Name: Een geoptimaliseerde Protocol Analyseer glycolyse en mitochondriale Ademhaling in lymfocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Leer glycolyse en mitochondriale ademhaling meten in lymfocyten via een geoptimaliseerde extracellular flux assay. Deze methode biedt real-time inzicht in immunometabolisme met hoge viabiliteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) voor steun en discussie, mevrouw Ann Kim voor het optimaliseren van het B-cel isolatieprotocol, Dr. Joseph Brzostowski voor zijn hulp met microscopie, en mevrouw Mirna Peña voor het verzorgen van de gebruikte dieren. Dit onderzoek werd ondersteund door de Intramurale Onderzoeksprogramma's van de National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, en National Heart, Lung, and Blood Institute.

Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de LIG-4 dier protocol, dat door de NIAID Animal Care en gebruik Comite werd goedgekeurd uitgevoerd. 1. Bereiding van reagentia <ol><li> Bereid magnetische scheiding (MS) buffer: PBS (pH 7,2) aangevuld met 0,5% BSA en 2 mM EDTA of automatische scheidingsoplossing aangevuld met 0,5% BSA. Steriel filter (0,22 pm) en opslag bij 2-8 ° C. </li><li> Bereid RF10 medium: RPMI 1640 medium aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum, 50 U / ml penicilline, 50 uM streptomycine, 1 mM natriumpyruvaat, 2 mM L-glutamine, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 50 pM 2 mercaptoethanol, 10 mM HEPES. Gebruik steriele reagentia. Steriel filter en bewaar bij 2-8 ° C. </li><li> Bereid mitochondriale stresstest medium: XF basismedium gesupplementeerd met 1 mM natriumpyruvaat, 2 mM L-glutamine en 25 mM glucose. </li><li> Bereid glycolyse stresstest medium: XF basismedium vullendeted met 2 mM L-glutamine. </li><li> De pH van zowel de mitochondriale en glycolyse stresstest media 7,4, steriel filter en bewaar bij 2-8 ° C. Warm media tot 37 ° C en opnieuw op pH vóór gebruik (pH verrichten metingen bij 37 ° C). OPMERKING: Met XF medium dat bicarbonaat mist, is kritisch. Omdat de atmosfeer in de extracellulaire flux analysator bevat slechts omgeving CO 2, elke bicarbonaat in het medium na binding aan protonen uitgebracht als een bijproduct van glycolyse, dissociëren tot CO2 en water. CO 2 ontgast tijdens het experiment, waardoor afwijkingen in pH dat de glycolytische verzuring signaal zou verduisteren. </li><li> Bereid oligomycin: Bereid 10 mM voorraadoplossing in DMSO; bewaren bij -20 ° C. </li><li> Bereid 2,4-DNP: Bereid 1 M voorraadoplossing in DMSO; bewaren bij -20 ° C. </li><li> Bereid antimycin A: Bereid 10 mM voorraadoplossing in DMSO; bewaren bij -20 ° C. </li><li> Bereid rotenon: Bereid 10 mM stock oplossing in DMSO; bewaren bij -20 ° C. </li><li> Bereid glucose: Los glucose in glycolyse stresstest medium om een ​​250 mM oplossing; vers bereid voor elk experiment en niet invriezen. </li><li> Bereid 2-DG: Los solid 2-DG in glycolyse stresstest medium om een ​​500 mM oplossing te vormen; vers bereid voor elk experiment en niet invriezen. </li></ol> 2. Oogsten milt en de lymfeklieren van muizen <ol><li> Euthanaseren de muis door CO 2 stikken, gevolgd door cervicale dislocatie. </li><li> Spuit de muis met 70% ethanol. </li><li> Voor de volgende T-cel isolatie, de oogst van de milt, oppervlakkige cervicale, oppervlakkige / diepe oksel, onderkaak, lies en mesenteriale lymfeklieren. </li><li> Voor daaropvolgende B celisolatie, oogst alleen de milt. LET OP: Gebruik een bioveiligheid kast en houden de geoogste organen in PBS of RF10 media op ijs tot verwerking. Gebruik steriel laboratorium en steriele techniek voor alle verwerkingen en isolatie stappen. Houd alle buffers en media op ijs isolatie efficiëntie te verhogen en celdood te verminderen. </li></ol> 3. Weefsel bewerken <ol><li> Plaats een 70 um cel zeef in een 50 ml conische buis en de overdracht van de organen op de zeef. Voor T cel isolatie combineren alle organen en B celisolatie overdracht alleen de milt. </li><li> Met de plunjer van een steriele 3 ml spuit, mash het weefsel door de zeef. Tijdens pureren, zorg ervoor dat het filter en de organen zijn vochtig te allen tijde en nat hen, zoals vereist door het toevoegen van MS buffer. Dit zal zowel de levensvatbaarheid van de cellen blijven hoog en verstopping van het filter te voorkomen. </li><li> Na pureren, gelden 5-10 ml MS buffer om het filter naar cel herstel te vergroten. Centrifugeer de suspensie bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. (Voer alle verdere centrifugeren onder deze omstandigheden, tenzij anders aangegeven). </li><li> Schenk de vloeistof en resuspendeer de pellet in 5 ml ACK rode bloedcel lysisbuffer. Incuverminder gedurende 5 min op ijs rode bloedcellen lyseren (rode bloedcellen moeten worden verwijderd omdat ze interfereren met de magnetische scheiding). Voeg 10-20 ml MS buffer en centrifuge. </li><li> Plaats een 30 um cel filter over een 15 ml conische buis en vul het met 1 ml MS buffer (dit filtratie zal puin van de erytrocyten lysis te verwijderen). Schenk de vloeistof van de gecentrifugeerde buis, resuspendeer de pellet in 5 ml MS buffer en doorgeven door het filter. Was de eerste buis met 4 ml MS buffer naar cel herstel te verhogen, en dit gebruiken om het filter te spoelen. </li><li> Met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celgetalmeter Bepaal het totale aantal cellen. Deze cel nummer wordt gebruikt om de hoeveelheid magnetische scheiding benodigde reagentia in punt 4. Indien splenocyten worden gebruikt in de daaropvolgende extracellulaire flux assay te bepalen, vernietiging van het juiste aantal cellen op dit moment. </li><li> Centrifugeer de schorsing en ga verder met magnetische scheiding. Resuspendeer splenocyten niet gebruiktvoor B-cel isolatie in 5 ml RF10 en blijf op ijs tot de extracellulaire flux test. </li></ol> 4. Magnetische scheiding van B-cellen en naïeve CD4 + T-cellen <ol><li> Bepaal de benodigde hoeveelheden biotine-antilichaam cocktail, anti-biotine microbolletjes en MS buffer. Gebruik de volgende hoeveelheden van 10 8 cellen als richtlijn en vergroot of verkleind indien nodig. OPMERKING: Incubeer monsters in de koelkast niet op ijs sinds incuberen op ijs kan antilichaambinding efficiëntie en langere incubatietijden kunnen worden verlangd verminderen. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Reagentia voor naïeve CD4 + T-celscheiding </td><td> Volume 10 8 cellen </td></tr><tr><td> (schaal adequaat) </td></tr><tr><td> Biotine-antilichaam cocktail </td><td> 100 gl</td></tr><tr><td> MS buffer voor de eerste incubatie </td><td> 400 gl </td></tr><tr><td> Anti-biotine microkorrels </td><td> 200 gl </td></tr><tr><td> CD44 microbolletjes </td><td> 100 gl </td></tr><tr><td> MS buffer voor de tweede incubatie </td><td> 200 gl </td></tr><tr><td colspan="2"> Incubeer de biotine-antilichaam cocktail en cellen bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Add anti-biotine microbolletjes, CD44 microkralen, MS buffer en incuberen bij 4 ° C gedurende 15 minuten. </td></tr></tbody></table> Tabel 1: T cel isolatie volumes en instructies. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Reagentia voor B celscheiding </td><td> Volume 10 8 cellen </td></tr><tr><td> (schaal adequaat) </td></tr><tr><td> Biotine-antilichaam cocktail </td&gt; <td> 100 gl </td></tr><tr><td> MS buffer voor de eerste incubatie </td><td> 400 gl </td></tr><tr><td> Anti-biotine microkorrels </td><td> 200 gl </td></tr><tr><td> MS buffer voor de tweede incubatie </td><td> 300 gl </td></tr><tr><td colspan="2"> Incubeer de biotine-antilichaam cocktail en cellen bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Voeg de juiste hoeveelheid biotine-antilichaam cocktail en MS buffer en incuberen van het mengsel bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Voeg de juiste hoeveelheid anti-biotine microbolletjes en MS buffer en incuberen van het mengsel bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Na de tweede incubatie, vul de buis met MS buffer en centrifuge. </td></tr></tbody></table> Tabel 2: B celisolatie volumes en instructies. <ol start="2"><li> Resuspendeer de pellet in buffer MS: 500 pl voor handmatige scheiding, 3-4 ml voor automatische scheiding. </li><li> Ga verder met handmatige of automatische scheidingenals volgt: <ol><li> Handmatig Scheiding: <ol style="margin-left: 40px;"><li> Plaats een LS kolom in de scheiding magneet plaatst onder een steriele 15 ml conische buis om de stroom door en de eerste kolom verzamelen door wassen met 3 ml buffer MS. Gooi de stroom door. </li><li> Breng de celsuspensie aan het gegronde LS kolom en laat het passeren; was het buisje gebruikt tijdens de incubatie met 3 ml MS buffer en geven deze door de kolom ook. Het eluaat wordt de gezuiverde cellen bevatten. Voor de B-cel isolatie, passeren de gezuiverde cellen door de kolom voor de tweede keer in een nieuwe 15 ml buis en herhaal de wasstap. Dit zuiverheid en opbrengst te verhogen. </li></ol></li><li> Geautomatiseerde Scheiding: <ol><li> Schakel de automatische afscheider en controleer de niveaus van loopbuffer, spoeloplossing en 70% ethanol. Zorg ervoor dat het afval leeg is voordat de scheiding. </li><li> Selecteer het juiste gekoeld rek afhankelijk van de buis grootte van tHij ongezuiverde monster (bijvoorbeeld 15 ml). Om de levensvatbare cellen gedurende het scheidingsproces te houden, gebruikt stellingen die eerder bij 2-8 ° C gedurende 3-4 uur gekoeld, of totdat de koelvloeistof vaste stof. </li><li> Monteer de gekoelde rek op het monster etappe van de automatische afscheider. </li><li> Plaats de monsterbuis in slot A1, een buis voor de negatieve fractie slot B1, en een buis voor de positieve fractie C1. Wanneer verzamelen meer dan één monster, plaatst extra buizen in de volgende kolommen (A2, B2, C2, etc.). </li><li> Selecteer het tabblad scheiding op het touchscreen, en geven de plaatsing van buizen op het rek. Vanuit het menu scheiding, selecteer het programma &quot;put&quot; en vul het programma cyclus met het juiste type van wassen (zie opmerking hieronder). LET OP: Het programma &quot;put&quot; voert uitputting behulp van meest gevoelige modus van de machine, die de zuiverheid prioriteit. Daarnaast zijn er drie verschillende wassen opties: quick spoelen, spoelen, en slapen. Indien de monsters uit dezelfde bron en worden samengevoegd, selecteert snelle spoelen. Als de monsters gescheiden moeten worden gehouden, selecteert spoelen. Selecteer de optie slaapstand als er geen verdere isolaties die dag zal worden uitgevoerd en als de machine zal worden afgesloten na isolatie </li><li> Begin de isolatie door te drukken &quot;Run&quot; en bevestig de buffer levels als daarom wordt gevraagd. Nadat het programma is afgelopen, zullen de negatieve fractie gezuiverde cellen bevatten. </li></ol></li><li> Vul het conische buis tot 15 ml met MS buffer en centrifugeer. </li><li> Giet het MS buffer en resuspendeer cellen in 5 ml RF10 media. Houd cellen op ijs tot de extracellulaire flux assay. OPMERKING: Idealiter het extracellulaire flux bepaling worden onmiddellijk na isolatie uitgevoerd. In voorlopige experimenten geen significante verschillen in bepalingsbuffer resultaten werden waargenomen in cellen die binnen 3 hr isolatie versus vers geïsoleerde degenen. </li></ol></li></ol> OPMERKING: Het protocol hier beschreven is aan de 96-well formaat van het instrument. Volumes moeten worden aangepast als een ander formaat wordt gebruikt. <ol><li> Hydratatie van Sensor Cartridge <ol><li> Til de sensorcartridge, vul elk putje van het nut plaat met 200 ul kalibrant oplossing en laat de sensorcartridge op het nut plaat, kopje onder de sensoren in de kalibrant oplossing. LET OP: Controleer of het kalibratieoplossing niveau is hoog genoeg om de sensoren onder water te houden. De patroon herbergt fluoroforen geassocieerd O 2 en H + voor elk putje; deze moeten worden gehydrateerd, zodat zij goed werken. </li><li> Plaats de patroon in een 37 ° C incubator niet aangevuld met CO 2 of zuurstof / stikstof. Verricht alle verdere incubaties onder deze omstandigheden, tenzij anders aangegeven. Incubeer de cartridge &#39;s nachts te hydrateren. </li></ol></li><li> preparatie van Adhesive-coated Plates <ol><li> Bereid 2,5 ml van een 22,4 mg / ml hechtende oplossing in 0,1 M natriumbicarbonaat, pH 8,0 (bicarbonaat bepaalt de optimale pH voor kleefstof adsorptie). </li><li> Toepassen 25 ul van de oplossing in elk putje van de testplaat, en incubeer de bank bij kamertemperatuur gedurende 20 min. </li><li> Zuig lijm en was elk putje twee keer met behulp van 200 ui steriel water. Wacht tot putten droog zijn voor het zaaien van de cellen. </li></ol></li><li> Zaaien Cellen in-Adhesive gecoate platen <ol><li> Centrifugeer cellen bij kamertemperatuur bij 200 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen in 5 ml van de geschikte bepaling (zie hierboven voor bereiding van mitochondriale stress en glucosebelastingstest media). Centrifuge cellen opnieuw en resuspendeer in de gewenste concentratie in testmedium (resuspensie volume zal variëren op basis van de concentratie; elk putje wordt 180 pi celsuspensie bevatten). OPMERKING: Zolang de geschikte test media en verbindings worden gebruikt, de extracellulaire flux analyzer kan gelijktijdig de mitochondriale en glycolyse stresstests op dezelfde plaat. </li><li> Plaat 180 gl celsuspensie in elk putje. Gebruik putten A1, A12, H1, en H12 voor achtergrond temperatuurcorrectie: voeg 180 ul assay medium in deze putten (geen cellen). </li><li> Incubeer de platen gedurende 25 min bij 37 ° C. </li><li> Centrifugeer de plaat bij 200 xg gedurende 5 minuten zonder rem zodat alle cellen volledig zijn bevestigd. Visueel bevestigen dat de cellen die stabiel zijn gehecht aan het cultuur oppervlak, waarbij een monolaag, door het bekijken onder de microscoop. Breng de plaat terug in de incubator gedurende nog 30 min. </li></ol></li><li> Bereiding van 10x concentraties van verbindingen en laden van injectorpoorten <ol><li> Voor de mitochondriale stresstest bereiden 2,5 ml van 10 uM oligomycin, 1 mM DNP en een mengsel van 10 uM en 10 uM rotenon antimycin A, alle in mitochondriale spanning assay medium. Opmerking: De concentratie van 2,4-DNP is gebaseerd op eerder gepubliceerde studies, 21 dit is een algemene richtlijn maar de concentratie ontkoppelaar voor elk gebruikte celtype worden bepaald door de onderzoeker. </li><li> Voor de glycolyse stress test, voor te bereiden 2,5 ml van 250 mM glucose, 10 uM oligomycin en 500 mM 2-deoxyglucose (2-DG) in glycolyse stress-test medium. </li><li> Warm 10x oplossingen tot 37 ° C en de pH instellen op 7,4. </li><li> Laad de verbindingen in de juiste injectorpoorten van de patroon met een multichannel micropipettor en het laden geleiders, als volgt: <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Haven </td><td> Mitochondriale Stress Assay </td><td> Glycolyse Stress Assay </td></tr><tr><td> EEN </td><td> 20 gl oligomycin </td><td> 20 pi glucose </td></tr><tr><td> B </td><td> 22 ui 2,4-DNP </td><td> 22 ul oligomycin </td></tr><tr><td> C </td><td> 25 gl antimycin A / rotenon </td><td> 25 ui 2-DG </td></tr></tbody></table> Tabel 3: Verbinding volumes. OPMERKING: Elke reeks poorten (bijvoorbeeld alle poorten A) moet hetzelfde volume bevatten. Het is essentieel dat alle putjes in een bepaalde serie worden geplaatst, ook als deze niet gebruikt in het experiment, anders zullen de verbindingen niet worden geïnjecteerd (poorten in ongebruikte bronnen kan worden geladen met hetzelfde volume testmedium). </li><li> Incubeer de cartridge tijdens het opzetten van het programma. </li></ol></li><li> Opstellen Extracellulaire Flux Assay Protocollen <ol><li> Stel de volgende programma (tabel 4). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Stap </td><td> Lus </td></tr&gt; <tr><td> ijking </td><td> - </td></tr><tr><td> evenwicht </td><td> - </td></tr><tr><td> Baseline lezingen </td><td> 3 keer: Meng 3 min, wacht 0 min, maatregel 3 min </td></tr><tr><td> einde lus </td><td> - </td></tr><tr><td> Injecteren Port A </td><td> - </td></tr><tr><td> Afmetingen </td><td> 3 keer: Meng 3 min, wacht 0 min, maatregel 3 min </td></tr><tr><td> einde lus </td><td> - </td></tr><tr><td> Injecteren Port B </td><td> - </td></tr><tr><td> Afmetingen </td><td> 3 keer: Meng 3 min, wacht 0 min, maatregel 3 min </td></tr><tr><td> einde lus </td><td> - </td></tr><tr><td> Injecteren Port C </td><td> - </td></tr><tr><td> Afmetingen </td><td> 3 keer: Meng 3 min, wacht 0 min, MEASURe 3 min </td></tr><tr><td> einde lus </td><td> - </td></tr><tr><td> einde Programma </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabel 4: Program lay-out. OPMERKING: In bepaalde omstandigheden, bijvoorbeeld bij het gebruik van geactiveerde cellen, de verzuring kunnen blijven langer dan bij niet eerder behandelde cellen. Daarom kan het nodig zijn de &quot;wacht&quot; tijd in het programma elke meetcyclus keer verlengen of herhalen. </li><li> Begin het programma. Na de kalibratie stap, vervangt de kalibrant plaat voor de testplaat (als daarom wordt gevraagd). OPMERKING: Gebruik van de software, is het mogelijk om groepen van putjes die soortgelijke voorwaarden geven. Daarnaast is het van cruciaal belang om aan te geven welke bronnen de controle putten zijn (in dit protocol, zijn ze de vier hoeken van de plaat) en aan te geven welke putten leeg zijn. Voor een meer gedetailleerde, stap-voor-stap protocol voor het instellen van de machine en hets software, dient de website van de fabrikant worden geraadpleegd. </li></ol></li><li> Het meten van het eiwitgehalte <ol><li> Verwijder het resterende assay medium uit elk putje zonder de cellen. Opmerking: Als het niet handig te gaan met de eiwitconcentratie assay, kan men de gehele plaat invriezen bij -20 ° C tot analyse. Indien bevroren, ontdooien alvorens verder te gaan. </li><li> Bereid een 1x oplossing van proteaseremmers (100x voorraad) in RIPA lysis medium (voldoende voor 50 pl / putje). </li><li> Voeg 50 ul RIPA lysis medium aangevuld met proteaseremmers aan elk putje. Schud plaat op een schudder gedurende 5 min, en vervolgens incubeer plaat op ijs gedurende 30 minuten volledig te lyseren cellen. </li><li> Draai de plaat bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur lipiden en andere moleculen aan de onderzijde van de plaat te brengen zodat ze niet interfereren met de bicinchoninezuur (BCA) assay. </li><li> Meet eiwitconcentratie door BCA assay volgens de fabrikant &amp;# 39; s aanbevelingen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Motz, G. T., Coukos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+and+reversing+tumor+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Deciphering and reversing tumor immune suppression.</a> Immunity. 39 (1), 61-73 (2013).</li>
<li>Akkaya, M., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+pathogens+drive+the+evolution+of+paired+receptors%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">How do pathogens drive the evolution of paired receptors?</a> Eur J Immunol. 43 (2), 303-313 (2013).</li>
<li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 27, 591-619 (2009).</li>
<li>Dinarello, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokines.</a> Chest. 118 (2), 503-508 (2000).</li>
<li>Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory B cells.</a> Nat Rev Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+immunity%3A+insights+into+metabolism+and+lymphocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function.</a> Science. 342 (6155), 1242454(2013).</li>
<li>Gerriets, V. A., Rathmell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathways+in+T+cell+fate+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathways in T cell fate and function.</a> Trends Immunol. 33 (4), 168-173 (2012).</li>
<li>Doughty, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+receptor-mediated+changes+in+glucose+metabolism+in+B+lymphocytes%3A+role+of+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+in+the+glycolytic+control+of+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antigen receptor-mediated changes in glucose metabolism in B lymphocytes: role of phosphatidylinositol 3-kinase signaling in the glycolytic control of growth.</a> Blood. 107 (11), 4458-4465 (2006).</li>
<li>Caro-Maldonado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+is+required+for+antibody+production+that+is+suppressed+in+anergic+but+exaggerated+in+chronically+BAFF-exposed+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming is required for antibody production that is suppressed in anergic but exaggerated in chronically BAFF-exposed B cells.</a> J Immunol. 192 (8), 3626-3636 (2014).</li>
<li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Methods Enzymol. 542, 125-149 (2014).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+Analysis+of+Extracellular+Acid+Production+to+Determine+Glycolytic+Rate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate.</a> J Vis Exp. (106), e53464(2015).</li>
<li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets%2C+lymphocytes%2C+monocytes%2C+and+neutrophils%2C+and+the+oxidative+burst+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).</li>
<li>Klein, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+different+cell+isolation+techniques+on+lymphocyte+viability+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunoassay+Immunochem%22%5BJournal%5D)">Impact of different cell isolation techniques on lymphocyte viability and function.</a> J Immunoassay Immunochem. 27 (1), 61-76 (2006).</li>
<li>Hsueh, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+Mouse+Splenic+B+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22AfCS+Research+Reports%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of Mouse Splenic B Lymphocytes.</a> AfCS Research Reports. 1 (1), 1-11 (2012).</li>
<li>Zambrano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+ex+vivo+expansion+and+differentiation+of+naive+murine+CD43+B+splenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Prolonged ex vivo expansion and differentiation of naive murine CD43 B splenocytes.</a> Biotechnol Prog. , (2016).</li>
<li>Costa, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+rare+populations+of+murine+antigen-specific+T+lymphocytes+by+retroviral+transduction+for+potential+application+in+gene+therapy+for+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeting rare populations of murine antigen-specific T lymphocytes by retroviral transduction for potential application in gene therapy for autoimmune disease.</a> J Immunol. 164 (7), 3581-3590 (2000).</li>
<li>Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+characterization+and+isolation+of+rare+memory+B+cells+with+antigen+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers.</a> Blood. 118 (2), 348-357 (2011).</li>
<li>Schneider, D. F., Glenn, C. H., Faunce, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphocyte+subsets+and+their+immunoregulatory+roles+in+burn+injury+and+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Burn+Care+Res%22%5BJournal%5D)">Innate lymphocyte subsets and their immunoregulatory roles in burn injury and sepsis.</a> J Burn Care Res. 28 (3), 365-379 (2007).</li>
<li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Removal of lymphoid organs.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 1, Unit 1 9(2001).</li>
<li>Akkaya, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple%2C+Versatile+Antibody-Based+Barcoding+Method+for+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A Simple, Versatile Antibody-Based Barcoding Method for Flow Cytometry.</a> J Immunol. 197 (5), 2027-2038 (2016).</li>
<li>Traba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fasting+and+refeeding+differentially+regulate+NLRP3+inflammasome+activation+in+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects.</a> J. Clin. Invest. 125 (12), 4592-4600 (2015).</li>
<li>Wick, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+Primary+Metabolic+Block+Produced+by+2-Deoxyglucose%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization of the Primary Metabolic Block Produced by 2-Deoxyglucose.</a> J. Biol. Chem. 224 (2), 963-969 (1957).</li>
<li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the ATP synthetase system.</a> Methods Enzymol. 55, 472-518 (1979).</li>
<li>Terada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncouplers+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Uncouplers of oxidative phosphorylation.</a> Environmental Health Perspectives. 87, 213-218 (1990).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+Maximum+Glycolytic+Capacity+Using+Extracellular+Flux+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements.</a> PLOS ONE. 11 (3), e0152016(2016).</li>
<li>Lai, L., Alaverdi, N., Maltais, L., Morse, H. C. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cell+surface+antigens%3A+nomenclature+and+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse cell surface antigens: nomenclature and immunophenotyping.</a> J Immunol. 160 (8), 3861-3868 (1998).</li>
<li>Gerberick, G. F., Cruse, L. W., Miller, C. M., Sikorski, E. E., Ridder, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+modulation+of+T+cell+memory+markers+CD62L+and+CD44+on+murine+draining+lymph+node+cells+following+allergen+and+irritant+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Selective modulation of T cell memory markers CD62L and CD44 on murine draining lymph node cells following allergen and irritant treatment.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 146 (1), 1-10 (1997).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochim. Biophys. Acta - Bioenergetics. 1847 (2), 171-181 (2015).</li>
<li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+metabolism+drives+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell metabolism drives immunity.</a> J Exp Med. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben. De Open Access-kosten voor dit artikel werden betaald door Agilent Technologies.

De techniek die we ontwikkeld toegestaan ​​efficiënte isolatie van zuivere en levensvatbare lymfocyten, die vervolgens in extracellulair flux analyse werden in verschillende concentraties aan de verschillen in de glycolyse en mitochondriale ademhaling te evalueren. Dit protocol is speciaal ontworpen voor lymfocyten en richt de speciale overwegingen met betrekking tot deze celtypes, zoals lage basale metabolische activiteit, breekbaarheid, lage frequentie, en hun onvermogen om zich aan testplaten. Daarom vergeleken met eerder gepubliceerde protocollen 11,12, onze methode biedt een handige en beter geoptimaliseerd gids voor onderzoekers op het gebied van immunologie. Er zijn een aantal cruciale stappen in dit protocol, met inbegrip van het krijgen van zuivere en levensvatbaar celpopulaties, plating de cellen op een optimale samenvloeiing, en het standaardiseren van de extracellulaire flux test metingen om de eiwit-concentratie in elk putje. de initial aantal cellen verzilverd konden beide worden gevisualiseerd door lichtmicroscopie en ook worden gekwantificeerd met behulp van eiwitconcentratie metingen. De lineaire correlatie tussen het aantal cellen en eiwitconcentratie bevestigd dat de eiwitconcentratie inderdaad kan worden gebruikt als een manier om de effecten van veranderingen in het aantal cellen tussen verschillende putjes standaardiseren. Door het standaardiseren van de ECAR en OCR de eiwitconcentraties hebben we aangetoond dat, ondanks de lagere celconfluentie, zo weinig als 2,5 x 10 5 cellen / putje kan worden gebruikt in de meeste assays zonder de kwaliteit van de gegevens. De ondergrens van cellen die gebruikt kunnen variëren tussen celtypen en assays. Bijvoorbeeld, terwijl zo weinig als 1,25 x 10 5 cellen kunnen worden gebruikt voor B-cel OCR metingen, zelfs 2,5 x 10 5 cellen / putje waren niet voldoende om de glycolytische prestaties van hetzelfde celtype beoordelen. Daarom, zolang als aantal cellen is geen beperkende factor, scheepswand in meer dan90% confluentie, die ongeveer overeenkomt met 5 x 10 5 lymfocyten / putje, de voorkeur. Verdere optimalisatie kan vereist indien cellen van verschillende grootte-zoals eerder geactiveerde en gedeeltelijk gedifferentieerde lymfocyten-gebruik. Bovendien, bij gebruik van eerder gekweekte primaire lymfocyten, kan er een verschil in cellevensvatbaarheid verschillende behandelingsomstandigheden, die de betrouwbaarheid van eiwitconcentratie zou dalen als maat voor het aantal cellen omdat dood of stervende cellen kunnen ook bijdragen aan de gemeten eiwitniveaus . In dergelijke gevallen kan het nuttig zijn om levende cellen door flow cytometry gekozen voor het uitvoeren van de extracellulaire flux assays. In onze tests met vers geïsoleerde en hoogst haalbare lymfocyt populatie, verkregen we betrouwbare functionele gegevens voor zowel OCR en ECAR metingen. Terwijl alle celtypen eveneens gedragen in de mitochondriale stresstest opvallende verschillen tussen celtypen warenwaargenomen in de glycolyse stresstest. Bijvoorbeeld, de glycolytische prestaties van naïeve T-cellen was laag vergeleken met splenocyten of B-cellen, en veranderde niet met de toevoeging van oligomycin. Deze waarneming is in overeenstemming met eerder gepubliceerde studies 7,30, hetgeen de validiteit van onze protocol. Concluderend onze methode biedt een efficiënte en eenvoudige manier van het testen van de metabole activiteit van lymfocyten met een extracellulair flux analysator, en kan nuttig zijn bij een groot aantal immunologische studies waarin de metabole veranderingen in immuuncellen na activering, celdifferentiatie of wegens ziekte fenotypes zoals infectie, auto-immuniteit en hematologische maligniteiten.

De immuunrespons tegen antigenen is een strak gereguleerd evenwicht tussen immuunactivatie en immuunonderdrukking. Immuun-activering drijft snelle celproliferatie en migratie, en cytokineproductie, antilichaamuitscheiding en verhoogde fagocytose in reactie op de stimulans, terwijl immuunsuppressie eenvoudig deze gebeurtenissen remt en derhalve is belangrijk bij het voorkomen van onnodige immuunresponsen 1-6. Recente studies hebben aangetoond dat er een rechtstreeks verband bestaat tussen de activeringsstatus van immuuncellen en de activiteit van verschillende metabolische pathways 7. Immuuncellen kan verschuiven tussen rustende en geactiveerde toestanden door over te schakelen energieproducerende paden in en uit. Verder is waargenomen dat verschillende celtypen immune verschillende metabolische strategieën kunnen gebruiken om hun toegenomen energiebehoefte brandstof tijdens de activering. Bijvoorbeeld, terwijl activatie van T lymfocyten leidt cellen in een vrijwel glycolytische state 8 </sup&gt;, geactiveerde B-lymfocyten gebruiken een combinatie van glycolyse en oxidatieve fosforylering 9,10. Deze studies wijzen op het belang van het onderzoek naar de effecten van de immuuncel activering op de celstofwisseling. Real-time, gelijktijdige metingen van zuurstofverbruik rate (OCR) en extracellulaire verzuring rate (ECAR), als indicatoren van oxidatieve fosforylering en glycolyse, is een gemeenschappelijke strategie om de toestanden van energieproducerende paden 11-13 te pakken. Om dit te bereiken, een extracellulair flux analysator, zoals Seahorse XF 96, wordt routinematig gebruikt. Een dergelijk instrument kan snel veranderingen in OCR en ECAR vergelijken uit verschillende celtypen of op verschillende stimulatie omstandigheden. Tot dusver verschillende celtypen, waaronder immuuncellen, werden onderzocht met behulp van deze apparaten. Echter, een geoptimaliseerd protocol specifiek voor immuuncellen niet beschikbaar. Immuuncellen bijzonder lymfocyten, verschillen othaar celtypen in een aantal kritische manieren. Lymfocyten fragiele cellen die geen overleven lange duur in ex vivo omstandigheden 14-16. Dit is een nog groter probleem wanneer ze worden gekweekt in suboptimale groei medium zonder essentiële voedingsstoffen, zoals die gebruikt in extracellulaire flux analyse. In tegenstelling tot macrofagen en vele cellijnen, hoeft lymfocyten niet aan kunststof oppervlakken; Daarom is het essentieel om ze te hechten aan de analyse plaat zonder dat dit tot stress. Tenslotte kunnen sommige lymfocyt subpopulaties uiterst zeldzaam en het oogsten op de gewenste, optimale hoeveelheden kunnen uitdagend 17-19 zijn. Hier geven we een geoptimaliseerd protocol dat specifiek voor lymfocyten ontwikkeld. Gebruik splenocyten, B-lymfocyten en naïeve CD4 + T-lymfocyten geïsoleerd uit muizen milt en lymfeklieren 20 tonen wij de kenmerken van de ruststatus glycolyse en oxidatieve fosforylering in Gesplitstet celdichtheden. Gegevens werden genormaliseerd om rekening te houden met de verschillen in de initiële celaantallen voor elke wel door meting eind assay cellysaat proteïneconcentraties, die recht evenredig met het aantal cellen waren. Ons protocol biedt niet alleen richtlijnen voor de snelle isolatie van levensvatbare lymfocyten voor extracellulaire flux assays, maar het maakt het ook mogelijk voor het werken bij suboptimale cel concentraties, zonder afbreuk te doen aan de kwaliteit van de gegevens.

<table><tbody><tr><td>PBS (pH 7.2)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>20012-050</td><td>Om MACS buffer te maken</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td>Om MACS buffer te maken</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8</td><td>Quality Biological</td><td>10128-446</td><td>Om MACS buffer te maken</td></tr><tr><td>autoMACS rinsing solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>In plaats van PBS + EDTA om MS buffer te maken. Ook gebruikt in autoMACS Pro Separator.</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11875-093</td><td>Bevat fenolrood en L-glutamine</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>10437-028</td><td>Voor hitte-inactivatie, ontdooi de bevroren voorraadfles in een 37 &deg;C waterbad en activeer vervolgens bij 56 &deg;C gedurende 30 min. Verdeel het geinactiveerde serum in porties voor opslag (bijv. in 50 ml kegelbuizen) en bewaar in de vriezer bij -20 &deg;C tot het nodig is.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (Pen Strep)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15140-122</td><td>Combineer Pen Strep met L-Glut 1:1 (als je 500 ml media maakt, maak in totaal 12 ml Pen Strep/L-Glut); bewaar porties bij -20 &deg;C tot je klaar bent om media te maken.</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (L-Glut)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>25030-081</td><td>Onderdeel van RF10 en stress test media</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate 100 mM</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td>Onderdeel van RF10 en stress test media</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td>Onderdeel van RF10</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11140-050</td><td>Onderdeel van RF10</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>Onderdeel van RF10</td></tr><tr><td>Falcon 70 &mu;m cell strainer</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>87712</td><td>Gebruikt bij celisolatie</td></tr><tr><td>Monoject 3 ml Syringe, Luer-Lock Tip</td><td>Covidien</td><td>8881513934</td><td>Gebruikt bij celisolatie</td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>Gebruikt bij celisolatie</td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Gebruikt bij celisolatie</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Gebruikt bij celisolatie</td></tr><tr><td>CellTrics 30 &mu;m cell filter, steriele, enkel verpakt</td><td>Partec CellTrics</td><td>04-004-2326</td><td>Gebruikt bij celisolatie</td></tr><tr><td>B Cell Isolation Kit, muis</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-862</td><td>Gebruikt bij celisolatie</td></tr><tr><td>Na&iuml;ve CD4+ T cell isolation kit, muis</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-453</td><td>Gebruikt bij celisolatie</td></tr><tr><td>LS Column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Gebruikt bij celisolatie</td></tr><tr><td>MidiMACS separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>Magneet voor scheiding</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>Houdt magneten vast</td></tr><tr><td>autoMACS Rinsing Solution</td><td></td><td>130-091-222</td><td>Spoelvloeistof voor autoMACS Pro Separator</td></tr><tr><td>autoMACS Pro Separator Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375-5G</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Celkleefmiddel. Let op de concentratie, omdat elke partij anders is (pakket is 1 mg).</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D198501</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td>Wordt geleverd als 100x cocktail, combineer met RIPA om een 1x oplossing voor lysis te vormen.</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td>Volg de instructies van de fabrikant</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>101085-004</td><td>Bevat assayplaten, cartridges, laadgidsen voor het overbrengen van verbindingen naar de assaycartridge en calibratieoplossing.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Medium</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102353-100</td><td>Wordt gebruikt om stress test media te bereiden</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 &mu;m</td><td>EMD Millipore-Fisher Scientific</td><td>SCGPU10RE</td><td>Wordt gebruikt om media sterieel te filteren.</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>487031</td><td>Opgelost tot 0.1 M en gebruikt om Cell-Tak te verdunnen.</td></tr></tbody></table>

een geoptimaliseerde protocol analyseer glycolyse en mitochondriale ademhaling in lymfocyten

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

Lymfocyten reageren op verschillende stimuli door het activeren van intracellulaire signaleringsroutes, wat weer leidt tot een snelle cellulaire proliferatie, migratie en differentiatie en cytokineproductie. Al deze gebeurtenissen zijn nauw verbonden met de energiestatus van de cel, en bestudeert daarom de energieproducerende paden kan aanwijzingen over de algemene functionaliteit van deze cellen geven. Het extracellulaire flux analysator is een gebruikelijke inrichting voor het evalueren van de prestaties van glycolyse en mitochondriale respiratie in vele celtypen. Dit systeem is gebruikt om immuuncellen te bestuderen in enkele gepubliceerde rapporten, maar een algemeen protocol bijzonder geoptimaliseerd voor lymfocyten ontbreekt. Lymfocyten fragiele cellen die slecht overleven in ex vivo omstandigheden. Vaak lymfocyt subsets zijn zeldzaam, en het werken met een laag aantal cellen is onvermijdelijk. Aldus wordt een experimentele strategie die deze problemen behandelt vereist. Hier bieden we een protocoldat zorgt voor snelle isolatie van levensvatbare lymfocyten van lymfoïde weefsels en voor de analyse van de metabolische toestanden in de extracellulaire flux analysator. Bovendien geven we de resultaten van experimenten waarin de metabolische activiteiten van verschillende subtypes lymfocyten bij verschillende celdichtheden werden vergeleken. Deze waarnemingen suggereren dat ons protocol kan worden gebruikt om consistente, goed gestandaardiseerde resultaten zelfs bij lage concentraties cel, en dus kan het brede toepassingsmogelijkheden in toekomstig onderzoek gericht op de karakterisering van metabole gebeurtenissen in immune cellen.

Eukaryotische cellen gebruiken een geïntegreerd netwerk van glycolyse, de tricarbonzuur (TCA) cyclus en oxidatieve fosforylering het merendeel van de energiebehoefte te voldoen en tussenproducten nodig zijn voor celgroei en proliferatie. Deze routes beginnen met het intracellulaire vangen van vrije glucose in glucose-6-fosfaat, dat vervolgens wordt verwerkt tot pyruvaat. Pyruvaat wordt hetzij gereduceerd tot lactaat of in de mitochondriën, waar het vormt acetyl coenzyme A (CoA) getransporteerd. Acetyl-CoA gaat dan in de TCA cyclus. Hoge-energie tussenproducten met de TCA cyclus voortbewegen van de beweging van elektronen in de elektronentransportketen (ETC), dat op zijn beurt verdrijft H + van de mitochondriale matrix een H + gradiënt over de binnenste mitochondriale membraan ontstaan. Zuurstof fungeert als de uiteindelijke elektronen acceptor, en H + terug te keren naar de mitochondriale matrix door de F O / F &lt;sub&gt; 1 complex, waar hun potentiële energie wordt gebruikt om ATP (Figuur 1A) genereren. Het werkingsprincipe van de extracellulaire flux test hangt af van bemoeien met glycolyse en oxidatieve fosforylering op specifieke punten, en de beoordeling van de daaruit voortvloeiende gevolgen. Hiervoor gebruikten we glucose glycolyse uitgehongerde cellen en 2-deoxyglucose (2-DG), dat wordt omgezet in 2-deoxyglucose-6-fosfaat, een competitieve remmer van phosphoglucoisomerase 23, door hexokinase verspreiden, teneinde blokkeren glycolyse. Rotenon (complex I-specifieke remmer van de ETC), antimycin A (een complex III-specifieke remmer van de ETC), oligomycin (remmer van ATP synthase 24), en de ontkoppeling middel 2,4-dinotrophenol (DNP) 25 waren gebruikt om specifieke evenementen in verband met het vervoer, proton gradiënt en ATP synthese (Figuur 1A) elektronen ingrijpen. In plaats van 2,4-DNP, carbonyl cyanide-4- (trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP) kan ook gebruikt worden, maar verdere optimalisatie kan vereist. In beide gevallen moet ontkoppelrails altijd getitreerd voor een bepaald celtype voor gebruik om de optimale concentratie te bepalen nodig. De glycolyse stress test (Figuur 1B) begint met een nulmeting van de extracellulaire verzuring rate (ECAR) in de eerder uitgehongerd cellen. Omdat deze cellen hun basale minimum en derhalve praktisch gezien als niet-glycolytische wordt de ECAR gemeten op dit punt als de niet-glycolytische verzuring. Deze verzuring waarschijnlijk overeen met respiratoire CO 2 gegenereerd in de TCA cyclus wordt omgezet in HCO 3 - en H +. Dit wordt gevolgd door de injectie van glucose glycolyse activeren, die weer als een toename van het extracellulaire verzuring door de vorming van lactaat.Deze toename vertegenwoordigt het normale tarief van glycolyse. De cellen worden vervolgens geprikkeld met de injectie van oligomycin, welke blokken de vorming van ATP door middel van oxidatieve fosforylering. Cellen reageren op deze dramatische daling van ATP productie door het activeren glycolyse zijn maximumniveau en dat resulteert in een toename van de secundaire ECAR niveau (glycolytische reserve). De proef wordt beëindigd door totale remming van glycolyse met de glucose analoge 2-DG, die de ECAR de niet-glycolytische niveau terugkeert. Interessant is voorgesteld dat, zoals aanbevolen door de fabrikant, maximale glycolyse wordt niet noodzakelijkerwijs bereikt door de injectie van oligomycin 26. In cellen met een hoge glycolytische capaciteit, als er geen significante toename in ATP vraag glycolyse kan perfect kunnen gaan met het verlies van mitochondriale ATP zonder dat dit product up-gereguleerd. De glycolytische tarief met oligomycin kon worden overtroffen door het toevoegen van de luchtwegen remmersZoals rotenon en myxothiazol, die enkele voordelen ten opzichte oligomycin bieden: 1) Zij vergen ATP mocht de omkering van ATP synthase veroorzaken met ATP hydrolyse, om protonen te pompen in een poging om de mitochondriale membraanpotentiaal 26 herstellen; 2) Ze voorkomen respiratoire verzuring van het medium, waarin de ECAR resultaten (zie hieronder) kunnen verwarren. Andere manieren om ATP vraag te vergroten omvatten de toevoeging van verbindingen die de hydrolyse van ATP stimuleren door het plasmamembraan ATPasen 26. Dit alles moet zorgvuldig worden overwogen door onderzoekers bij het plannen van een glycolyse stresstest. De mitochondriale stress test (figuur 1C) begint met een nulmeting van het zuurstofverbruik rate (OCR) in niet-uitgehongerd cellen. Dit wordt gevolgd door de injectie van oligomycin, die de terugkeer van protonen door de F O / F 1-complex remt en daardoor snel hyperpolarizes het mitochondriale membraan. Hyperpolarisatie voorkomt verdere proton pompen door respiratoire complexen, en de ademhalingsfrequentie afneemt. De resterende ademhaling heet proton lek, waarbij de stroom van protonen met lipiden of andere kanalen vertegenwoordigt. Dit gehyperpolariseerde toestand wordt snel omgekeerd door de toevoeging van de ontkoppeling middel 2,4-DNP, dat als een proton ionofoor. In reactie, cellen proberen om de membraanpotentiaal in een vergeefse poging te herstellen door het verhogen van het elektron transport tarief op zijn maximum, en dit op zijn beurt verhoogt de OCR. Tot slot, met de toevoeging van twee ETC-remmers (antimycin A en rotenon), mitochondriale ademhaling volledig stopt en OCR af tot het laagste niveau. Op dit niveau zuurstofverbruik niet door mitochondriale activiteit (niet-mitochondriale). Het verschil in de OCR die door deze remmers wordt de maximale mitochondriale ademhaling, die de som van de basislijn ademhaling en de reservecapaciteit. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; B- en T-cel isolatie op zeer levensvatbare pure lymfocytenpopulaties. B-cellen en naïeve CD4 + T-cellen werden geïsoleerd zoals beschreven in paragraaf 4 van het protocol, en splenocyten werden eenvoudigweg verkregen door lyseren van de rode bloedcellen zoals beschreven in paragraaf 3.3. De gevoeligheid van celtype-specifieke metabolische assays afhankelijk van de levensvatbaarheid en de zuiverheid van het uitgangsmateriaal celpopulatie. Daarom, om de levensvatbaarheid van de geïsoleerde muizen T-cellen, splenocyten en B-cellen en de zuiverheid van T- en B-cellen te verifiëren, kleine fracties cellen werden gekleurd voor flowcytometrische analyse (figuur 2). In de forward scatter-area versus zijwaartse verstrooiing-area (FSC-A vs. SSC-A) plot, lymfocyten werden afgesloten, en binnen deze poort, de bevolking langs de diagonaal in de forward scatter-height (FSC-H) vs. FSC-A plot werden bepaald als de singlets. Binnen het singlet bevolking, werd levensvatbaarheid gemeten door het poorten van de cellen die negatief gekleurd voor de live / dead marker (Figuur 2A); T cellevensvatbaarheid was 97,9%, splenocyten levensvatbaarheid was 92%, en B cellevensvatbaarheid was 94%. B-cel zuiverheid, zoals gemeten door de B220 + CD19 + populatie 26, was 99%, terwijl CD4 + T-cel zuiverheid zoals gemeten door de CD44 - populatie CD4 + 27 was 98,3% (Figuur 2B). Eiwitconcentratie van het cellysaat kan worden gebruikt als een directe indicatie plated celaantal. Geïsoleerde lymfocyten en splenocyten werden uitgezet in een met kleefstof beklede 96-well assay plaat bij 5 x 10 5 cellen / putje, 2,5 x 10 5 cellen / putje, 1,25 x 10 5 cellen / putje, en 0,625 x 10 <sup&gt; 5 cellen / putje. De samenloop van elk uitplaatdichtheid van de drie soorten cellen werd gevisualiseerd onder de lichtmicroscoop (figuur 3A). Zoals verwacht, samenvloeiing gecorreleerd met de eerste plating dichtheden. Na voltooiing van de extracellulaire flux test werden uitgeplaat gelyseerd en hun eiwitconcentraties werden gekwantificeerd met de BCA assay. Voor alle celtypes zijn lysaat eiwitconcentraties aangetoond lineair verband te houden met de initiële beplating dichtheden (figuur 3B), waaruit blijkt dat lysaat eiwitconcentraties kunnen worden gebruikt als een nauwkeurige maat voor de normalisatie van celaantallen bij het interpreteren van de extracellulaire flux-gegevens. De beplating dichtheden die in dit experiment zijn geoptimaliseerd voor naïeve, niet-gestimuleerde lymfocyten. Indien gestimuleerd of eerder gekweekte cellen worden gebruikt, kan verdere optimalisatie nodig. Mitochondriale en glycolytische stress assays zijn afhankelijk van vergulde aantal cellen. Het OCR werd gemeten voor elk celtype en plating dichtheid in de extracellulaire flux analysator. Zoals verwacht hogere celaantallen een hogere gemeten OCR, evenals meer dramatische reacties op oligomycin, 2,4-DNP en antimycin A / rotenon (Figuur 4A). Standaardiseren OCR metingen om eiwitconcentratie elk monster onthult dat in het algemeen, grotere aantallen cellen leiden tot een meer nauwkeurige OCR-metingen. Scheepswand in 5 en 2,5 x 10 5 cellen / putje leidde tot soortgelijke genormaliseerde OCR metingen in de T-cellen en splenocyten en 5 en 1,25 x 10 5 cellen / putje leidde soortgelijke genormaliseerde OCR metingen in B-cellen (Figuur 4B). De kleine verschillen in de genormaliseerde B-cel OCR metingen kan een indirecte indicatie dat B-cellen beter presteren bij 2,5 x 10 5 cellen / putje in vergelijking met andere celdichtheden. Door alle maatregelen, 0,625 x 10 5 cellen / putje gaf suboptimale resultaten, waaruit blijkt dat dit plating dichtheid is onvoldoende. Baseline ademhaling, proton lek, maximale mitochondriale ademhaling, niet-mitochondriale ademhaling en ATP productie lineair gecorreleerd met plating dichtheden voor alle celtypen (Figuur 4C). Bovendien, de meeste van de basislijn ademhaling wordt aangewend voor het synthetiseren van ATP, zoals aangegeven door de lage proton lek in de drie celsoorten. Terwijl de primaire focus van de mitochondriale spanning experiment is om bij OCR meten de ECAR nog steeds nuttig op te nemen zodat de test met succes is uitgevoerd. Vergelijkbaar met de OCR, de twee hoogste beplating dichtheden leidde tot hogere ECAR en dramatischer reacties op oligomycin, 2,4-DNP en antimycin A / rotenon (Figuur 4D). De dramatische veranderingen in ECAR bij toevoeging van 2,4-DNP en antimycin A / rotenon kan door veranderingen in de ademhaling naast veranderingen in glycolysis Aangezien CO 2 gegenereerd in de TCA cyclus wordt omgezet in HCO 3 - en H +. Deze kwestie is onlangs aangepakt, en er bestaat een eenvoudige methode voor het corrigeren van de totale extracellulaire verzuring signaal met behulp van zuurstofverbruik van gegevens, naar de echte glycolytische tarief 12,29 te verkrijgen. De glycolyse spanning test was zeer succesvol in de hoogste plaatdichtheid (Figuur 5A, B). In alle celtypes, de 5 x 10 5 cellen / putje monsters hadden de grootste veranderingen in ECAR na de toevoeging van glucose, oligomycin en 2-DG (Figuur 5B). Bovendien, het normaliseren van eiwit concentratie aangetoond dat voor elk type cel, de 5 x 10 5 cellen / putje monsters leverde een optimaal resultaat, terwijl lagere concentraties, vooral 0,625 x 10 5 cellen / goed niet een robuuste glycolytische reservecapaciteit te geven. Non-glycolytic verzuring, glycolyse, en schijnbare glycolytische capaciteit lineair gecorreleerd met plating dichtheden voor alle celtypes (figuur 5C). Voor de glycolyse spanning experiment, de OCR grafiek blijkt dat glucose enigszins stimuleert mitochondriale ademhaling, die vervolgens wordt geremd door oligomycin behandeling; de toevoeging van 2-DG beïnvloedde de OCR (figuur 5D). De OCR grafiek kan worden gebruikt als een verdere indicatie dat de glycolyse spanning experiment succesvol is uitgevoerd. Ook kan de OCR grafiek worden voor het corrigeren van de ECAR grafiek eventueel zoals hierboven beschreven bij de mitochondriale stresstest 12,29. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig1.jpg" /> Figuur 1:. Overzicht van extracellulaire flux assays (A) Illustratie van glycolyse (links) en oxidatieve fosforylering (rechts) die de werking van demetabole geneesmiddelen die in het extracellulaire flux assays. (B) Schematische voorstelling van de extracellulaire verzuring rate (ECAR) grafiek; schematische weergave van het zuurstofverbruik rate (OCR) grafiek (C). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig2.jpg" /> . Figuur 2: Stapsgewijze gating van T-cellen, B-cellen en splenocyten levensvatbaarheid en zuiverheid bepalen Flow cytometrische plots die de levensvatbaarheid van T-cellen, splenocyten, en B-cellen (A); en zuiverheid van T- en B-cellen (B). De resultaten zijn representatief voor ten minste drie onafhankelijke experimenten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van th bekijken</a>is figuur. <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig3.jpg" /> Figuur 3:. Celconfluentie correleert met het lysaat eiwitconcentraties van elk celtype in verschillende plating dichtheden (A) licht microfoto van cellen in putjes van ten plating dichtheden variërend van 5 x 10 5 cellen / putje tot 0,625 x 10 5 cellen / goed. Schaalbalken geven 50 urn. (B) Lysate eiwitconcentraties op verschillende plating dichtheden, zoals gemeten met de BCA assay. De resultaten zijn representatief voor ten minste drie onafhankelijke experimenten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig4.jpg" /> Figuur 4:<html> Mitochondriale stress-test. Raw (A) en gestandaardiseerde (B) OCR voor elk celtype en plating dichtheid weergegeven. (C) Aantal cellen afhankelijke veranderingen in de niveaus van de basislijn, maximale mitochondriale en non-mitochondriale ademhaling, en zuurstof verbruik verbonden proton lekken of ATP productie, worden getoond voor elke celtypen. (D) Raw ECAR waarden verkregen uit de mitochondriale stresstest getoond. Elk gegevenspunt stelt het gemiddelde van 7-8 putjes standaarddeviatie. Gelabelde pijlen duiden injecties oligomycin (O), 2,4-DNP (D) en rotenon / antimycin A (R / A). De resultaten zijn representatief voor ten minste drie onafhankelijke experimenten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> _upload / 54918 / 54918fig5.jpg &quot;/&gt; Figuur 5:. Glycolytische spanning assay Raw (A) en gestandaardiseerde (B) ECAR voor elk celtype en plating dichtheid weergegeven. (C) Aantal cellen afhankelijke veranderingen ECAR voor niet-glycolytische verzuring, glucose geïnduceerde glycolyse en totale glycolytische capaciteit getoond. (D) Raw OCR waarden verkregen uit de glycolytische stresstest getoond. Elk gegevenspunt stelt het gemiddelde van 7-8 putjes standaarddeviatie. Gelabelde pijlen duiden injecties van glucose (G), oligomycin (O) en 2-deoxyglucose (2-DG). De resultaten zijn representatief voor ten minste drie onafhankelijke experimenten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

De studie van metabolisme wordt steeds relevanter voor immunologisch onderzoek. Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor het meten van glycolyse en mitochondriale ademhaling in muis splenocyten, en T- en B-lymfocyten.

Een geoptimaliseerde Protocol Analyseer glycolyse en mitochondriale Ademhaling in lymfocyten

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

Het algemene doel van deze procedure is om glycolyse en mitochondriale respiratie in lymfocyten nauwkeurig te meten met behulp van een extracellular flux assay. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van het immunometabolisme, zoals welke metabole veranderingen er optreden in immuuncellen bij activatie, differentiatie of tijdens ziekte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de efficiënte real-time analyse van metabole profielen van meer dan 90 monsters tegelijk mogelijk maakt.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in het metabolisme van lymfocyten, kan deze ook worden toegepast op andere cellen, waaronder niet-adherente cellen die in de plaat moeten worden toegevoegd met minimale verstoring van hun functionaliteit. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben omdat lymfocyten fragiel zijn en een voorzichtige behandeling vereisen om hun functionaliteit en levensvatbaarheid te behouden. Til de dag voor het experiment de sensorkartridge van de extracellular flux analyzer op en vul elke put van de utility plate met 200 microliters kalibratie-oplossing.Plaats vervolgens de cartridge op de plaat, zodat de sensoren in de kalibratieoplossing worden ondergedompeld, en incubeer de cartridge een nacht in een incubator van 37 °C zonder kooldioxide of stikstof. Coat de volgende ochtend elke put van een 96-well assayplaat met 25 µL adhesieoplossing en incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Aspireer na afloop van de incubatie de adhesieoplossing en was elke put twee keer met 200 µL steriel water.Terwijl de plaat aan de lucht droogt, plaatst u een cellzeef van 70 micron over een conische buis van 50 milliliter en brengt u de geoogste organen over op de zeef. Gebruik de zuiger van een steriele spuit van drie milliliter om het weefsel door de zeef te drukken, waarbij het filter en de organen tijdens het maceratieproces vochtig worden gehouden door indien nodig MS-buffer toe te voegen. Spoel vervolgens de zeef af met vijf tot 10 milliliter MS-buffer, gevolgd door centrifugatie van de resulterende celsuspensie.Resuspendeer de pellet in vijf milliliter ACK-lysebuffer voor rode bloedcellen. Na vijf minuten op ijs wordt de tenacity hersteld met 10 tot 20 milliliter MS-buffer en worden de cellen opnieuw gecentrifugeerd. Plaats aan het einde van de centrifugatie een cellenzeef van 30 micron over een conische buis van 15 milliliter en spoel de zeef voor met één milliliter MS-buffer.Resuspendeer de cellen in vijf milliliters verse MS-buffer en filter de celsuspensie door de zeef om de aggregaten van gelyseerde rode bloedcellen te verwijderen. Voeg vier milliliters verse MS-buffer toe om de lege lysisbuis spoelen en laat dit spoelwater door de zeef lopen. Tel de cellen en verdeel een适当 aantal miltcellen in aliquoten voor de extracellular flux assay.Pellet vervolgens beide sets cellen en resuspendeer het splenocytmonster voor de extracellular flux assay in vijf milliliter RF 10 medium op ijs. Resuspendeer de cellen voor bead-isolatie in de juiste volumes biotin-antilichaamcocktail, anti-biotin microbeads en MS-buffer voor de aangegeven incubatietijden bij twee tot acht graden Celsius. Verzamel aan het einde van de tweede incubatie de cellen door middel van centrifugatie en resuspendeer de pellet in 500 microliters verse MS-buffer per 1 × 10⁸ cellen.Laad vervolgens de juiste kolom op de scheidingsmagneet en prim de kolom met drie milliliter MS-buffer, waarbij de doorstroom wordt weggegooid. Plaats een steriele conische buis van 15 milliliter onder de kolom en laad het volledige volume van het celmonster op de kolom. Spoel daarna de celincubatiebuis met drie milliliter verse MS-buffer en verzamel het spoelwater in de conische buis.Nadat het laatste eluaat is opgevangen, wordt de buis aangevuld tot een eindvolume van 15 milliliters MS-buffer en worden de negatief geïsoleerde cellen gecentrifugeerd. Resuspendeer de pellet vervolgens in vijf milliliters vers RF 10-medium op ijs. Centrifugeer uiterlijk drie uur na de isolatie alle celmonsters en resuspendeer de pellets in vijf milliliters van het geschikte assay-medium voor een volgende centrifugatie.Resuspendeer na de tweede centrifugatie de pellets bij de juiste experimentele concentratie om een eindvolume van 180 microliters cellen per well in vers assaymedium te bereiken, en verdeel 180 microliters cellen over elke well van de plaat. Incubeer de cellen gedurende 25 minuten bij 37 graden Celsius. Centrifugeer vervolgens de plaat om de cellen stevig aan de bodem van de wells te laten hechten en plaats de plaat terug in de incubator.Gebruik na 30 minuten een micropipet om de vers bereide verbindingen van belang bij 37 graden Celsius in de juiste injectiepoorten van de sensorcartridge van de extracellular flux analyzer te laden; vul alle controle-achtergrond- en niet-experimentele poorten enkel met medium. Plaats de geladen cartridge terug in de incubator en stel het programma voor de extracellular flux assay in. Laad vervolgens de cartridge en start het programma, waarbij de kalibratieplaat na de kalibratie wordt vervangen door de assayplaat zoals aangegeven.Ga na de extracellulaire flux-assay over tot de metingen van het eiwitgehalte. Meer dan 90% van alle celpopulaties is levensvatbaar, waarbij een zuiverheid van 98 tot 99% werd waargenomen voor de lymfocyten. De confluentie van elk celtype correleert met de initiële plating-dichtheden.De eiwitconcentraties van het lysaat correleren lineair met de zaaidichtheden, wat bevestigt dat eiwitconcentraties gebruikt kunnen worden om extracellulaire fluxgegevens nauwkeurig te normaliseren. Hogere celaantallen correleren met een hogere gemeten zuurstofconsumptiesnelheid, evenals met sterkere reacties op mitochondriële inhibitoren. Hogere zaaidichtheden leiden tot vergelijkbare genormaliseerde metingen van de zuurstofconsumptiesnelheid in T-cellen en splenocyten, terwijl vijf en 1,25 × 10⁵ cellen per well leiden tot vergelijkbare genormaliseerde metingen van de zuurstofconsumptiesnelheid in B-cellen.Parameters van de mitochondriale respiratie correleren ook lineair met de platingdichtheden. Bovendien wijst de lage protonlekkage erop dat het grootste deel van de basale respiratie wordt aangewend voor ATP-synthese. Hogere platingdichtheden resulteren in hogere extracellulaire verzuringssnelheden en sterkere reacties op mitochondriale inhibitoren.Glycolyseparameters correleren lineair met de celplaatdichtheden, waarbij is vastgesteld dat de hoge plaatdichtheid het meest optimaal is voor een succesvolle glycolyse-stressassay. Glucose stimuleert de mitochondriale respiratie licht, welke wordt geremd door oligomycine, terwijl 2-DG het zuurstofverbruik niet significant beïnvloedt. Eenmaal beheerst kan deze techniek in zes tot acht uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de cellen vóór de extracellular flux-analyse op ijs moeten worden bewaard en dat de cellen nauwkeurig moeten worden geteld en uitgeplaat. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals het meten van het mitochondriële potentiaal en de glucoseopname, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de metabole status van de cellen te beantwoorden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u lymfocyten kunt isoleren en een extracellular flux-assay kunt uitvoeren.

an-optimized-protocol-to-analyze-glycolysis-mitochondrial-respiration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hematopoietische stam voorlopercellen (Hspc's) overgang van een rusttoestand naar een differentiatie toestand als gevolg van hun metabole plasticiteit tijdens de bloedvorming. Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor het meten van de mitochondriale ademhaling en glycolyse van Hspc's.

Analyse van hematopoietische stam voorlopercellen metabolisme

In dit artikel beschrijven we een methode om glycolyse en mitochondriale ademhaling te meten in primaire menselijke Natural Killer (NK) cellen geïsoleerd van perifeer bloed, in rust of na IL15-geïnduceerde activering. Het beschreven protocol kan gemakkelijk worden uitgebreid tot primaire menselijke NK-cellen die worden geactiveerd door andere cytokines of oplosbare stimuli.

Analyse van human natural killer cell metabolisme

Metabole aanpassing is fundamenteel voor T-cellen omdat het differentiatie, persistentie en cytotoxiciteit dicteert. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het monitoren van mitochondriale ademhaling in ex vivo cytokine-gedifferentieerde menselijke primaire T-cellen.

Real-time monitoring van mitochondriale ademhaling in cytokine-gedifferentieerde menselijke primaire T-cellen

We beschrijven stapsgewijze protocollen die de mitochondriale ademhaling van muis en menselijke neutrofielen en HL60-cellen meten met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator.

Real-time meting van het mitochondriale bio-energetische profiel van neutrofielen

De bio-energetica van CD8 T-cellen kan worden ondervraagd met behulp van de Mito-stresstest. Deze methodologie kan worden gebruikt om acute en chronische metabole programmering te bestuderen. Dit protocol beschrijft benaderingen om de relaties tussen T-celreceptorbiologie en bio-energetische analyse te onderzoeken.

Meten van de mitochondriale functie van naïeve en effector CD8 T-cellen

Mitochondriale ademhaling in gistcellen is een waardevolle indicator van de bio-energetica van cellen. Hier presenteren we een protocol om dit fenotype te kwantificeren dat van toepassing is op verschillende gistsoorten.

Kwantificering van mitochondriale ademhaling in hele gistcellen

Hier beschrijven we in detail methoden voor het extraheren van macrofagen uit het beenmerg, de milt en het hartinfarct, en vervolgens het beoordelen van de metabole flux in levende cellen.

Analyse van ex vivo metabole flux in milt- en cardiale macrofagen en beenmergmonocyten

Dit protocol beschrijft een kosteneffectieve manier om een glycolyse-stresstest uit te voeren om metabole herprogrammering in primaire muismicroglia te kwantificeren. Na isolatie en ontstekingsstimulatie wordt de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) gemeten met vers bereide, pH-gecorrigeerde reagentia, gevolgd door eiwitnormalisatie om een nauwkeurige en reproduceerbare beoordeling van glycolytische verschuivingen mogelijk te maken.

Onderzoek naar glycolyse in primaire microglia met behulp van extracellulaire fluxassay

Cel-gemedieerde lymphocytotoxicity (CML) testen kunnen worden gebruikt voor het autoreactieve reacties en onderzoek naar mechanismen van celdood in vitro test. Echter, met behulp van live-cell confocale microscopische beeldvorming technieken met fluorescente kleurstoffen, het type en de kinetiek van celdood en gebruik gemaakt van de paden worden bestudeerd in meer detail.

Methoden om Beta Cell Death gemedieerd beoordelen door cytotoxische T lymfocyten

We presenteren onze geoptimaliseerde high-throughput nucleofection protocol als een efficiënte manier transfecteren primaire menselijke monocyt-afgeleide dendritische cellen met een plasmide DNA of siRNA, zonder dat cel rijping. We verder bewijs leveren voor een succesvolle siRNA zwijgen van gerichte gen RIG-I zowel op mRNA-en eiwitniveau.

Geoptimaliseerd protocol voor Efficiënte Transfectie van dendritische cellen zonder Cell Rijping

Leer glycolyse en mitochondriale ademhaling meten in lymfocyten via een geoptimaliseerde extracellular flux assay. Deze methode biedt real-time inzicht in immunometabolisme met hoge viabiliteit.

Een geoptimaliseerde Protocol Analyseer glycolyse en mitochondriale Ademhaling in lymfocyten

Meer video's verkennen