2D en 3D matrices om Lineaire Invadosome Formatie en Activiteit te bestuderen
2 juni 2017
Dit protocol beschrijft hoe u een 2D gemengde matrix voorbereidt, bestaande uit gelatine en collageen I, en een 3D collageen I plug om lineaire invadosomen te bestuderen. Deze protocollen staan voor de studie van lineaire invadosoomvorming, matrixdegradatieactiviteit en de invasiemogelijkheden van primaire cellen en kankercellijnen.
Onze groep werkt aan de interactie tussen cel en extracellulaire matrix. Cellen kunnen het extracellulaire matrixelement produceren, maar ook afbreken. Degradatie van de matrix kan optreden tijdens fysiologische maar ook bij pathologische processen, zoals neurodegeneratie en de invasie van celtumoren.
Op cellulair niveau kunnen we de aanwezigheid van actin-gebaseerde structuren opmerken die betrokken zijn bij de afbraak van de matrix. En deze structuren worden invadosomes genoemd. Invadosome, het is een algemene term die podosome omvat in normale cellen en invadopodia in kankercellen.
De degradatie van dit invadosome kan zichzelf organiseren in verschillende vormen, stippen, aggregaten en roosjes. En de activiteit van dit invadosome wordt aangedreven door metalloproteïnasen, zoals MMP2 en MT1-MMP. Het is niet lang geleden dat het paar, MMP2, MT1-MMP wordt geactiveerd door de type 1 collageen fibrillen.
Om de activiteit van invadosomes te bestuderen, werd een klassieke zymografie in-situ assay gebruikt. Maar om de rol en impact van type 1 collageen fibrillen in invadosomes te bestuderen, besloten we om een nieuwe assay te creëren. Om dit te doen, creëerden we een gemengde matrix bestaande uit gelatine en type 1 collageen fibrillen.
In deze film in het eerste deel, zal Eloide Henriet je laten zien hoe we dit soort matrix genereren. In het tweede deel, zal Zakaria Ezzoukhry je laten zien hoe we in staat zijn om de impact van type 1 collageen fibrillen in de morfologie, vorming en activering van de invadosomes te meten. En in het laatste deel, zal Julie Di Marino je laten zien hoe we een 3D collageen invasie assay aanpassen.
Ik zal je laten zien hoe je een gemengde matrix kunt bereiden die bestaat uit gelatine en type 1 collageen fibrillen. Ik zal twee soorten gemengde matrix maken. Een om de zymografie in-situ assay te doen met fluorescerende gelatine en niet-fluoresceerende type 1 collageen.
En een andere die ons toelaat om de collageen fibrillen te visualiseren met niet-fluoresceerende gelatine en gelabelde collageen fibrillen. Om de gelatine matrix voor te bereiden, verdeel 20 microliter druppels gelatine op een stukje parafilm. Bedek elke druppel met een geautoclaveerde glazen deksel.
Incubeer op kamertemperatuur gedurende 20 minuten en bescherm tegen licht. Voor gelatine fixatie, verdeel 40 microliter druppels van 0,5% glutaaraldehyde in PBS. Gebruik een pincet om de gelatine-gecoate deksels over te brengen naar elke glutaaraldehyde druppel.
Incubeer op kamertemperatuur gedurende 40 minuten en bescherm tegen licht. Neem een multiwell celcultuur plaat en vul elke put met 500 microliters steriele 1X PBS. Aan het einde van de incubatieperiode, plaats elke deksel, gelatine kant omhoog, in elke put.
Was de deksels twee keer in 1X PBS gedurende vijf minuten elk. In deze stap kunnen de deksels worden gebruikt voor experimenten of worden opgeslagen voor later gebruik. Pipet 0,4 mg per ml collageen een in een buisje.
Voeg de fluorescerende kleurstof toe voor een eindconcentratie van 10 microgram per ml. Meng de oplossing in het buisje en incubeer gedurende vijf minuten op kamertemperatuur beschermd tegen licht. Verdun tot het eindvolume met 1x DPBS en voeg 500 microliters van de oplossing toe bovenop gelatine-gecoate deksels in een multiwell plaat.
Incubeer gedurende vier uur bij 37 graden Celsius voor collageen polymerisatie. Verwijder na incubatie het overtollige collageen. Voeg cellen toe voor een eindvolume van 500 microliters en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius voor fixatie.
Dit type matrices kan worden gemodificeerd met andere matrix elementen zoals fibronectine, vitronectine of type IV collageen. Voor mijn deel, zal ik je laten zien hoe je immunofluorescentie uitvoert door Tks5 te gebruiken, een marker van invadosomes, en hoe je lineaire invadosomes op type 1 collageen gecoate deksels kunt kwantificeren. We kunnen de resultaten presenteren door het aantal cellen in lineaire invadosomes te tonen, maar ook kunnen we het aantal structuren in elke cel presenteren.
Fixeer de deksels gedurende 10 minuten in 500 microliters van 4% paraformaldehyde in PBS. Was twee keer met 1x PBS en permeabiliseer de cellen met 0,2% Triton X-100 in 1x PBS gedurende 10 minuten. Verdeel 50 microliter druppels primaire antilichaamoplossing in 4% BSA in 1x PBS op een stukje parafilm.
Plaats elke deksel op een druppel. Incubeer gedurende 40 minuten op kamertemperatuur beschermd tegen het licht. Was de deksels twee keer met 1x PBS en incubeer deksels in secundair antilichaam, colloidine en Hoechst kleurstof gedurende 30 minuten beschermd tegen licht.
Na de incubatie, was twee keer met 1x PBS, gevolgd door gedistilleerd water om zouten te verwijderen. Monteer deksels op een glazen plaat met polymeriserend montagemedium. Laat de plaat overnacht drogen op kamertemperatuur voordat je gaat beeldvormen.
Voor de beeldanalyse, verwerf een beeld van actin en Tks5 sequentieel met behulp van een confocale microscoop. Om de grootte en het aantal lineaire invadosomes per cel te kwantificeren, gebruik de ImageJ software en de geleverde macro. Voer eerst de macro uit in ImageJ en open het actin beeld.
Open vervolgens het Tks5 beeld. Stel de drempel in en pas de macro toe. De geanalyseerde resultaten zullen verschijnen in twee tabellen.
Het aantal lineaire invadosomes per cel en andere informatie zoals het percentage oppervlakte gebruikt door lineaire invadosomes in de cel zal in de samenvattingstabel staan. De grootte van elke lineaire invadosome zal in de resultatentabel staan. Na de kwantificering van de beelden, kunnen we de resultaten presenteren door het aantal structuren per cel te tonen.
Dus in mijn deel, passen we een methode aan om de aanwezigheid van lineaire invadosomes in 3D aan te tonen. We realiseerden ons dat de gel alleen bestaat uit collageen één fibrillen en deze assay wordt gebruikt om de celinvasie in de collageen één context te evalueren. Bereid een oplossing van type 1 collageen op ijs bij een eindconcentratie van twee mg per ml.
Voeg de fluorescerende kleur
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de bereiding van een 2D gemengde matrix van gelatine en collageen I, samen met een 3D collageen I plug, om lineaire invadosomen te onderzoeken. De studie richt zich op de vorming van invadosomen, matrixdegradatie en de invasieve capaciteiten van zowel primaire cellen als kankercellijnen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Celbiologie
- Interacties met de extracellulaire matrix
- Kankeronderzoek
Achtergrond
- Cellen kunnen componenten van de extracellulaire matrix produceren en afbreken.
- Matrixafbraak is van groot belang in zowel fysiologische als pathologische processen.
- Invadosomen zijn actine-gebaseerde structuren die betrokken zijn bij de afbraak van de matrix.
- Deze structuren omvatten podosomen in normale cellen en invadopodia in kankercellen.
Doel van de studie
- Om een gemengde matrix voor te bereiden voor het bestuderen van invadosoomvorming.
- Om de matrixdegradatie-activiteit te beoordelen.
- Om de invasiecapaciteiten van verschillende celtypen te evalueren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een 2D gemengde matrix van gelatine en collageen I.
- Creatie van een 3D collageen I-plug.
- Onderzoek naar de vorming van lineaire invadosomen.
- Analyse van primaire cellen en kankercellijnen op invasiecapaciteiten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle bereiding van matrices voor het bestuderen van invadosomen.
- Aangetoonde matrixdegradatie-activiteit door cellen.
- Geïdentificeerde verschillen in invasiecapaciteiten tussen celtypen.
- Inzichten verschaft in de rol van invadosomen bij de invasie van kankercellen.
Conclusies
- De protocollen maken een gedetailleerde studie van de dynamiek van invadosomen mogelijk.
- Inzicht in matrixdegradatie kan bijdragen aan kankeronderzoek.
- Verder onderzoek kan leiden tot therapeutische inzichten voor tumorinvasie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het begrijpen van de vorming van invadosomen in fysiologisch relevante matrices is cruciaal voor het verminderen van risico's bij de validatie van targets in onderzoek naar kankermetastasering. De mogelijkheid om lineaire invadosome-activiteit op type I collageenfibrillen te kwantificeren, biedt een mechanistische read-out voor het evalueren van ECM-gestuurde invasiepaden. Dit versterkt het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van lead-moleculen door moleculaire targets zoals DDR1 te koppelen aan functionele invasie-fenotypes in ziekterelevante systemen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar DDR1 mogelijk als receptor die de vorming van lineaire invadosomen op fysiologische collageen I-matrices medieert.
- Operationele waarde: Biedt een kwantitatieve assay om target engagement te beoordelen via de morfologie van invadosomen en degradatieactiviteit.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door receptorinhibitie te koppelen aan een verminderde vorming van lineaire invadosomen in ziekterelevante ECM-contexten.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Levert een gestandaardiseerde 2D gemengde matrix (gelatine + collageen I) en een 3D collageen I plug voor reproduceerbare invadosoomvorming en invasie-readouts.
- Kwantitatieve output: Maakt meting mogelijk van het lineaire aantal invadosomen, de grootte en de cellulaire lokalisatie via ImageJ-gebaseerde analyse van actin en Tks5 co-lokalisatie.
- Schaalbaarheid: Compatibel met high-content imaging en aanpasbaar naar multiwell-formaten voor compound screening-campagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Modelleert tumorcelinvasie door fysiologisch type I collageen, een cruciale barrière bij metastasering.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen 2D mechanistische inzichten en 3D invasie-assays om de effecten van verbindingen op celmigratie door fibrillair collageen te evalueren.
- Risicogebaseerde vooruitgang: Ondersteunt go/no-go beslissingen door veranderingen in de lineaire invadosoomactiviteit te kwantificeren als biomarker voor het ECM-afhankelijke invasiepotentieel.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische efficiëntie-testen, in het bijzonder voor oncologieprogramma's gericht op metastasering.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van ECM-receptorfunctie (bijv. DDR1) bij de regulatie van invadosoom-afhankelijke matrixafbraak.
- Screening: Levert assay-klare matrices met gestandaardiseerde collageen I-fibrillen om reproduceerbare invadosoomvorming te waarborgen over verschillende condities van verbindingstherapie.
- Analytics: Genereert kwantitatieve imaging-read-outs (aantal en grootte van lineaire invadosomen per cel) die dosis-responsanalyse en beoordeling van targetmodulatie mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire mechanismen met fenotypische invasie in 3D collageen I, wat bijdraagt aan de preklinische validatie van anti-invasiestrategieën.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het evalueren van ECM-modulerende verbindingen over verschillende kankertypes en stromale contexten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van het target door de DDR1-afhankelijke vorming van lineaire invadosomen in fysiologisch relevante matrices aan te tonen.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde matrixpreparatie en invariante imaging- en kwantificeringsprotocollen.
- Strategische waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in invasiepaden, wat een eerdere identificatie van klinisch relevante targets mogelijk maakt.
- Impact op portfolio: Faciliteert risicogebaseerde prioritering van invasieremmers op basis van functionele ECM-interactie in plaats van louter biochemische activiteit.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in extracellulaire matrixbiologie, immunofluorescentie en confocale microscopie voor een nauwkeurige detectie van invadosomen.
- Is afhankelijk van gecontroleerde collagen I-polymerisatie en fluorescente labeling om de integriteit en visualisatie van de fibrillen te behouden.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams voor matrixpreparatie, celzaai en de toepassing van ImageJ-macro's om de vergelijkbaarheid van gegevens te garanderen.
- Aanpassing aan andere ECM-componenten (bijv. fibronectine, vitronectine) kan een heroptimalisatie van de concentratie en incubatietijden vereisen.
- Beperkt tot celtypen die invadosomen vormen; niet toepasbaar op niet-invasieve of mesenchymale migratiemodellen zonder actine-gebaseerde protrusieve structuren.
