Name: Sub-nanometer Resolution Imaging met amplitude-modulatie Atomic Force Microscopy in Liquid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Leer sub-nanometer resolutiebeeldvorming met amplitude-modulatie AFM in vloeistof voor biologische en materiaalwetenschappelijke toepassingen. Deze methode optimaliseert beeldparameters voor commerciële microscopen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De financiering van de Engineering and Physical Sciences Research Council (subsidies 1.452.230 en EP / M023915 / 1), de biotechnologie en biologische Science Research Council (verlenen BB / M024830 / 1) en de Europese Raad (FP7 CIG 631.186) worden bedankt.

1. Reiniging gereedschap en andere oppervlakken OPMERKING: Wanneer het streven naar een hoge resolutie, kan elke vorm van besmetting nadelige gevolgen hebben. Het is daarom noodzakelijk om ervoor te zorgen alle instrumenten die worden gebruikt om te manipuleren van het monster, substraat of AFM tips worden grondig gereinigd. Het volgende geldt voor elk oppervlak of instrument (bijvoorbeeld pincetten) die in contact met het monster, cantilever AFM cel, inclusief de monstertafel zelf kan komen. <ol><li> Bad ultrasone trillingen instrumenten in ultrazuiver water (18,2 MQ, &lt;5 ppm organische), gevolgd door isopropanol (99,7% zuiverheid), gevolgd door opnieuw ultrazuiver water, elk gedurende 10 min. Gebruik indien mogelijk isopropanol onder een zuurkast om inademen van dampen te verminderen. </li><li> Droog onder een stikstofstroom. </li><li> Als volledige onderdompeling niet mogelijk is (bijvoorbeeld voor cantilever houder / elektronica), fysiek schoon het oppervlak schoon met enkellaags, pluisarme weefsels (lichte weefsels ruitenwissers) gedrenkt in ultrapuopnieuw water, isopropanol en ultrapuur water, sequentieel. Laat het oppervlak drogen in lucht (meestal binnen 15 tot 30 min). </li></ol> 2. Voorbereiding van de ondergrond Opmerking: Het substraat duidt het vaste oppervlak direct ondersteunen van de monsters, typisch in contact komen met zowel de AFM scanner en het monster. AFMs meeste hebben een magnetische stand en stalen schijven kunnen worden gebruikt, maar hetzelfde protocol is ook geschikt voor substraten zoals glasplaatjes. Hier gaan we uit een stalen schijf waarop een mica schijf is aangebracht. Het doel van deze procedure is om zoveel mogelijk externe contaminatie die de beeldvorming kan beïnvloeden beperken. Handschoenen moeten worden gedragen ten alle tijden. <ol><li> Bad ultrasone trillingen de stalen monsterdisk in ultrazuiver water (18,2 MQ), gevolgd door isopropanol en tenslotte door ultrazuiver water weer, elk voor 10 min. </li><li> Droog de schijven onder een stikstofstroom. </li><li> Bereid een kleine hoeveelheid epoxylijm met reagentia grondig gemengd en plaats ~ 1081, l op de stalen schijf. </li><li> Bevestig het substraat (muscoviet mica, SiO 2 kristal, glas, enz.) Aan de stalen schijf door druk op het substraat. Laat de epoxy uitharden gedurende verscheidene uren bij een verhoogde temperatuur (zie specificaties van de fabrikant). </li><li> Voorkomen dat epoxy direct wordt blootgesteld aan de lucht, de randen van het substraat. Dit zal gebeuren als overmatige hoeveelheid epoxy wordt gebruikt en kunnen een bron van besmetting geworden. <ol><li> Een mica substraat krachtig op ~ 2,5 cm breed plakband op het substraat, zodat het hele gezicht bedekt, en soepel afschilferen. Met mild plakband en schil de mica door evenwijdig aan het oppervlak te trekken. Het verwijderde materiaal zichtbaar op de band. Herhaal dit proces 2-3 keer, totdat de mica spiegelgladde voor het oog. </li><li> Voor glas / SiO 2, indien verdere chemische modificatie van het oppervlak nodig is, herhaal dan de bad-sonicatie routine stappen 2,1-2,2. U kunt ook gebruik maken van Ublootstelling V-eenheid (18 W UV-C kiemdodende lampen) gedurende 30-60 min, afhankelijk van het vermogen) op alle organische stoffen die kunnen worden overgelaten aan de oppervlakte pyrolyseren. Deze procedure maakt ook het oppervlak meer hydrofiel zonder aanzienlijke verhoging van ruwheid. </li></ol></li></ol> 3. Voorbereiding van Cantilever en Tip <ol><li> Dompel de cantilever chip in een bad van isopropanol, gevolgd door ultrazuiver water, elk gedurende 60 min. </li><li> Wanneer de cantilever / tip vereist intensieve reiniging (bijvoorbeeld na langdurige opslag in geldoos), voeg een 30 min onderdompelen in aceton (&gt; 99,5% zuiverheid) vóór stap 1 (zie ook afdeling aan verontreiniging). De opslag tips gel in dozen is, in onze ervaring, een van de primaire bron van besmetting die zeer snel kan 59 plaatsvinden. </li><li> Maak de tip licht kort (&lt;5 min) UV teneinde de vorming van stabiele hydratatie plaatsen 60 bevorderen. Vermijd langere overbelichting keer als het de tip of inc kunnen beschadigenrease de kromtestraal. </li><li> Plaats de cantilever in de AFM cantilever houder en pipetteer ~ 50 pi imaging-oplossing (de aard van de oplossing hangt af van het monster dat wordt onderzocht, maar gebruikt in dit geval een 10 mM oplossing van rubidium chloride in ultrazuiver water) op de cantilever en kantel het om natte pre; Dit zal het verschijnen van luchtbellen te beperken bij het naderen van het monster. </li></ol> 4. Set-up van de AFM Cell <ol><li> Monteer het monster schijf en substraat op de monstertafel en voeg een druppel imaging vloeistof (vloeibare kenmerkend 2-3 mm dik op het hoogste punt). </li><li> Sluit de cantilever houder aan de AFM. </li><li> Breng de cantilever en sample in dichte nabijheid teneinde een capillaire brug tussen de vloeistoffen op cantilever / tip en het monster vormen. </li></ol> 5. initialiseren Meting en kalibratie van de cantilever <ol><li> Lijn het meten laser (meestal rood) in de buurt van de top-end van de cantilever. Afhankelijk van het AFM-model, dat doen hetzij via software-instellingen of door handmatige instelling van de laser positie. Verwerven thermische spectrum van de cantilever in vloeistof (zie figuur 1A). De werkwijze neemt de thermische fluctuaties van de cantilever met de laser, om de frequentie van resonantie van de belangrijkste cantilever&#39;s (fundamentele eigenmode) vinden. In de meeste moderne AFM gebeurt dit door geautomatiseerde procedures in de software-instellingen, maar gegevens kunnen per AFM AFM. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig1.jpg" /> Figuur 1: Tuning en het kalibreren van de cantilever. A: thermische ruis spectrum van verticale doorbuiging van de cantilever&#39;s (zwart) met een eenvoudige harmonische oscillator (SHO) fit van de fundamentele eigenmode (rood). Hier is de resonantie is 18,7 kHz in water. De eerste drie resonantiefrequenties die overeenkomen met de eerste drie buigzame eigenmodi zijn highligewoge n met blauwe pijlen. B: De kalibratie van de cantilever de Inverse Optical Lever Gevoeligheid. De lineaire doorbuiging van de cantilever gedrukt tegen een stijf (niet-vervormbaar) oppervlak wordt gebruikt om de conversiefactor (InvOLS) tussen de afwijking gemeten in volt en de bijbehorende waarde in nanometer meten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="2"><li> Neem een vervorming versus curve afstanden de cantilever op een stijf substraat (bv, mica of glas) en kalibreer de afbuiging door het opleggen dat de helling van de curve in de lineaire afbuiggebied (zoals in figuur 1B) is eenheid 61-63. OPMERKING: Dit proces vindt de omrekeningsfactor tussen de gemeten afbuiging van de fotodetector (in volt) en de reële doorbuiging van de cantilever (in nanometers) - known als het omgekeerde Optical Lever Sensitivity (InvOLS). De kalibratie kan de tip beschadigen, dus het is beter om het uit te voeren nadat alle metingen zijn voltooid. Gebruik de InvOLS afgeleide waarde voor een cantilever van dezelfde soort in een voorgaand experiment een schatting (gewoonlijk&gt; 90% nauwkeurig) van de werkelijke amplitude voordat kalibratie. </li><li> Monteer de resonantie piek in de thermische spectrum met een eenvoudige harmonische oscillator model 64-66 aan de veerconstante van de cantilever opleveren. Deze procedure is geautomatiseerd meeste AFM software en meestal niet vereist specialistische kennis van dat model. </li><li> Tunen van de cantilever. Vind de amplitude respons van de cantilever bij uitwendig aangedreven (bijvoorbeeld akoestisch of fotothermische excitatie) over een bereik van frequenties dicht bij de nominale resonantiefrequentie. Stel de aandrijffrequentie de bij de maximale in dit spectrum, iets naar links. Als de cantilever is Acoustically gedreven, vele valse maxima kan verschijnen bij het stemmen. <ol><li> Selecteer een resonantiepiek zo dicht mogelijk (binnen de omhulling van) de resonantie die in de thermische spectrum met de besturingssoftware van de AFM maar details kan afhangen van het type software versie die de AFM controleert. </li></ol></li></ol> 6. Aanpak en eerste controle van Monster <ol><li> Stel de aandrijvende amplitude zodat het vrije trillingsamplitude ongeveer 5 nm. Dit komt in principe overeen 0,2-0,8 V op de meeste AFMs (indien de InvOLS niet gekalibreerd). Stel de amplitude setpoint ~ 80% van de vrije amplitude. </li><li> Stel de feedback krijgt relatief hoog (de absolute waarde is afhankelijk van de AFM), maar voorkomen dat instabiliteit of beltoon optreedt. </li><li> Stel de eerste scan snelheid en grootte van de scan om kleine waarden (bijvoorbeeld om ~ 1 Hz en 10 nm respectievelijk). Dit helpt bij het behoud van de tip in het geval een aantal feedback parameters slecht zijn afgestelddoor het vermijden scanning over grote afstanden. De scan grootte kan vervolgens worden verhoogd tot een hogere waarde (bijvoorbeeld 100 nm) indien de scanvoorwaarden verschijnen geschikt. </li><li> Bepaal de geschatte lengte van het oppervlak (in sommige gevallen optisch moet gebeuren) vóór aanpak. </li><li> Initiëren aanpak van de punt aan het oppervlak met behulp van de AFM besturingssoftware. De fijne details van dit proces is afhankelijk van het model van AFM en software. <ol><li> Als er problemen zijn met de aanpak zijn bij het gebruik van een zachte cantilever, het gedrag van de aanpak in contact mode. In dit geval is ervoor te zorgen dat de winsten zijn lager dan in de AM-modus, en stel het setpoint op een relatief lage waarde (0,1-0,2 V na het centreren van de laser op de fotodetector) tot aan de punt te behouden. </li><li> Beoordelen of de tip het oppervlak heeft bereikt zonder opnieuw te beginnen om het met iets veranderen van de gewenste waarde (verhoging in contact modus of afname van de AM-modus). Of het dopje aan de oppervlakte, het effect op te verlenging van de Z-piëzo moet verwaarlozen. De live bewegingen van de Z-piëzo gewoonlijk grafisch weergegeven in de besturingssoftware van de meeste AFM. Als de gewenste verandering veroorzaakt een zichtbare beweging van de piëzo, is er een verkeerde grijpen. In het laatste geval herstart de benadering van de actuele positie uiteinde, met een iets hoger (contact) of lager (AM) setpoint. </li></ol></li><li> Zodra de punt van de grond heeft bereikt, trek de Z-piëzo (meestal door gewoon op &#39;stop&#39;) en opnieuw af te stemmen de cantilever (herhaal stap 5.4.); de resonantiefrequentie zal waarschijnlijk zijn verschoven naar een lagere waarde als gevolg van tip-sample interacties. </li><li> Verander het setpoint tot ~ 80% van de nieuw afgestemde gratis amplitude (in deze tip-sample afstand). </li><li> Schakel de cantilever en voeren een 10 × 10 nm 2-scan van het oppervlak in de AM-modus om te controleren of de imaging parameters zijn geschikt. <ol><li> Controleer of de trace (scannen van links naar rechts) en terugvinden (scannen van rechts naar links)profielen over elkaar. Indien niet verder te verminderen het setpoint en probeer het verhogen van de winst. </li><li> Verlaag de winst als het beeld wordt luidruchtig. </li></ol></li><li> Herhaal deze stappen een grote - 1 x 1 micrometer 2 tot 5 x 5 micrometer 2 - toont het monster mits beschikbaar. Op zachte of biologische monsters, kan dit een verontreiniging van de tip tot gevolg. </li></ol> 7. High-resolution Imaging <ol><li> Verminder de grootte van de scan op een waarde die geschikt zijn voor het visualiseren van de functies (bijvoorbeeld 100 x 100 nm 2 voor eiwitkristallen of 20 × 20 nm 2 voor mica of calciet). </li><li> Verminder de aansturingsamplitude van de cantilever genoeg voor de terugkoppellus zich automatisch intrekt de Z-piëzo en daardoor de tip van het oppervlak. Terwijl de cantilever van het oppervlak, stel de aansturingsamplitude zodat de cantilever amplitude ~ 1-2 nm (piek-piek). </li><li> Met behulp van de AFM besturingssoftware, Progrestend verminderen setpoint enkele tientallen mV in tot de Z-piëzo opnieuw uitstrekt naar het oppervlak en het oorspronkelijke beeld wordt teruggewonnen. Houd de gewenste amplitude tussen 75% en 95% van de nieuwe vrije amplitude. </li><li> Stel de winst met behulp van de AFM besturingssoftware; hogere winsten kunnen worden gebruikt bij lagere amplitudes zonder dat er veel lawaai. <ol><li> Herhaal de stappen 7,2-7,4 teneinde de beste combinatie van vrije amplitude setpoint bepalen en krijgen voor hoge resolutie. De optimale omstandigheden afhangen van het monster (solvatatie landschap en bevochtigingseigenschappen van de vloeistof), maar ook de cantilever (veerconstante, stijfheid). </li><li> Bekijk verschillende combinaties van amplituden aan beeldvorming te optimaliseren. Het kan nodig zijn opnieuw te verhogen de vrije amplitude 42 zijn. In dat geval moet u eerst het instelpunt op een hogere waarde en vervolgens krachtiger aandrijving (dwz omgekeerde volgorde dan gebruikt om de amplitude te verlagen). </li><li> Houd de setpoint amplitude in het gebied van 0,5 nm - 1,5 nm (piek tot piek) regelwaarde verhoudingen bleef boven 0,7 (kenmerkend 0,75-0,95). Voor solvophilic interfaces, gebruiken uitkragingen met een veerconstante van 0,5-2 N / m. Dit is voldoende voor de tip de meeste grensvlak vloeistof te verwijderen zonder het raken van het oppervlak. Een vuistregel is voorgesteld in eq. 4 van referentie 29. </li></ol></li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Aangenomen dat de beeldvormende vloeistof en de cantilever stijfheid passende wijze zijn geselecteerd, de meest kritische stappen voor bereiken van succesvolle hoge resolutie is de aanpassing van de amplitude beeldvorming, en de algehele zuiverheid van het systeem onderzocht. Amplitudes vergelijkbaar met de dikte van het grensvlak vloeistofgebiedje (typisch minder dan 2 nm) sondes hoofdzakelijk variatie in de eigenschappen van het grensvlak 42 oplosmiddel. Als de oscillatie amplitude te groot is, zal de trillende tip dwars lange afstand, niet-lineaire krachtvelden 52 dat de stabiliteit van cantilever beweging voorkomen, en onvermijdelijk sloeg het monster, ongeacht de beeldvormingsomstandigheden 29, wat resulteert in verslechtering van de resolutie. Naast het verlies in resolutie, hogere harmonischen beginnen te verschijnen in de top beweging en het systeem ingewikkelder model 55. Een defect imaging amplitude te klenly de interface wordt geprobed (gewoonlijk specifieke lagen van het grensvlak vloeistof) en stabiele beeldvorming kan alleen worden bereikt met stijve cantilevers (&gt; 10 N / m in water 53) voor een goede signaal-ruisverhouding, met het risico schadelijke zachte samples over grote hoogteverschillen. De behoefte aan stijve uitkragingen is om de thermische ruis die belangrijker dat het signaal gemeten Bij het werken met kleine amplitudes, de lange afstand interacties tussen de tip en het monster zijn nog steeds aanwezig, maar zijn grotendeels constant en hebben geen invloed op kan worden overwonnen hoge-resolutie contrast in de beelden verkregen. Netheid van de imaging-omgeving is van het grootste belang als het gaat om hoge-resolutie AFM. Ongewenste stoffen in het systeem interfereren met zowel de beeldvorming en de kracht spectroscopie. Er zijn twee hoofdcategorieën van verontreinigingen die de neiging hebben de experimenten beïnvloeden: (i) verontreinigingen direct zichtbaar bij beeldvorming ( <strong&gt; Figuur 4B, 4C) en (ii) algemene onverklaarbare ontbreken van een hoge resolutie. Geval (i) neigt slechts in sterk geïdealiseerde systemen zoals de water-mica interface waar geadsorbeerde moleculaire aggregaten die interfereren met de tip-sample interacties duidelijk afsteken tegen atomair vlakke mica oppervlak (Figuur 4A) optreedt. Voordat u de tip en het monster, is het de moeite waard het verwerven van spectroscopische bochten met een grote uitslag, effectief herhaaldelijk op harde de tip tegen het monster. Dit zou normaal gesproken beschadigen van een nieuwe tip, maar kan af en toe een vuile tip schoon te maken of induceren stabiel hydratatie geschikte plaatsen voor de beeldvorming. Dit punt zal echter onvermijdelijk stomp en derhalve alleen geschikt voor vlakke monster zelfs als de beeldvorming ten goede komt. In geval van een vermoeden van besmetting dan stijf monsters, kan het proberen waard om de afbeelding met de tweede eigenmode van de cantilever voordat de ietwat destructieve procedure zoals hierboven beschreven zijn. Dit vereist gewoon swjeuk de drijvende frequentie naar de tweede eigenmode en bijstelling van de amplitude / setpoint (zie de discussie over het oplossen van problemen hieronder). De effectieve stijfheid van de cantilever aanzienlijk toeneemt bij gebruik bij de tweede eigenmode en eventuele zwak geadsorbeerd verontreiniging kan rijden met de punt, terwijl beeldvorming worden geduwd. Deze strategie is geen vervanging voor de behoefte aan een schone monster en tip, maar biedt wat meer mogelijkheden om goede foto&#39;s te verwerven wanneer een tip / monster is duidelijk niet ideaal. <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig4.jpg" /> Figuur 4: Voorbeelden van verontreiniging waargenomen wanneer beeldvorming micamica die hoge-resolutie beeldvorming te remmen. A: Mica afgebeeld in 5 mM RbCl - geen verontreinigende deeltjes zichtbaar zijn. B: Verontreiniging in de vorm van aggregaten van de orde van tientallen nm over, terwijl de beeldvorming in nominaal ultrapuur water. C: Zelf geassembleerde structuren gevormd door contaminant deeltjes vermoedelijk amfifiele in de natuur. Imaging werd opnieuw uitgevoerd in nominaal ultrapuur water. D: Verticaal offset secties die overeenkomen met de stippellijnen in A, B en C illustreren de afwijking van atomair vlakke ondergrond mica&#39;s. Schaalbalken in A, B en C komen overeen met 300 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Geval (ii) komt vaker en vooral gekenmerkt door de frustrerende feit dat sub-nanometer functies kunnen simpelweg niet worden opgelost, ongeacht de beeldvormingsomstandigheden. De ondertekening van dit soort situaties is meestal zichtbaar kracht spectroscopie meting die de neiging hebben om een ​​aantal tegenstrijdigheden te laten zien. Deze kunnen onder meer slecht reproduceerbaar bochten en amplitude vs afstand bochten die significant afwijken van een typische sigmoïdale vorm 42. Als verontreinigingen, ionische of anderszins, zijn dispersed homogeen door de vloeistof, kunnen ze niet worden weergegeven in topografische beeldvorming, maar kon de hydratatie structuur van het monster 69, wat cruciaal is voor het handhaven van een regelmatige tip-sample interactie 29 en het verkrijgen van hoge resolutie 70 verstoren. Er kunnen ook directe effecten van de verontreinigingen op het monster, met name in zachte biologische experimenten. Zo is het bekend dat de aanwezigheid van alcoholen (van de reinigingsprocedure) gel-fase lipide bilagen kan fluidify 71-73, waardoor subnanometerniveau resolutie mogelijk. Indien hoge resolutie niet mogelijk is, moet erop worden eerst in het reinigingsproces, met name gericht op alle apparatuur die in contact met de beeldvormende oplossing komt. Zelfs ogenschijnlijk stabiele verbindingen zoals epoxyhars solvaat in het fluïdum enigszins of zelfs volledig uitgehard. Hoge-resolutie beeldvorming met AM-AFM is veeleisend, vereist geduld envaak meerdere processen voor het bereiken van de best mogelijke beeldvormende omstandigheden. Kleine experimentele problemen kunnen gemakkelijk belangrijker geworden genoeg om te voorkomen dat een hoge resolutie en het oplossen van problemen vaardigheden zijn essentieel. Hierna geven we een aantal van de meest voorkomende problemen die we met onze voorgestelde oplossing tegengekomen. cantilever tuning De meeste commerciële AFMs gebruiken akoestische excitatie om de cantilever drijven. In dat geval afstemmen van de cantilever, zoals beschreven in stap 5.4, nabij zijn resonantiefrequentie bepaalt vaak voldoende prestaties voor gebruik in lucht. In vloeibare milieus, de vloeistof de neiging om enkele koppeling tussen verschillende mechanische onderdelen van de AFM zoals cantilever chip en de houder veroorzaken. Dit kan invloed hebben op de schijnbare resonantie van de cantilever, vaak geïllustreerd door een cantilever frequentiespectrum dat veel scherpe pieken en dalen gewoonlijk omschreven als &quot;bos pieken&quot; vertoont. Daardoor is het vaak moeilijk de corre vindenct rijden frequentie. Deze pieken bestaan ook in gasomgevingen, maar vanwege de hoge waarde van de kwaliteitsfactor van cantilever, de amplitude van resonanties aanzienlijk groter 74,75. In vloeibare selecteren van de juiste piek tot de cantilever rijden kan niet gemakkelijk zijn en kan trial and error nodig. In de praktijk frequentiepiek met steilste variatie in amplitude in de &quot;bos pieken&quot; rond de resonantiefrequentie is meestal de beste gok ondanks dat niet noodzakelijkerwijs precies op resonantie en geeft vaak een aandrijffrequentie voldoende hoge resolutie beeldvorming te verkrijgen. beeldvervorming Imaging drift is vaak een probleem bij het zoeken naar een hoge resolutie en maakt de afbeeldingen er vervormd (meestal uitgerekt). Zijn oorsprong is over het algemeen thermisch, hetzij omdat de scanner / AFM niet het evenwicht bedrijfstemperatuur heeft bereikt of omdat een deel van de monstervloeistof snel verdampende (bijvoorbeeld, weergave in alcoholen<html> ). In alle gevallen is de afwijking verwaarloosbaar bij thermisch evenwicht. Het is daarom nuttig om de temperatuur van het monster indien mogelijk lossen. Anders is het de moeite waard het verlaten van de AFM om een ​​blanco monster (groot formaat scan bij lage scansnelheid) gedurende enkele uren scannen voordat het uitvoeren van het experiment. Als verdamping is geen probleem, wordt deze procedure best gedaan na stap 6 van de procedure, zorg ervoor dat eerst de tip te trekken op korte afstand (bijvoorbeeld 20 pm) van het oppervlak. Af en toe zal de drift zelfs na uitgebreide thermalisatie blijven. Dit geeft meestal dat de cantilever of de chip gedeeltelijk het monster te slepen terwijl imaging, iets dat kan gebeuren op zachte samenhangende monsters, zoals dunne films of als de tip / cantilever / chip is niet geschikt geplaatst. Op chips die host meer dan één cantilever / tip, is het vaak nuttig om de cantilever die niet in gebruik zijn, in plaats van hen te laten slepen over het oppervlak te breken. ionsterkte ntent &quot;&gt; Aangezien de beeldvorming wordt gedomineerd door het grensvlak vloeistof, is het soms nuttig om zout voor hoge resolutie afbeelding van het geladen oppervlak in water toegevoegd. De rol van het zout is tweeledig. Ten eerste wijzigt de hydratatie landschap van de oppervlakte afgebeeld op adsorptie, die vaak het contrast verbetert. Ten tweede helpt het scherm sterke elektrostatische interacties tussen de tip en monster (bijvoorbeeld op mica). over het algemeen grotere ionen zoals kalium, rubidium en cesium mogelijk betere beelden door hun specifieke hydratatie eigenschappen 76, en het feit dat ze vaak adsorberen hoofdzakelijk in een unieke hydratatietoestand 77. Bad cantilever / tip Als het vermoeden bestaat dat de cantilever is een bron van besmetting (zie de symptomen hierboven beschreven), moet het eerst worden geïnspecteerd onder een optische microscoop. Indien opgeslagen in een gel doos, kan de cantilever pick-up sporen van gel polymeren of siliconenolie 59 die kunnen voorkomenIn extreme gevallen, zoals donkere vlekken, op de rug van de cantilever (zoals in figuur 5A). Fotothermische oscillatie van de cantilever kan dit vlekken veroorzaken, maar ze zijn vanwege afbraak / oververhitting van de cantilever bekleding van het groot laser. Verontreiniging neigt verschijnt op willekeurige cantilever. Een langere (12 hr) reiniging met isopropanol en vervolgens met ultrazuiver water kan ongewenste deeltjes uit de cantilever te verwijderen. <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig5.jpg" /> Figuur 5: Vergelijking tussen een nieuwe cantilever en een van dezelfde soort die uitgebreid is gebruikt voor harde oppervlakken en achtergelaten in een geldoos gedurende langere tijd. A: Top; optisch beeld van gloednieuwe cantilever dat is schoongemaakt (zie procedure). Bodem; optisch beeld aantonen van de verschijning van zichtbare verontreiniging (blauwe pijl) van de gel doos. B: Vergelijking van de respectieve thermische spectra uitkragingen &#39;.Verbreding van de oude cantilever eerste resonantie piek is duidelijk (groene pijl) en een aantal hogere orde modi worden versterkt (blauwe pijl). Spectra werden verticaal afwijkend en gepresenteerd op een log-log schaal voor de duidelijkheid. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Als de gewenste sub-nanometer resolutie niet is bereikt, ondanks aanvaardbare beelden met lage resolutie, is het mogelijk dat de AFM tip is geworden chemisch gewijzigd tijdens de opslagomgeving. Dit kan worden behandeld door blootstelling van de cantilever chip een ultraviolet oxidator voor 120 seconden, waarbij het creëren van hydrofiele oppervlaktegroepen helpt op het uiteinde 60. Zorg dient echter te worden genomen, zoals de exacte tijd die nodig is kan variëren afhankelijk van de tip geometrie en UV macht, en overmatige blootstelling kan leiden tot afstomping van de tip en de lagere resolutie. Thermische ruis &lt;/ P&gt; Hoge-resolutie beeldvorming vereist een grote gevoeligheid voor variaties in de kracht en de afstanden (meestal sub-pN krachten en sub-Ångström afstanden 78). Voor zachtere cantilevers, kunnen de thermo-mechanische beweging van de cantilever vanwege zijn intrinsieke Brownse beweging (thermische trillingen) een probleem. In eerste benadering, met een cantilever stijfheid k, is het onmogelijk te bepalen kenmerkt kleiner dan <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/54924/54924equation1.jpg" /> De amplitude van de thermische ruis, waarbij k B Boltzmann constante en T de temperatuur. Praktisch gebruik cantilever met hogere resonantiefrequenties verspreidt het geluid over een groter frequentiegebied, en vermindert de algemene geluidsniveau in de meetbandbreedte 79. Hogere eigenmode imaging Soms kan het nuttig zijn om de cantilever draait met het tweede eigenmodusdoor de toename effectieve stijfheid (zie bespreking contaminatie). Praktisch, dit is gewoon gedaan door het besturen van de cantilever in tweede eigenmodus (de tweede resonantie piek bij een hogere frequentie, zie figuur 1A). Bij het afstemmen van de cantilever, selecteert u de tweede eigenmode in plaats van de belangrijkste resonantie en ga verder met stap 5.4. Merk op dat de InvOLS afwijkt als de cantilever op de tweede eigenmode wordt aangedreven; typisch ~ 1/3 van de InvOLS gemeten in stap 5.2 een rechthoekige cantilever. De belangrijkste beperking van deze techniek is dat het een stabiel solvatatie landschap aan het oppervlak van het monster. Het monster moet robuust genoeg om te verstoren het grensvlak vloeistof zonder het induceren van significante vervorming van het monster zelf. Dit kan een uitdaging op zeer zacht en onstabiele monsters zulke grote biomoleculen zijn. Bovendien, kleine amplitude AFM zoals hier beschreven kan mechanische informatie over de p niet te verkrijgenigenschappen van een monster, zoals de cantilever tip besteedt het grootste deel van zijn tijd in het grensvlak vloeistof. Hierbij kan het gunstig zijn om andere benaderingen quantitative Nanomechanical Mapping 80 gebruik of het gebruik van hogere harmonischen vrijdragende beweging. Hogere harmonica&#39;s zijn over het algemeen versterkt wanneer beeldvorming in vloeistof (met een lage kwaliteit-factoren) 29,81 - 83 en kan tegelijkertijd zorgen voor topografie en stijfheid van de monsters 25,81 - 84, maar ze zijn over het algemeen nadelig voor hoge resolutie. Andere beperkingen inherent zijn aan alle scanning probe microscopie technieken nog steeds gelden hier met name het feit dat de resultaten onvermijdelijk informaties van het meetpunt bevatten. Het gebruik van kleine amplitudes is niet ideaal voor monsters met grote hoogteverschillen; de terugkoppellus onvermijdelijk reageren trager bij hoogteverschillen groter dan de beeldvormende amplitude, dus riskeren monster en tip schade. Het gebruik of zachtere cantilever verhelpt dit probleem tot op zekere hoogte. Het belangrijkste voordeel van de hier gepresenteerde methode is het feit dat zij de hoogst mogelijke beeldresolutie AFM in vloeistof, maar kan worden uitgevoerd op commerciële AFM, mits het geluidsniveau van de machine laag genoeg. De vergelijkbare resolutie over commerciële instrumenten wordt meestal bereikt in contact modus, of zo nu en dan in FM-AFM met stijve uitkragingen. Werken in AM-modus en met relatief zachte cantilevers maakt een ruimere keuze van de monsters en is eenvoudiger te implementeren dan FM-AFM meeste systemen. De aanpak is gebaseerd op het benutten van de solvatatie krachten op het raakvlak tussen een vaste en vloeibare bestaande om de resolutie te verbeteren en krijgen lokale chemische informatie. Deze kan in principe worden gebruikt omgevingsomstandigheden, enkel op basis van de waterlagen (typisch enkele nanometers dik) opbouw op de meeste oppervlakken vanwege vochtigheid van de lucht. De beginselen die ten grondslag liggen aan dehoge-resolutie strategie ongewijzigd maar de meeste van de tip in de lucht, met slechts een capillair brug tussen de punt apex en het monster 85. High-resolution is aangetoond op stijf monsters in deze voorwaarden 86,87. De beeldvormende omstandigheden echter anders dan die ondergedompeld vloeistof door een hogere Q-factor oscillatie de cantilever is. Praktisch, vonden we het moeilijk bereiken stabiele werking via zacht of onregelmatige monsters, vermoedelijk als gevolg van tijdelijke veranderingen in de capillaire brug en verhoogde Q-factoren voor een bepaalde cantilever stijfheid. De hierin beschreven protocol biedt een methode voor het bereiken van moleculair niveau resolutie beelden van de monsters in de vloeistof met de meeste moderne commerciële AM-AFMs. Wij zorgen voor de wetenschappelijke rationale achter onze keuze voor imaging parameters en benadrukken de rol van solvatatie krachten. We bespreken ook gemeenschappelijke problemen en in het bijzonder besmetting. De specifieke tip-sample interacties can variëren sterk afhankelijk van de inhoud van de imaging-oplossing, de cantilever geometrie en materialen, en het monster chemie. Een praktische kennis van de aard van de dominante krachten tijdens het scannen aanwezig is daarom essentieel om dit protocol aan te passen aan nieuwe en betrouwbare resultaten. Wanneer geoptimaliseerd, de experimentele benadering is krachtig te winnen in-situ lokale moleculair niveau inzicht van de monsters in oplossing.

Sinds de uitvinding, dertig jaar geleden, atomic force microscopy (AFM) 1 heeft zich gevestigd als een techniek van de keuze voor het onderzoeken van monsters op nanoschaal, met name wanneer gemiddeld meer dan macroscopische oppervlakken is niet mogelijk en lokale informatie nodig is. In een typische AFM meting wordt de doorbuiging van een flexibele cantilever de interacties kracht kwantificeren tussen een klein aantal moleculen en een UltraSharp tip aan het uiteinde van de cantilever. Afhankelijk van het type interacties en de tijdschaal beschouwd, kan een grote hoeveelheid informatie worden verkregen, zoals de visco-elastische eigenschappen van zachte biologische membranen 2,3, de sterkte van een enkelvoudige chemische binding of moleculaire 4,5, de atomaire details van een oppervlakte 6-8, de magnetische 9, capacitieve 10, 11 geleidend, 12,13 thermische en chemische 14 eigenschappen van de monsters <sup&gt; 15. Een deel van het succes van AFM is de mogelijkheid om aan een breed scala van materialen 16 en in meerdere omgevingen zoals vacuüm 17, 11,18 gas of vloeistof 19,20, omdat het niet afhankelijk van een bepaalde kracht tussen probe en monster . In de praktijk, echter, werken de AFM in andere dan omgevingsomstandigheden kan een uitdaging en vele gepubliceerde resultaten nog steeds in lucht verkregen. Een bijkomend probleem is het feit dat het meestal noodzakelijk de AFM dynamische modus (trillende tip) om zowel tip en sample veilig te stellen door grote wrijvingskrachten werken. Hoewel meer uitdagende, dynamische werking kan in principe zorgen voor meer informatie over de geanalyseerde monster, en zonder verlies van de ruimtelijke resolutie. In de afgelopen tien jaar is het gebied van dynamische AFM in vloeibare belangrijke ontwikkelingen gezien, van de opkomst van video-rate AFM 21-23, om meerdere frequenties metingen <sup&gt; 24,25 en sub-nanometer beeldvorming van hydratatie structuren op interfaces 26-31. AFM operatie terwijl ondergedompeld in vloeistof wordt nu routinematig gebruikt in de biologie en biofysica 32-36, polymeer onderzoek 37, elektrochemie 38-40 en solid-vloeistof grensvlakken karakterisering 41-44. De aanwezigheid van vloeistof rond de trillende cantilever verandert aanzienlijk de dynamiek 45 en de interactie tussen de tip en het sample 29,42. Bij goed gebruik, kan de vloeistof worden benut beeldresolutie 26,29 verbeteren, met een typische verbetering van bijna een orde van grootte in vergelijking met de beste resolutie bereikt omgevingsomstandigheden 46. In AFM, de hoogst haalbare ruimtelijke resolutie voor een bepaalde meting hangt af van zowel de kwaliteit van de AFM zelf en de aard van de tHij interactie gesondeerd 20,47,48. Op dit moment zijn de meeste high-end, in de handel verkrijgbaar AFMs huidige geluidsniveaus die dicht bij die van thermische limiet 12 zijn zo bepalend voor de resolutie is meestal de tip-sample interactie. Het is in feite de ruimtelijke gradiënt van deze interactie dat de resolutie bepaalt: metingen gebaseerd op de korte afstand, snel rottend interactie produceren hogere resolutie resultaten dan wanneer langere afstand interacties in het spel. In vloeistof kan solvatatie krachten beeldresolutie verbeteren, omdat ze de neiging te verdwijnen over slechts enkele moleculaire diameters van de vloeistof (meestal &lt;1 nm) bij het verplaatsen van het oppervlak van het monster 49. Deze komen voort uit de interactie tussen de vloeibare moleculen en het oppervlak van het monster. Een vloeistof met een sterke affiniteit voor het oppervlak de neiging om meer geordende en minder mobiel dan bulkvloeistof aan het grensvlak met het monster 29,42,50. Als gevolg,het zal meer energie te nemen voor een trillende AFM tip om grensvlak vloeistof moleculen verdringen dan vloeibare bulk 42, waardoor de meting zeer gevoelig voor lokale variaties in het grensvlak vloeistof eigenschappen op nanoschaal -de solvatatie landschap. Om solvatatie krachten te benutten, moeten verscheidene praktische aspecten in overweging te nemen. Ten eerste, de trillingsamplitude van de punt moet vergelijkbaar met het bereik van de solvatatie krachten zijn, typisch &lt;1 nm. Ten tweede, de vloeistof die moet welomschreven solvatatie landschap aan het oppervlak van het monster te vormen. Macroscopisch is dit gelijk aan die een &quot;bevochtiging&quot; vloeistof voor het proefmonster. Bijvoorbeeld, in het water is het makkelijker om resolutie over hydrofiele mica dan op hydrofobe grafiet 42,51 moleculair niveau te bereiken. Ten slotte moet de veerconstante van de cantilever ondersteunen het uiteinde geschikte 52,53 geselecteerd. Bij het werken in deze convoorwaarden, de AFM niet alleen moleculair niveau afbeeldingen van de interface, maar het vloeit ook informatie over de plaatselijke sample-vloeistofaffiniteit die kan worden gebruikt om chemische informatie over het oppervlak van het monster 54 te verkrijgen. De meest voorkomende dynamische modi voor AFM in vloeistof amplitude-modulatie (AM, ook &#39;tapping mode&#39;), AFM en de frequentie-modulatie (FM) AFM. In het eerste geval 55, de tip-raster scant het monster terwijl de trillingsamplitude door een terugkoppellus die continu opnieuw past de tip-sample afstand constant wordt gehouden. Een topografisch beeld van het monster wordt verkregen door de terugkoppellus toegepaste correctie. FM-AFM 28,41,56, is de oscillatiefrequentie van de cantilever / tip die constant wordt gehouden terwijl de tip scant het monster. Beide technieken bieden vergelijkbare topografische resolutie in vloeibare 36,57. Kwantificering van de tip-sample interactie heeft de neiging om meer te zijn Straightforward en nauwkeurig in FM-AFM, maar AM-AFM is eenvoudiger te implementeren, meer robuuste, en maakt het werken met zachtere uitkragingen, iets nuttigs voor het bestuderen van gemakkelijk vervormbare of delicate samples. Significant, AM-AFM is wijdverspreid onder AFM gebruikers, deels om historische redenen, maar ook vanwege het feit dat het technisch gemakkelijker te geleiden. Hoewel de amplitude constant door de terugkoppeling tijdens de AM-AFM beeldvorming wordt gehouden, wordt de fase-lag tussen de tip oscillatie en de drijvende oscillatie toegestaan ​​om vrij te veranderen. De fase-vertraging kan nuttige informatie verschaffen over de tip-sample interacties, is gerelateerd aan de energie afgevoerd tijdens oscillatie van de tip op het grensvlak met het monster 58. Vandaar fase-beeldvorming kan gelijktijdig worden verworven topografische beeldvorming en vaak complementair aandacht voor de heterogeniteit van een monsteroppervlak. Fase beeldvorming is gebruikt voor diverse mapping interacties, waaronder direct in kaart brengen van de hechting energie 42, visco-elastische eigenschappen 58 en de hydratatie landschap van een interface 44. Praktisch, verkrijgen van hoge resolutie beelden in vloeistof blijft niet-triviale vanwege het grote aantal parameters te controleren, en het ontbreken van een eenvoudige, systematische protocol dat werkt in elke situatie. Beeldkwaliteit is meestal afhankelijk van de cantilever geometrie en elasticiteit, de punt chemie, de oscillatieamplitude, en het monster stijfheid oa 55. AFM metingen ook per definitie perturbatieve het systeem. Hierdoor veranderen imaging variabelen en omgevingsomstandigheden zonder overdenking kan leiden tot moeilijkheden bij reproduceerbaarheid en / of misrepresentative observaties en valse resultaten. Hier presenteren we ons protocol voor het bereiken van een hoge resolutie beelden van harde en zachte samples in oplossing, met behulp van commerciële instrumenten gebruikt in amplitude-modulatie. Ons doel is om een ​​praktische procedure bieden voor het optimaliseren van de belangrijkste parameters kans om de resolutie te beïnvloeden over verschillende monsters, uit te leggen in elk geval de redenen voor onze keuzes van de fysische principes die ten grondslag liggen aan de beeldvorming proces. We detail een stap-voor-stap benadering van het substraat reiniging en voorbereiding van de keuze van cantilever, aanpassing van de beeldvormingsparameters en de meest voorkomende problemen oplossen. Uitleg over de wetenschappelijke gedachte achter onze keuzes en procedures voor hoge-resolutie zou moeten helpen het maken van rationele keuzes bij de aanpassing van de methodologie, en dienen als uitgangspunt voor de beeldvorming nieuwe systemen. In deze tekst gebruiken we AM te verwijzen naar de amplitudemodulatie werkingsmodus van een AFM. We verwijzen naar de parameter feedback constant gehouden tijdens ofwel de cantilever doorbuiging (contact modus) of oscillatie amplitude (AM-modus) als de gewenste waarde. In de AM-modus, wordt de cantilever extern gedrevenhetzij door een akoestische trilling of door een gepulste laser gericht aan de basis van de cantilever. De aansturingsamplitude is de intensiteit van de externe oscillerende signaal. De absolute waarde van de amplitude schijf om een ​​bepaald trillingsamplitude van de cantilever te bereiken hangt af van vele parameters, zoals de wijze van besturen (akoestisch, fotothermische of magnetisch), cantilever fixatie en parameters (stijfheid, geometrie) en laseruitlijning. De exacte waarde van de aandrijving amplitude derhalve niet relevant maar wordt aangepast elk experiment teneinde een geschikte (en kwantificeerbare) trillingsamplitude van de cantilever verschaffen. Wanneer de aangedreven cantilever ver van het monster en geen demping van de trillingen vindt plaats via tip-sample interacties, wordt de trillingsamplitude zogenaamde vrije oscillatieamplitude. Aangezien de trillende tip nadert het oppervlak van het monster, de amplitude begint te dalen. Als de feedback is ingeschakeld, zal de z-piëzo constantly opnieuw aan te passen de uitbreiding ervan, zodat de geselecteerde setpoint amplitude kiel, constant. De gewenste waarde is normaal gesproken altijd kleiner dan de vrije amplitude. Het is gebruikelijk om naar de gewenste waarde, de verhouding van de gewenste amplitude (imaging amplitude) via vrije amplitude. Hoe kleiner de gewenste verhouding, hoe harder de beeldvormende voorwaarden.

<table><tbody><tr><td>Multimode IIIA AFM</td><td>Brucker</td><td>NA</td><td>Een van de gebruikte machines</td></tr><tr><td>Cypher ES AFM</td><td>Asylum Resarch</td><td>NA</td><td>Een van de gebruikte machines</td></tr><tr><td>AFM cantilever/tip</td><td>Nanoworld</td><td>Arrow UHF-AUD</td><td>best voor hoge frequentie</td></tr><tr><td>AFM cantilever/tip</td><td>Olympus</td><td>RC800-PSA</td><td>veelzijdig en goedkoop</td></tr><tr><td>ultrapuur water</td><td>Milipore</td><td>NA</td><td>Lab filtering systemen kunnen besmetting veroorzaken</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aaldrich</td><td>200-664-3&nbsp;</td><td>standaard chemie, geen verdere zuivering</td></tr><tr><td>Monovalente zouten</td><td>Sigma-Aaldrich</td><td></td><td>standaard chemie, geen verdere zuivering</td></tr><tr><td>Lipiden</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td>lipide dubbellagen gevormd met behulp van standaard protocollen</td></tr><tr><td>Kristallen</td><td>MTI</td><td></td><td>geslepen kristallen</td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td>3M</td><td>Scotch Magic Tape</td><td>Doorschijnende tape werkt het beste. Transparant plakt te sterk</td></tr></tbody></table>

sub-nanometer resolution imaging met amplitude-modulatie atomic force microscopy in liquid

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomaire krachtmicroscopie (AFM) is uitgegroeid tot een gevestigde techniek voor nanoschaalbeelden van monsters in lucht en in vloeistof. Recente studies hebben aangetoond dat wanneer gewerkt wordt in amplitudemodulatie (tapping) modus, beelden met atomaire of moleculaire resolutie kunnen worden bereikt over een breed scala van zachte en harde monsters in vloeistof. In deze situaties verbeteren kleine oscillatieamplitudes (SAM-AFM) de resolutie door gebruik te maken van de gesolvateerde vloeistof aan het oppervlak van het monster. Hoewel de techniek met succes is toegepast in verschillende vakgebieden zoals materiaalwetenschap, biologie en biofysica en oppervlaktechemie, kan het verkrijgen van hoge resolutiebeelden in vloeistof nog steeds een uitdaging zijn voor beginnende gebruikers. Dit komt deels door het grote aantal variabelen dat moet worden gecontroleerd en geoptimaliseerd, zoals de keuze van de cantilever, de monstervoorbereiding en de juiste manipulatie van de beeldparameters. Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van hoge resolutiebeelden van harde en zachte monsters in vloeistof met behulp van SAM-AFM op een commercieel instrument. Ons doel is om een stap-voor-stap praktische gids te bieden voor het verkrijgen van hoge resolutiebeelden, inclusief de reiniging en voorbereiding van de apparatuur en het monster, de keuze van de cantilever en optimalisatie van de beeldparameters. Voor elke stap leggen we de wetenschappelijke grondgedachte achter onze keuzes uit om de aanpassing van de methodologie aan elk specifiek systeem van de gebruiker te vergemakkelijken.

De in de vorige paragraaf beschreven protocol is met succes toegepast op verschillende commerciële AFMs moleculair of atomair niveau beelden te verkrijgen. Alle beelden werden verkregen met het werken amplitudes tussen 0,5 nm en 1,5 nm aangepast individueel na de procedure stappen 7,1-7,4. Resultaten kunnen worden verkregen over een breed gebied van zachte (figuur 2) en stijf (figuur 3) monsters. In elk geval worden de belangrijke kenmerken gemarkeerd. Een van de grote voordelen van de techniek is dat kleine oscillatie amplitudes en hoge set-punten minimaliseren van de kracht die wordt uitgeoefend door de tip over het monster, waardoor kwetsbare zelf-assemblage van lipiden (figuur 2A), eiwitten (Figuur 2B en D), en amfifiele moleculen (figuur 2C) te beelden zonder schade in oplossing. Hardere kristallijne materialen zoals mineralen (Figuren 3A, B, D) enenkelvoudige metaalionen geadsorbeerd op een oppervlak (figuur 3C) worden afgebeeld volgens de methode, omdat in elk geval is het grensvlak vloeistof die effectief is afgebeeld de beschreven protocol. De solvatatie krachten vergelijkbaar op de getoonde figuren 2 en 3 monsters: alle monsters zijn hydrofiel (meer algemeen, &quot;solvophilic&quot; voor van de figuren 2C, 3B, 3D) ten opzichte van de imaging-oplossing. Consequent, cantilevers vergelijkbare stijfheid (0,2-0,8 N / m) werden in alle gevallen. Zowel het monster en de punt moet solvophilic ervoor te zorgen dat vloeistof moleculen vormen een goed gedefinieerde solvatatie structuur die kan worden afgebeeld. Dit is niet altijd voldoende, maar in de meeste gevallen en voor relatief kleine moleculen vloeistof, de vloeistof opnieuw structuren zich op een manier die het monster symmetrie nabootst. De belangrijkste oorzaak van de hoge-resolutie is de lokale variatie in de affiniteit van de geadsorbeerde oplosmiddel moleculende oppervlakken (Ångström schaal, in het geval van de figuren 2A, 3A, 3C). De techniek is zo uitstekend geschikt voor stof, waarvan de structuur varieert oplosmiddel grotendeels over het oppervlak. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig2.jpg" /> Figuur 2: Zachte interfaces afgebeeld door AM-AFM in waterige oplossingen. A: dipalmitoylfosfatidylcholine (DPPC) lipide dubbellaag in gelfase afgebeeld in in 150 mM KCl. De-hexagonaal verpakt lipide kopgroepen zijn te onderscheiden in zowel de topografie en fase, samen met de lokale contrast met vermelding van plaats-specifieke variaties in de hydratatie. B: Purple membranen van Halobacterium salinarum afgebeeld in 150 mM KCl, 10 mM Tris, pH 7,4. Verschillende bacteriorhodopsine eiwit trimeren worden gemarkeerd. De fase vertoont een contrast anders topografie vanwege lokale hydratatie plaatsen op het eiwit. Individuele eiwit trimeren<html> kan worden gemaakt (stippellijnen). C: Amfifiele kleurstof (Z907) geadsorbeerd aan het oppervlak van een TiO 2 nanodeeltjes in een kleurstof-gesensibiliseerde zonnecel. Het beeld werd in ethyl-isopropyl sulfon verworven. Het sponsachtig uiterlijk wordt gecreëerd door de geadsorbeerde kleurstof moleculen. D: Aquaporin kristal in natief runder lens membranen afgebeeld in dezelfde buffer B. Een aquaporine tetrameer is gemarkeerd. Sub-structuur die overeenkomt met inter-spiraalvormige loops zijn zichtbaar in de topografie, terwijl fase een opvallend verschillend contrast toont als gevolg van de ongewone gedrag water in de buurt van het eiwit. De beelden zijn afgeleid refs 36 (B), ref 38 (C) en referentie 67 (D). De schaalbalk is 5 nm (A), 10 nm (B), 3 nm in (C) en 15 nm (D) de kleurschaal geeft respectievelijk hoogte en fasevariatie van 200 pm en 15 ° (A), 600 uur en 4 ° (B), 2,5 nm en 2,5 ° (C) en 1,6 nm en 9,5 ° (D).load / 54924 / 54924fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig3.jpg" /> Figuur 3: Representatieve AM-AFM afbeeldingen harde monsters in vloeibare oplossingen. A: calcietkristal [ <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/54924/54924equation2.jpg" /> ] Surface afgebeeld in een evenwicht gebracht ultrapuur water oplossing. B: Strontiumtitanaat afgebeeld verkregen in dimethylsulfoxide (DMSO). Hoge resolutie is niet mogelijk in het water. C: Moskoviet mica afgebeeld in 3 mM RbCl - één geadsorbeerd Rb + -ionen zijn zichtbaar op rooster plaatsen van de mica&#39;s in zowel de fase en hoogte scans. D: silicium carbide in beeld gebracht in DMSO. De verwachte kristallografische bepalingen zijn weergegeven in afbeeldingen B en D. De beelden zijn afgeleid ref 68 (A), ref 42 (B en D),en ref 44 (C). De schaalbalk is 3 nm (A, B, D) en 5 nm (C). De kleurenschaal geeft respectievelijk hoogte en fasevariatie van 250 pm en 14 ° (A), 600 pm en 5,5 ° (B), 800 pm en 15 ° (C) en 500 pm en 3,5 ° (D). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

We presenteren een methode voor het bereiken van sub-nanometer resolutie beelden met amplitude-modulatie (tapping mode) atomic force microscopy in vloeistof. De methode wordt gedemonstreerd op de commerciële atomic force microscopen. We leggen de grondgedachte achter onze keuzes van de parameters en suggereren strategieën voor het oplossen van optimalisatie.

Sub-nanometer Resolution Imaging met amplitude-modulatie Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Het algemene doel van deze procedure is om beeldvorming met de hoogst mogelijke resolutie in vloeistof te bereiken met een commerciële AFM die wordt bediend via amplitudmodulatie, ook wel bekend als tapping-modus. Deze methode helpt de grenzen van standaard AFM-operatie in vloeistof te verleggen door gebruik te maken van de beste combinatie van parameters voor een hoge resolutie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze met de meeste commerciële AFM's kan worden gebruikt en dat er daarom geen gespecialiseerde apparatuur vereist is.De hier gepresenteerde methode is gericht op wetenschappers en technici die al over enige basiskennis van AFM beschikken, maar meer uit de techniek willen halen. Deze methode is niet gericht op een specifiek type monster en kan breed worden toegepast op monsters uit de fysica, biologie, chemie, materiaalkunde en toegepaste wetenschappen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek moeite hebben, omdat het enige geduld vereist om de beste parameters voor een bepaald monster te vinden.Soneer de instrumenten en de schijf die het substraat ondersteunt in een bad met ultrapuur water. Volg dit met isopropanol en opnieuw ultrapuur water, telkens gedurende 10 minuten. Bij het streven naar een hoge resolutie kan elke contaminatie nadelige gevolgen hebben.Draag te allen tijde handschoenen en zorg ervoor dat alle oppervlakken of instrumenten die in contact komen met het monster, de cantilever of de AFM-cel grondig zijn gereinigd. Droog na sonicatie elk van de instrumenten en de monsterschijf onder een stroom stikstof. Gebruik een stalen schijf als drager voor mica om individuele geabsorbeerde metaalionen af te beelden.Reinig fysiek de oppervlakken die niet via sonificatie kunnen worden gereinigd door ze opeenvolgend af te nemen met éénlaags pluisvrije tissues gedrenkt in ultrapuur water, isopropanol en ultrapuur water. Laat het oppervlak tot 30 minuten aan de lucht drogen. Bereid vervolgens een kleine hoeveelheid epoxylijm door de reagentia grondig te mengen en breng ongeveer 10 µL van de epoxy aan op de schone stalen monsterdisk.Plaats het mica-substraat op de epoxy en bevestig het aan de stalen schijf door druk uit te oefenen op het substraat. Laat de epoxy enkele uren uitharden bij een verhoogde temperatuur volgens de specificaties van de fabrikant. Druk vervolgens een 2,5 centimeter breed stuk plakband stevig op het substraat, zodat het gehele oppervlak bedekt is, en trek de bovenste laag er voorzichtig af.Herhaal dit proces twee tot drie keer totdat het mica visueel spiegelglad is. Dompel de cantileverchip eerst 60 minuten in een bad van isopropanol, gevolgd door 60 minuten in ultrapuur water. Stel de tip vervolgens maximaal vijf minuten bloot aan UV-licht om de vorming van stabiele hydratatieplaatsen te bevorderen.Langere overbelichtingstijden kunnen de tip beschadigen of de krommingsstraal ervan vergroten. Plaats de cantilever in de cantileverhouder van de AFM en pipetteer 25 µL van de beeldvormingsvloeistof op de cantilever en de tip om het oppervlak voorbevochtigen. Dit zal het ontstaan van luchtbellen verminderen bij het naderen van het monster.Smelt de monsterdisk en het substraat op de monsterhouder en voeg een druppel van de beeldvormingsvloeistof toe aan het monster. Sluit vervolgens de cantileverhouder aan op de AFM. Breng de cantilever en het monster dicht bij elkaar zodat er een capillairbrug ontstaat tussen de vloeistoffen op de tip van de cantilever en die op het monster.Gebruik de AFM-software om de meetlaser dicht bij het uiteinde van de tip van de cantilever uit te lijnen. Bepaal vervolgens de resonantiefrequentie van de cantilever aan de hand van de hoofdpiek in het thermische spectrum. Indien de uitbuiging van de cantilever is gekalibreerd, levert het fitten van de resonantiepiek met een model van een eenvoudige harmonische oscillator de veerconstante van de cantilever op.Stel vervolgens de cantilever af door de amplituderespons te bepalen wanneer deze extern wordt aangestuurd over een bereik van frequenties nabij de resonantiefrequentie die in het thermische spectrum is geïdentificeerd. Pas de aandrijfamplitude aan zodat de amplitude van de vrije oscillatie ongeveer vijf nanometer bedraagt. Dit komt bij de meeste AFM's doorgaans overeen met 0,2-0,8 volt.Stel vervolgens het amplitude-setpoint in op ongeveer 80% van de vrije amplitude. Stel daarna de feedback-gains relatief hoog in. Nadat is vastgesteld dat er geen instabiliteit of ringing optreedt, wordt de initiële scansnelheid ingesteld op ongeveer één hertz en de scanmaat op 10 nanometers.Start de benadering van de tip naar het oppervlak met behulp van de AFM-besturingssoftware. Beoordeel of de tip het oppervlak heeft bereikt zonder met het beelden te beginnen door de setpoint-waarde licht te wijzigen. Als de tip zich op het oppervlak bevindt, moet het effect op de uitrekking van de ZPA-zone verwaarloosbaar zijn.Zodra de tip het oppervlak heeft bereikt, wordt de ZPA-zone teruggetrokken en de cantilever opnieuw afgestemd. De resonantiefrequentie is waarschijnlijk verschoven naar een lagere waarde als gevolg van interacties tussen de tip en het monster. Wijzig nu het instelpunt naar ongeveer 80% van de nieuw afgestelde vrije amplitude en activeer de cantilever om een scan van 10 bij 10 nanometer vierkant van het oppervlak uit te voeren in amplitudemodulatiemodus om te verifiëren of de beeldparameters geschikt zijn.Controleer of de trace- en retrace-profielen samenvallen. Zo niet, verlaag dan het instelpunt verder en probeer de gains te verhogen. Als het beeld ruis vertoont, verlaag dan de gains.Herhaal de bewerking over een groot gebied van vijf bij vijf micrometer kwadraat van het monster, indien dit mogelijk is. Bij zachte of biologische monsters kan dit leiden tot contaminatie van de tip. Verklein de scantoevoer naar een waarde die geschikt is voor het visualiseren van de relevante kenmerken.Dit kan zo klein zijn als 20 bij 20 nanometer. Verlaag vervolgens de aandrijfamplitude van de cantilever voldoende zodat de feedbackloop de ZPA-zone automatisch intrekt en de tip van het oppervlak tilt. Terwijl de cantilever van het oppervlak is verwijderd, wordt de aandrijfamplitude zo ingesteld dat de amplitude van de cantilever één tot twee nanometer piek-tot-piek bedraagt.Verlaag het instelpunt geleidelijk in kleine stappen, totdat de ZPA-zone zich opnieuw naar het oppervlak uitstrekt en het oorspronkelijke beeld is hersteld. Houd de amplitude van het instelpunt tussen 75% en 95% van de nieuwe vrije amplitude. Stel daarna de versterkingen opnieuw in, aangezien er bij lagere amplitudes hogere versterkingen kunnen worden gebruikt zonder dat dit significante ruis introduceert.Optimaliseer het systeem om de beste combinatie van vrije amplitude, instelpunt en versterking voor een hoge resolutie te vinden. De optimale systeemcondities zijn afhankelijk van het monster, de bevochtigingseigenschappen van de vloeistof en de gebruikte cantilever. Gebruik voor solvofiele interfaces cantilevers met een veerconstante van 0,5 tot twee newton per meter.Met deze techniek werden beelden met sub-nanometerresolutie verkregen van een breed scala aan monsters. De zachte monsters die hier worden getoond, omvatten een lipide dubbellaag, paarse membranen van halobacterium salinarum, een zelfgeassembleerde monolaag van amfofiele dimoleculen en aquaporine-kristallen uit een runderlensmembraan. In elk geval zijn de relevante kenmerken gemarkeerd.De kleine oscillatieamplitudes en hoge instelpunten minimaliseren de kracht die door de tip op het monster wordt uitgeoefend, waardoor fragiele zelfassemblages van lipiden in de dubbellaag, eiwitten in native biomembranen en amfifiele moleculen in oplossing kunnen worden afgebeeld zonder beschadiging. Hardere kristallijne materialen, zoals calciet, strontiumtitaniet, siliciumcarbide en enkelvoudige metaalionen geabsorbeerd op een mica-oppervlak, kunnen met deze aanpak worden afgebeeld, omdat in elk geval de interstitiële vloeistof effectief wordt afgebeeld en niet het kristal zelf. Eenmaal beheerst, biedt deze techniek vrijwel elke keer dat deze correct wordt uitgevoerd resolutie op moleculair of atomair niveau in vloeistof.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om er rekening mee te houden dat de interstitiële vloeistof wordt afgebeeld. Dit betekent dat er zachte beeldvormingscondities moeten worden gebruikt. Contaminatie van de tip, het monster of de vloeistof is gewoonlijk de belangrijkste oorzaak voor het niet behalen van een hoge resolutie.Bij twijfel is het vaak een goed idee om alle oppervlakken die in contact komen met de vloeistof te reinigen en imaging-oplossingen opnieuw te gebruiken. Externe ruis is eveneens nadelig voor een hoge resolutie. Een vloer met weinig trillingen, uitgeschakeld van een ventilatiekanaal, is beter.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u uw beeldvormingsparameters kunt optimaliseren om AFM met een hoge resolutie te bereiken. Natuurlijk kan het, zoals bij elke geavanceerde techniek, meerdere pogingen kosten om uit te zoeken hoe een monster het beste in beeld kan worden gebracht, dus geduld is essentieel.

sub-nanometer-resolution-imaging-with-amplitude-modulation-atomic

Research

JoVE Journal

Engineering

Techniek

Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Atomic Force Microscopy to Visualize Phage–Antigen Interactions

Colloïdale sondev-nanoscopie kan binnen verschillende velden worden gebruikt om inzicht te krijgen in de fysische stabiliteit en coagulatiesnelheid van colloïdale systemen en om medicijnontdekking en formuleringswetenschappen te ondersteunen met behulp van biologische systemen. De beschreven methode biedt een kwantitatief en kwalitatief middel om dergelijke systemen te bestuderen.

Kwantitatieve en kwalitatieve onderzoek van Particle-deeltje Interacties gebruik Colloïdaal Probe Nanoscopy

Een methode voor het onderzoeken van de structuur van een eiwitfotoreceptor met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM) wordt beschreven in dit artikel. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) onthult intacte eiwitdimeren op een mica-oppervlak.

Atomic Force Microscopy van Red-Light Fotoreceptoren behulp PeakForce Kwantitatieve Nanomechanical Property Mapping

We beschrijven een protocol voor de bereiding van ondersteunde lipide-dubbellagen en de karakterisering ervan met behulp van atoomkrachtmicroscopie en krachtspectroscopie.

Atomic Force Microscopy Imaging en Force Spectroscopie van Ondersteunde lipidendubbellagen

Dit protocol beschrijft de werking van een vloeistofstroom monsterhouder voor het scannen van transmissie elektronenmicroscopie van AuNPs in water, zoals gebruikt voor de observatie van nanoschaal dynamische processen.

Het bestuderen van dynamische processen van Nano-sized Objecten in Vloeistof met behulp van Scanning Transmission Electron Microscopy

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) biedt een krachtig platform voor bacteriële studies, waardoor resolutie op nanoschaal kan worden bereikt. Zowel het in kaart brengen van subcellulaire veranderingen (bijvoorbeeld bij celdeling) als vergelijkende studies van de chemische samenstelling (bijvoorbeeld als gevolg van medicijnresistentie) kunnen worden uitgevoerd op een enkel celniveau in bacteriën.

Atomic Force Microscopie gecombineerd met infraroodspectroscopie als hulpmiddel om single bacterium chemistry te onderzoeken

Magnetische krachtmicroscopie (MFM) maakt gebruik van een verticaal gemagnetiseerde atomaire krachtmicroscopiesonde om monstertopografie en lokale magnetische veldsterkte met nanoschaalresolutie te meten. Het optimaliseren van de ruimtelijke resolutie en gevoeligheid van MFM vereist het balanceren van de afnemende hefhoogte tegen toenemende amplitude van de aandrijving (oscillatie) en profiteert van het werken in een dashboardkastje met inerte atmosfeer.

Magnetische krachtmicroscopieresolutie en -gevoeligheid optimaliseren om magnetische domeinen op nanoschaal te visualiseren

Grootschalige steekproefinspectie met nanoschaalresolutie heeft een breed scala aan toepassingen, met name voor nanogefabriceerde halfgeleiderwafers. Atoomkrachtmicroscopen kunnen hiervoor een geweldig hulpmiddel zijn, maar worden beperkt door hun beeldvormingssnelheid. Dit werk maakt gebruik van parallelle actieve cantilever-arrays in AFM's om inspecties met een hoge doorvoer en op grote schaal mogelijk te maken.

Actieve sonde-atoomkrachtmicroscopie met quattro-parallelle vrijdragende arrays voor grootschalige monsterinspectie met hoge doorvoer

Hier tonen we het beeldvormingsprotocol voor het observeren van biomoleculaire interacties met fotothermisch off-resonantie tappen (PORT), waar we beeldvormingsparameters hebben geoptimaliseerd, systeemlimieten hebben geïdentificeerd en mogelijke verbeteringen hebben onderzocht in de beeldvorming van driepunts-ster DNA-motiefassemblage.

High-speed atomaire krachtmicroscopie beeldvorming van DNA driepunts-stermotief zelfassemblage met behulp van fotothermisch off-resonantie tappen

We hebben een self-contained vloeibare cel die imaging doorlaat vloeistoffen met een transmissie-elektronenmicroscoop. Dynamische processen van nanodeeltjes in vloeistoffen kan worden onthuld in real-time met sub-nanometer resolutie.

Onthulling dynamische processen van de grondstoffen in vloeistoffen met behulp van vloeibare Cell Transmissie Elektronen Microscopie

Leer sub-nanometer resolutiebeeldvorming met amplitude-modulatie AFM in vloeistof voor biologische en materiaalwetenschappelijke toepassingen. Deze methode optimaliseert beeldparameters voor commerciële microscopen.

Sub-nanometer Resolution Imaging met amplitude-modulatie Atomic Force Microscopy in Liquid

Meer video's verkennen