Name: Induceren van ischemie-reperfusie schade in de Mouse Ear Skin voor intravitale Multiphoton Imaging van immuunresponsen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Leer hoe je een ischemie-reperfusiemodel induceert op muizenoorhuid met magneetklemmen voor intravitale multiphotonbeeldvorming. Deze techniek maakt real-time observatie van immuunresponsen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken Thomas Graf voor het beschikbaar stellen van de LysM-eGFP muizen.

Alle experimenten te maken met levende dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante gebruik van dieren en de richtlijnen en voorschriften zorg. 1. Keuze van Fluorescent Reporter Muizen <ol><li> Gebruik 6 tot 12 weken oude LysM-eGFP 11 muizen (geen voorkeur voor mannen of vrouwen). Opmerking: Het gebruik van verschillende celspecifieke fluorescent reporter muizen maakt de visualisatie van andere immuuncellen in vivo. In deze stam, circulerende neutrofielen (GFP hi-cellen), circulerende monocyten (GFP lo-cellen), en de huid macrofagen (GFP lo-cellen) kunnen worden gevisualiseerd. Met de beeldvormende parameters gebruikt, worden alleen de signalen van heldere GFP-positieve neutrofielen worden gedetecteerd. Opmerking: Een lijst van immuun-cel-specifieke tl-reporter muis stammen die geschikt zijn voor dit type van de huid imaging studie kan worden gevonden in referentie 8. Opmerking: Het wordt sterk aanbevolen dat albino muizen worden gebruikt voor de beeldvorming, zo pigmented muizen zijn meer vatbaar voor photodamage. Dit komt omdat de gepigmenteerde oorhuid is veel gevoeliger voor laser geïnduceerde speckling (indicatief weefsel branden). Hierdoor kan neutrofielen werving en accumulatie worden waargenomen, zelfs tijdens de steady state 8,12. </li><li> Houd de muizen in specifieke pathogeenvrije (SPF) aandoeningen met 12-uur licht-donker cycli. </li></ol> 2. Muis Anesthesie <ol><li> Verdoven de muis met een intraperitoneale injectie van ketamine-xylazine (8 pi -1 g lichaamsgewicht), bestaande uit een mengsel van 15 mg ketamine mL -1 en 1 mg ml -1 xylazine opgelost in steriel water. </li><li> Plaats de muis op een verwarmingselement om de lichaamstemperatuur op 37 ° C te houden gedurende de bereidingsprocedure. Controleer of er voldoende verdoving door het observeren van een afwezigheid van een teen knijpen reflex. Let op: Na het eerste uur, later kwartaal doses van verdoving moet subcutaan een te worden toegediendd duurt ongeveer 0,5 uur elk. Het trillen van snorharen of de staart kan ook aangeven dat de verdoving af is het dragen en dat er een top-up nodig is. </li><li> Gebruik oogheelkundige smeermiddel op de ogen te voorkomen droogheid terwijl onder verdoving. </li></ol> 3. ontharen <ol><li> toepassing ontharingscrème goed naar de bovenste tweederde van de dorsale muizenoor gebruik wattenstaafjes. </li><li> Wacht op 2-3 minuten voor het verwijderen van de crème met behulp van natte katoen-tip applicators op een grondige maar zachte manier. Opmerking: Sta niet toe dat ontharingscrème te blijven op de muis oor te lang, want het ontsteking 13,14 kan veroorzaken. </li></ol> 4. Inductie van ischemie en reperfusie schade <ol><li> Gebruik vergulde, N42-grade neodymium magneten, 12 mm diameter x 2 mm dik en met een Gauss waardering van ongeveer 3.000 tot ischemie induceren in de muis oor huid. Opmerking: In dit geval is de kuiltjes gezicht van de magneten Denotes de noordpool. </li><li> Slot de magneten in hun afzonderlijke plastic gidsen. Opmerking: De kunststof gids dient voor het plaatsen en scheiding van de zeer sterke magneten vergemakkelijken. Door hun sterke magnetische werking nog laag breukvastheid, geen individuele magneten dicht bij elkaar te plaatsen of andere metalen. Breuk en versplintering kan optreden als ze trekken naar elkaar toe. </li><li> Plaats de eerste (dorsale) magneet zodanig dat alleen de rand in contact met de tweede (ventrale) magneet (figuur 3a) Let op: Dit voorkomt dat de magneten aan elkaar snapping voor dat ze correct zijn gepositioneerd. </li><li> Positioneer beide magneten zodanig dat het ventrale magneet ligt plat op het oor (figuur 3a). Opmerking: Voordat ischemie wordt veroorzaakt, ervoor te zorgen dat de muis bij 37 ° C wordt gehouden en dat er voldoende verdoving wordt gehandhaafd (zie stap 2.2). </li><li> Eenmaal klaar, voorzichtig laat de magneten bij elkaar komen (figuur 3a </strong&gt;). Opmerking: Voor grafische doeleinden klem slechts de helft van het oor, zodat een IR en IR-gebied niet kan worden waargenomen. </li><li> Na 1,5 uur van ischemie, verwijder de magneten door het verdraaien van de magneten uit de buurt van elkaar met behulp van de kunststof geleidingen, waardoor reperfusie te laten plaatsvinden. Opmerking: Er moet worden voorkomen dat de oren kreukelt wanneer de magneten zijn geplaatst. Onvolledige ischemie is duidelijk als de macroscopisch zichtbare grote bloedvaten opnieuw Perfuseren onmiddellijk (dwz bloed vult de vaten direct) na de magneten worden verwijderd. Reperfusie hoewel niet optreden onmiddellijk na de verwijdering van magneten, bloedvat occlusie slechts voorbijgaand. Als zodanig is het noodzakelijk om de muisoor bereiden op beeldvorming zo spoedig mogelijk. </li></ol> 5. Injectie van Blood Vessel Labeling Agents <ol><li> Onmiddellijk na het verwijderen van de magneet, beheren intraveneus (via retro-orbitale of staartader injectie) Evans blauw (10 mg ml -1in PBS of zoutoplossing; 1 gl -1 g lichaamsgewicht) of een ander bloedvat labelingmiddel keuze. Opmerking: Voordat injectie, ervoor te zorgen dat er voldoende verdoving wordt nog steeds onderhouden door het uitvoeren van zachte teen knijpen. </li></ol> 6. Plaatsing van het oor op de Imaging Platform <ol><li> Knip 2 stukjes plakband 1,5 cm in lengte en 1,8 cm in de breedte. </li><li> Laat de lijm kanten aan elkaar blijven terwijl waardoor ongeveer 1 mm lijm over de breedte. </li><li> Snijd het plakband in twee, in de lengte, naar de plaatsing huisvesten binnen de sleuf op het oor platform. </li><li> Plaats deze afplakband ongeveer halverwege de gleuf, zodat de klevende kant naar boven gericht. </li><li> Plaats de muis op de verwarming pad, zodat het oor af te beelden is naast de afplakband strip. </li><li> Door twee PBS-bevochtigd katoen-tip applicators, voorzichtig op het oor tegen de plakstrip. </li><li> Met behulp van de strip als een gids, breng de muis oordoor de sleuf tegelijkertijd instellen van de muis dichter naar het podium. </li><li> Het plakband te verwijderen, eerst een druppel PBS om de hechting van de band te verminderen. </li><li> Scheid de muisoor het plakband zo voorzichtig mogelijk met een fijne kwast. </li><li> Plat het oor tegen het oor platform door zacht glooiende een vochtige katoen-tip applicator over het oor. </li><li> Een druppel PBS onder het dekglaasje (die in positie op de houder dekglaasje behulp vet wordt gehouden; figuur 2) en plaats voorzichtig het over het oor. Bijvullen met meer PBS indien nodig. Opmerking: De dekglaasje houder verhoogt de stabiliteit tijdens de beeldvorming. </li><li> Plaats de rectale temperatuursensor en de draden aan het verwarmingssysteem volgens de instructies van de fabrikant. Opmerking: Stel de temperatuur van het lichaam verwarmingselement tot 37 ° C en het oor stage platform 35 ° C. </li></ol> 7. Multiphoton Microscoop Seten Imaging Parameters Let op: Dit protocol maakt gebruik van een enkele straal, multiphoton microscoop met een instelbare (680 - 1080 nm) Ti: Sa laser (3,3 W bij 800 nm; puls lengte van 140 fs; 80 MHz herhalingsfrequentie) met een 20X water objectief (NA = 1.0) voor intravitale imaging studies. <ol><li> Open de imaging software. </li><li> Lijn de laser volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Stel de excitatiegolflengte naar 950 nm. Opmerking: GFP en Evans blauw kunnen tegelijkertijd opgewonden bij 950 nm. </li><li> Om preview, gebruik de volgende instellingen: 500 pm 2 scanfield, 505 x 505 pixel resolutie, en een scan frequentie van 800 Hz in een enkele lijn scan. Klik op &quot;Preview&quot;. </li><li> Schakel de demper (laser) macht. Zorg ervoor dat alle essentiële signalen worden opgepikt zonder bloot het veld beeldvorming om grote hoeveelheden laservermogen, waarbij warmte schade kan veroorzaken. Opmerking: Start bij een lage demper vermogen en toenemen indien de signal is zwak. Zoals neutrofielen afwezig zal zijn van het interstitium op vroege tijdstippen na reperfusie, kunnen macrofagen worden gebruikt als een maat van de minimale benodigde vermogen te bepalen, omdat de eerstgenoemde zwakker dan neutrofielen. Opmerking: Als deze stap wordt uitgevoerd voor de eerste keer, pas de instellingen in de niet-ischemische zone, waarbij intacte vasculaire integriteit verwacht en wordt de instelling van de verzwakker vermogen vergemakkelijken. In de daaropvolgende experimenten, hoeft deze instellingen niet veel aanpassingen nodig, tenzij het laservermogen is instabiel. </li><li> Pas de PMT-instellingen. Opmerking: Informeer bij de fabrikant voor het maximale optimale winst spanning voor de PMT. Instellen PMT voltage boven de aanbevolen drempel leidt tot een hogere signaal-ruisverhouding. Algemeen wordt aangeraden om de versterking PMT voltage op de aanbevolen drempel en de verzwakker te verhogen als noodzakelijk zou het signaal te zwak. </li><li> Selecteer een beeldgebied dat dicht bijde rand van de ischemie, gekenmerkt door grote Evans blauwe lekkage. </li><li> Verzamel GFP en Evans blauw signalen met behulp van 525/50 bandpass (BP) en 655/40 BP filters, respectievelijk. Voor de tweede harmonische generatie (SHG) signalen van collageen vezels in de huid compartiment, gebruik dan een 475/42 BP filter. </li><li> Maak een map om de afbeeldingen in een formaat dat compatibel is voor de beschikbare beeldanalyse-software is op te slaan. </li><li> Te verwerven, gebruik de volgende instellingen: 500 pm 2 scanfield, 505 x 505 pixel resolutie, en een scan frequentie van 400 Hz in een enkele lijn scan. </li><li> Een 100-um z-stack met een stapgrootte van 4 urn herhaaldelijk kan worden verkregen in de tijd, op 1 min tussenpozen neutrofielen infiltratie controleren. Opmerking: Speciaal voor leukocyten (bijvoorbeeld neutrofielen) met een hogere snelheid trekkende, een interval dat langer is dan 1 min kan leiden tot problemen tijdens cell tracking analyse. In dit geval kan de gebruiker verlaagt de dikte van de acinquisitie stapelen of verhoog de scan frequentie. Opmerking: Als het vereiste verwerving stapel van de ischemische zone kleiner als gevolg van de compressie (alternatief gekenmerkt door een hogere intensiteit SHG) weergegeven, zal later reperfusie resulteren in massieve ontsteking die veroorzaakt het oor te zwellen. Aanzienlijke afwijkingen in de Z-richting worden verwacht. Als zodanig is de verwerving van een groot z-stack moet de drift tegemoet. </li><li> Gedurende de beeldvorming, boven het PBS en water regelmatig het oor vochtig en het objectief ondergedompeld in water te houden. Opmerking: Een typisch experiment duurt gewoonlijk 2-4 uur. Afhankelijk van de experimentele opzet, en in combinatie met een goed gecontroleerde anesthesie regime verlengen beeldvorming mogelijk. </li></ol> 8. Het beëindigen van het Experiment <ol><li> Euthanaseren de muis door kooldioxide stikken volgens de instelling Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) procedures. Opmerking: euthanaseren altijd de muis door erkende methoden, zoals bepaald door de instelling van de regels, voorschriften en richtlijnen. Als herhaalde beeldvorming nodig is, houdt de muis op de verwarming pad totdat de verdoving is uitgewerkt. Zodra de muis voldoende bewustzijn herwonnen en is mobiel, de terugkeer van de muis zijn kooi. </li></ol> 9. Beeldanalyse Opmerking: de gegevens gegenereerd door de beeldvormende experiment kan zichtbaar worden gemaakt door verschillende softwarepakketten. <ol><li> Open de imaging-analyse software. </li><li> Onder overtreffen Mode, importeert u het bestand (Open → selecteert u een bestand in de gewenste map → Klik op &quot;open&quot;). </li><li> pseudo bewerken kleuren als standaard kleuren zijn niet van toepassing (aanpassing bewerken → Display → Onder de tab-kanaal, selecteert u de gewenste kleur uit het kleurenpalet). </li><li> Pas de helderheid, contrast en achtergrond (Edit → Display Adjustment → Toggle Max en Min waarden). </li&gt; <li> Zorg ervoor dat het bestand afmetingen juist zijn (Edit → Beeld eigenschappen → Onder de tab geometrie, controleer dan de voxel grootte. In dit protocol, X = 0,99, Y = 0,99, en Z = 4). Let op: Leid X en Y door de scanfield dimensie te delen door de pixel resolutie. Z is de dikte van elke plak. Opmerking: Het resultaat van deze datasets kan worden gepresenteerd als maximale projectie films. Opmerking: Tracking analyse vereist het volledig karakteriseren van de cellulaire activiteiten en interacties om hun functie in vivo te begrijpen. Gedetailleerde instructies van cell tracking met behulp van ter plaatse beschikbare functie in de software kan worden gevonden in het protocol in referentie 15. Let op: Er zijn vele manieren van het kwantificeren leukocyten migratie, waarvan de details zijn te vinden in het overzichtsartikel in referentie 16. </li></ol>

<ol><li>Black, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Pressure+Ulcer+Advisory+Panel%27s+updated+pressure+ulcer+staging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Skin+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">National Pressure Ulcer Advisory Panel's updated pressure ulcer staging system.</a> Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Huebener, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HMGB1%2FRAGE+axis+triggers+neutrophil-mediated+injury+amplification+following+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis.</a> J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).</li>
<li>Wassermann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chronic+pressure+ulcer+model+in+the+nude+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">A chronic pressure ulcer model in the nude mouse.</a> Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).</li>
<li>Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple%2C+noninvasive%2C+clinically+relevant+model+of+pressure+ulcers+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Surg%22%5BJournal%5D)">Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse.</a> J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).</li>
<li>Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+ischemia-reperfusion+injury+in+a+microcirculatory+model+of+pressure+ulcers%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers.</a> Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).</li>
<li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).</li>
<li>Li, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+immune+responses+in+the+mouse+ear+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin.</a> Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).</li>
<li>Tong, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+immune+atlas%3A+three-dimensional+analysis+of+cutaneous+leukocyte+subsets+by+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy.</a> J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).</li>
<li>Saito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+MCP-1+attenuates+cutaneous+ischemia-reperfusion+injury+in+a+mouse+model+of+pressure+ulcer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer.</a> J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96, 719-726 (2000).</li>
<li>Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dendritic+cell+migration+within+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing dendritic cell migration within the skin.</a> Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).</li>
<li>Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+imaging+for+the+in+vivo+tracking+of+high-speed+vesicle+transport+in+mouse+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils.</a> Sci Rep. 3, 1913(2013).</li>
<li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+dermal+dendritic+cells+act+as+rapid+sensors+of+protozoan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites.</a> PLoS Pathog. 4, e1000222(2008).</li>
<li>Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+clathrin-mediated+endocytosis+of+G+protein-coupled+receptors+at+single-event+resolution+via+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy.</a> J Vis Exp. , e51805(2014).</li>
<li>Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+immune+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysing immune cell migration.</a> Nat Rev Immunol. 9, 789-798 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Betekenis IR is een van de belangrijkste oorzaken van de huid decubitus. De vroege stadia (I en II) van decubitus beschrijft de toestand van de menselijke huid (ten opzichte van de onderliggende onderhuidse weefsels en spieren). Echter, is een begrip van de immunologische etiologie ontbreekt nog. Hier presenteren we een eenvoudige en robuuste IR model op muis oorhuid om deze in te lopen. We simuleren ischemie door het klemmen van de muis oor tussen twee magneten en vervolgens de studie van de d...

Ischemie-reperfusie schade (IRI) treedt op wanneer er een voorbijgaande hypoxie als gevolg van de obstructie van de bloedstroom (ischemie), gevolgd door een latere re-oxygenatie van weefsels (reperfusie). In de huid wordt ischemie-reperfusie (IR) beschouwd als een van de factoren die bijdragen aan de pathofysiologie van decubitus, waarbij langdurige bedrust predisponeert langdurige ziekenhuispatiënten om letsel. Bij deze patiënten wordt zowel de huid en de onderliggende spieren voortdurend blootgesteld aan gewicht uitgeoefende druk over gebieden van botuitsteeksel, waardoor gelokaliseerde verwondingen die, indien onbehandeld, kan necrotisch 1 worden. De betrokken bij een IRI schade zijn tweeledig. Tijdens ischemie, de occlusie van bloedvaten leidt tot een drastische daling van zuurstofafgifte aan de weefsels. Dit resulteert in een daling van ATP en pH, die ATPasen betrokken celstofwisseling inactiveert. Op zijn beurt, de cellulaire calcium niveaus spike, en gestrest of beschadigde cells ondergaan apoptose of necrose 2. De afgifte van intracellulaire inhoud of schade geassocieerde moleculaire patronen (DAMP), zoals HMGB1 bijdraagt aan de ontstekingsreactie 3. De tweede belediging optreedt tijdens reperfusie. Hoewel zuurstof en pH-niveaus worden hersteld tijdens reperfusie resulteert in de generatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), die leidt tot de oxidatie van intracellulaire lipiden, DNA en eiwitten. Dientengevolge zijn pro-inflammatoire mediatoren geactiveerd, dat een secundair ontstekingsreactie die de rekrutering van immuuncellen naar de ontstekingsplaats 2 omvat vertrekt. Terwijl de cascade van biochemische gebeurtenissen die leidden tot de ontstekingsreactie is goed beschreven, worden de ruimtelijke en temporele regulatie van het immuunsysteem cel activiteiten niet goed begrepen. Hier beschrijven we een robuuste IR-model op de muis oor huid met behulp van eenvoudige magneet klemmen. In combinatie met multifoton intravitale beeldvorming (MP-IVM), wewerd een model voor de in vivo ontstekingsreacties die na reperfusie plaatsvindt bestuderen. De grondgedachte achter de ontwikkeling en het gebruik van deze techniek is om te proberen te begrijpen hoe zowel de interstitiële en infiltrerende cellen reageren op IR in real time. Bestaande modellen van IR behulp van de stel- techniek op de huid flank zijn sterk invasieve mocht de chirurgische implantatie van staalplaten in de huid flank vereist, waardoor ze minder dan ideaal voor immunologische studies 4. Een dergelijke niet-invasieve klemming techniek is beschreven in de muizenhuid flank 5,6. Vanwege de integratie van de intravitale beeldvorming component in deze werkwijze, maar wij kozen voor de oorhuid de beoogde IR site, zoals omzeilt bewegingen door ademhaling en stabiliteit biedt tijdens beeldvorming 7,8. Bovendien leukocyten subsets de interstitium overspannen zijn identiek tussen het oor huid en de huid flank, hoewel degetallen en verhoudingen kunnen enigszins variëren 9. Dus de oorhuid vertegenwoordigt een ideale beeldvorming plaats. Daarnaast hebben de meeste gegevens uit deze IRI modellen zijn beperkt tot macroscopische evaluaties (grading van zweren) en microscopische analyses van endpoint inflammatoire indicatoren 10. Met behulp van dit model wordt real-time visualisatie van de cellulaire respons van neutrofielen na reperfusie in de huid van een tl-reporter muis ingeschakeld. Een eerder gepubliceerd intravitale oor imagingmodel wordt gebruikt 8 met extra modificaties (figuren 1, 2).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Muizenstammen</td></tr><tr><td>Lysozyme-GFP C57BL/6</td><td>Thomas Graf, Center for Genomic Regulation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6-C2J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>000058</td><td>Te kruisen met Lysozyme-GFP om albino Lysozyme-GFP te genereren voor huidbeeldvorming</td></tr><tr><td colspan="4">Reagentia</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viaflex 0,9% (wt/vol) zoutoplossing</td><td>Baxter Healthcare</td><td>F8B1323</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (100 mg mL&minus;1 ketamine hydrochloride</td><td>Parnell</td><td></td><td>Ketamine is een gecontroleerd medicijn en alle relevante lokale voorschriften moeten worden gevolgd</td></tr><tr><td>Ilium Xylazil-20 (20&nbsp;mg&nbsp;mL&minus;1 xylazine hydrochloride)</td><td>Troy Laboratories</td><td></td><td>Xylazil-20 is een gecontroleerd medicijn en alle relevante lokale voorschriften moeten worden gevolgd.</td></tr><tr><td>Evans blauw (10&nbsp;mg&nbsp;mL&minus;1 in PBS of zoutoplossing)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46160</td><td></td></tr><tr><td>Ultragezuiverde water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Uitrusting</td></tr><tr><td>Insulinespuit met naald</td><td>BD</td><td>328838</td><td></td></tr><tr><td>Overdrachtpijpjes</td><td>Biologix Research Company</td><td>30-0135</td><td></td></tr><tr><td>3 M papier maskertape</td><td>3M</td><td>2214</td><td></td></tr><tr><td>Deckglaser microscoopdekglas (22 mm &times; 32 mm)</td><td>Paul Marienfeld</td><td>101112</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen splintertang</td><td>Aesculap, B. Braun Melsungen</td><td>BD312R</td><td></td></tr><tr><td>Veet haartverwijderingscrème</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medische katoenen applicators</td><td>Puritan Medical Products Company</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>C-fold handdoeken</td><td>Kimberly-Clark</td><td>20311</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes delicate task wipes</td><td>Kimtech Science</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Verguld, N42-grade neodymium magneten, 12 mm in diameter en 2 mm dik&nbsp;</td><td>first4magnets</td><td>F656S</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof geleider, 10 cm bij 1,5 cm (polyvinylchloride materiaal)</td><td></td><td></td><td>vouw in de lengte doormidden, bind met maskertape en plaats magneet in</td></tr><tr><td>Hoge vacuümvet</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microscoop</td></tr><tr><td>TriM Scope II enkelstraals twee-foton microscoop</td><td>LaVision BioTec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aanpasbare (680&ndash;1.080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:saffierlaser (&ge;3,3 W bij 800 nm; pulslengte van 140 fs, 80 MHz herhalingsfrequentie)</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterdompelobjectieven (20&times;, NA = 1,0)</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN20xW</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microscoop filter- en spiegelsets (voor beeldvorming van GFP, SHG, Evans Blauw)</td></tr><tr><td>495 long-pass</td><td>Chroma</td><td>T495LPXR</td><td></td></tr><tr><td>560 long-pass</td><td>Chroma</td><td>T560LPXR</td><td></td></tr><tr><td>475/42 band-pass</td><td>Semrock</td><td>FF01-475/42-25</td><td></td></tr><tr><td>525/50 band-pass</td><td>Chroma</td><td>ET525/50m</td><td></td></tr><tr><td>655/40 band-pass</td><td>Chroma</td><td>NC028647</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Huid-beeldvormingsplatform (zie diagram voor samenstelling)</td></tr><tr><td>Een metalen basisplaat (126 mm &times; 126 mm &times; 1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Een koperen platform voor het oor (79 mm &times; 19 mm; 1 mm dikte aan de zijkant, 0,5 mm dikte in het midden; Figuur 1) met spleet (1,7 mm &times; 1 mm; 1,5 mm van de lange kant)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Twee plastic blokken (10 mm hoog)&mdash;voor warmte-isolatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gebogen houder, voor het positioneren van de controle-thermistor op het oorplatform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interface kabel CC-28 met DIN-connector en thermistors, één voor de temperatuurregeling en de andere voor de temperatuurmonitor</td><td>(Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>640106</td><td>sluit de interfacekabel aan op beide weerstandsverwarmingsblokken ingesteld op 35 &deg;C</td></tr><tr><td>Weerstandsverwarmingsblokken RH-2</td><td>(Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>640274</td><td>Weerstandsverwarmingsblokken kunnen het koperen oorplatform in minuten op meer dan 100 &deg;C verwarmen. Zorg ervoor dat de controle-thermistor goed is bevestigd in de houder om oververhitting te voorkomen.</td></tr><tr><td>Temperatuurregelaar TC-344B voor het oorplatform</td><td>(Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>640101</td><td></td></tr><tr><td>Temperatuurregelaar TR-200 voor muisverwarmingsmat</td><td>Fine Science Tools</td><td>21052-00</td><td>Eenheid wordt niet langer verkocht. Vraag de fabrikant om alternatieven</td></tr><tr><td>Voeding voor TR-200</td><td>Fine Science Tools</td><td>21051-00</td><td>Eenheid wordt niet langer verkocht. Vraag de fabrikant om alternatieven</td></tr><tr><td>Verwarmingsmat</td><td>Fine Science Tools</td><td>21060-00</td><td>Eenheid wordt niet langer verkocht. Vraag de fabrikant om alternatieven.&nbsp;</td></tr><tr><td>Rectale sonde voor dieren&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>21060-01</td><td>Eenheid wordt niet langer verkocht. Vraag de fabrikant om alternatieven. Nadat de rectale sonde en verwarmingsmat op de temperatuurregelaar TR-200 zijn aangesloten, stelt u de temperatuur in op 37 &deg;C</td></tr><tr><td colspan="4">Dekglashouder</td></tr><tr><td>2 plastic staven, 1 cm in diameter, 10 cm lang</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 plastic adapter met gaten geboord om staven te bergen (zie diagram)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 plastic aanhaalschroeven om de plastic staven op hun plaats te houden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 metalen plaat, 6 cm x 2,5 cm, met een 2 cm vierkant ges

induceren van ischemie-reperfusie schade in de mouse ear skin voor intravitale multiphoton imaging van immuunresponsen

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Ischemische-reperfusieletsel (IRI) treedt op wanneer er sprake is van tijdelijke hypoxie als gevolg van obstructie van de bloedstroom (ischemie) gevolgd door een daaropvolgende heroxygenatie van de weefsels (reperfusie). In de huid is ischemie-reperfusie (IR) de belangrijkste bijdragende factor aan de pathofysiologie van drukzweren. Hoewel de cascade van gebeurtenissen die leiden tot de ontstekingsreactie goed is bestudeerd, zijn de ruimtelijke en temporele reacties van de verschillende subsets van immuuncellen op een IR-letsel niet goed begrepen. Bestaande modellen van IR met behulp van de klemmingstechniek op de huidflank zijn zeer invasief en ongeschikt voor het bestuderen van immuunreacties op letsels, terwijl soortgelijke niet-invasieve magneetklemmingstudies in de huidflank minder dan ideaal zijn voor intravitale beeldvormingsstudies. In dit protocol beschrijven we een robuust model van niet-invasieve IR ontwikkeld op de muizenoorhuid, waarbij we in real-time de cellulaire respons van immuuncellen na reperfusion willen visualiseren via multifoton intravitale beeldvorming (MP-IVM).

Dit protocol maakt gebruik van een op maat gemaakte oorhuid imaging platform, zie figuur 1. Verschillende functies van dit platform zijn specifiek ontworpen om beeldvorming te vergemakkelijken, terwijl fysiologische instellingen behoud. Het plaatsen van het oor op de verwarmde koperen platform niet oefent slechts het oor bij een fysiologische temperatuur van 35 ° C, maar isoleert het oor van onvermijdelijke bewegingen als gevolg van ademhaling. De toevoeging van een meta...

Dit protocol beschrijft de inductie van een ischemie-reperfusie (IR) model op de muis oor huid met behulp van magneet klemmen. Met behulp van een custom-built intravitale imaging model, bestuderen we in vivo ontstekingsreacties post-reperfusie. De reden voor de ontwikkeling van deze techniek is om te begrijpen hoe leukocyten reageren op huid IR schade verlengen.

Induceren van ischemie-reperfusie schade in de Mouse Ear Skin voor intravitale Multiphoton Imaging van immuunresponsen

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Het hoofddoel van dit experiment is om te begrijpen hoe immuuncellen reageren op ischemie-reperfusie door middel van intravitale multifoton-imaging van de muisoorhuid. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van enkele zeer belangrijke vragen binnen het vakgebied van de immunologie en dermatologie om het dynamische gedrag van immuuncellen te begrijpen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een robuust imagingmodel biedt voor het bestuderen van cellulaire activiteiten in de huid in een ontstoken of rustende toestand.Hoewel deze methode inzicht kan geven in ischemische reperfusieschade, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals overgevoeligheidsreacties en infecties. Plaats de muis aan het begin van deze procedure op een warmtemat om de lichaamstemperatuur gedurende de voorbereidingsprocedure op 37 °C te houden. Bevestig de diepte van de anesthesie door de afwezigheid van de tenenknijpreflex.Breng vervolgens een oogheulmiddel aan op de ogen van het dier om uitdroging tijdens de anesthesie te voorkomen. Breng daarna voorzichtig ontharingscrème aan op de bovenste twee derde van de dorsale zijde van het oor en wacht twee tot drie minuten. Verwijder d

inducing-ischemia-reperfusion-injury-mouse-ear-skin-for-intravital

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video demonstrates the intravital fluorescence microscopy technique to study thrombus formation in a mouse model. The mouse is injected with a fluorophore-labeled polysaccharide to monitor blood circulation. Upon illumination with a high-intensity light, the phototoxic induction of an injury in the microvasculature of the ear leads to the formation of a thrombus, which is confirmed by visualizing the obstruction in the blood flow.

Intravital Fluorescence Microscopy to Study Microvascular Thrombus Formation

De extracellulaire matrix ondergaat ingrijpende verbouwing tijdens de wondgenezing, ontsteking en het ontstaan ​​van tumoren. Wij presenteren een nieuwe intravitale immunofluorescentie microscopie benadering van de dynamiek van fibrillaire en mesh-achtige matrix componenten met hoge ruimtelijke en temporele resolutie met behulp van epifluorescentie of twee-foton microscopie visualiseren.

Langdurige Intravitale Immuunfluorescentie beeldvorming van Tissue Matrix Bestanddelen met Epifluorescentie en twee-foton microscopie

De mechanismen die de interstitiële beweeglijkheid van CD4-effector-T-cellen regelen op plaatsen van ontsteking zijn relatief onbekend. Wij presenteren een niet-invasieve benadering visualiseren en manipuleren in vitro geprimed CD4 T-cellen in het ontstoken oor dermis, waardoor studie van het dynamisch gedrag van deze cellen in situ.

Beeldvorming CD4 T Cell interstitiële Migratie in de ontstoken Dermis

Dit huidige protocol maakt gebruik van fluorescente reporters, in vivo labeling en intravitale beeldvormingstechnieken om het dynamische proces van neutrofiel priming in levende dieren te kunnen monitoren.

Intravitale Imaging van neutrofielen Priming gebruik van IL-1β-Promoter gedreven DsRed Reporter Muizen

Het oor model van de kale SKH1-Hr uur muis maakt intravitale fluorescentiemicroscopie microcirculatie en fototoxische trombus inductie zonder voorafgaande chirurgische preparaten in de onderzochte microvasculaire bed. Daarom is het oor van de haarloze muis is een uitstekend in vivo model voor de complexe interacties te bestuderen tijdens microvasculaire trombusvorming, trombus evolutie, en trombolyse.

Opklaren en Trombus inductie in de oorlel van een Hairless Mouse

We een nieuwe chirurgische protocol voor twee-foton beeldvorming van levende muizen lever met minimale invasie opgericht. Met deze techniek vastgesteld we de gedetailleerde structuur van de lever tijdens lipopolysaccharide-geïnduceerde endotoxemia. Wij verwachten dat deze methode kan worden gebruikt om te bepalen van de effectiviteit van verschillende behandeling van de reagentia te hepatische migratie.

Twee-foton Intravital Imaging van leukocyten tijdens de immuunrespons bij Lipopolysaccharide-behandelde muis lever

In vivo beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor de studie van biologie in gezondheid en ziekte. Dit protocol beschrijft transpupillaire beeldvorming van het netvlies van de muis met een standaard microscoop met twee fotonen. Het demonstreert ook verschillende in vivoimaging-methoden om fluorescerend meerdere cellulaire cohorten van het netvlies te labelen.

Transpupillaire twee-fotonen in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis

De rekrutering van leukocyten en bloedplaatjes vormt een essentieel onderdeel dat nodig is voor de effectieve groei van collaterale slagaders tijdens arteriogenese. Multifotonenmicroscopie is een efficiënt hulpmiddel voor het volgen van celdynamica met een hoge spatio-temporele resolutie in vivo en minder fototoxiciteit om leukocytenrekrutering en extravasatie tijdens arteriogenese te bestuderen.

Multifoton intravitale beeldvorming voor het monitoren van leukocytenrekrutering tijdens arteriogenese in een Murine Hindlimb-model

De migratie van neutrofielen is gebaseerd op de snelle en continue hermodellering van het plasmamembraan als reactie op chemoattractant en zijn interacties met de extracellulaire micro-omgeving. Hierin wordt een procedure beschreven op basis van intravitale subcellulaire microscopie om de dynamiek van membraanremodellering te onderzoeken bij neutrofielen die in het oor van verdoofde muizen worden geïnjecteerd.

Beeldvorming van neutrofielenmigratie in de huid van muizen om subcellulaire membraanremodellering onder fysiologische omstandigheden te onderzoeken

Het protocol presenteert een nieuw hulpmiddel om intravitale beeldvorming te vereenvoudigen met behulp van omgekeerde confocale microscopie.

Gestroomlijnde intravitale beeldvormingsbenadering voor langetermijnmonitoring van de dynamiek van epitheelweefsel op een omgekeerde confocale microscoop

Deze studie presenteert een in vivo twee-foton beeldvormingsbenadering om de structuren van laag-drempel mechanoreceptor (LTMR) axonterminalen in de voorpoothuid van muizen te visualiseren. Met behulp van herhaalde, hoogresolutiebeeldvorming van individuele axonen biedt deze methode een nieuw platform voor het bestuderen van de structuur en functie van het cutane sensorische circuit tijdens de ontwikkeling en bij volwassenen.

Intravitale tweefotonbeeldvorming van aanrakingssensorische axonmorfologie in muizenhuid

Leer hoe je een ischemie-reperfusiemodel induceert op muizenoorhuid met magneetklemmen voor intravitale multiphotonbeeldvorming. Deze techniek maakt real-time observatie van immuunresponsen mogelijk.

Induceren van ischemie-reperfusie schade in de Mouse Ear Skin voor intravitale Multiphoton Imaging van immuunresponsen

Meer video's verkennen