Efficiënt en Site-specifiek antilichaam Labeling by-stam bevorderde azide-alkyn Cycloadditiereacties

Het algemene doel van deze procedure is om chemische sondes op locatie in een antilichaamfragment te introduceren door genetisch een azide-bevattend aminozuur in te bouwen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de chemische biologie te beantwoorden, zoals bij eiwitmodificatie, -engineering en -conjugatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat uw doelprobe of bouillon op locatie in eiwitten of antilichamen kan worden geïntroduceerd door eenvoudig te mengen.

Na het construeren van de plasmiden, voegt u één microliter van elk toe aan 20 microliter van E.Coli-stam DH10-beta bij een concentratie van twee keer 10 tot de achtste cellen per microliter in een centrifugeerbuis van 1,5 milliliter. Gebruik een pipette om de oplossing voorzichtig te mengen. Plaats vervolgens 20 microliter van de gemengde oplossing in een schone cuvet.

Stel de elektroporatiemachine in op 25 microfarad en 2,5 kilovolt. Plaats vervolgens de cuvet in de schuif van de schokkam. Duw de schuif in de kamer tot de cuvet stevig contact maakt met de elektroden van de kamer.

Druk eenmaal op de pulsknop totdat de elektroporatiemachine piept. Voeg daarna snel één milliliter SOC-medium toe aan de cuvet. Breng vervolgens het mengsel over naar een reageerbuis.

Incubeer met schudden bij 37 graden Celsius gedurende één uur. Nadat de incubatie voltooid is, verdeel de getransformeerde E.Coli-cellen op lysogeniebouillonagarplaten met geschikte antibiotica. Incubeer de platen gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius.

Nadat de plaatincubatie voltooid is, inoculeert u een enkele getransformeerde kolonie in vijf milliliter LB-medium met antibiotica. Incubeer met schudden gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius. Breng vervolgens de primaire cultuur over in 200 milliliter LB-medium met 100 microgram per milliliter ampicilline en één millimolair AF.Incubeer met schudden bij 37 graden Celsius gedurende minimaal drie uur.

Voeg twee milliliter van 1,6 molair arabinos toe wanneer de cultuur een optische dichtheid van 0,8 bereikt bij 550 nanometer. Incubeer vervolgens met schudden bij 30 graden Celsius gedurende 12 uur. Wanneer de incubatie voltooid is, oogst u de cellen door centrifugatie bij 11.000 keer g gedurende vijf minuten.

Gooi het supernatant weg en bevriest de pellet bij min 20 graden Celsius. Wanneer u klaar bent om de cellen te lyseren, bouwt u de pellet opnieuw op in 20 milliliter paraplasmisch lysebuffer in een schone centrifugeerbuis. Incubeer het mengsel gedurende één uur bij 37 graden Celsius.

Centrifugeer vervolgens het cellysaat gedurende 15 minuten bij 18.000 keer g bij vier graden Celsius. Breng de supernatant over naar een schone buis en gooi de pellet weg. Voeg vervolgens 400 microliter van een Ni-NTA-harssuspensie toe.

Gebruik een rotator om de buis gedurende één uur bij vier graden Celsius voorzichtig te agiteren. Nadat het mengen voltooid is, giet u de suspensie in een polypropyleen kolom. Was de hars drie keer met vijf milliliter wasbuffer.

Elueer het doelantilichaam met 300 microliter elutiebuffer. Bepaal vervolgens de concentratie van het mutante eiwit zoals beschreven in het tekstprotocol. Begin door 10 microliter van een 10 micromolair oplossing van HerFab-L177AF in fosfaatbuffer met 10 millimolair natriumfosfaat dibasisch en 100 millimolair natriumchloride toe te voegen aan een schone centrifugeerbuis.

Voeg vervolgens 20 microliter van een 200 micromolair oplossing van Cy 5.5 azadibenzocyclooctyne in water toe. Bedek vervolgens het reactievat met aluminiumfolie. Laat de door kleurstof gepromoveerde cyclo-editiereactie zes uur bij 37 graden Celsius doorgaan.

Zodra de reactie voltooid is, voegt u 30 microliter monster en 450 microliter fosfaatbuffer toe om Cy 5.5 kleurstof in een centrifugaalfiltercentrifugeerbuis af te wassen. Centrifugeer de centrifugeerbuis gedurende 15 minuten bij 14.000 keer g bij vier graden Celsius. Gooi het doorstroomafval weg en breng vervolgens het gezuiverde monster over naar een microcentrifugeerbuis van 1,5 milliliter.

Bewaar het gezuiverde gelabelde HerFab bij vier graden Celsius, tenzij het klaar is voor analyse. Begin door 13 microliter van 7,8 micromolair gezuiverd HerFab toe te voegen aan een schone buis. Voeg vervolgens vijf microliter LDS-eiwitmonsterbuffer toe.

Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij 95 graden Celsius. Na incubatie, bevestigt u de vier tot 12% Bis-Tris SDS-PAGE-gelcassette aan de elektroforesecel. Voeg draaibuffer toe.

Laad vervolgens de geconjugeerde eiwitmonsters in de voorgekleurde moleculaire gewichtsmarker. Voer gelelektroforese gedurende 35 minuten bij 200 volt uit. Nadat de elektroforese voltooid is, brengt u de gel over naar een geldocumentatie- en analysesysteem.

Scan voor Cy 5.5 en kleurt vervolgens de gel met een commerciële eiwitkleuring. In deze studie wordt het antilichaamfragment Her-Fab op locatie geconjugeerd met een Dit wordt bereikt door een azide-bevattend aminozuur in het fragment in te bouwen en vervolgens het mutante antilichaamfragment te laten reageren met een verspannen cyclooctyn. SDS-PAGE-analyse wordt uitgevoerd voor mutante eiwitten die zowel met als zonder het azide-bevattende aminozuur tot expressie worden gebracht.

Zoals te zien is, werd het volledige antilichaamfragment alleen verkregen in aanwezigheid van het aminozuur. Het antilichaam dat het aminozuur bevat, wordt geëvalueerd op conjugatie via reactie met een Cy 5.5-gekoppelde azadibenzocyclooctyne-derivaat Cy 5.5 en geanalyseerd door SDS-PAGE. De fluorescentiebeelden tonen conjugatie van het mutante antilichaamfragment met Cy 5.5 terwijl geen conjugatie werd waargenomen in de controle.

Zodra uw eiwit correct tot expressie is gebracht en gezuiverd met acetylfenylalanine, kan het eiwit efficiënt worden gelabeld met een sonde met de stam Omdat de labelreactie geen extra reagens vereist, kunt u de