ondersteund door een promovendus van de Ministère de l&#39;Enseignement Supérieur et de la Recherche. ZE wordt ondersteund door een postdoctorale gemeenschap van Agence Nationale de la Recherche (ANR). CM wordt ondersteund door het Tischkankerinstituut aan de Mount Sinai School of Medicine en JJBC wordt ondersteund door de NIH / NCI-subsidie ​​K22CA196750, het JRR-fonds voor Kankeronderzoek TCI Young, en het Tischkankerinstituut aan de Sinai School of Medicine. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS wordt ondersteund door de &quot;Ligue nationale contre le cancer&quot;. VM en FS worden ondersteund door financiering van &quot;Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016&quot; en Institut National du Cancer, INCA_8036 en PLBio2012.

OPMERKING: Alvorens de fixatie te voltooien, worden alle stappen ingevuld in een steriele laminaire stroomkap. 1. 2D matrix OPMERKING: 2D matrices worden gebruikt om het percentage cellen te bepalen die invadosomen vormen en het matrixafbraakgebied per cel bepalen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig1.jpg" /> Figuur 1: Protocol. Samenvatting van het protocol dat wordt gebruikt om gelatine- en collageen I-matrices te bereiden. Het is mogelijk om alleen de gelatine matrix of een gelatine- en collageen I gemengde matrix te maken. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol><li> Gelatine matrix OPMERKING: Fluorescerende gelatine matrices worden gebruikt om matrixdegradatie te kwantificeren, en niet-fluorescerende gelatine wordt gebruikt om de hechting van collageen I vezels te bevorderen. Fluorescerende gelatine matRijstjes worden ook gebruikt voor podosome en invadopodia studies (zie figuur 1 ). <ol><li> Plaats onder een steriele laminaatstroomkapje een stuk parafilm (20 cm x 15 cm) op het werkgebied en desinfecteer het met 70% ethanol. </li><li> Aliquot 20 μL druppels van 1 mg / ml gelatine in een lijn, op afstand ongeveer 1 cm van elkaar; Verwijzen naar figuur 1 voor druppelorganisatie. </li><li> Bedek elke 20 μL gelatine druppel met een geautoclaveerde glazen deklaag (12 mm in diameter). </li><li> Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Als de gelatine fluorescent is, bescherm het tegen licht. </li><li> Aliquot 40 μL druppels van 0,5% glutaraldehyde in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) in een lijn, die elk ongeveer 1 cm onder de lijn van de dekglazen van stap 1.1.3 liggen. VOORZICHTIG: Glutaraldehyde is een giftig fixatief middel. Gebruik handschoenen en niet inademen. </li><li> Met behulp van juwelkleurige pennen, overdragen elke gelatine bedekte deklaag naar een glutaraldehyde druppel. Noteer hetIs normaal dat een kleine gelatine druppel op de parafilm blijft. Gebruik dit niet opnieuw voor een ander experiment. </li><li> Incubeer gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur. Voor fluorescerende deklagen, bescherm ze tegen licht. </li><li> Neem een ​​24-putjes celkweekplaat en vul elke put met 500 μL steriele 1x PBS. Leg de dekglazen, gelatine kant omhoog, in elke put. </li><li> Wassen twee keer in 1x PBS gedurende 5 minuten elk. OPMERKING: Bij deze stap kunnen de deklagen worden gebruikt voor experimenten of opgeslagen in 1x PBS bij 4 ° C. Niet-fluorescerende deklagen kunnen voor een week worden opgeslagen, en fluorescerende deklips kunnen 48 uur opgeslagen worden. </li></ol></li><li> Fibriele collageen type I matrix OPMERKING: Fibriele collageen type I matrix wordt gebruikt om lineaire invadosoomvorming en de bijbehorende matrixdegradatie te bestuderen. Een combinatie van fluorescerende collageen I en niet-fluorescerende gelatine deksellips wordt gebruikt om invadosom markers te co-localiseren met collageenvezels (bijvoorbeeld F-actine iN het verre rode kanaal, collageen I in het rode kanaal, Tks5 in het groene kanaal en Hoechst verven voor een kernvlek). Aan de andere kant wordt een combinatie van niet-fluorescerende collageen I met niet-fluorescerende gelatine-deklagen gebruikt om het aantal geïnduceerde invadosoommarkers te maximaliseren (bijvoorbeeld F-actine in het verre rode kanaal, cortactine in het rode kanaal, Tks5 in Het groene kanaal en Hoechst kleurstof voor een kernvlek). Tenslotte wordt een combinatie van niet-fluorescerende collageen I met fluorescerende gelatine-deklagen gebruikt om de gelatine-geassocieerde afbraak te kwantificeren (bijvoorbeeld F-actine in het verre kanaal, Tks5 in het rode kanaal, in het groene kanaal en Hoechst-kleurstof Voor een kernvlek) (zie figuur 1). Hoechst-kleurstof is gebruikt om de kern te vleken, en controleert ook op mycoplasma-verontreiniging, naast een PCR-test die regelmatig wordt uitgevoerd op de gebruikte cellijnen. <ol><li> Fluorescerende collageen I <ol><li> Gebruik commercieel collageen I geëxtraheerd uit rat-tail pezen in 0,02 N acetic acidd. Verwijder de hoeveelheid collageen die ik nodig heb om 500 μL oplossing per deklaag te bereiden bij een uiteindelijke concentratie van 0,4 mg / ml collageen I. </li><li> Voeg 5-carboxy x rhodamine succinimidyl ester toe bij een uiteindelijke concentratie van 10 μg / ml, berekend voor het uiteindelijke volume van collageen I oplossing (nx 500 μl). </li><li> Meng de oplossing door pipettering omhoog en omlaag en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. </li><li> Verdun tot het eindvolume met 1X Dulbecco&#39;s fosfaatbufferde zoutoplossing (DPBS) die calcium en magnesium bevat en direct gebruiken. </li></ol></li><li> Fibrillair collageen I deklaag <ol><li> Gebruik de niet-fluorescerende of fluorescerende gelatine deklagen die eerder in stap 1.1 zijn voorbereid. </li><li> Bereid een oplossing van fluorescerende of niet-fluorescerende collageen I bij een uiteindelijke concentratie van 0,4 mg / ml in 1X DPBS die calcium en magnesium bevatten. </li><li> Voeg 500 μL fluorescerende of niet-fluorescerende collageen I oplossing perDeklip in een celkweekplaat met 24 putjes. </li><li> Incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C voor collageen I-polymerisatie. </li><li> Verwijder na het incuberen het overtollige collageen I door de plaat en de pipettering aan de zijkant van de put te kantelen (niet direct op de deklaag) om de matrix te beschadigen. OPMERKING: Deze matrix kan niet worden opgeslagen. Zaad de cellen onmiddellijk na het verwijderen van overtollig collageen I. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Cellseeding, tijd van cultuur en fixatie <ol><li> Afhankelijk van het celtype, bereid de cellen in het geschikte kweekmedium en voeg cellen toe voor een eindvolume van 500 μl per putje. </li><li> Om de capaciteit van een cellijn te vormen om lineaire invadosomen te vormen en de matrix te degraderen, plaatst u de cellen gedurende 4 uur, 12 uur en 24 uur op collageen I matrix om de kinetiek van lineaire invadosoomvorming en de bijbehorende afbraakactiviteit te bepalen. OPMERKING: Tabel 1 bevat voorbeelden van cellijnenGetest in het laboratorium. <table border="1"><tbody><tr><td> Cellijn </td><td> Aantal cellen per coverlip </td><td> Tijd van contact met matrix voor lineaire invadosoom kwantificering </td><td> Tijd van contact met matrix voor kwantificering van lineaire invadosoom degradatie activiteit </td></tr><tr><td> MDA MB 231 </td><td> 40.000 </td><td> 4 uur </td><td> 12 uur </td></tr><tr><td> HUH7cellen </td><td> 40.000 </td><td> 12 uur </td><td> 24 uur </td></tr><tr><td> HEP 3B </td><td> 40.000 </td><td> 12 uur </td><td> 24 uur </td></tr><tr><td> SNU 398 </td><td> 40.000 </td><td> 12 uur </td><td> 24 uur </td></tr><tr><td> NIH 3T3 src </td><td> 30.000 </td><td> 4 uur </td><td> 12 uur </td></tr><tr><td> A431 </td><td> 50.000 </td><td> 6 uur </td><td> 24 uur </td></tr><tr><td> A549 </td><td> 40.000 </td><td> 12 uur </td><td> 24 uur &amp;# 160; </td></tr><tr><td> RAW </td><td> 40.000 </td><td> 12 uur </td><td> 12 uur </td></tr><tr><td> PAE </td><td> 40.000 </td><td> 12 uur </td><td> 12 uur </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Cellseeding en incubatietijdreferentie. Deze tabel bevat een niet-exhaustieve lijst van cellijnen die worden gebruikt om lineaire invadosomen te bestuderen. Het geeft het aantal cellen aan zaad op de matrix aan, de tijd die nodig is om lineaire invadosomen te waarnemen en de tijd die nodig is om de bijbehorende matrixdegradatie te waarnemen. Lineaire invadosomen hebben een korte levensduur. Om lineaire invadosomen in het maximale aantal cellen te kunnen observeren, moeten de cellen gedurende een korte tijd in contact staan ​​met de collageenmatrix. Aan de andere kant, om de gerapporteerde gelatine degradatie te kunnen visualiseren, moeten de cellen gedurende een langere tijd in contact komen met de collageenmatrix dan die welke hierboven zijn vermeld. </li><li> Na de verwijdering van het celkweekmedium,Reinig de dekglazen gedurende 10 minuten in 500 μl 4% paraformaldehyde in 1X PBS. </li><li> Was twee keer met 1x PBS. </li><li> Bewaar bij 4 ° C, beschermd tegen licht. </li></ol> 3. Immunofluorescentie <ol><li> Permeabiliseer de cellen gedurende 10 minuten met een vers bereide oplossing Van 0,2% Triton X-100 in 1x PBS. Gebruik deze oplossing niet opnieuw. </li><li> Was de deklips tweemaal met 1x PBS. </li><li> Plaats een stuk parafilm (20 cm x 15 cm) op de bank. </li><li> Verdun primair antilichaam in 4% boviene serumalbumine (BSA) in 1x PBS, zoals beschreven in de Material Table . </li><li> Aliquot 50 μL druppels van primaire antilichaamoplossing in een lijn, elk op een afstand van ongeveer 1 cm van elkaar. </li><li> Plaats elke deklaag op een druppel. </li><li> Incubeer gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. </li><li> Na de incubatieperiode wassen twee keer met 1x PBS. </li><li> Verdun het secundaire antilichaam, phalloidine en Hoechst-kleurstof in 4% BSA in 1xPBS. </li><li> Aliquot 50 μL druppels van de mix, elk van elkaar geplaatst ongeveer 1 cm onder de eerste lijn van de dekglazen, zoals eerder gedaan. </li><li> Plaats elke deklaag op een druppel. </li><li> Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. </li><li> Na incubatie, wassen twee keer met 1x PBS. </li><li> Was eens met gedestilleerd water om de zouten te verwijderen. </li><li> Monteer de deklagen op een glazen glijbaan met polymerisatie montage medium. </li><li> Laat de dekglazen overnachten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, voor microscopie. </li></ol> 4. Kwantificaties <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig2.jpg" /> Figuur 2: Lineaire invadosome kwantificering. De macro vereist confocale beelden van F-actin en Tks5-kleuring (formaat: 1.024 x 1.024). ( A ) Eerst, open de F-actin foto en maak een masker. ( B ) Open danDe Tks5 foto en drempel het. Pas de macro toe. ( C ) Geanalyseerde resultaten worden in twee tabellen weergegeven. Het aantal lineaire invadosomen per cel en andere informatie, zoals het percentage gebied dat wordt gebruikt door lineaire invadosomen in de cel, staat in de samenvattingstabel. De grootte van elke lineaire invadosoom komt in de tabel Resultaten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol><li> Percentage cellen die lineaire invadosomen vormen <ol><li> Tel de cellen die lineaire invadosomen vormen, ongeveer 100 cellen per deklaag (gebruik technische triplicaten). Kwantificeer tenminste 300 cellen per n, met n = 3. </li><li> Bereken het percentage cellen dat lineaire invadosomen vormt door het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten te berekenen, wat resulteert in 900 gekwantificeerde cellen. </li></ol></li><li> Lineaire invadosoomgrootte en aantal per cel <li> Gebruik ImageJ met de aanvullende macro. </li></ol></li><li> Degradatie per cel <ol><li> Gebruik drie deklips per voorwaarde. </li><li> Neem 30 afbeeldingen per deklaag van fluorescerende gelatine en Hoechst-gekleurde kernen. </li><li> Gebruik de ImageJ software zoals beschreven in Martin KH et al. 9 . </li></ol></li></ol> 5. 3D-collageen Invasion Assay <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig3.jpg" /> Figuur 3: Invasie assay schema. Samenvatting van het invasie assay protocol. Collageen I is verknoopt met succinimidylester kleurstof en gepolymeriseerd gedurende 1 uur bij 37 ° C. Cellen worden toegevoegd in serumvrij medium bovenop de collageen I-stekker. Het inzetstuk wordt in medium wi geplaatstDe 10% FBS. Collageen I proppen worden 1 uur vastgelegd na het zaaien van cellen in de controle en 3 dagen na het zaaien van cellen in de experimentele conditie om de invasiecapaciteit van de cellen te bepalen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol><li> Collageen I plug voorbereiding <ol><li> Maak een tijdsbaan van 4 uur, 12 uur, 24 uur, 48 uur en 72 uur voor het eerste experiment om de kinetiek van invasie in de gel volgens het celtype te bepalen. Voor elk experiment voegt u een 1 h tijdspunt toe als referentie tijdpunt wanneer er geen invasie plaatsvindt. </li><li> Bereid de collageen I oplossing op ijs onder een steriele laminar flow hood. Bereid 500 μL oplossing voor 3 Boyden kamerinzetten. </li><li> Aspireren 1 mg commercieel rat-staart collageen I om een ​​oplossing te bereiden met een uiteindelijke concentratie van 2 mg / ml collageen I. </li><li> Voeg 5-carboxy x Rhodamine succinimidyl ester bijEen uiteindelijke concentratie van 1 μg / ml, berekend voor het uiteindelijke volume van collageen I oplossing (in dit geval 500 μl). </li><li> Meng goed en incubeer gedurende 5 minuten op ijs onder de steriele laminaire stroomkap, beschermd tegen licht. </li><li> Voeg 50 μl ijskoud, gefilterd 10X PBS en 6,25 μl ijskoud 1 M natriumhydroxide (NaOH) toe. </li><li> Voeg steriel water volgens de formule 443.75 - x ul collageen I. </li><li> Voeg 100 μL oplossing per Boyden kamerinzet toe. </li><li> Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C om polymerisatie mogelijk te maken. </li><li> Voeg celcultuurmedium verrijkt met foetaal runder serum (FBS) in nieuwe putjes toe; Plaats inzetstukken in deze putjes. </li><li> Zaad 30.000 cellen bovenop het collageen. Ik steek het FBS-vrije medium in. </li><li> Nadat u de cellen bij 37 ° C hebt gekweekt, fixeer de collageen I-plug gedurende 30 minuten in 4% paraformaldehyde in 1x PBS. </li><li> Volledige immunofluorescentie zoals in stap 3, met uitzondering van de volgende stappen: permeabiliZe met 0,2% Triton X-100 in 1x PBS gedurende 30 minuten, niet 10 minuten; Incuberen met primaire en secundaire antilichaamoplossingen gedurende 1,5 uur elk, in plaats van respectievelijk 40 minuten en 30 minuten. Vlek voor F-actine of kernen om de cellen te lokaliseren. </li><li> Na immunofluorescentie, gebruik een scalpel om het membraan van het inzetstuk te snijden en zorg ervoor dat de collageen I-stekker voorzichtig overgaat naar een glazen bodemschotel. Zorg ervoor dat de bovenkant van de collageen I-stekker in contact is met het glas. Houd het inzetmembraan vast aan de onderkant van de collageen I-stekker om de integriteit van de stekker te handhaven. OPMERKING: De collageen I-stekker blijft intact in de glasbodemschotel. De diepte tussen de glazen bodem en het plastic rondom de glazen bodem is gelijk aan de dikte van de stekker. </li><li> Plaats een deksel op de collageen die ik stekker en monteer met polymerisatie montage medium om te voorkomen dat de stekker uitdroogt. </li><li> Gebruik een omgekeerde confocale microscoop om de collageen die ik stekker aan te geven; de top vanDe stekker is in contact met de glazen bodem van de schotel. <ol><li> Verkrijg een z-stapel van de top naar de onderkant van het collageen, ik plug in om de invasie van een cel te visualiseren. Bepaal de dikte van de z-stapel door te onderzoeken hoe diep de cellen het beeldgebied binnendringen. Doe acquisities met een 40X olie doelstelling in een 512 x 512 formaat met een z-step grootte van 0.25 μm. OPMERKING: ter referentie is de gemiddelde z-stapel voor MDA-MB-231 cellen 3 dagen na het zaaien 30 μm. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+signature+of+metastasis+in+primary+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A molecular signature of metastasis in primary solid tumors.</a> Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).</li>
<li>Gilkes, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+prolyl+hydroxylases+are+essential+for+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis.</a> Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).</li>
<li>Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degrading+Devices%3A+Invadosomes+in+Proteolytic+Cell+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).</li>
<li>Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27ins%27+and+%27outs%27+of+podosomes+and+invadopodia%3A+characteristics%2C+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).</li>
<li>Di Martino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+and+Tks5%3A+a+minimal+and+universal+molecular+signature+for+functional+invadosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh.+Migr%22%5BJournal%5D)">Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes.</a> Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).</li>
<li>Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+invasion+by+tumour+cells%3A+a+focus+on+MT1-MMP+trafficking+to+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia.</a> J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).</li>
<li>Juin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+type+I+collagen+organization+induces+the+formation+of+a+novel+class+of+linear+invadosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes.</a> Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).</li>
<li>Juin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discoidin+domain+receptor+1+controls+linear+invadosome+formation+via+a+Cdc42-Tuba+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway.</a> J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).</li>
<li>Martin, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+invadopodia-mediated+extracellular+matrix+proteolysis+in+single+and+multicellular+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts.</a> J. Vis. Exp. , e4119(2012).</li>
<li>Diaz, B. <a target="_blank" href="http://www.bio-protocol.org/e997">Invadopodia detection and gelatin degradation assay.</a> Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).</li>
<li>Artym, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dense+fibrillar+collagen+is+a+potent+inducer+of+invadopodia+via+a+specific+signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network.</a> J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).</li>
<li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocytes+assemble+podosomes+that+degrade+matrix+and+protrude+through+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane.</a> Blood. 121, 2542-2552 (2013).</li>
<li>Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+invasion+assays%3A+native+basement+membrane+and+chemoinvasion+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay.</a> Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).</li>
<li>Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amoeboid+shape+change+and+contact+guidance%3A+T-lymphocyte+crawling+through+fibrillar+collagen+is+independent+of+matrix+remodeling+by+MMPs+and+other+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases.</a> Blood. 102, 3262-3269 (2003).</li>
<li>Geraldo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+cancer+cells+have+distinct+adhesions+in+3D+collagen+matrices+and+in+vivo%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?</a> Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).</li>
<li>Monteiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+WASH+and+exocyst+complexes+control+exocytosis+of+MT1-MMP+at+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia.</a> J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Klassiek worden invadosomen in vitro bestudeerd, zonder inachtneming van de micro-omgeving en de matrix waarop de cellen zijn geplateerd. Verschillende soorten matrices worden momenteel gebruikt, waaronder gelatine, fibronectine, vitronectine of hoge dichtheidsfibrillair collageen (HDFC) 7 , 11 ; Echter zijn deze vaak niet representatief voor de micro-omgeving waarin cellen zich bevinden en niet fysiologisch relevant zijn. Hier wordt een nieuw type matr...

Extracellulaire matrix (ECM) remodeling komt voor tijdens fysiologische en pathologische processen, zoals angiogenese en tumorcel invasie. In fysiologische omstandigheden kunnen veel celltypes, meestal uit de hematopoietische afstamming, ECM-elementen afbreken. Macrofagen kunnen bijvoorbeeld anatomische barrières oversteken om weefsels te bereiken, en osteoclasten verlagen botmatrix om calciumhomeostase te waarborgen. Wereldwijd vernieuwen alle matrices in het lichaam hun fysieke en chemische eigenschappen. In kankerweefsels verandert de micro-omgeving van de tumor. Bijvoorbeeld bij borst- en longkanker wordt type I collageen overexpresseerd en verzamelt zich rond de tumor. Bovendien is deze accumulatie geassocieerd met een verhoogd risico op het ontwikkelen van metastase 1 , 2 . Kankermetastase is afhankelijk van het vermogen van kankercellen om de ECM te degraderen en aanliggende weefsels te invallen. DeInvasieve activiteit van cellen wordt toegeschreven aan gespecialiseerde actinrijke structuren die bekend staan ​​als invadosomen. Deze term omvat podosomen en invadopodia, die respectievelijk aanwezig zijn in normale en kankercellen (bijvoorbeeld macrofagen , endotheelcellen en kankercellen zoals de MDA-MB-231 borstkanker cellijn). In vitro kunnen invadosomen in verschillende vormen organiseren: stippen, aggregaten of rozetten 3 . Klassiek zijn invadosomen samengesteld uit een F-actin-kern die verscheidene eiwitten bevat, zoals het steigerproteïne Tks5 en cortactine, omringd door hechtingsplaatmoleculen, zoals integrins en vinculine 4 . Recent werd aangetoond dat Tks5 en de RhoGTPase Cdc42 als minimum moleculaire handtekening voor functionele invadosomen 5 kunnen worden gebruikt. Deze structuren zijn in staat om de ECM te degraderen via de werving en activatie van specifieke metalloprotease-eiwitten, zoals MT1-MMP en MMP-2 6. In een eerdere studie hebben we gemeld dat de interactie tussen type I collageenfibrillen en de discoidin domeinreceptor 1 (DDR1), een specifieke receptor van type I collageenfibrillen, leidt tot de vorming van een nieuwe klasse invadosomen, genaamd lineaire invadosomen. Lineaire invadosomen worden gevormd langs type I collageenfibrillen 7 . Deze structuren kunnen type I collageenfibrillen afbreken via de werving en activering van MT1-MMP / MMP2. Bovendien is hun vorming afhankelijk van Tks5 en Cdc42 5 . In vitro hebben we het bestaan ​​van lineaire invadosomen en de betrokkenheid van DDR1 in hun vorming en activiteit 8 aangetoond door gebruik te maken van verschillende strategieën die bestaan ​​uit een combinatie van verschillende matrixelementen, waaronder: i) fluorescerende gelatinecoated deklagen, ii) collageenfibril fluorescent type I -coated coverlips, en iii) 3D type I collageen pluggen. Door het gebruik van verschillende matrices waren we in staat om te studeren en karakterIze lineaire invadosome vorming en hun afbraakactiviteit 7 , 8 . Tenslotte, om de biologie van invasieve cellen beter te begrijpen, werden een combinatie van ECM-componenten in zowel 2D- als 3D-cultuursystemen gebruikt, die de complexiteit van de micro-milieusamenstelling van de tumor nabootsen. Hieronder staan ​​protocollen voor coatingslips met gelatine / type I collageen in 2D en 3D-cultuur systemen.

<table><tbody><tr><td>Gelatin solution</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td>Stock 20 mg/ml gebruikt bij 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate</td><td>Molecular probe life technologies</td><td>G13186</td><td>5mg verdunnen tot 1 mg/ml in steriel water</td></tr><tr><td>Microscope cover glasses</td><td>Marlenfeld GmbH &amp; Co</td><td>111520</td><td>&Oslash;12mm No.1</td></tr><tr><td>2.5% Glutaraldehyde in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4</td><td>Electron microscopy science</td><td>15960</td><td>Verdunnen tot 0.5% in steriel water</td></tr><tr><td>1x PBS pH 7.4</td><td>Gibco by life technologies</td><td>10010-015</td><td>Gebruik deze PBS in alle stappen vóór fixatie</td></tr><tr><td>Collagen I Rat tail</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>5 carboxy X rhodamine siccinimidyl ester</td><td>Life technologies</td><td>C-6125</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x + calcium + magnesium</td><td>Gibco by life technologies</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% oplossing</td><td>Electron microscopy science</td><td>15710</td><td>Verdunnen tot 4% in 1X PBS</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS buffer pH 7.4</td><td>Ambion</td><td>AM9625</td><td>Verdunnen tot 1X in water Gebruik in stappen na fixatie</td></tr><tr><td>Tks5 antilichaam</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-30122</td><td>Invadosome markers Verdunning: 1/100</td></tr><tr><td>Cortactin 4F11 antilichaam</td><td>Millipore</td><td>5180</td><td>Invadosome markers Verdunning: 1/100</td></tr><tr><td>DDR1 antilichaam</td><td>Cell signaling</td><td>5583</td><td>Lineaire invadosome receptor</td></tr><tr><td>Verdunning: 1/100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin FluoProbes</td><td>Interchim</td><td>FT-AZ0330</td><td>Fibrillair actin marker Verdunning: 1/200</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>33258</td><td>Kern marker Verdunning: 1/200</td></tr><tr><td>Secundaire antilichamen FluoProbes</td><td>Interchim</td><td>FP-488 FP-547H of FP-647H</td><td></td></tr><tr><td>Albumine uit runder serum</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Verdunnen tot 4% in 1X PBS</td></tr><tr><td>Fluoromount G montage medium</td><td>Interchim</td><td>FP 483331</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>Public domain</td><td></td><td>http://www.macbiophotonics.ca/imagej/</td></tr><tr><td>Cell culture insert</td><td>Corning</td><td>353097</td><td>8.0&micro;m poriëngrootte / 24 putjes</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr></tbody></table>

2d en 3d matrices om lineaire invadosome formatie en activiteit te bestuderen

2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Celhechting, migratie en invasie zijn betrokken bij veel fysiologische en pathologische processen. Bijvoorbeeld bij de vorming van de metastase moeten tumorcellen anatomische barrières oversteken om in te vallen en door het omringende weefsel te migreren om bloed of lymfevaten te bereiken. Dit vereist de interactie tussen cellen en de extracellulaire matrix (ECM). Op cellulaire niveau kunnen veel cellen, waaronder de meerderheid van de kankercellen invadosomen vormen, die F-actin gebaseerde structuren vormen die ECM kunnen degraderen. Invadosomen zijn protrusieve actin structuren die matrix metalloproteinases (MMPs) werven en activeren. De moleculaire samenstelling, dichtheid, organisatie en stijfheid van de ECM zijn cruciaal bij het reguleren van invadosome vorming en activatie. In vitro is een gelatine-assay de standaardassess die gebruikt wordt om invadosome degradatieactiviteit te observeren en te kwantificeren. Gelatine, die gedenatureerd collageen I is, is echter geen fysiologische matrix element. Een nieuwe test met behulp van type I collageenfibrillen werd ontwikkeld en gebruikt om aan te tonen dat deze fysiologische matrix een krachtige inductor van invadosomen is. Invadosomen die langs de collageenfibrillen vormen, staan ​​bekend als lineaire invadosomen door hun lineaire organisatie op de vezels. Bovendien liet de moleculaire analyse van lineaire invadosomen zien dat de discoidin-domeinreceptor 1 (DDR1) de receptor is die bij hun vorming betrokken is. Deze gegevens tonen duidelijk aan het belang van het gebruik van een fysiologisch relevante matrix om de complexe interacties tussen cellen en de ECM te begrijpen.

Met behulp van een combinatie van twee soorten matrices, gelatine en type I collageen ( figuren 1 en 4 ) hebben we een nieuw type invadosome, bekend als lineaire invadosomen, gemarkeerd. De etikettering van deze matrices zorgt voor de observatie van lineaire invadosome vorming langs collageen I vezels en van hun afbreekmogelijkheden ( Figuur 5 ). Het aantal invasieve structuren kan dan gekwantificeerd worden door de eerder beschreven mac...

Dit protocol beschrijft hoe u een 2D gemengde matrix voorbereidt, bestaande uit gelatine en collageen I, en een 3D collageen I plug om lineaire invadosomen te bestuderen. Deze protocollen staan ​​voor de studie van lineaire invadosoomvorming, matrixdegradatieactiviteit en de invasiemogelijkheden van primaire cellen en kankercellijnen.

2D en 3D matrices om Lineaire Invadosome Formatie en Activiteit te bestuderen

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

Onze groep werkt aan de interactie tussen cel en extracellulaire matrix. Cellen kunnen het extracellulaire matrixelement produceren, maar ook afbreken. Degradatie van de matrix kan optreden tijdens fysiologische maar ook bij pathologische processen, zoals neurodegeneratie en de invasie van celtumoren.Op cellulair niveau kunnen we de aanwezigheid van actin-gebaseerde structuren opmerken die betrokken zijn bij de afbraak van de matrix. En deze structuren worden invadosomes genoemd. Invadosome, het is een algemene term die podosome omvat in normale cellen en invadopodia in kankercellen.De degradatie van dit invadosome kan zichzelf organiseren in verschillende vormen, stippen, aggregaten en roosjes. En de activiteit van dit invadosome wordt aangedreven door metalloproteïnasen, zoals MMP2 en MT1-MMP. Het is niet lang geleden dat het paar, MMP2, MT1-MMP wordt geactiveerd door de type 1 collageen fibrillen.Om de activiteit van invadosomes te bestuderen, werd een klassieke zymografie in-situ assay gebruikt. Maar om de rol en impact van type 1 collageen fibrillen in invadosomes te bestuderen, besloten we om een nieuwe assay te creëren. Om dit te doen, creëerden we een gemengde matrix bestaa

2d-and-3d-matrices-to-study-linear-invadosome-formation-and-activity

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Modellen van de tumorcel invasie in drie-dimensionale extracellulaire matrix beter aansluiten bij...

Modeling and Imaging 3-Dimensionale Collectief Cell Invasion

Cellulaire processen zoals celmigratie van oudsher bestudeerd op twee-dimensionale, stijve kunststof oppervlakken. Dit rapport beschrijft een techniek voor het direct visualiseren eiwit lokalisatie en het analyseren van eiwitten dynamiek in cellen migreren in een meer fysiologisch relevante, drie-dimensionale matrix.

Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix

We beschrijven de prototypische werkwijze voor het produceren microscoop dekglaasje bedekt met fluorescent gelatine visualiseren invadopodia-gemedieerde matrixafbraak. Rekentechnieken met beschikbare software gepresenteerd voor het kwantificeren van de niveaus van resulterende matrix proteolyse door enkele cellen in een gemengde populatie en voor meercellige groepen omvat gehele microscopische velden.

Kwantitatieve meting van Invadopodia-gemedieerde extracellulaire matrix proteolyse in Single en Meercellige contexten

Dit artikel behandelt een methode om fluorescerend label collageen dat verder kan worden gebruikt voor zowel vaste en levende beeldvorming van 3D celculturen. Wij bieden ook een geoptimaliseerd protocol om endogene cytoskeleteiwitten van cellen gekweekt in 3D-omgevingen te visualiseren.

Het openbaren van de organisatie van het cytoskelet van invasieve kankercellen in 3D

Dit protocol bestudeert efficiënt zoogdieren celdeling in 3D collageen matrices door de integratie van de synchronisatie van de celdeling, toezicht op divisie gebeurtenissen in 3D-matrices met behulp van live-cel beeldvormende techniek, time-resolved confocal reflectie microscopie en kwantitatieve analyse van beeldvorming.

Zoogdieren celdeling in 3D-Matrices via reflectie van kwantitatieve confocale microscopie

Dit protocol beschrijft een omgekeerde verticale invasie-bepaling die kan worden gebruikt om het kwantificeren van de mogelijkheden voor migratie en invasie van cellen in een driedimensionale omgeving met behoud van de cel-communicatie. Deze test is geschikt voor zeldzame en/of gevoelige cellen.

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Het huidige protocol beschrijft een geïntegreerde methode onderzoek naar kanker cel migratie en invasie op één platform in real-time, het verstrekken van een gemakkelijk reproduceerbaar zijn en tijd-efficiënte optie te bestuderen van de cel mobiliteit en morfologie.

Een eenvoudige migratie/invasie Workflow met behulp van een geautomatiseerde Live-cel Imager

Tumor microenvironment is een essentieel onderdeel van kankergroei en invasie. Om kanker progressie na te bootsen, is een biologisch relevante menselijke matrix nodig. Dit protocol introduceert een verbetering voor de drie-dimensionale sferoïde invasie assay in vitro door het toepassen van een menselijke leiomyoma-gebaseerde matrix. Het protocol introduceert ook een computer-based cel invasie analyse.

Volledig menselijke tumor-gebaseerde matrijs in driedimensionele sferoïde invasie assay

Invasie is een belangrijk biologisch fenomeen bij de ontwikkeling en progressie van kanker. Dit proces wordt beïnvloed door niet-neoplastische cellen en componenten van de micro-omgeving van de tumor. Het doel van deze studie is het beschrijven van een alternatieve methode voor het analyseren van tumorcelinvasie in vitro met behulp van driedimensionale (3D) culturen.

Alternatieve strategie om in vitro celinvasie van 3D-culturen te analyseren

Een cyclische druk bioreactor in staat om onderwerpen hartklep tissue om fysiologische en pathologische condities druk is ontworpen. Een LabVIEW programma stelt gebruikers in staat om de controle druk omvang, amplitude en frequentie. Dit apparaat kan gebruikt worden om de Mechanobiologie van hartklep tissue of geïsoleerde cellen te bestuderen.

Ontwerp van een Cyclic Pressure Bioreactor voor de Ex Vivo Studie van Aorta hartkleppen

Leer hoe je 2D en 3D matrices bereidt om lineaire invadosoomformatie en matrixdegradatie te bestuderen in primaire cellen en kankercellijnen. Deze methode helpt bij het begrijpen van celinvasie.

2D en 3D matrices om Lineaire Invadosome Formatie en Activiteit te bestuderen

Meer video's verkennen