Sub-nanometer Resolution Imaging met amplitude-modulatie Atomic Force Microscopy in Liquid

Het algemene doel van deze procedure is om beeldvorming met de hoogst mogelijke resolutie in vloeistof te bereiken met een commerciële AFM die wordt bediend via amplitudmodulatie, ook wel bekend als tapping-modus. Deze methode helpt de grenzen van standaard AFM-operatie in vloeistof te verleggen door gebruik te maken van de beste combinatie van parameters voor een hoge resolutie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze met de meeste commerciële AFM's kan worden gebruikt en dat er daarom geen gespecialiseerde apparatuur vereist is.

De hier gepresenteerde methode is gericht op wetenschappers en technici die al over enige basiskennis van AFM beschikken, maar meer uit de techniek willen halen. Deze methode is niet gericht op een specifiek type monster en kan breed worden toegepast op monsters uit de fysica, biologie, chemie, materiaalkunde en toegepaste wetenschappen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek moeite hebben, omdat het enige geduld vereist om de beste parameters voor een bepaald monster te vinden.

Soneer de instrumenten en de schijf die het substraat ondersteunt in een bad met ultrapuur water. Volg dit met isopropanol en opnieuw ultrapuur water, telkens gedurende 10 minuten. Bij het streven naar een hoge resolutie kan elke contaminatie nadelige gevolgen hebben.

Draag te allen tijde handschoenen en zorg ervoor dat alle oppervlakken of instrumenten die in contact komen met het monster, de cantilever of de AFM-cel grondig zijn gereinigd. Droog na sonicatie elk van de instrumenten en de monsterschijf onder een stroom stikstof. Gebruik een stalen schijf als drager voor mica om individuele geabsorbeerde metaalionen af te beelden.

Reinig fysiek de oppervlakken die niet via sonificatie kunnen worden gereinigd door ze opeenvolgend af te nemen met éénlaags pluisvrije tissues gedrenkt in ultrapuur water, isopropanol en ultrapuur water. Laat het oppervlak tot 30 minuten aan de lucht drogen. Bereid vervolgens een kleine hoeveelheid epoxylijm door de reagentia grondig te mengen en breng ongeveer 10 µL van de epoxy aan op de schone stalen monsterdisk.

Plaats het mica-substraat op de epoxy en bevestig het aan de stalen schijf door druk uit te oefenen op het substraat. Laat de epoxy enkele uren uitharden bij een verhoogde temperatuur volgens de specificaties van de fabrikant. Druk vervolgens een 2,5 centimeter breed stuk plakband stevig op het substraat, zodat het gehele oppervlak bedekt is, en trek de bovenste laag er voorzichtig af.

Herhaal dit proces twee tot drie keer totdat het mica visueel spiegelglad is. Dompel de cantileverchip eerst 60 minuten in een bad van isopropanol, gevolgd door 60 minuten in ultrapuur water. Stel de tip vervolgens maximaal vijf minuten bloot aan UV-licht om de vorming van stabiele hydratatieplaatsen te bevorderen.

Langere overbelichtingstijden kunnen de tip beschadigen of de krommingsstraal ervan vergroten. Plaats de cantilever in de cantileverhouder van de AFM en pipetteer 25 µL van de beeldvormingsvloeistof op de cantilever en de tip om het oppervlak voorbevochtigen. Dit zal het ontstaan van luchtbellen verminderen bij het naderen van het monster.

Smelt de monsterdisk en het substraat op de monsterhouder en voeg een druppel van de beeldvormingsvloeistof toe aan het monster. Sluit vervolgens de cantileverhouder aan op de AFM. Breng de cantilever en het monster dicht bij elkaar zodat er een capillairbrug ontstaat tussen de vloeistoffen op de tip van de cantilever en die op het monster.

Gebruik de AFM-software om de meetlaser dicht bij het uiteinde van de tip van de cantilever uit te lijnen. Bepaal vervolgens de resonantiefrequentie van de cantilever aan de hand van de hoofdpiek in het thermische spectrum. Indien de uitbuiging van de cantilever is gekalibreerd, levert het fitten van de resonantiepiek met een model van een eenvoudige harmonische oscillator de veerconstante van de cantilever op.

Stel vervolgens de cantilever af door de amplituderespons te bepalen wanneer deze extern wordt aangestuurd over een bereik van frequenties nabij de resonantiefrequentie die in het thermische spectrum is geïdentificeerd. Pas de aandrijfamplitude aan zodat de amplitude van de vrije oscillatie ongeveer vijf nanometer bedraagt. Dit komt bij de meeste AFM's doorgaans overeen met 0,2-0,8 volt.

Stel vervolgens het amplitude-setpoint in op ongeveer 80% van de vrije amplitude. Stel daarna de feedback-gains relatief hoog in. Nadat is vastgesteld dat er geen instabiliteit of ringing optreedt, wordt de initiële scansnelheid ingesteld op ongeveer één hertz en de scanmaat op 10 nanometers.

Start de benadering van de tip naar het oppervlak met behulp van de AFM-besturingssoftware. Beoordeel of de tip het oppervlak heeft bereikt zonder met het beelden te beginnen door de setpoint-waarde licht te wijzigen. Als de tip zich op het oppervlak bevindt, moet het effect op de uitrekking van de ZPA-zone verwaarloosbaar zijn.

Zodra de tip het oppervlak heeft bereikt, wordt de ZPA-zone teruggetrokken en de cantilever opnieuw afgestemd. De resonantiefrequentie is waarschijnlijk verschoven naar een lagere waarde als gevolg van interacties tussen de tip en het monster. Wijzig nu het instelpunt naar ongeveer 80% van de nieuw afgestelde vrije amplitude en activeer de cantilever om een scan van 10 bij 10 nanometer vierkant van het oppervlak uit te voeren in amplitudemodulatiemodus om te verifiëren of de beeldparameters geschikt zijn.

Controleer of de trace- en retrace-profielen samenvallen. Zo niet, verlaag dan het instelpunt verder en probeer de gains te verhogen. Als het beeld ruis vertoont, verlaag dan de gains.

Herhaal de bewerking over een groot gebied van vijf bij vijf micrometer kwadraat van het monster, indien dit mogelijk is. Bij zachte of biologische monsters kan dit leiden tot contaminatie van de tip. Verklein de scantoevoer naar een waarde die geschikt is voor het visualiseren van de relevante kenmerken.

Dit kan zo klein zijn als 20 bij 20 nanometer. Verlaag vervolgens de aandrijfamplitude van de cantilever voldoende zodat de feedbackloop de ZPA-zone automatisch intrekt en de tip van het oppervlak tilt. Terwijl de cantilever van het oppervlak is verwijderd, wordt de aandrijfamplitude zo ingesteld dat de amplitude van de cantilever één tot twee nanometer piek-tot-piek bedraagt.

Verlaag het instelpunt geleidelijk in kleine stappen, totdat de ZPA-zone zich opnieuw naar het oppervlak uitstrekt en het oorspronkelijke beeld is hersteld. Houd de amplitude van het instelpunt tussen 75% en 95% van de nieuwe vrije amplitude. Stel daarna de versterkingen opnieuw in, aangezien er bij lagere amplitudes hogere versterkingen kunnen worden gebruikt zonder dat dit significante ruis introduceert.

Optimaliseer het systeem om de beste combinatie van vrije amplitude, instelpunt en versterking voor een hoge resolutie te vinden. De optimale systeemcondities zijn afhankelijk van het monster, de bevochtigingseigenschappen van de vloeistof en de gebruikte cantilever. Gebruik voor solvofiele interfaces cantilevers met een veerconstante van 0,5 tot twee newton per meter.

Met deze techniek werden beelden met sub-nanometerresolutie verkregen van een breed scala aan monsters. De zachte monsters die hier worden getoond, omvatten een lipide dubbellaag, paarse membranen van halobacterium salinarum, een zelfgeassembleerde monolaag van amfofiele dimoleculen en aquaporine-kristallen uit een runderlensmembraan. In elk geval zijn de relevante kenmerken gemarkeerd.

De kleine oscillatieamplitudes en hoge instelpunten minimaliseren de kracht die door de tip op het monster wordt uitgeoefend, waardoor fragiele zelfassemblages van lipiden in de dubbellaag, eiwitten in native biomembranen en amfifiele moleculen in oplossing kunnen worden afgebeeld zonder beschadiging. Hardere kristallijne materialen, zoals calciet, strontiumtitaniet, siliciumcarbide en enkelvoudige metaalionen geabsorbeerd op een mica-oppervlak, kunnen met deze aanpak worden afgebeeld, omdat in elk geval de interstitiële vloeistof effectief wordt afgebeeld en niet het kristal zelf. Eenmaal beheerst, biedt deze techniek vrijwel elke keer dat deze correct wordt uitgevoerd resolutie op moleculair of atomair niveau in vloeistof.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om er rekening mee te houden dat de interstitiële vloeistof wordt afgebeeld. Dit betekent dat er zachte beeldvormingscondities moeten worden gebruikt. Contaminatie van de tip, het monster of de vloeistof is gewoonlijk de belangrijkste oorzaak voor het niet behalen van een hoge resolutie.

Bij twijfel is het vaak een goed idee om alle oppervlakken die in contact komen met de vloeistof te reinigen en imaging-oplossingen opnieuw te gebruiken. Externe ruis is eveneens nadelig voor een hoge resolutie. Een vloer met weinig trillingen, uitgeschakeld van een ventilatiekanaal, is beter.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u uw beeldvormingsparameters kunt optimaliseren om AFM met een hoge resolutie te bereiken. Natuurlijk kan het, zoals bij elke geavanceerde techniek, meerdere pogingen kosten om uit te zoeken hoe een monster het beste in beeld kan worden gebracht, dus geduld is essentieel.