Name: Efficiënt en Site-specifiek antilichaam Labeling by-stam bevorderde azide-alkyn Cycloadditiereacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Leer site-specifieke antilichaamlabeling via SPAAC-reacties met azide-houdende aminozuren in E. coli. Deze efficiënte methode maakt eenvoudige eiwitmodificatie mogelijk voor chemische biologieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Plasmide Bouw <ol><li> Construct een expressieplasmide (pBAD-HerFab-L177TAG), die het doelwit antilichaam-gen (pBAD-HerFab-WT) met een Zijn 6-tag zou uiten, en vervang het codon voor leucine-177 met de amber codon (TAG) 27, met behulp van conventionele plaatsgerichte mutagenese techniek. Zie tabel van Materialen. </li><li> Construct een andere uitdrukking plasmide (pEVOL-AFRS) die de genen voor de geëvolueerde tRNA Tyr en aminoacyl-tRNA synthetase (JAV) paar. Gebruik de speciaal ontworpen plasmidevector, pEVOL, voor een efficiënte opname van UAAs. De gedetailleerde informatie en plasmide klonen protocollen worden beschreven in het vorige verslag. 28 </li><li> Verkrijgen van hoge kwaliteit plasmide DNA door toepassing van commercieel verkrijgbare plasmide preparaat kits. De 260/280 verhouding van ~ 1,8 is optimaal voor het gezuiverde DNA. Desgewenst voeren 1% agarose gelelektroforese om de zuiverheid van het DNA te controleren. </li></ol><ol><li> elektroporatie <ol><li> Voeg elk 1 pl DNA van pEVOL-AFRS 28 en pBAD-HerFab-L177TAG tot 20 pl Escherichia coli DH10β stam. Meng voorzichtig pipetteren. De plasmiden kunnen samen of in onafhankelijke reacties worden omgezet. </li><li> Voor 0,1 cm cuvetten, zet de elektroporatie instellingen tot 25 uF en 2,5 kV. </li><li> Plaats de cuvet in de schuif van de schokkende kamer. Duw de schuif in de kamer tot de cuvette maakt stevig contact met de kamer elektroden. </li><li> Pulse eens door te drukken op de pulsknop totdat de elektroporatie apparaat piept. </li><li> Voeg 1 mL super optimale bouillon met katabolische repressie (SOC) medium dat 2% (w / v) trypton, 0,5% (w / v) gistextract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 10 mM MgCl2 en 20 mM glucose de cuvette snel en het mengsel over te brengen naar een reageerbuis. Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 37 ° C onder schudden.</li><li> Spread getransformeerde E. coli cellen op lysogenie bouillon (LB) agarplaten die geschikte antibiotica (35 ug / ml chlooramfenicol en 100 ug / ml ampicilline voor het selecteren pEVOL-AFRS en pBAD-HerFab-L177TAG respectievelijk). Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 12 uur. </li></ol></li><li> cultuur voorbereiding <ol><li> Inoculeer een enkele getransformeerde kolonie in 5 ml LB medium met antibiotica. Incubeer gedurende 12 uur bij 37 ° C onder schudden. </li></ol></li></ol> 3. Expressie en zuivering van HerFab-L177AF <ol><li> Expressie van HerFab-L177AF <ol><li> Breng de primaire kweek (5 ml) in 200 ml LB-medium dat ampicilline (100 ug / ml) en AF (1 mM), gevolgd door incubatie bij 37 ° C onder schudden. OPMERKING: 100 mM voorraadoplossing AF (10 ml) werd bereid door 206 mg AF in 100 mM zoutzuur (10 ml, eindvolume). </li><li> Voeg 2 ml van 1,6 M arabinose (16mM uiteindelijke concentratie) als de cultuur van de log-fase (OD 550 = 0,8, OD = optische dichtheid) bereikt. Incubeer gedurende 12 uur bij 30 ° C onder schudden. </li><li> Oogst de cellen door centrifugatie bij 11.000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en bevriezen van de pellet bij -20 ° C. </li></ol></li><li> cellysis <ol><li> Resuspendeer de celpellets in 20 ml periplasmatische lysisbuffer die 30 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 20% sucrose en 0,2 mg / ml lysozym, en incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Centrifugeer het cellysaat bij 18.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Breng de supernatant naar een nieuwe buis en gooi de pellet. </li></ol></li><li> Ni-NTA affiniteitchromatografie <ol><li> Add Ni-NTA hars suspensie aan elke centrifugebuis (400 ul hars een 200 ml kweek) en meng voorzichtig bij 4 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Giet de suspensie in een polypropyleen kolom en was de hars driemaal met 5 ml wassen buffer bevattende 50 mM NaH 2PO 4 (pH 8,0), 20 mM imidazool en 300 mM NaCl. </li><li> Elueer het doelantilichaam met 300 ul elutiebuffer die 50 mM NaH 2PO 4 (pH 8,0), 250 mM imidazool en 300 mM NaCl. </li><li> Bepaal de concentratie van het mutante eiwit door Bradford eiwit assay 29 of door meting van de absorptie bij 280 nm. Bereken de extinctiecoëfficiënt (75.866 M -1 cm -1) voor HerFab-L177AF bij 280 nm door eiwit extinctiecoëfficiënt rekenmachine met behulp van de extinctiecoëfficiënt (2471 M -1 cm -1) voor AF. LET OP: De aminozuurvolgorde van HerFab kan worden gevonden in de NCBI website (GI: 783.282.791 en GI: 783.282.792). </li></ol></li></ol> 4. Conjugatie van gezuiverde HerFab-L177AF met Acetyleenalkoholen Probes Met behulp-Strain bevorderd azide-alkyn Cycloadditiereacties (SPAAC) <ol><li> Voeg 20 ul van Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-Adibo) in H2O (20081; M eindconcentratie) aan een oplossing van 10 uL HerFab-L177AF (10 uM eindconcentratie) in fosfaatbuffer die 10 mM Na 2 HPO 4 (pH 7,0) en 100 mM NaCl. LET OP: Als alternatieven, difluorinated cyclooctyne (DIFO) en bicyclo [6.1.0] nonyn (BCN) derivaten zijn ook beschikbaar voor dezelfde toepassing. </li><li> Laat de-stam bevorderde cycloadditiereactie men gedurende 6 uur bij 37 ° C. Als een lichtgevoelige sensor (bijv Cy5.5) wordt gebruikt, omvatten het reactievat met aluminiumfolie. </li><li> Zuiver het gemerkte HerFab volgens stap 5. </li></ol> 5. Zuivering van gelabelde HerFab <ol><li> Voeg 500 ul van het monster op een centrifugaal filter spinkolom. </li><li> Centrifugeer de spinkolom bij 14.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Discard doorstroom en overdracht gezuiverd monster van de spinkolom een ​​1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Als alternatief voor stap 5.1- 5.3 Voer Purificatie door dialyse tegen dezelfde buffer. </li><li> Bewaar de gezuiverde gemerkte HerFab bij 4 ° C. </li></ol> 6. SDS-PAGE analyse van gelabelde HerFab <ol><li> Voeg 5 ul LDS eiwit monsterbuffer bevattende 106 mM Tris-HCl, 141 mM Tris base (pH 8,5), 2% LDS, 10% glycerol, 0,51 mM EDTA, 0,22 mM SERVA Blue G250 en 0,175 mM fenolrood aan 13 pl gezuiverd gelabeld HerFab (7,8 uM of 0,38 mg / ml) in de aanwezigheid (+) of afwezigheid (-) van 2 pl dithiothreitol (DTT, 100 mM eindconcentratie). Incubeer het mengsel bij 95 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Bevestig de 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gel cassette aan de elektroforese cel en voeg loopbuffer. Laad het geconjugeerde eiwit monsters en de pre-lood gewicht marker moleculair. Voeren gelelektroforese 35 minuten bij 200 V. Opmerking: Bewaar de elektroforese cel in het donker tijdens de gehele periode van de foto-bleken van de fluorofoor te minimaliseren. </li><li> Na elektroforese overdragende gel een gel fluorescerende scanner en scannen op fluorescentie-emissie bij de geschikte golflengte. Voor Cy5.5, gebruik maken van de Cy5-modus in de scanner software. </li><li> Vlekken op de gel met een commerciële eiwit vlek. </li></ol>

<ol><li>Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).</li>
<li>Wu, X., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+at+the+interface+of+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis at the interface of chemistry and biology.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).</li>
<li>Liu, C. C., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+new+chemistries+to+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Adding new chemistries to the genetic code.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).</li>
<li>Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+the+keto+functional+groupto+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli.</a> proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).</li>
<li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+p-azido-L-phenylalanine+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli.</a> J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li>
<li>Deiters, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+incorporation+of+an+alkyne+into+proteins+in+Esshcerichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).</li>
<li>Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+copper-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded copper-free click chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).</li>
<li>Seitchik, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+tetrazine+amino+acid+directs+rapid+site-specific+in+vivo+bioorthogonal+ligation+with+transcyclooctenes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).</li>
<li>Lee, Y. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+acrylamide+fuctionality%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded acrylamide fuctionality.</a> ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).</li>
<li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+norbornene+directs+site-specific+cellular+protein+labelling+via+a+rapid+bioorthogonal+raction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction.</a> Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).</li>
<li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+encoding+of+bicyclononynes+and+trans-cyclooctenes+for+site-specific+protein+labeling+in+vitro+and+in+live+mammalian+cells+via+rapid+fluorogenic+Diels-Alder+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).</li>
<li>Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Cu-free+click+chemistry+with+readily+synthesized+biarylazacyclooctynones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).</li>
<li>Debets, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azadibenzocyclooctynes+for+fast+and+efficient+enzyme+PEGylation+via+copper-free+%283+%2B+2%29+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition.</a> Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).</li>
<li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mechanism+to+mouse%3A+a+tale+of+two+bioorthogonal+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions.</a> Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).</li>
<li>Debets, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugation+with+strained+alkenes+and+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Bioconjugation with strained alkenes and alkynes.</a> Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).</li>
<li>Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-promoted+alkyne%E2%88%92azide+cycloadditions+%28SPAAC%29+reveal+new+features+of+glycoconjugate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis.</a> ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).</li>
<li>Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+functionalization+using+catalyst-free+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).</li>
<li>Yao, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorophore+targeting+to+cellular+proteins+via+enzymemediated+azide+ligation+and+strain-promoted+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).</li>
<li>Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+bioorthogonal+functionalities+into+proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells.</a> Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).</li>
<li>Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residue+choice+defines+efficiency+and+influence+of+bioorthogonal+protein+modification+via+genetically+encoded+strain+promoted+Click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry.</a> Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).</li>
<li>Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-drug+conjugates%3A+an+emerging+concept+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).</li>
<li>Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+staudinger+modification+of+proteins+containing+p-Azidophenylalanine%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine.</a> ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).</li>
<li>Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+and+efficient+method+for+the+site-specific+dual-labeling+of+proteins+for+single+molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).</li>
<li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+strategies+for+single-molecule+protein+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Click strategies for single-molecule protein fluorescence.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).</li>
<li>Jang, S., Sachin, K., Lee, hJ., Kim, D. W., Lee, hS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+method+for+protein+conjugation+by+copper-free+click+reaction+and+its+application+to+antibody-free+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis.</a> Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).</li>
<li>Kazane, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+antibody+multimers+through+peptide+nucleic+acid+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).</li>
<li>Ko, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+site-specific+antibody+labeling+by+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Korean+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Cho, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+extracellular+region+of+HER2+alone+and+in+complex+with+the+Herceptin+Fab%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab.</a> Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+%3A+Diverse+chemical+function+from+a+few+good+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De genetische incorporatie van niet-natuurlijke aminozuren in eiwitten heeft verscheidene voordelen boven andere werkwijzen voor eiwitmodificatie. 1-3 Eén van de belangrijkste voordelen is de algemene toepasbaarheid op elke vorm van eiwit. In principe is er geen beperking in het selecteren van een doeleiwit en een doelwitplaats van het eiwit. Echter kan vervanging van een structureel of functioneel belangrijke residuen met een UAA leiden tot veranderen van de structuur en functie van het doeleiwit. Algemeen, ...

Aangezien de genetische incorporatie van p -methoxyphenylalanine in Escherichia coli werd gemeld, zijn meer dan 1 100 onnatuurlijke aminozuren (UAAs) met succes opgenomen in diverse eiwitten. 1-3 Onder deze UAAs, de aminozuren met bioorthogonal functionele groepen zijn uitgebreid bestudeerd en vormen het grootste deel. De bioorthogonal functionele groepen die in de UAAs omvatten keton, 4 azide, alkyn 5, 6 cyclooctyne, tetrazine 7, 8 α, β-onverzadigd amide, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 en bicyclo [6.1.0] -nonyne. 11 Hoewel elke functionele groep heeft zijn voor- en nadelen, hebben de azide aminozuren het meest intensief gebruikt voor het eiwit conjugatie. p -Azidophenylalanine (AF), een van de azido-aminozuren, gemakkelijk beschikbaar, en de opneming efficiency is uitstekend. Mutante eiwitten die dit aminozuur worden omgezet met alkynen door koper gekatalyseerde cycloadditie of cyclooctynes ​​door SPAAC. 12-20 Recent zijn biofarmaceutische het aantrekken van veel aandacht in de farmaceutische industrie. Het antilichaam-geneesmiddel conjugaat (ADC) is een klasse van therapeutische antilichamen die voordelig zijn vanwege hun vermogen voor gerichte therapie voor de behandeling van humane kankers en 21 andere ziekten. Meer dan 50 ADC&#39;s zijn momenteel in klinische studies, en het aantal neemt snel toe. Bij ontwikkeling van ADCs moeten vele factoren worden beschouwd om de efficiëntie te maximaliseren en de bijwerkingen te minimaliseren. Onder deze factoren een efficiënte en plaatsspecifieke conjugatie reactie op een covalente binding tussen een antilichaam en een geneesmiddel is kritiek. De gewenste efficiëntie en specificiteit van de conjugatiereactie kan worden bereikt door conjugatie met een bioorthogonal functionele groep pernatuurlijk aminozuur dat op specifieke wijze een antilichaam is opgenomen. 22-26 Hier melden wij een protocol bij plaatsspecifiek te nemen AF in een antilichaamfragment conjugaat en het mutante antilichaamfragment met een biochemische probe.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Plasmid Constructie</td></tr><tr><td>plasmid pBAD_HerFab_L177TAG</td><td></td><td></td><td>Optioneel bevat de amber stopcodon (TAG) op een gewenste positie. Ko, W. et al. Efficiënte en Site-specifieke Antilichaam Labeling door Strain-gepromoveerde Azide-Alkyne Cycloadditie. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)</td></tr><tr><td>plasmid pEvol-AFRS</td><td></td><td></td><td>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., en Schultz, P. G. Een verbeterd systeem voor onnatuurlijke aminozuur mutagenese in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)</td></tr><tr><td>DH10B</td><td>Invitrogen</td><td>C6400-03</td><td>Expressie Host</td></tr><tr><td>Plasmid Mini-prep kit</td><td>Nucleogen</td><td>5112</td><td>200/pack</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Intron biotechnology</td><td>32034</td><td>500&nbsp;g</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Alfa Aesar</td><td>L07482</td><td>1 g</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>500&nbsp;g</td></tr><tr><td colspan="4">2. Cultuur Preparatie</td></tr><tr><td colspan="4">2.1 Electroporatie</td></tr><tr><td>Micro pulser</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>Micro pulser cuvette</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2089</td><td>0.1&nbsp;cm elektrode gap, pkg. van 50</td></tr><tr><td>Ampicillin Sodium</td><td>Wako</td><td>018-10372</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Alfa Aesar</td><td>B20841</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Agar</td><td>SAMCHUN</td><td>214230</td><td>500 g</td></tr><tr><td>SOC medium</td><td>Sigma</td><td>S1797</td><td>100 mL</td></tr><tr><td colspan="4">3. Expressie en Zuivering van HerFab-L177AF</td></tr><tr><td colspan="4">3.1 Expressie van Herfab-L177AF</td></tr><tr><td>p-azido-L-phenylalanine (AF)</td><td>Bachem</td><td>F-3075.0001</td><td>1 g</td></tr><tr><td>L(+)-Arabinose, 99%</td><td>Acros</td><td>104981000</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid, 35~37%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0256</td><td>500 mL</td></tr><tr><td colspan="4">3.2 Cel Lysis</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1351</td><td>500 g</td></tr><tr><td>EDTA disodium salt dihydrate, 99.5%</td><td>SAMCHUN</td><td>E0064</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Siyaku</td><td>126-0671</td><td>1 g</td></tr><tr><td colspan="4">3.3 Ni-NTA Afiniteit Chromatografie</td></tr><tr><td>Ni-NTA resin</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Polypropylene column</td><td>QIAGEN</td><td>34924</td><td>50/pack, 1 mL capaciteit</td></tr><tr><td>Imidazole, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>I0578</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic, 98%</td><td>SAMCHUN</td><td>S0919</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sodium Chloride, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>S2907</td><td>1 kg</td></tr><tr><td colspan="4">4. Conjugatie van Gezuiverde HerFab-L177AF met Alkyn Probes Gebruikmakend van Strain-gepromoveerde Azide-alkyne Cycloadditie (SPAAC)</td></tr><tr><td>Cy5.5-ADIBO&nbsp;</td><td>FutureChem</td><td>FC-6119</td><td>1 mg</td></tr><tr><td colspan="4">5. Zuivering van Gelabelde HerFab</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters</td><td>MILLIPORE</td><td>UFC500396</td><td>96/pack, 500 &#956;L capaciteit</td></tr><tr><td colspan="4">6. SDS-PAGE Analyse van Gelabelde HerFab en Fluorescerende Gel Scanning</td></tr><tr><td>1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%</td><td>Sigma</td><td>10708984001</td><td>10 g</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x</td><td>Thermofisher</td><td>NP0007</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>MES running buffer</td><td>Thermofisher</td><td>NP0002</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels</td><td>Thermofisher</td><td>NO0321</td><td>12-well</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Typhoon 9210 variable mode imager</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

efficiënt en site-specifiek antilichaam labeling by-stam bevorderde azide-alkyn cycloadditiereacties

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

Er zijn veel chemische instrumenten waarover scheikundige probes introduceren in proteïnen om hun structuur en functie te bestuderen. Een bruikbare methode is eiwitconjugatie door genetisch inbrengen van een niet-natuurlijk aminozuur dat een functionele groep bioorthogonal. Dit rapport beschrijft een gedetailleerd protocol voor site-specific antilichaam vervoeging. Het protocol bevat experimentele details voor de genetische incorporatie van een azide-aminozuur, en de vervoeging reactie by-stam bevorderde azide-alkyn cycloadditie (SPAAC). Deze stam bevorderde reactie verloopt door eenvoudig mengen van de reagerende moleculen bij fysiologische pH en temperatuur, en geen extra reagentia zoals koper (I) ionen en koper-chelerende liganden vereisen. Daarom zou deze methode bruikbaar voor algemene eiwitconjugatie en ontwikkeling van antilichamen geneesmiddelconjugaten (ADCs) zijn.

<html> In deze studie werd een antilichaamfragment eigen specifiek een fluorofoor geconjugeerd door het opnemen van een azide-aminozuur in het fragment en het reageren van het mutante antilichaamfragment met een gespannen cyclooctyne (figuur 1). HerFab werd geselecteerd als het doel antilichaamfragment waarin AF werd opgenomen als een azide-aminozuur. Aan het residu in HerFab de vervanging AF kiezen, het röntgen kristalstructuur van HerFab geanalyseerd. 30 Bela...

Hier presenteren we een protocol om chemisch verkennende sondes op een specifieke plaats in een antilichaamfragment in te brengen door genetisch een azid-bevattend aminozuur in te bouwen en vervolgens het azid te koppelen aan een chemische sonde door spanningsgepromoveerde azid-alkyn cycloadditie (SPAAC).

Efficiënt en Site-specifiek antilichaam Labeling by-stam bevorderde azide-alkyn Cycloadditiereacties

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

Het algemene doel van deze procedure is om chemische sondes op locatie in een antilichaamfragment te introduceren door genetisch een azide-bevattend aminozuur in te bouwen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de chemische biologie te beantwoorden, zoals bij eiwitmodificatie, -engineering en -conjugatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat uw doelprobe of bouillon op locatie in eiwitten of antilichamen kan worden geïntroduceerd door eenvoudig te mengen.Na het construeren van de plasmiden, voegt u één microliter van elk toe aan 20 microliter van E.Coli-stam DH10-beta bij een concentratie van twee keer 10 tot de achtste cellen per microliter in een centrifugeerbuis van 1,5 milliliter. Gebruik een pipette om de oplossing voorzichtig te mengen. Plaats vervolgens 20 microliter van de gemengde oplossing in een schone cuvet.Stel de elektroporatiemachine in op 25 microfarad en 2,5 kilovolt. Plaats vervolgens de cuvet in de schuif van de schokkam. Duw de schuif in de kamer tot de cuvet stevig contact maakt met de elektroden van de kamer.Druk eenmaal op de pulsknop totdat de elektroporatiemachine piept. Voeg daarna snel één milliliter SOC-medium toe aan de cuvet. Breng vervolgens het mengsel over naar een reageerbuis.Incubeer met schudden bij 37 graden Celsius gedurende één uur. Nadat de incubatie voltooid is, verdeel de getransformeerde E.Coli-cellen op lysogeniebouillonagarplaten met geschikte antibiotica. Incubeer de platen gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius.Nadat de plaatincubatie voltooid is, inoculeert u een enkele getransformeerde kolonie in vijf milliliter LB-medium met antibiotica. Incubeer met schudden gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius. Breng vervolgens de primaire cultuur over in 200 milliliter LB-medium met 100 microgram per milliliter ampicilline en één millimolair AF.Incubeer met schudden bij 37 graden Celsius gedurende minimaal drie uur.Voeg twee milliliter van 1,6 molair arabinos toe wanneer de cultuur een optische dichtheid van 0,8 bereikt bij 550 nanometer. Incubeer vervolgens met schudden bij 30 graden Celsius gedurende 12 uur. Wanneer de incubatie voltooid is, oogst u de cellen door centrifugatie bij 11.000 keer g gedurende vijf minuten.Gooi het supernatant weg en bevriest de pellet bij min 20 graden Celsius. Wanneer u klaar bent om de cellen te lyseren, bouwt u de pellet opnieuw op in 20 milliliter paraplasmisch lysebuffer in een schone centrifugeerbuis. Incubeer het mengsel gedurende één uur bij 37 graden Celsius.Centrifugeer vervolgens het cellysaat gedurende 15 minuten bij 18.000 keer g bij vier graden Celsius. Breng de supernatant over naar een schone buis en gooi de pellet weg. Voeg vervolgens 400 microliter van een Ni-NTA-harssuspensie toe.Gebruik een rotator om de buis gedurende één uur bij vier graden Celsius voorzichtig te agiteren. Nadat het mengen voltooid is, giet u de suspensie in een polypropyleen kolom. Was de hars drie keer met vijf milliliter wasbuffer.Elueer het doelantilichaam met 300 microliter elutiebuffer. Bepaal vervolgens de concentratie van het mutante eiwit zoals beschreven in het tekstprotocol. Begin door 10 microliter van een 10 micromolair oplossing van HerFab-L177AF in fosfaatbuffer met 10 millimolair natriumfosfaat dibasisch en 100 millimolair natriumchloride toe te voegen aan een schone centrifugeerbuis.Voeg vervolgens 20 microliter van een 200 micromolair oplossing van Cy 5.5 azadibenzocyclooctyne in water toe. Bedek vervolgens het reactievat met aluminiumfolie. Laat de door kleurstof gepromoveerde cyclo-editiereactie zes uur bij 37 graden Celsius doorgaan.Zodra de reactie voltooid is, voegt u 30 microliter monster en 450 microliter fosfaatbuffer toe om Cy 5.5 kleurstof in een centrifugaalfiltercentrifugeerbuis af te wassen. Centrifugeer de centrifugeerbuis gedurende 15 minuten bij 14.000 keer g bij vier graden Celsius. Gooi het doorstroomafval weg en breng vervolgens het gezuiverde monster over naar een microcentrifugeerbuis van 1,5 milliliter.Bewaar het gezuiverde gelabelde HerFab bij vier graden Celsius, tenzij het klaar is voor analyse. Begin door 13 microliter van 7,8 micromolair gezuiverd HerFab toe te voegen aan een schone buis. Voeg vervolgens vijf microliter LDS-eiwitmonsterbuffer toe.Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij 95 graden Celsius. Na incubatie, bevestigt u de vier tot 12% Bis-Tris SDS-PAGE-gelcassette aan de elektroforesecel. Voeg draaibuffer toe.Laad vervolgens de geconjugeerde eiwitmonsters in de voorgekleurde moleculaire gewichtsmarker. Voer gelelektroforese gedurende 35 minuten bij 200 volt uit. Nadat de elektroforese voltooid is, brengt u de gel over naar een geldocumentatie- en analysesysteem.Scan voor Cy 5.5 en kleurt vervolgens de gel met een commerciële eiwitkleuring. In deze studie wordt het antilichaamfragment Her-Fab op locatie geconjugeerd met een Dit wordt bereikt door een azide-bevattend aminozuur in het fragment in te bouwen en vervolgens het mutante antilichaamfragment te laten reageren met een verspannen cyclooctyn. SDS-PAGE-analyse wordt uitgevoerd voor mutante eiwitten die zowel met als zonder het azide-bevattende aminozuur tot expressie worden gebracht.Zoals te zien is, werd het volledige antilichaamfragment alleen verkregen in aanwezigheid van het aminozuur. Het antilichaam dat het aminozuur bevat, wordt geëvalueerd op conjugatie via reactie met een Cy 5.5-gekoppelde azadibenzocyclooctyne-derivaat Cy 5.5 en geanalyseerd door SDS-PAGE. De fluorescentiebeelden tonen conjugatie van het mutante antilichaamfragment met Cy 5.5 terwijl geen conjugatie werd waargenomen in de controle.Zodra uw eiwit correct tot expressie is gebracht en gezuiverd met acetylfenylalanine, kan het eiwit efficiënt worden gelabeld met een sonde met de stam Omdat de labelreactie geen extra reagens vereist, kunt u de

efficient-site-specific-antibody-labeling-strain-promoted-azide

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Adenovirus deeltjes zijn ontworpen om zowel de onnatuurlijke aminozuur analoog azidohomoalanine of de azido suiker...

Chemoselectieve Wijziging van Viral oppervlakken via bioorthogonal Klik Chemie

We genetisch coderen natuurlijk aminozuur, p-azido-L-fenylalanine op verschillende gerichte posities in GPCRs en tonen de veelzijdigheid van de azidogroep in verschillende toepassingen. Deze omvatten een gerichte fotoverknoping technologie om resten in de ligand-bindingsplaats van een GPCR te identificeren, en de site-specifieke bioorthogonal modificatie van GPCR's met een peptide-epitoopmerker of fluorescente probe.

Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

DNA en eiwitten sequentie-specifiek gemerkt met affiniteit of fluorescente reporter groepen met DNA of eiwit methyltransferases en synthetische analogen cofactor. Afhankelijk van de cofactor specificiteit van de enzymen, aziridine of dubbel geactiveerde cofactor analogen worden gebruikt voor één of twee stappen labeling.

Sequentie-specifieke Labeling van nucleïnezuren en eiwitten met methyltransferases en Cofactor Analogues

Fotostabiele cyanine kleurstoffen worden aan oligonucleotiden gekoppeld om hybridisatie te controleren door energieoverdracht.

Synthese van golflengteverschuivende DNA hybridisatie sondes met behulp Fotostabiele Cyanine Dyes

We beschrijven hier een methode voor de identificatie van klein molecuul-bindende eiwitten met behulp van fotoaffiniteitslabeling. Het voordeel van deze techniek is dat binding en covalente labeling van de doeleiwitten plaatsvindt binnen de levende cellulaire omgeving, waardoor het risico van verstoring van de native eiwitstructuur en bindingscondities bij cellyse wordt geëlimineerd.

Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

Een gedetailleerde procedure voor de synthese van een 125 I-gemerkt azide en het radioactief merken van dibenzocyclooctyne (DBCO) -groep geconjugeerd, 13-nm-sized goud nanodeeltjes met behulp kopervrij click reactie wordt beschreven.

Een geoptimaliseerde protocol voor de efficiënte Radioactief merken van Gold Nanodeeltjes met behulp van een<sup&gt; 125</sup&gt;-Gemerkte azide prosthetische groep

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Integratie van een cyclopropeen derivaat van lysine in antilichamen kan de sitespecifieke, snelle en efficiënte koppeling van tetrazine-bevattende moleculen voor het genereren van geconjugeerde antilichaam-drug.

Genetische codering van een niet-canonieke aminozuur voor de generatie van antilichaam-Drug conjugaten door een snel Bioorthogonal reactie

In dit protocol beschrijven we de synthese van PODS, een phenyoxadiazolyl methyl-sulfon gebaseerde reagens voor de site-selectieve bevestiging van cargos aan de thiolen van biomoleculen, met name antilichamen. Daarnaast beschrijven we de synthese en de karakterisering van een Peul-bevattende bifunctionele complexvormer en zijn geconjugeerde aan een model antilichaam.

Synthese en Bioconjugation van Thiol-reactieve reagentia voor de oprichting van Site-selectief bewerkt Immunoconjugates

Fluorescerende gelabelde antibiotica zijn krachtige instrumenten die kunnen worden gebruikt om meerdere aspecten van antimicrobiële resistentie te bestuderen. Dit artikel beschrijft de voorbereiding van fluorescerende gelabelde antibiotica en hun toepassing op het bestuderen van antibioticaresistentie bij bacteriën. Sondes kunnen worden gebruikt om mechanismen van bacteriële resistentie (bijvoorbeeld efflux) te bestuderen door spectrofotometrie, stroomcytometrie en microscopie.

Visualisatie van bacteriële resistentie met behulp van fluorescerende antibiotica sondes

Leer site-specifieke antilichaamlabeling via SPAAC-reacties met azide-houdende aminozuren in E. coli. Deze efficiënte methode maakt eenvoudige eiwitmodificatie mogelijk voor chemische biologieonderzoek.

Efficiënt en Site-specifiek antilichaam Labeling by-stam bevorderde azide-alkyn Cycloadditiereacties

Meer video's verkennen