Name: Chondrogene differentiatie Inductie van vetcellen afgeleide stamcellen door Centrifugaal Zwaartekracht (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Leer chondrogene differentiatie van vetcellen afgeleide stamcellen door centrifugale zwaartekracht. Deze methode induceert SOX9 zonder cytokines voor kraakbeenreparatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van het Korea Health Technology R&D Project via het Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), gefinancierd door het Ministerie van Volksgezondheid & Welzijn, Republiek Korea (subsidienummer: HI14C2116) en door het Onderzoeksfonds van Seoul St. Mary's Hospital, The Catholic University of Korea.

Deze studie protocol werd goedgekeurd door de institutionele review board van de Katholieke Universiteit van Korea (KC16EAME0162) en uitgevoerd volgens de NIH richtlijnen. Alle weefsels werden verkregen met schriftelijke informed consent. 1. Centrifugaal Zwaartekracht laden en Pellet Cultuur <ol><li> Celcultuur en oogst <ol><li> Cultuur ASC (P2-P3, zie Lijst van Materials) in Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium-laag glucose (DMEM-LG) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine (P / S) bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. </li><li> Wanneer de cellen 80% confluentie bereikt, gooi het medium en spoelen van de cellen met 5 ml 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Voeg 1 ml PBS met 1 mM EDTA en incubeer gedurende 2 minuten bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. </li><li> Tik op de cultuur plaat zachtjes, voeg 4 ml vers medium, de overdracht van de celleneen 15-ml conische buis en gecentrifugeerd cellen bij 250 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT). </li></ol></li><li> Centrifugale zwaartekracht loading <ol><li> Na centrifugeren (stap 1.1.4), de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren en resuspendeer de pellet in 10 ml DMEM-LG met 10% FBS. Tel de cellen met een hemocytometer. </li><li> CG laden, overdragen 2,5 x 10 5 cellen in nieuw 15-ml conische buis en centrifugeer bij 2400 xg gedurende 15 min. </li></ol></li><li> pellet cultuur <ol><li> Onmiddellijk na centrifugatie, zuig de supernatant en voeg 500 ul van gedefinieerde chondrogene differentiatie medium (CDM, hoog-glucose DMEM aangevuld met 1% FBS, 1% ITS + Premix, 100 nM dexamethason, 1x MEM niet-essentiële aminozuren oplossing 50 ug / mL L-proline, en 1% penicilline / streptomycine). Voeg 50 ug / ml vers bereide L-ascorbinezuur 2-fosfaat bij elke mediumverversing. Als positieve controle induceren chondrogene differentiatide in uncentrifuged cellen door toevoeging CDM bevattende 10 ng / mL TGF-β1. </li><li> Plaats de losjes afgedekte buizen met de pellets in een staande positie en incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. </li><li> Verander het medium elke andere dag gedurende 3 weken. </li></ol></li><li> micromassakweek <ol><li> Direct na centrifugeren (stap 1.2.2; 2400 xg gedurende 15 min), zuig de supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ul CDM. </li><li> Een Micromass vormen, plaatst de geresuspendeerde cellen in het midden van een putje van een 24-wells plaat. </li><li> Na 2 uur, 1 ml CDM Voeg aan de bron, pipetteren tegen de wand van de plaat niet te verstoren de micromassa. Als een positieve controle, voeren een micromassakweek met uncentrifuged cellen door toevoeging CDM bevattende 10 ng / mL TGF-β1. </li><li> Incubeer de micromassa bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. </li><li> Verander het medium every andere dag gedurende 3 weken. </li></ol></li></ol> 2. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) te detecteren transcriptionele opregulatie van chondrogene differentiatie Markers <ol><li> Op dag 14 Gebruik een pipet om de bolvormige pellets naar een nieuwe 1,5 ml buis en wassen in 1 x PBS. </li><li> Extraheer het totale RNA van de pellets met de guanidinium thiocyanaat-fenol- chloroform extractie methode 9. </li><li> Synthetiseren cDNA van 2 ug totaal RNA met behulp van reverse transcriptase volgens het protocol van de fabrikant (incuberen bij 42 ° C gedurende 1 uur en vervolgens inactiveren van het enzym bij 70 ° C gedurende 5 min). </li><li> Voer PCR met primers specifiek voor chondrogene differentiatie merkers 10. </li></ol> 3. Kleuring de overexpressie van chondrogene differentiatie merkereiwitten Detect <ol><li> Paraffine inbedding celpellets <ol><li> Op dag 21,Gebruik een pipet om de bolvormige pellets te oogsten en was ze met 1x PBS. </li><li> Bevestig de bolvormige pellets door onderdompeling in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur. Let op: Paraformaldehyde is zeer giftig. contact met de ogen, huid of slijmvliezen te voorkomen. Minimaliseer blootstelling aan en inademen te voorkomen tijdens de bereiding. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. </li><li> Gooi de fixatief en spoel de celpellets met gedemineraliseerd water (DW). </li><li> Plaats een laag van gaas op de cassette en breng de vaste pellets met een pipet. Bedek de pellet door het vouwen van het gaas en sluit de cassette deksel. </li><li> Dehydrateer de pellets. <ol><li> Dompel de pellets in 70% ethanol (EtOH) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Dompel de pellets in 80% EtOH gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Dompel de pellets in 95% EtOH gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Dompel de pellets in 100% EtOH gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal dit twee keer. </li><li> Dompel de pellets 100% xyleen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal twice. </li></ol></li><li> Insluiten vaste celpellets in paraffine bij 56 ° C in een matrijs; de pellets kan worden ingebed in paraffine middels geautomatiseerde gespecialiseerde weefsel verwerkingssystemen. </li><li> Cut 5 urn dikke secties van de paraffine ingebedde celpellet toepassing van een roterende microtoom. </li><li> Float de secties in 50% EtOH en vervolgens overbrengen naar een 50 ° C waterbad met behulp van een glijbaan. </li><li> Plaats de zwevende gedeelten op objectglaasjes. </li></ol></li><li> Safranine O en alcianblauwkleuring <ol><li> Hydrateren de paraffine secties. <ol><li> Dompel de objectglaasjes in xyleen gedurende 15 min. Herhaal dit twee keer. </li><li> Dompel de objectglaasjes in 100% EtOH gedurende 5 min. Herhaal dit twee keer. </li><li> Dompel de glaasjes in 90% EtOH gedurende 5 min. </li><li> Dompel de glaasjes in 80% EtOH gedurende 5 min. </li><li> Dompel de dia&#39;s in 70% EtOH gedurende 5 minuten, en daarna was ze in 1x PBS. </li></ol></li><li> Vlekken op de gerehydrateerd secties met 1% Safranin O-oplossing en 3% Alcian blauw voor30 minuten. </li><li> Gooi de kleuroplossing en spoel de secties met DW. </li><li> Vlekken op de secties met hematoxyline / eosine-oplossing (tegenkleuring) gedurende 1 min. </li><li> Gooi de kleuroplossing en spoel de secties met DW. </li><li> Breng een druppel montage medium op een dekglaasje na het verwijderen van het resterende water. Plaats de dia (cell-kant naar beneden) op het dekglaasje met de montage medium zorgvuldig. </li><li> Laat de dia&#39;s drogen 2-3 uur bij kamertemperatuur. </li><li> beelden vast te leggen met behulp van een bright-field microscoop (geautomatiseerde rechtopstaande microscoop, 50X en 200X). </li></ol></li><li> immunofluorescentietest <ol><li> Hydrateren de secties zoals beschreven in paragraaf 3.2.1. </li><li> Dompel de objectglaasjes in natriumcitraat buffer (10 mM natriumcitraat, 0,05% Tween 20, pH 6,0), en vervolgens te handhaven op een sub kooktemperatuur gedurende 10 minuten in de magnetron. </li><li> Koel de dia&#39;s voor 20 minuten bij kamertemperatuur en daarna was ze met kraanwater. </li><li> Incubeer de glaasjes in 3%H 2 O 2 (in 1x PBS) gedurende 15 min, en vervolgens wassen met kraanwater gedurende 15 min 11. </li><li> Blokkeer de dia&#39;s met blokkerende buffer (10% normaal geit serum in PBS) gedurende 1 uur. </li><li> Zuig het blokkeren oplossing, en breng daarna een primair antilichaam verdund met 5% normaal geit serum op de dia&#39;s. </li><li> Incubeer de glaasjes nacht bij 4 ° C. </li><li> Was de glaasjes drie keer in 1x PBS gedurende 5 minuten elk. </li><li> Incubeer de glaasjes in fluorochroom-geconjugeerd secundair antilichaam verdund met 5% normaal geit serum gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Was de glaasjes drie keer in 1x PBS gedurende 5 min elk in het donker. </li><li> Incubeer de glaasjes met DAPI (1 ug / ml) gedurende 10 min, en vervolgens twee keer wassen in 1 x PBS gedurende 5 minuten elk. </li><li> Breng een druppel montage medium op een dekglaasje na het verwijderen van het resterende water. Plaats de dia (cell-kant naar beneden) op de montage medium zorgvuldig. </li><li> Laat de dia&#39;s drogen 2-3h in het donker bij kamertemperatuur. </li><li> Visualiseer de dia&#39;s met behulp van fluorescentie microscopie (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X en 200X vergroting) 12. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transforming+growth+factor+beta1+and+dexamethasone+on+the+growth+and+chondrogenic+differentiation+of+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells.</a> Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).</li>
<li>Erickson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+potential+of+adipose+tissue-derived+stromal+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo.</a> Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).</li>
<li>Sah, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthetic+response+of+cartilage+explants+to+dynamic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression.</a> J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).</li>
<li>Sakao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chondrogenic+phenotype+in+synovium-derived+progenitor+cells+by+intermittent+hydrostatic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure.</a> Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).</li>
<li>Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenesis+of+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+fibrin-polyurethane+composites+is+modulated+by+frequency+and+amplitude+of+dynamic+compression+and+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress.</a> Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).</li>
<li>Alves da Silva, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+chitosan-based+scaffolds+using+a+flow-perfusion+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor.</a> J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).</li>
<li>Maeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+microstructure+and+gene+expression+of+articular+chondrocytes+cultured+in+a+tube+under+mechanical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress.</a> Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).</li>
<li>Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugation+of+human+lung+epithelial+carcinoma+a549+cells+up-regulates+interleukin-1beta+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+RNA+using+TRIzol+%28TRI+reagent%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent).</a> Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UVB+induces+HIF-1alpha-dependent+TSLP+expression+via+the+JNK+and+ERK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways.</a> J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).</li>
<li>Wu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodetection+of+human+telomerase+reverse-transcriptase+%28hTERT%29+re-appraised%3A+nucleolin+and+telomerase+cross+paths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths.</a> J Cell Sci. 119, Pt 13 2797-2806 (2006).</li>
<li>Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+chondrogenic+phenotype+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Regulation of the chondrogenic phenotype in culture.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).</li>
<li>Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Sox9+has+essential+roles+in+successive+steps+of+the+chondrocyte+differentiation+pathway+and+is+required+for+expression+of+Sox5+and+Sox6%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6.</a> Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).</li>
<li>Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+is+a+potent+activator+of+the+chondrocyte-specific+enhancer+of+the+pro+alpha1%28II%29+collagen+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene.</a> Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).</li>
<li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+for+clinical+application+to+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+regeneration+of+articular+cartilage+and+subchondral+bone+in+vivo+using+MSCs+induced+by+a+spatially+controlled+gene+delivery+system+in+bilayered+integrated+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds.</a> Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).</li>
<li>Janzen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell+ageing+modified+by+the+cyclin-dependent+kinase+inhibitor+p16INK4a%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a.</a> Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).</li>
<li>Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+mesenchymal+progenitors+from+human+bone+marrow+differentiate+in+vitro+according+to+a+hierarchical+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model.</a> J Cell Sci. 113, Pt 7 1161-1166 (2000).</li>
</ol>

We verklaren dat we geen belangenconflicten hebben die verband houden met dit werk.

Stemness de toestand van cellen is zeer belangrijk voor CG-geïnduceerde overexpressie van SOX9. In onze studie konden SOX9 expressie worden geïnduceerd door CG in vroege passage ASC&#39;s (2-3), maar niet in latere doorgang ASC. Het is gerapporteerd dat, tijdens de teelt, ASC bevatten CD34 + -cellen tot 3 passages 16. ASC neiging om de expressie van CD34 verliezen de cellen gepasseerd, waardoor een lage respons CG. Met centrifugale zwaartekracht, kan hydrostatische dr...

Defecten in gewrichtskraakbeen niet genezen natuurlijk. Bijgevolg stamcel is voorgesteld als een veelbelovende benadering voor het herstel van aangetast kraakbeen. Deze werkwijze vereist zowel het verkrijgen van een voldoende aantal stamcellen en de inductie van deze cellen chondrogene differentiatie ondergaan. Beenmerg (BM) is op grote schaal gebruikt als bron van stamcellen, maar celisolatie van BM heeft twee belangrijke nadelen: invasiviteit en onvoldoende opbrengst. Vanwege het gemak van verwerving, vetweefsel is een voorkeur bron van stamcellen. Eerdere studies toonden de haalbaarheid van het isoleren van stamcellen uit vetweefsel en het induceren van chondrogene differentiatie van deze cellen met behulp cytokines zoals TGF-β1 1, 2. Deze werkwijzen zijn effectief maar duur. Als goedkopere alternatief voor cytokinen, kunnen mechanische belasting worden gebruiktchondrogene differentiatie induceren. Mechanische belasting speelt een cruciale rol bij het handhaven van de gezondheid van gewrichtskraakbeen 3, en kan chondrogene fenotypes in verschillende cellen. Bijvoorbeeld, hydrostatische druk veroorzaakt chondrogene fenotypen in synovium afgeleide progenitorcellen via de MAP kinase / JNK pathway 4 en mechanische compressie veroorzaakt chondrogenese van menselijke mesenchymale stamcellen (MSC&#39;s) van genen opwaarts reguleren chondrocytische 5. Bovendien afschuifspanning bij tot de expressie van chondrogenese gerelateerde extracellulaire matrix (ECM) in humane MSC&#39;s 6. Centrifugale zwaartepunt (CG), een gemakkelijk worden gecontroleerd spanning gegenereerd door centrifugeren, kan differentiële genexpressie in cellen 7 induceren. Bijvoorbeeld, in longepitheelcellen carcinoomcellen, de expressie van interleukine (IL) -1 ter opgereguleerd door centrifugeren 8. Therefore, als experimenteel induceerbare spanning, CG kan worden gebruikt om chondrocyte genexpressie te induceren in stamcellen. Het blijft echter onduidelijk of CG het chondrogene differentiatie van stamcellen kunnen induceren. In deze studie hebben we vastgesteld dat CG induceerde de opregulatie van SOX9, regulering van de chondrogenese in menselijk ASCs, wat resulteert in de overexpressie van chondrocyte genen. Verder vergeleken we de effecten van CG op chondrogenese met die van TGF-β1, de groeifactor meest gebruikte in vitro chondrogenese te induceren in stamcellen.

```html
<table><tbody><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>100 mm Dish</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Dish</td><td>TPP</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Disposable Pipette</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Disposable Pipette</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">ASC Culture Media Materials</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Low glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11885-084</td><td>growth base media</td></tr><tr><td>Penicilin Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td>1%</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>10%</td></tr><tr><td>PBS/1 mM EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Chondrogenic Differentiation Media Materials</td></tr><tr><td>DMEM High glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td>chondrogenic differentiation base media</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915</td><td>100 nM</td></tr><tr><td>Penicilin Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td>1%</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>1%</td></tr><tr><td>Ascorbate-2-phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>50 &#956;g/mL</td></tr><tr><td>L-proline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5607</td><td>50 &#956;g/mL</td></tr><tr><td>ITS</td><td>BD</td><td>354352</td><td>1%</td></tr><tr><td>Human TGF&beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>18 mm Cover Glass</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech &amp; Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen II antibody</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>Molecular Probe</td><td>A-11037</td><td>1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probe</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong gold antifade reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Slide Glass, Coated</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA Polymerase</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10x TBE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>loading star</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1 kb (+) DNA ladder marker</td><td>Enzynomics</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Human adipose-derived stem cells (ASCs)</td><td>Catholic MASTER Cells</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
```

chondrogene differentiatie inductie van vetcellen afgeleide stamcellen door centrifugaal zwaartekracht

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Beschadigd kraakbeen kan niet natuurlijk genezen. Momenteel is de meest geavanceerde therapie voor kraakbeendefecten de transplantatie van chondrocyten die zijn gedifferentieerd uit stamcellen met behulp van cytokinen. Helaas is cytokine-geïnduceerde chondrogene differentiatie kostbaar, tijdrovend en gepaard gaande met een hoog risico op besmetting tijdens in vitro differentiatie. Echter, biomechanische stimuli dienen ook als cruciale regulatorische factoren voor chondrogenese. Bijvoorbeeld, mechanische stress kan chondrogene differentiatie van stamcellen induceren, wat een potentiële therapeutische aanpak suggereert voor de reparatie van beschadigd kraakbeen. In deze studie hebben we aangetoond dat centrifugale zwaartekracht (CG, 2.400 × g), een mechanische stress die gemakkelijk toegepast kan worden door centrifugatie, de upregulatie van sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) induceerde in vet-afgeleide stamcellen (ASCs), waardoor ze chondrogene fenotypes gaan uitdrukken. De gecentrifugeerde ASCs vertoonden hogere niveaus van chondrogene differentiatiemarkers, zoals aggrecaan (ACAN), collageen type 2 alfa 1 (COL2A1) en collageen type 1 (COL1), maar lagere niveaus van collageen type 10 (COL10), een marker van hypertrofische chondrocyten. Daarnaast werd chondrogene aggregaatvorming, een voorwaarde voor chondrogenese, waargenomen in gecentrifugeerde ASCs.

Centrifugale zwaartekracht induceert de overexpressie van chondrogene differentiatie merkers in adipeus afgeleide stamcellen. Om de mate van centrifugale zwaartekracht die geschikt is voor chondrogene differentiatie te induceren, werden ASC gestimuleerd met verschillende graden van CG (0, 300, 600, 1200 en 2400 x g) gedurende 15 min. Na stimulatie, het ASC werden opnieuw gezaaid in kweekplaten en gekweekt gedurende 24 uur. Zoa...

Mechanische stress kan de chondrogene differentiatie van stamcellen induceren, wat een potentiële therapeutische aanpak biedt voor de reparatie van beschadigd kraakbeen. We presenteren een protocol om de chondrogene differentiatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen (ASC's) te induceren met behulp van centrifugale zwaartekracht (CG). De door CG geïnduceerde opregulatie van SOX9 resulteert in de ontwikkeling van chondrogene fenotypes.

Chondrogene differentiatie Inductie van vetcellen afgeleide stamcellen door Centrifugaal Zwaartekracht

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Het algemene doel van deze procedure is om chondrogene differentiatie van ASC's te induceren voor defecte kraakbeenreparatie. Deze methode is om de prechondrogene differentiatie van ASC's te induceren door middel van centrifugale zwaartekracht. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de chondrogene differentiatie van ASC's, kan het ook worden toegepast op andere systemen, zoals osteogene en fibrogene differentiatie.Het grote voordeel van deze techniek is dat chondrogene differentiatie gemakkelijk kan worden geïnduceerd vanuit stamcellen zonder enige cytokinen te behandelen. Het demonstreren van de procedure zullen Yeri Alice Rim en Yoojun Nam uit mijn laboratorium zijn. Begin met het oogsten van 80% confluente adipogeen-afgeleide stamcellen uit een 100 milliliter kweekschaal door het medium weg te gooien en te wassen met vijf milliliter PBS.Voeg vervolgens één milliliter PBS toe dat één millimolar EDTA bevat, en incubeer gedurende twee minuten bij 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide. Na twee minuten tikt u zachtjes op de kweekplaat en voegt u vervolgens vier milliliter vers medium toe en brengt u de cellen over naar een 15 milliliter conische buis. Centrifugeer de cellen gedurende twee minuten bij 250 keer g bij kamertemperatuur.Na centrifugatie verwijdert u het supernatant zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer vervolgens de pellet in 10 milliliter medium. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.Voor centrifugaal zwaartekrachtbelasting, breng 2,5 keer tien tot de vijfde cellen over naar een nieuwe 15 milliliter conische buis en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 2400 keer g. Na de centrifugatie, gaat u verder met de pellet of micromass-kweek. Direct na de centrifugatie, aspireer het supernatant en bij 500 microliter chondrogene differentiatiemedium, of CDM, en 50 microgram per milliliter versbereide L-ascorbinezuur 2-fosfaat tot de pellet.Een positieve controle, induceer chondrogene differentiatie en verzamel de cellen door CDM toe te voegen dat 10 nanogram per milliliter TGF-beta-1 bevat. Doe de buizen losjes dicht en incubeer gedurende drie weken bij 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide. Direct na de centrifugatie met zwaartekrachtbelasting, aspireer het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 microliter CDM.Om een micromass te vormen, pipet de resuspendeerde cellen in het midden van een put van een 24-puttenplaat en plaats vervolgens de plaat in de incubator. Voeg na twee uur voorzichtig 500 microliter CDM toe aan de put, pipet tegen de wand van de plaat om verstoring van de micromass te voorkomen. Als positieve controle, voer een micromass-kweek uit met niet-gecentrifugeerde cellen door CDM toe te voegen dat 10 nanogram per milliliter TGF-beta-1 bevat.Incubeer de micromass gedurende drie weken. Op dag 21 na de vorming van de micromass, gebruik een pipet om de sferoïde pellets te oogsten en was vervolgens met 1X PBS. Bevestig de sferoïde pellets door ze 24 uur lang in 4% paraformaldehyde te dompelen.De volgende dag gooit u het fixeermiddel weg en spoelt u de celpellets af met gedeïoniseerd water. Plaats een laag gaas op de weefselcassette en breng de gefixeerde sferoïde pellets over met behulp van een pipet. Bedek de pellet door het gaas te vouwen en sluit de cassettedeksel.Daarna dehydrateer de sferoïde pellets door ze vijf minuten lang in 70% ethanol te dompelen bij kamertemperatuur. Ga vervolgens door een reeks ethanolconcentraties gedurende vijf minuten elk. Dompel de pellets vervolgens gedurende 15 minuten in 100% xyleen.Dompel de sferoïde pellets in paraffine bij 56 graden Celsius voor inbedding. Snijd vervolgens vijf micrometer dikke secties van de in paraffine ingebedde celpellet met behulp van een roterende microtoom. Laat de secties drijven in 50% ethanol en breng ze vervolgens over naar een 50 graden Celsius waterbad.Monteer de drijvende secties op dia's en ga vervolgens verder naar safranine o en alcian blauw voor immunofluorescente kleuring. Om een geschikte centrifugale zwaartekracht te bepalen, werden ASC's gecentrifugeerd bij een centrifugale zwaartekracht van nul, 300, 600, 1.200 en 2.400 keer g gedurende vijftien minuten. SOX9 mRNA-expressie werd geëvalueerd 24 uur na CG-stimulatie.Een CG van 2.400 keer g induceerde significant SOX9 mRNA-expressie. Om de expressie van chondrogenese-gerelateerde genen te evalueren, werd totaal RNA geëxtraheerd uit niet-gestimuleerde ASC's, ASC's die gecentrifugeerd waren of behandeld met TGF-beta-1. Zoals hier te zien is, induceert CG-stimulatie collageen type-2 en aggrecaanexpressie.Overexpressie van collageen type-2 in ASC's behandeld met CG werd bevestigd door immunofluorescentie met behulp van een antilichaam tegen collageen type-2 in een Alexa Fluor 594 geconjugeerd secundair antilichaam. Om het effect van CG op chondrogenese-gerelateerde ECM-overexpressie te bepalen, werden ASC's behandeld met TGF-beta-1 als positieve controle. De negatieve controle was een pelletcultuur die niet werd onderworpen aan CG-belasting of TGF-beta-1-behandeling.De overexpressie van chondrogenese-gerelateerde ECM werd geëvalueerd in sferische pellets bestaande uit gecentrifugeerde ASC's door gebruik te maken van safranine o en alcian blauw kleuring. Glycosaminoglycaan, een belangrijk onderdeel van gewrichtskraakbeen, werd blauw gekleurd door alcian blauw of oranje gekleurd door safranine o. Na 14 dagen micromass-kweek werd chondrocytencondensatie geëvalueerd door de grootte van de aggregaten.De grootte van elk aggregaat, gegenereerd door CG, was ongeveer 0,5 millimeter. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 30 minuten worden uitgevoerd, als deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe chondrogene differentiatie van stamcellen kan worden geïnduceerd met behulp van centrifugale zwaartekracht.

chondrogenic-differentiation-induction-adipose-derived-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol beschrijft de isolatie van varkens-vetafkomstige stamcellen (pADSC) uit subcutaan vetweefsel met onderzoek van multipotentie. De multipotente pADSC worden gebruikt om processen van adipocytendifferentiatie te bepalen en transdifferentiatie in meerdere cellijnen van mesodermaal mesenchym of verdere lijnen van ectoderm en endoderm te bestuderen voor regeneratieve onderzoeken.

Isolatie en differentiatie van vetcellen afgeleide stamcellen uit Porcine Onderhuids vetweefsel

Hier presenteren we een protocol voor de ontleding van menselijke navelstreng (UC) en foetale placenta monster in koord bekleding (CL), Wharton's gelei (WJ), cord-placenta junctie (CPJ) en foetale placenta (FP) voor het isoleren en karakterisering van mesenchymale stromale cellen (MSC's) met de explantaatkweek techniek.

Isolatie en karakterisering van mesenchymale stromale cellen uit menselijke navelstreng en foetale Placenta

Wij presenteren een protocol voor het genereren van een chondrogeen afkomst van menselijk perifere bloed (PB) via geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) met behulp van een integratievrije methode, waaronder embryoïde lichaamsvorming (EB), uitbreiding van fibroblastische cellen en chondrogeeninductie.

Differentiatie van chondrocyten van perifere bloed afgeleide humane geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier stellen wij een protocol voor chondrogenische differentiatie voor van bloedbloedmononucleaire cellen afgeleide door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Chondrogenische Pelletvorming van Koord Bloed afgeleide geïnduceerde Pluripotente Stamcellen

Een werkwijze te halen Dendrimeer gebaseerde ongelijke nanopatterns waarmee de nanoschaal controle van lokale arginine-glycine-aspartic acid (RGD) oppervlakte dichtheid is beschreven en toegepast op de studie van celdifferentiatie hechting en chondrogenic.

Dendrimeer gebaseerde ongelijke Nanopatterns naar lokaal controle oppervlak hechting: een methode om directe Chondrogenic differentiatie

Het doel van dit protocol is voor het testen van de mogelijkheid van voorlopercellen afgeleid van menselijke gerelateerde adipeus weefsel te differentiëren in meerdere cel geslachten. Differentiatie werd vergeleken met mesenchymale stamcellen, afgeleid van menselijke beenmerg, waarvan bekend is dat het differentiëren in adipocyte, Osteocyt en chondrocyten geslachten.

Differentiatie capaciteit van menselijke aorta gerelateerde adipeus voorlopercellen

We presenteren een protocol voor de isolatie, cultuur en adipogene inductie van neurale kam afgeleide vet-afgeleide stamcellen (NCADSCs) uit de periaortische vetweefsel van Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ muizen. De NCADSCs kunnen een gemakkelijk toegankelijke bron van ADSCs voor het modelleren van adipogenese of lipogenese in vitro.

Isolatie, cultuur en adipogene inductie van neurale crest originele vet-afgeleide stamcellen uit periaortic vetweefsel

Dit protocol beschrijft een methodologie voor het isoleren en identificeren van van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) van Sprague Dawley-ratten.

Isolatie en identificatie van mesenchymale stamcellen afgeleid van vetweefsel van Sprague Dawley-ratten

Het vetweefsel is een uitstekende bron van mesenchymale stamcellen. Hier brengen we de stapsgewijze extractie, cultivatie en karakterisering van van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's) uit epididymaal vetweefsel van Zwitserse muizen.

Isolatie, in-vitro-expansie en karakterisering van mesenchymale stamcellen uit epididymaal vetweefsel van muizen

Deze studie beschrijft een methode voor het produceren van chondrocytische sferoïden door cellen samen te voegen tot sferoïden onder omstandigheden met een lage adhesie met behulp van zwaartekracht, gevolgd door het kweken van de resulterende sferoïden in mini-bioreactoren.

Het genereren van sferoïden uit verschillende chondrocyten met behulp van weinig klevende omstandigheden onder zwaartekracht en zelfgemaakte mini-bioreactoren

Leer chondrogene differentiatie van vetcellen afgeleide stamcellen door centrifugale zwaartekracht. Deze methode induceert SOX9 zonder cytokines voor kraakbeenreparatie.

Chondrogene differentiatie Inductie van vetcellen afgeleide stamcellen door Centrifugaal Zwaartekracht

Meer video's verkennen