Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren In Vitro

Het algemene doel van deze techniek is om lipid-proximale eiwit-eiwitinteracties in vitro vast te leggen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen in het veld van mitochondriale dynamica, zoals hoe eiwit-eiwitinteracties aan het mitochondriale buitenmembraan kunnen worden beïnvloed door accessoire lipiden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het vastmaken van oplosbare eiwitdomeinen aan lipidesjablonen ervoor zorgt dat een meer natuurlijke bevestiging kan worden bereikt.

Bovendien kunnen complexe interacties tussen oplosbare eiwitten en hun vastgemaakte partners worden beoordeeld in aanwezigheid van gedefinieerde lipide cofactoren. Hoewel we deze methode gebruiken om eiwitinteracties in de mitochondriale splitsingsmachinerie te onderzoeken, kan deze ook worden toegepast op andere eiwitcomplexen die zich lokaliseren in diverse membraancompartimenten. Het demonstreren van deze procedure zal Ryan zijn, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium.

Combineer eerst chloroformoplossingen van de gewenste lipiden in een schone glazen testbuis. Verdun het oplosmiddel met droge stikstofgas terwijl je de buis draait om een dunne lipidefilm te vormen. Verwijder vervolgens het resterende oplosmiddel met de centrifugale evaporator gedurende één uur bij 37 graden Celsius.

Voeg hierna voorverwarmd buffer A toe om een ​​uiteindelijke lipideconcentratie van één tot twee millimolair te geven. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius met incidenteel vortexen om het lipidemengsel volledig te hersuspenderen. Na incubatie, breng de lipidemengsel over naar een plastic testbuis en plaats de buis in vloeibare stikstof gedurende ongeveer 30 seconden tot het volledig bevroren is.

Plaats vervolgens de buis in een 37 graden Celsius waterbad gedurende één tot twee minuten tot het volledig is ontdooid. Bereid vervolgens een lipide-extruder voor door vier filterondersteuningen en een polycarbonaatfilter in buffer A te weken en de extruder te monteren volgens de instructies van de fabrikant. Extrudeer de lipideoplossing 21 keer door de filter met zachte constante druk om een homogene grootteverdeling te garanderen.

Gedurende het extruderen, gebruik langzame constante druk om homogeniteit van de liposomengrootte te waarborgen. Met een filter van één micrometer is dit minder belangrijk. Maar met kleinere filtermaten kan meer schijnbare heterogeniteit worden geïntroduceerd.

Bewaar de geëxtrudeerde liposomen bij vier graden Celsius. Incubeer His-getagde mitochondriale splitsingsfactor of Mff met scaffold liposomen gedurende ten minste 15 minuten bij kamertemperatuur in buffer A en BME. Voor een Mff-vrije controle, incubeer de liposomen met een His-getagd controle-eiwit, zoals GFP, om blootgestelde Nickel-NTA te binden en af te schermen.

Voeg dynamin-gerelateerd eiwit een of Drp1 toe aan het liposomenmengsel en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Breng vervolgens vijf microliters van het monster over op een vel laboratoriumfilm en leg een koolstof-gecoat koper-rhodium rooster op het monster. Na incubatie gedurende één minuut, verwijder het overtollige vocht met filterpapier en voeg een druppel van 2% uraanacetaat toe.

Na incubatie gedurende nog een minuut, verwijder het overtollige kleurmiddel met filterpapier, en breng het monster over naar een roosterkast. Op de volgende dag, beeld de monsters af met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop bij een vergroting van 18.500 tot 30.000X om ultrastructurele veranderingen in eiwit- en liposomenmorfologieën waar te nemen. Incubeer His-getagde Mff en Fis1 met de scaffold liposomen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in buffer A en BME.

Voeg Drp1 toe en incubeer elke mengsel gedurende een extra 15 minuten bij kamertemperatuur. Breng de buizen over naar de thermocycler ingesteld op 37 graden Celsius en start de reacties door GTP en magnesiumchloride toe te voegen. Op de gewenste tijdstippen, breng 20 microliters van elk reactiemengsel over naar putjes van een microtiterplaat met vijf microliters van 0,5 molair EDTA om het magnesium te chelaten en de reactie te stoppen.

Bereid vervolgens een set fosfaatstandaarden door kaliumfosfaat in buffer A en BME te verdunnen om de resultaten te kalibreren. Voeg 20 microliters van elke standaard toe aan de putjes met vijf microliters van 0,5 molair EDTA. Voeg 150 microliters malachietgroenreagens toe aan elk putje.

Lees tenslotte de OD 650 vijf minuten na elke toevoeging. GTP zal langzaam hydrolyseren in aanwezigheid van het zure malachietgroenreagens. Dit reagens moet dus binnen 10 minuten na het meten van de absorptie aan alle monsterputjes worden toegevoegd om het signaal-ruis-verhouding te maximaliseren.

In afwezigheid van Drp1, resulteerde noch Mff noch GFP in membraandeformatie. En alleen liposomen zonder kenmerken werden waargenomen voor GFP-gedecoreerde verrijkte scaffold liposomen of ESL. Echter, wanneer Drp1 werd toegevoegd aan Mff-gedecoreerde ESL-sjablonen, was remodellering van de liposomen duidelijk zichtbaar.

Decoratie van de SL met Mff verhoogde de GTPase-activiteit. Omgekeerd, toen de blootgestelde NTA-kopgroepen werden geblokkeerd met His-getagd GFP, werd deze verhoogde GTPase-activiteit afgebroken. Het vastmaken van Fis1 zonder zijn transmembraandomein aan de SL, faalde ook om een stimulatie van Drp1's GTPase-activiteit teweeg te brengen.

Vergelijkbaar met de SL, resulteerde toevoeging van SL/Cl aan Drp1 in een lichte stimulatie van GTPase-activiteit die werd omgekeerd door het vastmaken van His-getagd Fis1 of GFP aan de liposomen. Er werd een synergie waargenomen tussen Mff en cardiolipine, aangezien de GTPase-activiteit van Drp1 2,6-voudig werd gestimuleerd toen het werd geïncubeerd met Mff-gedecoreerd SL/CL. Toen SL/PE/CL-sjablonen werden gedecoreerd met Mff, werd de activiteit van Drp1 verhoogd.

Het vermogen van Drp1 om liposomen om te vormen tot lipidebuizen werd verhoogd door de toevoeging van PE aan de scaffold liposomen. Eenmaal beheerst, kunnen deze