Engineering Kunstmatige Factoren om specifiek manipuleren alternatieve splitsing in menselijke cellen

Het algemene doel van dit protocol is om kunstmatige splicing-factoren te ontwikkelen die specifiek alternatieve splicing van een bepaald doelwit kunnen manipuleren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van RNA-verwerking te beantwoorden, zoals de regulatie en de misregulatie van alternatieve splicing in kankercellen. Het grote voordeel van deze techniek is de flexibiliteit.

We kunnen kunstmatige factoren ontwerpen die ofwel verschillende typen alternatieve splicing in willekeurige genen bevorderen ofwel remmen. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Huan-Huan, een onderzoeksmedewerker van mijn laboratorium, en Qianyun, een postdoc in mijn laboratorium. Wild-type PUF DNA wordt gebruikt als sjabloon voor het genereren van de aangepaste PUF domein scaffold.

Gebruik PCR-primers die PUF-sequenties bevatten die specifiek verschillende RNA-nucleotiden in elke positie herkennen. Gebruik voor elke PUF-herhaling vier verschillende primers om een andere base op elke positie te herkennen. In de eerste PCR-ronde, gebruik de getoonde primerparen om coderende sequenties voor vier PUF-herhalingen, universele brugfragmenten en cap-fragmenten te genereren.

In de tweede ronde, gebruik de PCR-producten die in de laatste stap zijn gegenereerd als sjablonen met de getoonde primercombinaties om coderende sequenties voor RNA-herkenningscodes R-een tot R-vier, en R-vijf tot R-acht te genereren. In de derde ronde, gebruik de producten uit de tweede ronde en brug vier tot vijf als sjablonen met de R-een voorwaartse primer en R-acht achterwaartse primer om coderende sequenties voor R-een tot R-acht zonder cappen te genereren. In de vierde PCR-ronde, gebruik R-een tot R-acht, vijf-primair einde cap en drie-primair einde cap als sjablonen om coderende sequenties voor complete PUF-domeinen te genereren.

Om de transfectie van HEK-293T-cellen te beginnen, meng de liposomale transfectiereagens voorzichtig door de flesschen om te keren. Verdun vervolgens twee microliter liposomale transfectiereagens in 50 microliter gereduceerd serummedium per transfectie. Meng voorzichtig en incubeer vervolgens vijf minuten bij kamertemperatuur.

Verdun vervolgens 0,4 microgram glycinerijk domeinexpressievector en 0,2 microgram van de modulaire splicing-reporterplasmide in 50 microliter gereduceerd serummedium in een steriele buis. Verdun vervolgens 0,4 microgram RS-effectordomeinexpressievector en 0,2 microgram PGZ-drie reporterplasmide in 50 microliter gereduceerd serummedium. Ten slotte, verdun 0,4 microgram PGL-RS-PUF expressievector en 0,2 microgram PEZ-1B of PEZ-2F reporterplasmiden in 50 microliter gereduceerd serummedium in een steriele buis.

Na vijf minuten incubatie bij kamertemperatuur, meng voorzichtig de verdunde liposomale transfectiereagens met de verdunde plasmidemixturen. Incubeer de uiteindelijke mixturen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens de transfectiemixturen met de expressievectoren toe aan elke put van een 24-puts plaat gezaaid met HEK-293 cellen en incubeer gedurende minimaal 12 uur in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Na 12 uur incubatie, verzamel de getransfecteerde cellen door trypsinisatie en centrifugatie. Na centrifugatie, gooi het medium weg en voeg 0,5 milliliter RNA-extractiebuffer per buis toe. Voeg 0,1 milliliter chloroform per 0,5 milliliter RNA-extractiebuffer toe aan elke steekproef.

Na de incubatie, centrifugeer de buizen gedurende 15 minuten bij 12.000 keer G en vier graden Celsius. Breng vervolgens de waterige basis over naar een verse buis. Voeg 0,25 milliliter isopropanol per 0,5 milliliter RNA-extractiebuffer toe die in de initiële homogenisatie is gebruikt.

Meng door te vortexen en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na een centrifugatie zoals eerder, is het RNA-precipitaat meestal zichtbaar op de bodem van de buis. Gooi de supernatant weg en was het RNA-pellet met 0,5 milliliter 75%ethanol per 0,5 milliliter RNA-extractiebuffer.

Vortex krachtig en centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten bij 7.500 keer G en vier graden Celsius. Na het centrifugeren, verwijder de supernatant en laat de RNA-pellets aan de lucht drogen. Los de RNA's op in 50 microliter RNase-vrij water.

Voeg vervolgens twee microliter van vijf eenheden per microliter DNase-een, zeven microliter van 10X buffer en 11 microliter water toe aan elke 50-microliter RNA-oplossing. Na de incubatie, verwarm de oplossingen gedurende 15 minuten tot 70 graden Celsius om de DNase te inactiveren. Na het uitvoeren van een reverse transcriptasereactie om cDNA uit elke steekproef te synthetiseren, voeg de componenten van de op het scherm aangegeven PCR-reactie toe in de volgorde aangegeven op het scherm aan PCR-buizen.

Bereid één reactie per steekproef voor. Voer het RT-PCR-programma uit op de thermische cycler. Los tenslotte de PCR-producten op door middel van elektroforese door een 10% polyacrylamidegel met TBE-buffer.

Gebruik een fluorescentiescanner om de producten te visualiseren en meet de hoeveelheid van elk gespleten isovorm met behulp van densitometriesoftware. Voor de immunofluorescentietest om apoptose te meten, bereid een transfectiemix voor die glycinerijk domeinexpressieplasmiden bevat zoals eerder getoond, en transfecteer HeLa-cellen gekweekt op met polylysine beklede glazen dekseltjes in een zes-puts plaat. 24 uur na transfectie, fixeer de cellen op de dekseltjes met één milliliter van 4% paraformaldehyde in 1x PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.

Was vervolgens de cellen op de dekseltjes voorzichtig met twee milliliter van 1x PBS gedurende vijf minuten. Permeabiliseer vervolgens de cellen met 0,2% Triton X-100 in 1x PBS gedurende 10 minuten. Na het wassen drie keer met 1x PBS zoals eerder, blokkeer niet-specifieke binding met 3% runder serum albumine in 1x PBS gedurende 10 minuten.

Verdun het flag antilichaam één op 1.000 in 3%BSA in PBS en pipetteer 30 microliter van het verdunde flag antilichaam op een parafilmblad. Gebruik een pincet om een