Het bestuderen van dynamische processen van Nano-sized Objecten in Vloeistof met behulp van Scanning Transmission Electron Microscopy
5 februari 2017
Dit protocol beschrijft de werking van een vloeistofstroom monsterhouder voor het scannen van transmissie elektronenmicroscopie van AuNPs in water, zoals gebruikt voor de observatie van nanoschaal dynamische processen.
Het algemene doel van vloeistoffasische scannen transmissie-elektronenmicroscopie is om structuren en fenomenen van nanomaterialen in biologische monsters volledig ingebed in een vloeistoflaag van maximaal enkele micrometers dikte te observeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het gebied van materiaalkunde, zoals het gedrag van nanomaterialen in vloeistoffen en de studie van biologische monsters in de natuurlijke vloeistofomgeving. Het grote voordeel van deze techniek is dat het morfologische informatie op nanoschaal over monsters in vloeistof biedt.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het laden van de monsterhouder en het verkrijgen van beelden niet zo eenvoudig is als bij de eerste keer met elektronenmicroscopie. Om de procedure te starten, maakt u in een schone laminaire flowhood een lichtmicroscoop glasplaat schoon met een vezelvrij doekje en zuivere ethanol. Plaats de plaat op een schoon kamerweefsel in een petrischaal met een deksel.
Om de SiN microchips te manipuleren, grijpt u met met koolstof gecoate pincetten de microchip stevig maar voorzichtig aan de lange zijden, waarbij de SiN membraan altijd naar boven gericht blijft. Gebruik deze techniek om vijf microchips zonder spacer en vijf microchips met een 200-nanometer spacer op de glasplaat te plaatsen. Sluit de petrischaal en breng de microchips naar een afzuigkap.
Plaats de microchips in een beker met HPLC-kwaliteit aceton met de membraanzijde omhoog. Schud de beker zachtjes gedurende twee minuten om de beschermende coating te verwijderen, zorg ervoor dat de microchips niet omvallen. Breng de microchips vervolgens snel over naar een beker met zuivere ethanol.
Dek de beker af met aluminiumfolie. Schud de beker zachtjes gedurende twee minuten om de coating te verwijderen en breng deze in een gesloten petrischaal naar de laminaire flowhood. Plaats de microchips op een vers schoon kamerweefsel, zorg ervoor dat de microchips niet omvallen wanneer ze uit de pincetten vallen.
Laat de microchips een paar minuten drogen. Plaats de microchips vervolgens op de glasplaat in de petrischaal. Sluit de petrischaal en breng de microchips naar een plasmareiniger.
Plaats de glasplaat en microchips in de plasmareiniger en voer een vijf minuten durend reinigingsprogramma uit om koolwaterstoffen van de SiN membraan te verwijderen. Inspecteer de microchips met een lichtmicroscoop op gescheurde membranen of vuildeeltjes. Gooi beschadigde of vuile microchips weg.
In de laminaire flowhood immobiliseert u de microchips in een schone transportdoos met een plakkerige binnenzijde. Breng een druppel van een microliter van een drie molaar citraat gestabiliseerd waterige goud nanodeeltjesoplossing aan op de SiN membraan van elke microchip zonder spacer, en laat de oplossing drogen. Breng vervolgens een microliter gedeïoniseerd water aan op de membraan om zout en oppervlakteactieve stoffen weg te spoelen.
Na 30 seconden gebruikt u filterpapier om voorzichtig het water weg te deppen en laat de microchips drogen. Plaats de punt van de vloeistofstroming TEM houder onder een binoculaire lichtmicroscoop. Verwijder het titanium deksel van de houderpunt en plaats het op een vel aluminiumfolie.
Stel een microfluïdische spuitpomp in met een glazen spuit van een milliliter met 0,5 milliliter HPLC-kwaliteit water. Verbind de spuit met het stromingssysteem en start de pomp. Terwijl het water door het systeem wordt gespoeld, controleert u de leidingen op lekken of stromingsbeperkingen.
Wanneer het pompen voltooid is, verwijdert u de spoeling van de vloeistofcelcompartiment en droogt u de houderpunt met filterpapier. Inspecteer de houderpunt met de lichtmicroscoop. Droog de punt met schoon kamerweefsel en verwijder stof of vezels met schone PTFE-gecoate pincetten.
Inspecteer het houderpuntdeksel, de O-ring en de schroeven, en verwijder stof of vezels met PTFE-gecoate pincetten. Plaats de O-ring in de houdergroepen. Plaats de eerste schroef en draai deze een paar keer zodat deze net blijft staan.
Plaats met schone gebogen pincetten de monstermicrochip in de zak van de houderpunt met de SiN membraan naar boven gericht. Gebruik de binoculaire lichtmicroscoop om te controleren of de microchip correct is geplaatst. Plaats een druppel van 0,3 microliter zuiver gefilterd water op de monstermicrochip.
Houd de microchip met pincetten op zijn plaats. Pak vervolgens een spacer microchip op met gebogen pincetten die ondersteboven wordt vastgehouden. Draai voorzichtig de pincetten zodat de microchipmembraan naar beneden gericht is.
Plaats de spacer microchip op de monstermicrochip. Plaats lichtreflecterend materiaal onder de houderpunt en controleer de microchipuitlijning onder de binoculaire lichtmicroscoop. Gebruik pincetten om de microchips voorzichtig aan te passen als de SiN ramen niet uitgelijnd zijn.
Pak vervolgens het deksel van de monsterkamer op met pincetten. Draai het deksel ondersteboven en zonder de microchips aan te raken, laat de achterkant van het deksel op de houderpunt rusten. Plaats de resterende schroef met pincetten en draai beide schroeven op een iteratieve manier vast.
Draai voorzichtig vast totdat ze weerstand bieden. Ramen kunnen gemakkelijk breken als het vastdraaien te sterk is. Start een vloeistofstroom van vier microliter per minuut door het systeem en controleer op lekken in de houderpunt.
Breng vervolgens de houder naar een vacuümpompstation en voer een lektest uit. Zorg ervoor dat de druk binnen vijf minuten minimaal 10 tot de negatieve vijfde mbar bereikt. Plaats de houder in zijn behuizing.
En breng de houder naar de elektronenmicroscoop. Stel de microscoop in STEM-modus in. Meet de stroomdichtheid van de elektronenstraal met een dunne koolstoffilm bedekt met goud nanodeeltjes als referentiemonster zonder water.
Start de stroom van zuiver water met een snelheid van niet meer dan twee microliter per minuut. Plaats de vloeistofstroming TEM houder in de vacuüm laadvergrendeling en begin met ontluchting. Zorg ervoor dat de druk normaal afneemt.
En plaats vervolgens de TEM houder volledig in de microscoop. Zodra
Overzicht
Dit protocol beschrijft de werking van een houder voor vloeistomstromingsmonsters voor scannende transmissie-elektronenmicroscopie van AuNP's in water, waardoor de observatie van dynamische processen op nanoschaal mogelijk wordt gemaakt.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Scannende Transmissie-Elektronenmicroscopie
- Nanomaterialen
- Beeldvorming in vloeistofvormige fase
Achtergrond
- Scannende transmissie-elektronenmicroscopie in vloeistofvormige fase maakt de observatie van nanomaterialen in een vloeibare omgeving mogelijk.
- Deze techniek levert morfologische informatie op nanoschaal over monsters op.
- Het is vooral nuttig voor het bestuderen van biologische monsters in hun natuurlijke vloeibare toestand.
- Nieuwe gebruikers kunnen het laden van monsters en het verkrijgen van beelden uitdagend vinden.
Doel van het onderzoek
- Om structuren en fenomenen van nanomaterialen in biologische monsters te observeren.
- Om het gedrag van nanomaterialen in vloeistoffen te onderzoeken.
- Om het begrip van dynamische processen op nanoschaal te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Reiniging en voorbereiding van SiN microchips voor het laden van monsters.
- Het aanbrengen van een gouden nanodeeltjesoplossing op de microchips.
- Gebruik van een TEM-houder voor vloeistomstroming voor beeldvorming.
- Het uitvoeren van lekkagecontroles en het waarborgen van de juiste uitlijning van microchips.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol toont met succes de voorbereiding en beeldvorming van AuNP's in een vloeibare omgeving.
- Het schetst de stappen voor het waarborgen van de integriteit van het monster tijdens het proces.
- De resultaten wijzen op de effectiviteit van de houder voor vloeistomstroming bij het vastleggen van dynamische processen.
Conclusies
- Deze methode biedt waardevolle inzichten in het gedrag van nanomaterialen in vloeistoffen.
- Het verbetert de capaciteit van elektronenmicroscopie voor het bestuderen van biologische monsters.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitbreiden naar verschillende gebieden in de materiaalwetenschap.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Liquid phase scanning transmission electron microscopy enables direct observation of nanomaterial behavior in physiologically relevant liquid environments, supporting target validation through mechanistic de-risking of nanoparticle-biological interactions. This capability enhances predictive confidence in preclinical models by capturing dynamic processes such as agglomeration, dissolution, and cellular uptake under controlled fluid conditions. The method addresses a critical gap in nanomedicine development by providing nanoscale resolution in hydrated states, reducing reliance on inferential assays and improving go/no-go decisions in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing nanomaterial structural changes in liquid, clarifying mechanisms of action and degradation pathways.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of nanoparticle interactions with biological components in near-native conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying unstable or reactive nanomaterials early, reducing late-stage failure risk due to unforeseen liquid-phase behavior.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by confirming nanomaterial stability and dispersion in liquid media prior to high-content screening.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of particle size, shape, and concentration changes over time, providing reproducible metrics for assay standardization.
- Platform Reuse: Facilitates screening readiness and scalability through standardized microfluidic chip preparation and leak-tight holder assembly, supporting repeated use across compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by maintaining nanomaterials in liquid environments that mimic physiological conditions, improving relevance of efficacy and toxicity readouts.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying dynamic processes such as ion-induced dissolution or agglomeration, which directly impact bioavailability and safety profiles.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking when primarily mechanistic, clarifying whether observed effects stem from the nanomaterial itself or liquid-phase transformation products.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work, supporting hypothesis testing, assay readiness, and translational continuity when nanomaterials are evaluated in liquid environments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct visualization of nanomaterial behavior in liquid, reducing mechanistic ambiguity in target engagement studies.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible liquid cell formation and nanoparticle immobilization, ensuring consistent starting conditions for compound evaluation.
- Analytics: Highlights liquid thickness measurement and nanoparticle tracking as key readouts that help teams compare stability across formulations or environmental conditions.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity by maintaining nanomaterials in hydrated states that reflect in vivo exposure, supporting biomarker alignment when dissolution products or agglomerates correlate with biological response.
- Enterprise Reuse:Frames the method as a reusable capability through standardized microfluidic chip preparation, holder assembly, and leak testing protocols, enabling consistent application across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in nanomaterial-biological interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of liquid cell preparation and imaging workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by identifying unstable nanomaterials early.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on direct observation of liquid-phase stability and transformation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic handling, vacuum systems, and electron microscopy to ensure proper specimen holder assembly and leak testing.
- Depends on instrumentation including plasma cleaners, liquid flow TEM holders, and STEM-capable microscopes with environmental holders.
- Necessitates cross-team standardization of chip cleaning, spacer use, and flow rate protocols to ensure reproducibility across sites.
- Involves adaptation considerations when transitioning from water-based to complex biological media, including viscosity effects and potential membrane fouling.
- Includes practical limitations such as beam-induced radiolysis effects on liquid chemistry and the need for vacuum compatibility, which may restrict certain volatile or reactive formulations.
