Chondrogene differentiatie Inductie van vetcellen afgeleide stamcellen door Centrifugaal Zwaartekracht

Het algemene doel van deze procedure is om chondrogene differentiatie van ASC's te induceren voor defecte kraakbeenreparatie. Deze methode is om de prechondrogene differentiatie van ASC's te induceren door middel van centrifugale zwaartekracht. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de chondrogene differentiatie van ASC's, kan het ook worden toegepast op andere systemen, zoals osteogene en fibrogene differentiatie.

Het grote voordeel van deze techniek is dat chondrogene differentiatie gemakkelijk kan worden geïnduceerd vanuit stamcellen zonder enige cytokinen te behandelen. Het demonstreren van de procedure zullen Yeri Alice Rim en Yoojun Nam uit mijn laboratorium zijn. Begin met het oogsten van 80% confluente adipogeen-afgeleide stamcellen uit een 100 milliliter kweekschaal door het medium weg te gooien en te wassen met vijf milliliter PBS.

Voeg vervolgens één milliliter PBS toe dat één millimolar EDTA bevat, en incubeer gedurende twee minuten bij 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide. Na twee minuten tikt u zachtjes op de kweekplaat en voegt u vervolgens vier milliliter vers medium toe en brengt u de cellen over naar een 15 milliliter conische buis. Centrifugeer de cellen gedurende twee minuten bij 250 keer g bij kamertemperatuur.

Na centrifugatie verwijdert u het supernatant zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer vervolgens de pellet in 10 milliliter medium. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.

Voor centrifugaal zwaartekrachtbelasting, breng 2,5 keer tien tot de vijfde cellen over naar een nieuwe 15 milliliter conische buis en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 2400 keer g. Na de centrifugatie, gaat u verder met de pellet of micromass-kweek. Direct na de centrifugatie, aspireer het supernatant en bij 500 microliter chondrogene differentiatiemedium, of CDM, en 50 microgram per milliliter versbereide L-ascorbinezuur 2-fosfaat tot de pellet.

Een positieve controle, induceer chondrogene differentiatie en verzamel de cellen door CDM toe te voegen dat 10 nanogram per milliliter TGF-beta-1 bevat. Doe de buizen losjes dicht en incubeer gedurende drie weken bij 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide. Direct na de centrifugatie met zwaartekrachtbelasting, aspireer het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 microliter CDM.

Om een micromass te vormen, pipet de resuspendeerde cellen in het midden van een put van een 24-puttenplaat en plaats vervolgens de plaat in de incubator. Voeg na twee uur voorzichtig 500 microliter CDM toe aan de put, pipet tegen de wand van de plaat om verstoring van de micromass te voorkomen. Als positieve controle, voer een micromass-kweek uit met niet-gecentrifugeerde cellen door CDM toe te voegen dat 10 nanogram per milliliter TGF-beta-1 bevat.

Incubeer de micromass gedurende drie weken. Op dag 21 na de vorming van de micromass, gebruik een pipet om de sferoïde pellets te oogsten en was vervolgens met 1X PBS. Bevestig de sferoïde pellets door ze 24 uur lang in 4% paraformaldehyde te dompelen.

De volgende dag gooit u het fixeermiddel weg en spoelt u de celpellets af met gedeïoniseerd water. Plaats een laag gaas op de weefselcassette en breng de gefixeerde sferoïde pellets over met behulp van een pipet. Bedek de pellet door het gaas te vouwen en sluit de cassettedeksel.

Daarna dehydrateer de sferoïde pellets door ze vijf minuten lang in 70% ethanol te dompelen bij kamertemperatuur. Ga vervolgens door een reeks ethanolconcentraties gedurende vijf minuten elk. Dompel de pellets vervolgens gedurende 15 minuten in 100% xyleen.

Dompel de sferoïde pellets in paraffine bij 56 graden Celsius voor inbedding. Snijd vervolgens vijf micrometer dikke secties van de in paraffine ingebedde celpellet met behulp van een roterende microtoom. Laat de secties drijven in 50% ethanol en breng ze vervolgens over naar een 50 graden Celsius waterbad.

Monteer de drijvende secties op dia's en ga vervolgens verder naar safranine o en alcian blauw voor immunofluorescente kleuring. Om een geschikte centrifugale zwaartekracht te bepalen, werden ASC's gecentrifugeerd bij een centrifugale zwaartekracht van nul, 300, 600, 1.200 en 2.400 keer g gedurende vijftien minuten. SOX9 mRNA-expressie werd geëvalueerd 24 uur na CG-stimulatie.

Een CG van 2.400 keer g induceerde significant SOX9 mRNA-expressie. Om de expressie van chondrogenese-gerelateerde genen te evalueren, werd totaal RNA geëxtraheerd uit niet-gestimuleerde ASC's, ASC's die gecentrifugeerd waren of behandeld met TGF-beta-1. Zoals hier te zien is, induceert CG-stimulatie collageen type-2 en aggrecaanexpressie.

Overexpressie van collageen type-2 in ASC's behandeld met CG werd bevestigd door immunofluorescentie met behulp van een antilichaam tegen collageen type-2 in een Alexa Fluor 594 geconjugeerd secundair antilichaam. Om het effect van CG op chondrogenese-gerelateerde ECM-overexpressie te bepalen, werden ASC's behandeld met TGF-beta-1 als positieve controle. De negatieve controle was een pelletcultuur die niet werd onderworpen aan CG-belasting of TGF-beta-1-behandeling.

De overexpressie van chondrogenese-gerelateerde ECM werd geëvalueerd in sferische pellets bestaande uit gecentrifugeerde ASC's door gebruik te maken van safranine o en alcian blauw kleuring. Glycosaminoglycaan, een belangrijk onderdeel van gewrichtskraakbeen, werd blauw gekleurd door alcian blauw of oranje gekleurd door safranine o. Na 14 dagen micromass-kweek werd chondrocytencondensatie geëvalueerd door de grootte van de aggregaten.

De grootte van elk aggregaat, gegenereerd door CG, was ongeveer 0,5 millimeter. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 30 minuten worden uitgevoerd, als deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe chondrogene differentiatie van stamcellen kan worden geïnduceerd met behulp van centrifugale zwaartekracht.