Een geoptimaliseerde Protocol Analyseer glycolyse en mitochondriale Ademhaling in lymfocyten

Het algemene doel van deze procedure is om glycolyse en mitochondriale respiratie in lymfocyten nauwkeurig te meten met behulp van een extracellular flux assay. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van het immunometabolisme, zoals welke metabole veranderingen er optreden in immuuncellen bij activatie, differentiatie of tijdens ziekte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de efficiënte real-time analyse van metabole profielen van meer dan 90 monsters tegelijk mogelijk maakt.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in het metabolisme van lymfocyten, kan deze ook worden toegepast op andere cellen, waaronder niet-adherente cellen die in de plaat moeten worden toegevoegd met minimale verstoring van hun functionaliteit. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben omdat lymfocyten fragiel zijn en een voorzichtige behandeling vereisen om hun functionaliteit en levensvatbaarheid te behouden. Til de dag voor het experiment de sensorkartridge van de extracellular flux analyzer op en vul elke put van de utility plate met 200 microliters kalibratie-oplossing.

Plaats vervolgens de cartridge op de plaat, zodat de sensoren in de kalibratieoplossing worden ondergedompeld, en incubeer de cartridge een nacht in een incubator van 37 °C zonder kooldioxide of stikstof. Coat de volgende ochtend elke put van een 96-well assayplaat met 25 µL adhesieoplossing en incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Aspireer na afloop van de incubatie de adhesieoplossing en was elke put twee keer met 200 µL steriel water.

Terwijl de plaat aan de lucht droogt, plaatst u een cellzeef van 70 micron over een conische buis van 50 milliliter en brengt u de geoogste organen over op de zeef. Gebruik de zuiger van een steriele spuit van drie milliliter om het weefsel door de zeef te drukken, waarbij het filter en de organen tijdens het maceratieproces vochtig worden gehouden door indien nodig MS-buffer toe te voegen. Spoel vervolgens de zeef af met vijf tot 10 milliliter MS-buffer, gevolgd door centrifugatie van de resulterende celsuspensie.

Resuspendeer de pellet in vijf milliliter ACK-lysebuffer voor rode bloedcellen. Na vijf minuten op ijs wordt de tenacity hersteld met 10 tot 20 milliliter MS-buffer en worden de cellen opnieuw gecentrifugeerd. Plaats aan het einde van de centrifugatie een cellenzeef van 30 micron over een conische buis van 15 milliliter en spoel de zeef voor met één milliliter MS-buffer.

Resuspendeer de cellen in vijf milliliters verse MS-buffer en filter de celsuspensie door de zeef om de aggregaten van gelyseerde rode bloedcellen te verwijderen. Voeg vier milliliters verse MS-buffer toe om de lege lysisbuis spoelen en laat dit spoelwater door de zeef lopen. Tel de cellen en verdeel een适当 aantal miltcellen in aliquoten voor de extracellular flux assay.

Pellet vervolgens beide sets cellen en resuspendeer het splenocytmonster voor de extracellular flux assay in vijf milliliter RF 10 medium op ijs. Resuspendeer de cellen voor bead-isolatie in de juiste volumes biotin-antilichaamcocktail, anti-biotin microbeads en MS-buffer voor de aangegeven incubatietijden bij twee tot acht graden Celsius. Verzamel aan het einde van de tweede incubatie de cellen door middel van centrifugatie en resuspendeer de pellet in 500 microliters verse MS-buffer per 1 × 10⁸ cellen.

Laad vervolgens de juiste kolom op de scheidingsmagneet en prim de kolom met drie milliliter MS-buffer, waarbij de doorstroom wordt weggegooid. Plaats een steriele conische buis van 15 milliliter onder de kolom en laad het volledige volume van het celmonster op de kolom. Spoel daarna de celincubatiebuis met drie milliliter verse MS-buffer en verzamel het spoelwater in de conische buis.

Nadat het laatste eluaat is opgevangen, wordt de buis aangevuld tot een eindvolume van 15 milliliters MS-buffer en worden de negatief geïsoleerde cellen gecentrifugeerd. Resuspendeer de pellet vervolgens in vijf milliliters vers RF 10-medium op ijs. Centrifugeer uiterlijk drie uur na de isolatie alle celmonsters en resuspendeer de pellets in vijf milliliters van het geschikte assay-medium voor een volgende centrifugatie.

Resuspendeer na de tweede centrifugatie de pellets bij de juiste experimentele concentratie om een eindvolume van 180 microliters cellen per well in vers assaymedium te bereiken, en verdeel 180 microliters cellen over elke well van de plaat. Incubeer de cellen gedurende 25 minuten bij 37 graden Celsius. Centrifugeer vervolgens de plaat om de cellen stevig aan de bodem van de wells te laten hechten en plaats de plaat terug in de incubator.

Gebruik na 30 minuten een micropipet om de vers bereide verbindingen van belang bij 37 graden Celsius in de juiste injectiepoorten van de sensorcartridge van de extracellular flux analyzer te laden; vul alle controle-achtergrond- en niet-experimentele poorten enkel met medium. Plaats de geladen cartridge terug in de incubator en stel het programma voor de extracellular flux assay in. Laad vervolgens de cartridge en start het programma, waarbij de kalibratieplaat na de kalibratie wordt vervangen door de assayplaat zoals aangegeven.

Ga na de extracellulaire flux-assay over tot de metingen van het eiwitgehalte. Meer dan 90% van alle celpopulaties is levensvatbaar, waarbij een zuiverheid van 98 tot 99% werd waargenomen voor de lymfocyten. De confluentie van elk celtype correleert met de initiële plating-dichtheden.

De eiwitconcentraties van het lysaat correleren lineair met de zaaidichtheden, wat bevestigt dat eiwitconcentraties gebruikt kunnen worden om extracellulaire fluxgegevens nauwkeurig te normaliseren. Hogere celaantallen correleren met een hogere gemeten zuurstofconsumptiesnelheid, evenals met sterkere reacties op mitochondriële inhibitoren. Hogere zaaidichtheden leiden tot vergelijkbare genormaliseerde metingen van de zuurstofconsumptiesnelheid in T-cellen en splenocyten, terwijl vijf en 1,25 × 10⁵ cellen per well leiden tot vergelijkbare genormaliseerde metingen van de zuurstofconsumptiesnelheid in B-cellen.

Parameters van de mitochondriale respiratie correleren ook lineair met de platingdichtheden. Bovendien wijst de lage protonlekkage erop dat het grootste deel van de basale respiratie wordt aangewend voor ATP-synthese. Hogere platingdichtheden resulteren in hogere extracellulaire verzuringssnelheden en sterkere reacties op mitochondriale inhibitoren.

Glycolyseparameters correleren lineair met de celplaatdichtheden, waarbij is vastgesteld dat de hoge plaatdichtheid het meest optimaal is voor een succesvolle glycolyse-stressassay. Glucose stimuleert de mitochondriale respiratie licht, welke wordt geremd door oligomycine, terwijl 2-DG het zuurstofverbruik niet significant beïnvloedt. Eenmaal beheerst kan deze techniek in zes tot acht uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de cellen vóór de extracellular flux-analyse op ijs moeten worden bewaard en dat de cellen nauwkeurig moeten worden geteld en uitgeplaat. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals het meten van het mitochondriële potentiaal en de glucoseopname, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de metabole status van de cellen te beantwoorden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u lymfocyten kunt isoleren en een extracellular flux-assay kunt uitvoeren.