Name: Isolatie en cultuur van de volwassen neurale stamcellen van de muis Subcallosal Zone (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Leer de isolatie en cultuur van volwassen neurale stamcellen uit de subcallosale zone van de muis. Deze methode maakt onderzoek naar neurogenese en therapeutische toepassingen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door het Brain Research Program via de National Research Foundation (NRF), gefinancierd door het Koreaanse Ministerie van Wetenschap, ICT en Toekomstplanning (Grants NRF-2015M3C7A1028790); en door een subsidie van het Korea Health Technology R&D Project via het Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), gefinancierd door het Ministerie van Gezondheid & Welzijn, Republiek Korea (HI14C3347).

1. Voorbereiding van Materialen en Cultuur Medium <ol><li> Voor de dissectie en dissociatie van de SCZ, wikkel de hersenen matrix, tweesnijdend scheermesje en pincet met aluminiumfolie, en vervolgens steriliseren ze in de autoclaaf. </li><li> Bereid 50 ml koude PBS buffer om de gehele muizenhersenen wassen. </li><li> Het opzetten van een dissectie microscoop en de voorbereiding van de chirurgische instrumenten die nodig zijn voor de dissectie van de hersenen (geautoclaveerd schaar en pincet) en de isolatie van de SCZ (1 ml spuit, 30 G naald, hersenen matrix, en fijne tang). </li><li> Bereiding van N2 Medium: <ol><li> Bereid F-12 / DMEM (+ L-glutamine, natriumbicarbonaat +) medium met 2% B27, 1% N2 supplementen, en 1% penicilline-streptomycine. Noot: Het groeimedium bestaat uit N2 medium en groeifactoren (20 ng / ml gezuiverd epidermale groeifactor (EGF) en 20 ng / ml basische fibroblastgroeifactor (bFGF2)). </li></ol></li><li> Bereid een spijsvertering buffer (40 eenheden / ml papaïne, 2,4 eenheid / ml Dispase II en 2% penicilline-streptomycine in PBS) voor weefsel spijsvertering. </li><li> Voorbereiding van de Coating Plate en Coverslip: <ol><li> Bereid poly-L-ornithine (PLO; 0,01%) en laminine (10 ug / ml opgelost in DH 2 O). Het coaten 6-well platen voor het onderhoud van SCZ-aNSCs als een monolaag of 18 mm dekglaasjes voor immunokleuring, incubeer ze met PLO nacht bij 4 ° C. Was ze vervolgens 3 maal met DH 2 O. Laat de platen en dekglaasjes te drogen na de laatste wassen. </li><li> Vervolgens incuberen van de platen met laminine overnacht bij 4 ° C. Vervolgens was ze 3 keer met DH 2 O. Let op: de laminine niet droog, welke cel beslag zal beïnvloeden. Opmerking: De coating oplossingen kunnen 3 keer worden hergebruikt. </li></ol></li></ol> 2. Isolatie en dissociatie van de Adult SCZ <ol><li> Voorafgaand aan de cultuur voorbereiding, plaatst de hersenen matrix en tweesnijdend scheermes op ijs. Opmerking: Niet in de vriezer van de hersenen matrix, omdat de brain kon hechten aan het. </li><li> Offer een muis (8 weken oud) door CO 2 stikken of cervicale dislocatie. <ol><li> Snijd het hoofd met een scherpe schaar na het spuiten 70% ethanol. Om het hoofd te immobiliseren, houdt beide zijkanten van het hoofd stevig vast. Snijd de huid met een schaar op de middellijn in een caudale-rostrale richting. Dit bevordert de volledige verwijdering van de huid van de schedel. </li><li> Verwijder het caudale deel van de schedel (posterior naar lambda), en dan steek de tang tussen de schedel en de hersenen bij de dorsale middellijn positie. Pak de links (of rechts) pariëtale bot en zorgvuldig afschilferen. Herhaal deze procedure voor het verwijderen van de andere pariëtale botten. Opmerking: Verbreking van de optische zenuw en verwijdering van de hersenvliezen van de hersenen het gemakkelijker maken om de hersenen losmaken van de schedel. </li><li> Breng de hersenen koude PBS buffer (25 ml) en spoel tweemaal om overtollig bloed te verwijderen. </li></ol></li><li> Plaats de hersenen in de hersenen matrix op ijs en make coronale bezuinigingen op 1 mm dikke plakken te verkrijgen. Breng de hersenen plakjes (1 mm) die de SCZ gebieden die zich in het achterste deel van de hersenen om een ​​koude PBS in een 35 mm plastic petrischaal. Let op: Met het oog op een parallelle vlak van coronale secties te verkrijgen, ervoor zorgen dat de hersenen spleet wordt geplaatst in de middellijn van de hersenen matrix; is het essentieel om onnodige variaties in de mijden. Let op: Verkrijg hersenen plakjes op 2-3 mm achter bregma; Hierdoor kan de scheiding van de SCZ de SVZ. </li><li> Onder de microscoop ontleden met een lage vergroting, micro-ontleden de SCZ van de witte stof gebied van de cortex en de hippocampus met een gebogen 30G naald 6,9. Verwijder vervolgens de cortex regio&#39;s boven de SCZ. Plaats de ontleed regio SCZ van de plakjes in een 35 mm plastic petrischaal op ijs zonder koude PBS. NB: Besmetting van extra gebieden met volwassen neuronen kunnen hebben voor de levensvatbaarheid van aNSCs en neurosphere vorming bmdat ze ondergaan celdood in ANSC kweekomstandigheden. </li><li> Met behulp van een gebogen 30 G naald, onmiddellijk Hak de ontleed weefsel in kleine stukjes. Opmerking: Als er een langere tijd nodig is voor het ontleden van de SCZ weefsel, dompel de ontleed weefsels in koude PBS voor het hakken. </li><li> Resuspendeer de gesneden weefsel met 1 ml digestiebuffer, breng het weefsel naar een 15 ml buis met 2 ml digestiebuffer en incubeer gedurende 30 minuten in een 37 ° C waterbad. Let op: Schud de buis om de 10 min goed te mengen. </li></ol> 3. Subcallosal Zone-afgeleide volwassen neurale stamcel Cultuur <ol><li> Tik de buis licht tot het gedigereerde weefsel dissociëren en centrifugeer de buis bij 145 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant, geresuspendeerd het gedigereerde weefsel met 1 ml voorverwarmd medium N2 uitwasbaar de digestiebuffer en voorzichtig pipet de monsteroplossing maximaal 5 keer met een pipet P1000. Opmerking: Over-tritureren met een smallepipet tip kan levensvatbaarheid van de cellen en de daaropvolgende groei verminderen. </li><li> Centrifugeer de buis bij 145 xg gedurende 5 minuten. Na het weggooien van het supernatant, resuspendeer de cel pellet in 1 ml N2 medium. </li><li> Bereid 1 ml N2 medium in een niet-beklede 6-well plaat en voeg 1 ml van de gesuspendeerde cellen op een eindvolume van 2 ml te maken. </li><li> Voeg EGF (20 ng / ml) en bFGF (20 ng / ml) in elk putje. Schud de 6-well cultuur schotel met de hand om de toegevoegde groeifactoren mengen met de vergulde cellen. Houd de 6-well plaat in een 37 ° C en 5% CO2 incubator. </li><li> Voeg EGF (20 ng / ml) en bFGF (20 ng / ml) aan elk putje elke dag gedurende 8 dagen. Elke derde dag, voeg 200 pl media N2 bij benadering volume 2 ml van het medium te handhaven. </li></ol> 4. Passage van NSCs als Neurosferen en monolaag culturen <ol><li> Verzamel de neurospheres en overbrengen naar een nieuwe 15 ml conische buis. Let op: het aantal neurosferen (&gt; 50 micrometer diameter) per en de SCZ van één muizenhersenen was 64,3 ± 7,31, die lager is dan die van de SVZ was (190,5 ± 6,33) 9. </li><li> Incubeer de neurosferen met 0,5 ml dissociatie buffer gedurende 5 minuten in een 37 ° C waterbad voor de neurosferen dissociëren in enkele cellen. Primaire neurospheres los kan worden gezien in enkele cellen en onderhouden over meerdere passages als neurosphere of monolaag culturen. Opmerking: Uitbreiding SCZ-aNSCs als een monolaag is superieur aan neurospheres omdat SCZ-aNSCs kan worden gepasseerd&gt; 10 keer in een monolaag cultuur formaat, maar &lt;5 keer in een neurosphere cultuur formaat. Voorzichtig: SCZ-aNSCs vertonen sterke aggregatie, en het is moeilijk om ze dissociëren in enkele cellen. Aldus wordt de neurosfeercultuur formaat niet geschikt voor routinematige celexpansie. </li><li> Voorzichtig pipet de monsteroplossing op en neer met een P1000 pipet minder dan 5 maal en centrifugeer de buis bij 145 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en re-subrengen de neurospheres met 1 ml N2 medium. Opmerking: Over tritureren met een smalle pipet tip kan levensvatbaarheid van de cellen en de daaropvolgende groei verminderen. </li><li> Om de cellen te tellen, maak een 1: 1 mengsel van de celsuspensie (10 ui) en 0,4% trypan blauwe oplossing, en tel het aantal levende cellen op een hematocytometer. Na het bekleden van een 6-wells plaat met PLO / laminine, plaat de cellen bij 2,5 x 10 5 cellen / ml met 2 ml N2 medium voor elk putje. Opmerking: wijzigingen in cel dichtheid kan hun conditie en differentiatie potentieel beïnvloeden. </li><li> Handhaaf de SCZ-aNSCs met een dagelijkse behandeling van groeifactoren (2 ml, 20 ng / ml) gedurende 5 dagen, en deze passage hen. </li></ol> 5. Differentiatie van Subcallosal Zone-afgeleide adulte neurale stamcellen <ol><li> ANSCs plaat op een PLO / laminine beklede 18 mm dekglaasje met 1 x 10 5 cellen / ml in 1 ml N2 met groeifactoren (20 ng / ml) voor differentiatie van de SCZ-aNSCs. </li><li> De volgende dag,wanneer de cellen stevig aan de dekglaasje, wisselen het groeimedium met N2 tot de groeifactoren te verwijderen. </li><li> Na 6 dagen was de gedifferentieerde cellen met 1 ml PBS om celresten te verwijderen en ze op te lossen voor immunokleuring. Opmerking: BrdU kan in het nieuw gesynthetiseerde DNA van prolifererende cellen worden opgenomen. Derhalve desgewenst BrdU (10 ug / ml) worden toegevoegd aan cellen leven voor de fixatie van cellen. </li></ol> 6. Immunokleuring adulte neurale stamcellen en gedifferentieerde Progenitors <ol><li> Voor immunokleuring, was de cellen met PBS en bevestig ze met 4% PFA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Let op: PFA is zeer giftig; Aanraking met de huid en ogen te vermijden. </li><li> Verwijder de 4% PFA, spoel de gefixeerde cellen met PBS 3 keer, en bewaar ze bij 4 ° Cuntil ze nodig zijn voor immunokleuring. </li><li> Incubeer de cellen op het dekglaasje met blokkeeroplossing (3% runderserumalbumine en 0,1% Triton X-100 in 1 x PBS) gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid de primaire antilichamen in verse blokkerende oplossing en incubeer de monsters gedurende de nacht bij 4 ° C. <ol><li> Immunokleuring de aNSCs <ol><li> Vlekken aNSCs het gebruik van anti-Nestin en anti-BrdU-antilichamen. Vóór fixatie, voeg 20 ug BrdU de aNSCs en incubeer ze gedurende 2 uur. Voer de denatureringsstap middels 2 N HCl gedurende 20 minuten bij 37 ° Cbefore uitvoeren van de blokkeringsstap. </li></ol></li><li> Immunokleuring de gedifferentieerde voorlopers: <ol><li> Met anti-O4, anti-BIII-tubuline en anti-gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) antilichamen tegen de gedifferentieerde voorlopercellen labelen. </li></ol></li></ol></li><li> Was de monsters met PBS 3 keer en incubeer ze met secundaire antilichamen geconjugeerd aan fluorescente kleurstoffen (1: 500) in blokkeeroplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens was de monsters 3 maal met PBS. Opmerking: Gebruik secundaire antilichamen die overeenkomen met de gastheren van de primaireantilichamen. Hoechest33343 (1: 2000) wordt gebruikt voor kleuring van kernen. </li><li> Voeg montage oplossing voor een dia glas en ga verder met de montage. Observeren en beeld het monster op een confocale microscoop op verschillende golflengten: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm), en Hoechest33343 (405 nm). </li></ol>

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+population+analyses+demonstrate+that+an+EGF-responsive+mammalian+embryonic+CNS+precursor+is+a+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell.</a> Developmental biology. 175, 1-3 (1996).</li>
<li>Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriched+monolayer+precursor+cell+cultures+from+micro-dissected+adult+mouse+dentate+gyrus+yield+functional+granule+cell-like+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons.</a> PloS one. 2, e388(2007).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+adult+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in adult subventricular zone.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 629-634 (2002).</li>
<li>Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Hippocampus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKempermann%2C+G+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22">Cold Spring Harbor perspectives in biology</a>. 7, a018812(2015).</li>
<li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li>
<li>Seri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+organization+of+the+SCZ%3A+a+large+germinal+layer+containing+neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain.</a> Cereb Cortex. 16 Suppl 1, i103-i111 (2006).</li>
<li>Kim, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+spontaneous+production+but+massive+programmed+cell+death+of+new+neurons+in+the+subcallosal+zone+of+the+postnatal+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Evidence for the spontaneous production but massive programmed cell death of new neurons in the subcallosal zone of the postnatal mouse brain.</a> The European journal of neuroscience. 33, 599-611 (2011).</li>
<li>Kim, H. J., Kim, J. Y., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+the+subcallosal+zone+neurogenesis+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+international%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in the subcallosal zone neurogenesis of mice.</a> Neurochemistry international. 61, 879-884 (2012).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+Cortical+Neurogenesis+from+the+Neural+Stem+Cells+in+the+Adult+Mouse+Subcallosal+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Promotion of Cortical Neurogenesis from the Neural Stem Cells in the Adult Mouse Subcallosal Zone.</a> Stem Cells. , (2015).</li>
<li>Nunes, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nature medicine. 9, 439-447 (2003).</li>
<li>Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+widespread+is+adult+neurogenesis+in+mammals%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">How widespread is adult neurogenesis in mammals?</a> Nature reviews. Neuroscience. 8, 481-488 (2007).</li>
<li>Gage, F. H., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells%3A+generating+and+regenerating+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells: generating and regenerating the brain.</a> Neuron. 80, 588-601 (2013).</li>
<li>Shaker, M. R., Kim, J. Y., Kim, H., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+secondary+neural+tube-derived+embryonic+neural+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+and+development%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of secondary neural tube-derived embryonic neural stem cells in vitro.</a> Stem cells and development. 24, 1171-1181 (2015).</li>
<li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Molecular neurobiology. 34, 153-161 (2006).</li>
<li>Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+heterogeneity+demonstrated+by+molecular+phenotyping+of+clonal+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14506-14511 (2002).</li>
<li>Richards, L. J., Kilpatrick, T. J., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+neuronal+cells+from+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">De novo generation of neuronal cells from the adult mouse brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 8591-8595 (1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+and+fibroblast+growth+factors+behave+as+mitogenic+regulators+for+a+single+multipotent+stem+cell-like+population+from+the+subventricular+region+of+the+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 3287-3297 (1999).</li>
<li>Wachs, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficacy+of+clonal+growth+and+expansion+of+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 949-962 (2003).</li>
<li>Xiong, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+time+for+passaging+neurospheres+based+on+primary+neural+stem+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimal time for passaging neurospheres based on primary neural stem cell cultures.</a> Cytotechnology. 63, 621-631 (2011).</li>
<li>Lee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Matrigel-based+culture+for+expansion+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells.</a> Animal Cells and Systems. 19, 175-180 (2015).</li>
<li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nature protocols. 7, 2005-2012 (2012).</li>
<li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+mouse%2C+two+cultures%3A+isolation+and+culture+of+adult+neural+stem+cells+from+the+two+neurogenic+zones+of+individual+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%29%22%5BJournal%5D)">One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). , e51225(2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol om NSC&#39;s te genereren uit de volwassen muis SCZ en te handhaven voor diverse toepassingen. Er zijn drie cruciale stappen voor het vaststellen van de in vitro kweeksysteem die nodig zijn om te zuiveren en uit te breiden SCZ-NSC. Ten eerste is het belangrijk dat de regio SCZ precies wordt doorsneden van andere potentiële neurogene regio&#39;s (Figuur 1B). Dik en nauwkeurige gedeelten met de SCZ gebieden werden verkregen met een 1 mm interval h...

NSC's hebben kenmerken van zelfvernieuwing en differentiatie in meerdere lijnen. Om deze eigenschappen te bevestigen, is er op grote schaal gebruik gemaakt van een neurosfeer-kweeksysteem. Het neurosfeer-kweeksysteem werd ontwikkeld in de vroege jaren 1990 en diende als een standaard stamcelkweeksysteem1. Afhankelijk van de potentie voor zelfvernieuwing, prolifereren NSC's continu en genereren ze een celmassa in een suspensiekweek. Het aantal cellen en de grootte van de neurosfeer worden beschouwd als nauw verbonden met de proliferatie-eigenschappen van de NSC's. Monolayer-kweeks zijn ook wijd gebruikt voor het onderhoud en de differentiatie van NSC's. In vergelijking met de neurosfeer-kweek, biedt het monolayer-kweeksysteem een betere homogene onderhoud en uitbreiding van NSC's2. Deze twee goed ontwikkelde kweeksystemen hebben bijgedragen aan de karakterisering van aNSC's in vitro. 
NSC's bevinden zich in verschillende hersengebieden, zoals de subventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikel en de subgranulaire zone (SGZ) van de hippocampus3-5. De subcallosale zone (SCZ) van de caudale subcorticale witte stof wordt erkend als een nieuwe neurogene regio6-8. Recent werd gemeld dat de SCZ-aNSC's therapeutisch potentieel hebben bij traumatisch hersenletsel9. In vergelijking met andere neurogene regio's, bevindt de SCZ zich langs de subcorticale witte stof. In de menselijke hersenen neemt de subcorticale witte stof een groter gebied in dan in de muizenhersenen10. Daarom is een begrip van de kenmerken van SCZ-aNSC's met behulp van een in vitro kweeksysteem belangrijk om het potentiële gebruik van deze cellen voor neurale regeneratie te bevorderen. Precieze dissectie van de gewenste hersengebied is vereist om mogelijke besmetting door ongewenste regio's met actieve of rustige NSC's uit te sluiten. Bijvoorbeeld, aNSC's in niet-neurogene regio's kunnen worden geactiveerd en nieuwe neurale cellen produceren in gewonde hersenen of tijdens in vitro kweken11. Om NSC's uit de SCZ te verkrijgen, werden cellen verzameld uit hersensneden die de SCZ bevatten. Vervolgens werd een zorgvuldige microdissectie van de SCZ-regio uitgevoerd met behulp van een fijne naald. Om de neurosfeer uit de SCZ te genereren, werden microdissected SCZ-weefselklompjes gedissocieerd in enkele cellen en vervolgens gekweekt als een suspensie in aanwezigheid van epidermale groeifactor (EGF) en basische fibroblast groeifactor (bFGF). Nadat SCZ-aNSC's neurosferen hebben gevormd, kunnen ze ook worden onderhouden als neurosferen of monolayers voor uitbreiding. Deze procedure toont ook immunokleuring processen met verschillende markers voor de detectie van NSC's en hun nakomelingen na hun uitbreiding en differentiatie in een monolayer-kweek. Hier wordt een visuele protocol van het SCZ-aNSC-kweeksysteem gepresenteerd. Dit protocol bevat gedetailleerde instructies voor de microdissectie van de SCZ-regio en voor het onderhoud en passeren van de cellen.

<table><tbody><tr><td>Medium components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>+L-glutamin, +Sodium bicarbonate</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Growth factor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Gibco</td><td>PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>BIOSOLUTION</td><td>BP007a</td><td>1x dilution</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dissociattion buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>04-942-078-001</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ICT</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>Tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>WPI</td><td>555229F</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Storz</td><td>E3321-C</td><td></td></tr><tr><td>Brain matrix (1 mm)</td><td>RWD</td><td>68707</td><td></td></tr><tr><td>Double-edged razor</td><td>DORCO</td><td>ST-300</td><td></td></tr><tr><td>30 G needle</td><td>SUNGSHIM</td><td>N1300</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubes</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>35 mm dish</td><td>SPL</td><td>10035</td><td>Petri dish</td></tr><tr><td>100 mm dish</td><td>SPL</td><td>10090</td><td>Petri dish</td></tr><tr><td>Cover slip (18 mm)</td><td>Deckglaser</td><td>111580</td><td></td></tr><tr><td>12 well dish</td><td>SPL</td><td>32012</td><td>non-coating</td></tr><tr><td>6 well dish</td><td>SPL</td><td>32006</td><td>non-coating</td></tr><tr><td>Coating materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLO</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td>0.01%</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Primary antibodies&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB353</td><td>mouse (1:1,000)</td></tr><tr><td>EGFR</td><td>Abcam</td><td>ab2430</td><td>rabbit (1:1,000)</td></tr><tr><td>DCX</td><td>Santa Cruz</td><td>SC8066</td><td>goat (1:500)</td></tr><tr><td>Tuj1</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td>rabbit (1:2,000)</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Invitrogen</td><td>13-0300</td><td>rat (1:1,000)</td></tr><tr><td>O4</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td>mouse (1:500)</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>Rat (1:500)</td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>1:500</td></tr><tr><td>anti-mouse cy3</td><td>Jackson</td><td>715-165-151</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse 647</td><td>Jackson</td><td>715-606-150</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit 488</td><td>Alexa</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit cy3</td><td>Jackson</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit 647</td><td>Jackson</td><td>711-605-152</td><td></td></tr><tr><td>anti-goat 488</td><td>Alexa</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>anti-goat cy3</td><td>Jackson</td><td>705-165-147</td><td></td></tr><tr><td>anti-goat 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21447</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat cy3</td><td>Jackson</td><td>712-166-150</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat 647</td><td>Jackson</td><td>712-605-153</td><td></td></tr><tr><td>Immunostaining materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Millipore</td><td>82-100-6</td><td>3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>usb</td><td>22686</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>Biosesang</td><td>P2031</td><td></td></tr><tr><td>Hoechest33342</td><td>Life Technology</td><td>H3570</td><td>Dye for staining nuclei</td></tr></tbody></table>

isolatie en cultuur van de volwassen neurale stamcellen van de muis subcallosal zone

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Volwassen neurale stamcellen (aNSCs) kunnen worden gebruikt voor de regeneratie van beschadigd hersenweefsel. NSC's hebben het potentieel voor differentiatie en proliferatie in drie soorten cellen: neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Het identificeren van aNSC-afgeleide regio's en het karakteriseren van de aNSC-eigenschappen zijn cruciaal voor het potentiële gebruik van aNSC's en voor het ophelderen van hun rol bij neurale regeneratie. De subcallosale zone (SCZ), gelegen tussen witte stof en de hippocampus, is recentelijk gerapporteerd om aNSC's te bevatten en continu neuroblasten voort te brengen. Een laag percentage van aNSC's uit de SCZ is gedifferentieerd in neuronen; de meeste cellen zijn gedifferentieerd in gliacellen, zoals oligodendrocyten en astrocyten. Deze cellen worden gezien als potentieel therapeutisch voor traumatische corticale schade. Dit protocol beschrijft in detail het proces om SCZ-aNSC's te genereren uit een volwassen muizenhersenen. Een hersenmatrix met intervallen van 1 mm wordt gebruikt om de SCZ-bevattende coronale secties te verkrijgen en om de SCZ nauwkeurig te dissekeren uit de hele hersenen. De SCZ-secties worden aanvankelijk onderworpen aan een neurosfeercultuur. Een goed ontwikkeld kweeksysteem maakt de verificatie van hun kenmerken mogelijk en kan onderzoek naar NSC's verhogen. Een neurosfeercultuursysteem biedt een nuttig hulpmiddel voor het bepalen van proliferatie en het verzamelen van echte NSC's. Een monolaagcultuur is ook een in vitro systeem om proliferatie en differentiatie te meten. Belangrijk is dat dit kweeksysteem een meer homogene omgeving biedt voor NSC's dan het neurosfeercultuursysteem. Dus, door gebruik te maken van een discrete hersenregio, zullen deze kweeksystemen nuttig zijn voor het uitbreiden van onze kennis over aNSC's en hun toepassingen voor therapeutische doeleinden.

Definieert het kweeksysteem voor aNSCs van de onbekende neurogene regio essentieel voor het begrijpen van deze cellen en het ontwikkelen van hun potentieel gebruik in de hersenen reparatie 12. Het is bekend dat NSC&#39;s op verschillende ontwikkelingsstadia en in verschillende gebieden zich anders gedragen 3,4. Onlangs werd bericht dat SCZ-afgeleide cellen vertonen differentiële potentieel voor neuronale differentiatie in vivo en in vitro vergeleke...

Het opzetten van cultuursystemen voor de expansie van volwassen neurale stamcellen (aNSCs) maakt het mogelijk om aNSCs te onderzoeken en toe te passen voor therapie. De subcallosale zone (SCZ) is onlangs herkend als een nieuwe neuroblastvormende regio in volwassen muizen. Hier worden methoden beschreven voor de isolatie, expansie en differentiatie van SCZ-aNSCs.

Isolatie en cultuur van de volwassen neurale stamcellen van de muis Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Het algemene doel van dit adult neurale celkulturesysteem is om adulte neurale stamcellen uit de subcallosale zone te isoleren en deze cellen uit te breiden in niet-adherente en adherente culturesystemen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van adulte neurale stamcellen, zoals de isolatie en cultivering van neurale stamcellen uit kleine hersenlaesies zoals de subcallosale zone. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de isolatie van adulte neurale stamcellen uit de subcallosale zone.Het is eenvoudig, maar nauwkeurig. Om deze procedure te starten, autoclaveer je de hersenmatrix, een tweesnijdend scheermesje en een pincet. Bereid vervolgens 50 milliliters koud PBS voor om de muizenhersenen te wassen.Stel vervolgens een dissectiemicroscoop in en bereid de chirurgische instrumenten voor die nodig zijn voor de dissectie van de hersenen en de isolatie van SCZ. Bereid F-12 DMEM-medium voor met 2% B-27 en 1% N-2 supplementen en 1% penicilline-streptomycine. Bereid daarna de digestiebuffer voor de weefseldigestie.Bereid vervolgens 0,01% Poly-L-Ornithine en laminine voor. Coat daarna zes kleine platen voor het onderhoud van volwassen neurale s

isolation-culture-adult-neural-stem-cells-from-mouse-subcallosal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video beschrijft de methode die wordt gebruikt voor het isoleren van neuroprecursors uit de ontwikkelingslanden cortex van embryonale muizen. De procedure voor het verwijderen van embryo's uit de baarmoeder, het ontleden van de corticale weefsel, en verteren de geïsoleerde cerebrale cortex wordt weergegeven.

Cultuur van Mouse Neurale Stem Cell Voorlopers

Deze video protocol laat de neurosphere assay methode voor het genereren en uit te breiden neurale stamcellen uit een volwassen muis periventriculaire regio, en biedt technische inzichten om ervoor te zorgen kan men reproduceerbare neurosphere culturen te bereiken.

Isolatie en uitbreiding van de volwassen muis neurale stamcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

Deze video toont protocol de toepassing van de neurosphere test voor de isolatie en de uitbreiding van neurale stamcellen van het ganglionisch eminenties van embryonale dag 14-hersenen van muizen.

Tot vaststelling van Embryonale Mouse Neural Stem Cell Culture Met behulp van de Neurosphere Assay

The video demonstrates the process of isolating and culturing neural stem cells from the mouse brain's subcallosal zone. It involves dissecting tissue, enzymatic dissociation, and culturing them with differentiation factors to develop into mature neural cells.

Isolation and Culturing of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

This video demonstrates a detailed protocol for isolating the lateral ventricle walls from the adult mouse brain and performing enzymatic tissue dissociation to obtain single cells. These cells are then subjected to specific culture conditions that selectively enhance the proliferation of neural stem cells and promote their differentiation into co-cultures of oligodendrocytes and astrocytes.

Obtaining a Mixed Oligodendrocyte and Astrocyte Culture From Adult Mouse Neural Stem Cells

This video demonstrates a method for isolating stem cells from the postnatal mouse cerebellum and differentiating them into neural cells. Stem cells from the isolated cell suspension are purified using antibody-coated magnetic beads and are cultured to form neurospheres. The neurospheres are then maintained in a differentiation medium to generate neural cells.

Isolation of Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum and Differentiation into Neural Cells

Neurale stamcellen geoogst uit de volwassen hersenen worden steeds gebruikt in toepassingen, variërend van het fundamenteel onderzoek van de ontwikkeling van het zenuwstelsel aan het verkennen van potentiële klinische toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Dit maakt strenge controle op de isolatie en kweekomstandigheden gebruikt om deze cellen cruciaal voor experimentele resultaten goed groeien.

Groeiende neurale stamcellen uit Conventionele en Niet-conventionele Regio&#39;s van de Adult knaagdierhersenen

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het gelijktijdig opwekken van neurale precursoren celculturen, hetzij als hechtende monolagen of neurosferen, uit de subventriculaire zone en dentate gyrus van individuele volwassen muizen.

Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen

We rapporteren een op Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) gebaseerde methode om neurale stamcellen (NSC's) en hun nakomelingen te isoleren uit de subventriculaire zone (SVZ) van de volwassen muizenhersenen. Toegepast op Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgene muizen, maakt het de studie van celcyclusprogressie mogelijk door live beeldvorming.

Celsortering van neurale stamcellen en stamcellen uit de Adult Mouse subventriculaire zone en Live-beeldvorming van de celcyclus Dynamics

Hier introduceren wij een nieuwe microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de E13 muis embryo ganglionaire eminentie.

Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen

Hier beschrijven we een nucleofectiesysteem dat is ontworpen om de efficiëntie van genafgifte te verbeteren in uitgebreide neurale stamcellen (NSC's) geïsoleerd uit de subventriculaire zone van volwassen muizen. De bevindingen tonen aan dat deze methode de genverstoring in NSC's aanzienlijk verbetert, de effectiviteit van traditionele transfectieprotocollen overtreft en de celoverleving verbetert.

Isolatie, expansie en nucleofectie van neurale stamcellen uit de subventriculaire zone van volwassen muizen

Leer de isolatie en cultuur van volwassen neurale stamcellen uit de subcallosale zone van de muis. Deze methode maakt onderzoek naar neurogenese en therapeutische toepassingen mogelijk.

Isolatie en cultuur van de volwassen neurale stamcellen van de muis Subcallosal Zone

Meer video's verkennen