Name: Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Leer hoe je lipide-proximale eiwit-eiwit interacties in vitro reconstitueert met steigerliposomen. Deze methode onderzoekt hoe accessoire lipiden interacties aan het mitochondriale buitenmembraan beïnvloeden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen de financiering die ze hebben ontvangen van de American Heart Association (SDG12SDG9130039) graag erkennen.

1. Steiger liposoompreparaat OPMERKING: Idealiter eerste experimenten een relatief eenvoudige en eentonige steiger (bestaande uit DOPC (1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfocholine of PC) en DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-dioleoyl gebruiken - sn-glycero-3 - [(N - (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiazijnzuur) succinyl]. (nikkelzout)) Het is gebaseerd op deze proeven lipide lading, flexibiliteit en kromming kan worden ingebracht als individuele factoren met de mogelijkheid om membraan-proximale interacties veranderen. Deze veranderingen kunnen verwezenlijkt worden met gedefinieerde hoeveelheden van specifieke lipide componenten, zoals fosfatidylserine of cardiolipine (CL), fosfatidylethanolamine (DOPE of PE) of galactosyl (β) ceramide. <ol><li> Combineer lipiden opgelost in chloroform in een schone glazen reageerbuis. Damp het oplosmiddel met droog stikstofgas tijdens draaiing van de buis een dunne lipide film te vormen. Resten oplosmiddel met een Centrifugalel verdamper gedurende 1 uur bij 37 ° C. OPMERKING: Diverse liposoomformuleringen gebruikt in de protocollen hieronder beschreven steiger liposomen (3,3 mol% DGS-NTA (Ni2 +) / 96,7 mol% DOPC), scaffold liposomen met cardiolipine (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% cardiolipine / 86,7 mol% DOPC), flexibele steiger liposomen met cardiolipine (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2 +) / 10 mol% cardiolipine / 35 mol% DOPE / 51,7 mol% DOPC), en verrijkte steiger liposomen (10 mol% DGS-NTA (Ni 2 +) / 15 mol% cardiolipine / 35 mol% DOPE / 40 mol% DOPC). </li><li> Voeg Buffer A (25 mM HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur), 150 mM KCl, pH ingesteld op 7,5 met KOH) voorverwarmd tot 37 ° C zodanig dat de uiteindelijke lipide concentratie 1-2 mM. Incubeer 30 min bij 37 ° C met af en toe wervelen volledig resuspendeer de lipidemengsel (figuur 1a). </li><li> Transfer naar een plastic reageerbuis, plaats de buis in vloeibare stikstof tot het volledig bevroren (rougHLY 30 s), en plaats in een 37 ° C waterbad tot ze volledig ontdooid (ongeveer 1-2 min). Herhalen voor een totaal van 4 vries-dooi cycli (Figuur 1b). </li><li> Bereid een lipide extruder door het weken 4 filterhouders en een polycarbonaat filter in buffer en monteren van de extruder volgens de instructies van de fabrikant. Extrusie van de lipide-oplossing door het filter 21 keer. Gebruik zachte, constante druk om te zorgen voor een homogene grootteverdeling (figuur 1c). LET OP: Voor alle experimenten beschreven in dit protocol, werd een 1,0 urn polycarbonaat filter gebruikt voor de extrusie. Drp1 wisselwerking met anionogene lipiden kunnen worden waargenomen met verschillende liposoom diameter van 50 nm tot 400 nm 12 of 13 groter. Vandaar dat de filter grootte van 1 urn gekozen ideaal voor zowel GTPase activiteit voor elektronenmicroscopie worden. Als er andere liposoom diameters gewenst zijn, de voorbereiding van reusachtige unilamellaire blaasjes 14,15 (GUVs) of kleine unilamellar 16 blaasjes (SUV&#39;s) kunnen worden gebruikt. Dynamische lichtverstrooiing kan worden gebruikt om liposoomgrootte heterogeniteit 13 beoordelen. </li><li> Bewaar geëxtrudeerde liposomen bij 4 ° C en gooi deze na 3-5 d. </li></ol> 2. Gebruik van Steiger liposomen voor eiwitbinding Analyse <ol><li> monstervoorbereiding <ol><li> Incubate His-tag MffΔTM (5 uM finale) met steiger liposomen (40 mol% PC / 35 mol% PE / 15 mol% CL / 10 mol% DGS-NTA (Ni 2+); 50 pm final) gedurende ten minste 15 min bij kamertemperatuur in Buffer A + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCI, 10 mM β-mercaptoethanol (BME), pH ingesteld op 7,5 met KOH). Voor een MFK gratis controle, incubeer liposomen met een his-gelabelde controle-eiwit (zoals GFP) te binden en schild blootgesteld NTA (Ni 2+). OPMERKING: MffΔTM werd tot expressie gebracht en gezuiverd zoals beschreven in een eerdere studie 2. GFP werd gezuiverd op gelijkaardige wijze, maar de ionuitwisseling werd weggelaten. BME nodig was voor deze Experiments omdat Drp1 gevoelig is voor oxidatie, welke de activiteit en assemblage eigenschappen kunnen veranderen. </li><li> Voeg Drp1 (2 pM eind) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. OPMERKING: Drp1 werd tot expressie gebracht en gezuiverd zoals beschreven in een eerdere studie 2. Na incubatie met Drp1, kan het effect van nucleotide bindend membraan vervorming onderzocht door incubatie van een extra uur met 2 mM MgCl2 en ofwel 1 mM GTP, 1 mM GMP-PCP of Buffer A + BME. </li></ol></li><li> Negative Stain Transmission Electron Microscopy (EM) Analyse <ol><li> Overdracht 5 pi van monster tot een vel laboratorium film, en leggen een koolstof beklede Cu / Rh raster op het monster. Incubeer het rooster 1 min op het monster, vlek weg overtollige vloeistof op filtreerpapier, en over te dragen aan een daling van 2% uranylacetaat. Incubeer 1 min, dep overtollige vlek op filterpapier, en over te dragen aan een raster doos. Opslag onder vacuüm O / N volledige uitdroging te waarborgen. </li><li> Afbeelding monsters met behulp van een transmissie elektronen Microscope op 18.500 - 30,000X vergroting ultrastructurele veranderingen in eiwitten en liposoom morfologie 17 in acht nemen. Opmerking: Ultrastructurele veranderingen kunnen worden gekwantificeerd met behulp van beeldanalyse software zoals ImageJ 13 (http://imagej.nih.gov/ij/). Eiwit decoratie kan worden gemeten in vergelijking met naakte lipide templates. Bovendien kunnen de diameters van buisvormige segmenten worden gemeten van het buitenste deel van de samenstellen 13. Een meer gedetailleerde analyse kan worden uitgevoerd met cryo-elektronenmicroscopie 17. Deze methode kan worden gebruikt voor het natieve eiwit-lipide samenstellingen in oplosmiddel zonder het gebruik van zware metalen vlekken die jas het monster. Zo gedetailleerde structurele kenmerken niet zichtbaar in negatieve vlek, met inbegrip van het onderliggende lipide morfologie, kunnen worden onderzocht en gekwantificeerd. </li></ol></li></ol> 3. Gebruik van Steiger liposomen voor enzymatische test Opmerking: Een colorimetrische GTPase-test 18 werd gebruikt om fosfaat bevrijding via GTP hydrolyse te meten. Alternatieve GTPase testen beschikbaar 19 en kan worden geïmplementeerd als nodig. <ol><li> Incubeer His-tag MffΔTM (MFF), Fis1ΔTM (Fis1) of GFP (5 uM finale voor alle) schavot liposomen (150 pM uiteindelijke) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in Buffer A + BME (volume = 30 ul). Voeg Drp1 (500 nM eind) en incubeer nog eens 15 minuten bij kamertemperatuur (volume = 80 ul). OPMERKING: Fis1 werd gezuiverd op gelijkaardige wijze als MFF 2, maar de ionenuitwisselingschromatografie werd weggelaten. Het doel van de His-gelabeld GFP is om de NTA (Ni 2+) kopgroepen beschermen en te voorkomen dat niet-specifieke lading interacties met andere eiwitten. Als er geen effect wordt waargenomen in de afwezigheid van GFP, dan is dit besturingselement niet vereist. Alternatieve blokkerende eiwitten (of vergelijkbare grootte aan het eiwit van belang) kan eveneens worden gebruikt, maar GFP maakt directe visualisatie van de interacties met scafvoudige liposomen. </li><li> Overdrachtsbuizen een thermocycler ingesteld op 37 ° C, en initiëren reacties door toevoeging van GTP en MgCl2 (1 mM en 2 mM finale respectievelijk volume = 120 ul). </li><li> Op gewenste tijdstippen (bijvoorbeeld T = 5, 10, 20, 40, 60 min) en breng 20 pl reactie op putjes van een microtiterplaat met 5 ul van 0,5 M EDTA chelaat Mg2 + en stop de reactie. </li><li> Bereid een reeks van fosfaat normen door verdunning van KH 2 PO 4 in Buffer A + BME om resultaten te kalibreren. Een handige set van normen is 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 en 0 uM. Voeg 20 ul van elk putjes die 5 pl 0,5 M EDTA. </li><li> Voeg 150 ul malachietgroen reagens (1 mM malachietgroen carbinol, 10 mM ammoniummolybdaat tetrahydraat en 1 N HCl) aan elk putje en lees OD 650 5 min na toevoeging. OPMERKING: GTP zuur labiel en hydrolyseert in aanwezigheid van malachietgroen reagens. Zorg ervoor dat thij de tijd tussen het toevoegen van malachiet reagens en het lezen is constant om ervoor te zorgen reproduceerbare resultaten. </li><li> Genereer een standaard kromme door het uitzetten OD 650 van de standaarden als functie van de fosfaatconcentratie. Lineaire regressie om de relatie tussen OD 650 en fosfaatconcentratie in een monster te bepalen. </li><li> Met de lineaire regressie, zet de OD 650 van de proteïne reactie monsters uM fosfaat. Bepaal de snelheid fosfaat genereren voor elk reactiemengsel getrokken waarbij fosfaatconcentratie als functie van de tijd, en zet aan kat k wordt door het percentage van de Drp1 concentratie (0,5 uM). OPMERKING: alleen de aanvankelijke lineaire snelheid worden gebruikt om het percentage fosfaat productie bepalen, en ten minste 3 gegevenspunten worden gebruikt. Indien de reactiesnelheid voldoende snel dat de eerste drie gegevenspunten zijn lineair (dwz r 2 van de lineaire fit is dan 0,9) een tekenificantly kortere tijdsverloop met minimaal 3 tijdstippen moeten worden uitgevoerd. </li></ol>

<ol><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-related+Protein+1+Oligomerization+in+Solution+Impairs+Functional+Interactions+with+Membrane-anchored+Mitochondrial+Fission+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor.</a> J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).</li>
<li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Fusion+and+Fission+in+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals.</a> Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).</li>
<li>Bui, H. T., Shaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+Assembly+Strategies+and+Adaptor+Proteins+in+Mitochondrial+Fission%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission.</a> Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).</li>
<li>Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+into+the+understanding+of+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+%28BBA%29+-+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances into the understanding of mitochondrial fission.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).</li>
<li>Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fis1%2C+Mff%2C+MiD49%2C+and+MiD51+mediate+Drp1+recruitment+in+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission.</a> Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).</li>
<li>Otera, H., Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mff+is+an+essential+factor+for+mitochondrial+recruitment+of+Drp1+during+mitochondrial+fission+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).</li>
<li>Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Novel+Tail-anchored+Membrane+Protein+Mff+Controls+Mitochondrial+and+Peroxisomal+Fission+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells.</a> Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).</li>
<li>Koirala, S., Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchangeable+adaptors+regulate+mitochondrial+dynamin+assembly+for+membrane+scission%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission.</a> Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).</li>
<li>Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dimeric+equilibrium+intermediate+nucleates+Drp1+reassembly+on+mitochondrial+membranes+for+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission.</a> Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).</li>
<li>Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Splice+Variants+of+Dynamin-related+Protein+1+Differentially+Utilize+Mitochondrial+Fission+Factor+as+an+Effector+of+Cooperative+GTPase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity.</a> J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).</li>
<li>Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Interaction+with+Cardiolipin+Triggers+Functional+Activation+of+Dynamin-Related+Protein+1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1.</a> PLoS ONE. 9 (7), (2014).</li>
<li>Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanoenzymatic+Core+of+Dynamin-Related+Protein+1+Comprises+the+Minimal+Machinery+Required+for+Membrane+Constriction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).</li>
<li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+Vesicles%3A+Preparations+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Giant Vesicles: Preparations and Applications.</a> ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).</li>
<li>Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+preparation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid preparation of giant unilamellar vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).</li>
<li>Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use+small+unilamellar+phospholipid+vesicles+by+ultrasonication+with+a+beaker+resonator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator.</a> Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).</li>
<li>Mears, J. A., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+13+Visualization+of+Dynamins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 13 Visualization of Dynamins.</a> Methods Cell Biol. 88, 237-256 (2008).</li>
<li>Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Colorimetric+Assays+for+Dynamin%27s+Basal+and+Stimulated+GTPase+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities.</a> Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).</li>
<li>Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnm1+forms+spirals+that+are+structurally+tailored+to+fit+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria.</a> J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).</li>
<li>Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+oligomerization+and+mitochondrial+remodelling+of+dynamin+1-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein.</a> EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).</li>
<li>James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hFis1%2C+a+Novel+Component+of+the+Mammalian+Mitochondrial+Fission+Machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery.</a> J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).</li>
<li>Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondrial+Protein+hFis1+Regulates+Mitochondrial+Fission+in+Mammalian+Cells+through+an+Interaction+with+the+Dynamin-Like+Protein+DLP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1.</a> Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).</li>
<li>Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+and+independent+roles+of+Drp1+adaptors+Mff+and+MiD49%2F51+in+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission.</a> J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).</li>
<li>Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-Directed+Self-Assembly+Enhances+RTK+Catalytic+Domain+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function.</a> J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).</li>
<li>Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-directed+Assembly+of+Signaling+Proteins%3A+A+Novel+Drug+Screening+and+Research+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool.</a> Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).</li>
<li>Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+a+membrane-bound+murine+MHC+class+I+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).</li>
<li>Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+helix+dimerization%3A+Beyond+the+search+for+sequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).</li>
<li>Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+diffusion+of+membrane-spanning+and+glycosylphosphatidylinositol-+linked+proteins%3A+toward+establishing+rules+governing+the+lateral+mobility+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins.</a> J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).</li>
<li>Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+diffusion+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Lateral diffusion of membrane proteins.</a> J Am Chem Soc. 131 (35), 12650-12656 (2009).</li>
<li>Gambin, Y., Reffay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+the+lateral+mobility+of+transmembrane+peptides+with+hydrophobic+mismatch%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch.</a> J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).</li>
<li>Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanotubes+as+substrates+for+helical+crystallization+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules.</a> Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol biedt een methode voor het onderzoeken van eiwit-eiwit interacties van integrale membraaneiwitten. Met behulp van een liposoom modulaire steiger, onderzoekers zijn geschikt om de activiteit van één of meer eiwitten in een lipide-proximale omgeving. 26 - Eerdere studies hebben een soortgelijke werkwijze voor receptor enzymen van de plasmamembraan 24 aangetoond. We hebben deze methode om lipide co-factoren op te nemen en interacties tussen eiwitten die deel uitmaken van de mec...

Bestuderen membraanproximale eiwit-eiwit interacties is een uitdagende poging door problemen als gevolg indient de natuurlijke omgeving van het integrale membraaneiwitten betrokken 1. Dit komt door de noodzaak detergens oplosbaar en inconsistente oriëntatie van eiwitten in proteoliposomen. Om deze problemen te voorkomen, hebben we een strategie waarbij oplosbare domeinen van integrale membraaneiwitten zijn uitgedrukt His-tag fusie-eiwitten toegepast, en deze oplosbare fragmenten zijn verankerd aan scaffold liposomen via interacties met NTA (Ni2 +) kopgroepen van het lipide oppervlak. Met deze steigers, kunnen lipide-proximale eiwitinteracties worden onderzocht over een traject van lipiden en eiwitten samenstellingen. Wij hebben effectief pasten deze methode het kritische eiwit-eiwit interacties die assemblage van de mitochondriale complex splitsing regelt onderzoeken en onderzoeken lipide interacties die deze pr modulerenocess 2. Tijdens mitochondriale splitsing, een geconserveerd membraan remodeling eiwit, genaamd-Dynamin gerelateerd eiwit 1 (Drp1) 3 wordt aangetrokken naar het oppervlak van de buitenste mitochondriale membraan (OMM) in reactie op cellulaire signalen die energie homeostase, apoptotische signalering, en verscheidene andere reguleren integraal mitochondriale processen. Deze grote cytosolische GTPase wordt aangetrokken naar het oppervlak van mitochondria door interactie met geïntegreerde OMM eiwitten 4-8. De rol van een dergelijk eiwit, Mitochondriale Splitsing Factor (MFF), moeilijk op te helderen als gevolg van een schijnbare zwakke interactie met Drp1 in vitro. Desondanks hebben genetische studies duidelijk aangetoond dat MFK essentieel voor een succesvolle mitochondriale kernsplijting 7,8. De methode in dit manuscript beschreven was in staat om eerdere tekortkomingen te verhelpen door de invoering van gelijktijdige lipide interacties die Drp1-MFF interacties te promoten. Over het algemeen, deze roman assay REVEAgeleid fundamentele interacties begeleiden van assemblage van het mitochondriale kernsplijting complex en voorzien van een nieuwe fase voor de lopende structurele en functionele studies van deze essentiële moleculaire machine. Tot op heden zijn onderzocht interacties tussen Drp1 en MFF bemoeilijkt door de inherente flexibiliteit van MFF 9, de heterogeniteit van Drp1 polymeren 2,10, en de moeilijkheid bij het zuiveren en reconstitutie full-length MFF met intact transmembraandomein 11. We gericht deze uitdagingen met behulp van NTA (Ni 2+) steiger liposomen His-tag MFF reconstrueren ontbreekt haar transmembraandomein (MffΔTM-His 6). Deze strategie is voordelig omdat MffΔTM was zeer oplosbaar toen over-uitgedrukt in E. coli, en deze geïsoleerde eiwit was gemakkelijk gereconstitueerd op steiger liposomen. Wanneer deze gebonden lipiden sjablonen, MFF verondersteld een identieke, naar buiten gerichte oriëntatie op het oppervlak van het membraan.Naast deze voordelen, mitochondrial lipiden, zoals cardiolipine, werden toegevoegd aan MFF vouwen en associatie stabiliseren het membraan 11. Cardiolipine ook interactie met het variabele domein van Drp1 2,12 waarvan de ongeordende gebied kan stabiliseren en assemblage van de splitsing machine te vergemakkelijken. Deze robuuste methode is breed toepasbaar voor toekomstige studies die streven naar het membraan-proximale eiwit interacties te evalueren. Door het gebruik van aanvullende tethering / affiniteit interacties, kan de complexiteit van deze membraan reconstitutie studies worden verbeterd om verder compliceren vinden op het oppervlak van membranen in cellen nabootsen. Tegelijkertijd kunnen lipidesamenstellingen worden gemodificeerd om nauwkeuriger na te bootsen de natuurlijke omgeving van deze macromoleculaire complexen. Kortom, deze werkwijze verschaft een middel om de relatieve bijdragen van eiwitten en lipiden in vormgeving membraan morfologie om tijdens kritieke cellulaire proc onderzochtsen.

<table><tbody><tr><td>Phosphatidylcholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylethanolamine (DOPE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>DGS-NTA(Ni2+)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Heart Cardiolipin (CL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840012</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>268320010</td><td></td></tr><tr><td>Liposome Extruder</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Cu/Rh Negative Stain Grids</td><td>Ted Pella</td><td>79712</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge Tube</td><td>Beckman</td><td>357448</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-1012</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3509</td><td></td></tr><tr><td>Microtiter Plate strips</td><td>Thermo Scientific</td><td>469949</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Acros Organics</td><td>40993-0010</td><td></td></tr><tr><td>Instant Blue Coomassie Dye</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Acros Organics</td><td>223211000</td><td></td></tr><tr><td>4 - 20% SDS-PAGE Gel</td><td>Bio Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Loading Dye</td><td>Bio Rad</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>Malachite Green Carbinol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>229105</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory Film</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Polysciences</td><td>21447</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai T12 100 keV Microscope</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TLA-55 Rotor</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated CentriVap Concentrator</td><td>Labconico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VersaMax Microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gebruik steiger liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren in vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies van integrale membraaneiwitten in vitro worden vaak gecompliceerd door de aanwezigheid van een hydrofoob transmembraandomein. Verdere complicerende deze studies, heropname van wasmiddel-opgeloste membraaneiwitten in liposomen is een stochastisch proces waarbij eiwitten topologie is onmogelijk om af te dwingen. Dit document biedt een alternatieve methode om deze moeilijke techniek die een liposoom gebaseerde scaffold gebruikt. Eiwit oplosbaarheid verbeterd door deletie van het transmembraandomein, en deze aminozuren zijn vervangen door een tethering groep, zoals een His-tag. Deze tuier interageert met een verankerende groep (Ni2 + gecoördineerd door nitrilotriazijnzuur (NTA (Ni2 +)) voor His-gelabelde eiwitten), waarbij een uniforme eiwit topologie dwingt aan het oppervlak van het liposoom. Een voorbeeld wordt gepresenteerd, waarin de interactie tussen-Dynamin gerelateerd eiwit 1 (Drp1) met een integraal membraaneiwit, Mitochondriale Fission Factor (MFK), was investigated met behulp van deze steiger liposoom methode. In dit werk hebben we het vermogen van MFK oplosbare Drp1 efficiënt rekruteren op het oppervlak van liposomen, waarvan de GTPase activiteit gestimuleerd aangetoond. Bovendien Drp1 was in staat om het MFK-versierde lipide-template in de aanwezigheid van specifieke lipiden buisvormig maken. Dit voorbeeld toont de effectiviteit van scaffold liposomen middels structurele en functionele assays en wordt de rol in het reguleren van MFF Drp1 activiteit.

Terwijl de interactie tussen Drp1 en MFF is aangetoond belangrijk mitochondriale splitsing zijn, heeft deze interactie moeilijk te herhalen in vitro. Ons doel was om beter na te bootsen de cellulaire omgeving waarin Drp1 en MFF interactie. Daartoe liposomen die limietconcentraties van NTA (Ni2 +) kopgroepen werden bereid door hydrateren van een vetfilm zoals hierboven beschreven. De lipideoplossing bestaat aanvankelijk van unilamellaire vesicles en multilamellaire van...

Dit artikel beschrijft een methode voor het beoordelen van de interacties en assemblages van integrale membraaneiwitten in vitro met verschillende partnerfactoren in een lipid-proximaal milieu.

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Het algemene doel van deze techniek is om lipid-proximale eiwit-eiwitinteracties in vitro vast te leggen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen in het veld van mitochondriale dynamica, zoals hoe eiwit-eiwitinteracties aan het mitochondriale buitenmembraan kunnen worden beïnvloed door accessoire lipiden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het vastmaken van oplosbare eiwitdomeinen aan lipidesjablonen ervoor zorgt dat een meer natuurlijke bevestiging kan worden bereikt.Bovendien kunnen complexe interacties tussen oplosbare eiwitten en hun vastgemaakte partners worden beoordeeld in aanwezigheid van gedefinieerde lipide cofactoren. Hoewel we deze methode gebruiken om eiwitinteracties in de mitochondriale splitsingsmachinerie te onderzoeken, kan deze ook worden toegepast op andere eiwitcomplexen die zich lokaliseren in diverse membraancompartimenten. Het demonstreren van deze procedure zal Ryan zijn, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium.Combineer eerst chloroformoplossingen van de gewenste lipiden in een schone glazen testbuis. Verdun het oplosmiddel met droge stikstofgas terwijl je de buis draait om een dunne lipidefilm te vormen. Verwijder vervolge

using-scaffold-liposomes-to-reconstitute-lipid-proximal-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Om de interactie van een proteïne test met haar doel lipide gebruikten we MACS en Annexine V-geconjugeerde magnetische kralen en lipide vesicles gesynthetiseerd uit het doel lipiden en Annexine V-bindend fosfatidylserine. Eiwitten gebonden aan de doelgroep lipide zijn co-gezuiverd en geanalyseerd na elutie van de kralen.

Lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): een nieuwe methode om eiwit-lipide Interactie Analyze

Hier presenteren we een protocol om enkele, SNARE-bemiddelde fusie gebeurtenissen tussen liposomen en ondersteund dubbellagen in microfluïdische kanalen met gepolariseerde TIRFM, met 'single molecule gevoeligheid en ~ 15 msec tijdsresolutie te detecteren. Lipide en oplosbare lading afgifte kan gelijktijdig worden gedetecteerd. Liposoom grootte, lipide diffusie, en fusie porie eigenschappen worden gemeten.

SNARE-gemedieerde Fusie van Single proteoliposomen met Tethered Ondersteund dubbellagen in een microfluïdische Flow Cell gecontroleerd door gepolariseerde TIRF Microscopie

Hier presenteren we twee ultrasnelle protocollen voor reconstructie van membraaneiwitten in fusogenic proteoliposomes, en de fusie van dergelijke proteoliposomes met doel lipide bilayers voor wasmiddel-gratis bezorging van deze membraaneiwitten binnen de postfusion dubbelgelaagde. De combinatie van deze benaderingen kan snel en gemakkelijk-gecontroleerde vergadering van complexe multi-component membraan systemen.

Wasmiddel-vrije ultrasnelle reconstitutie van membraaneiwitten in lipide-Bilayers met behulp van Fusogenic aanvullende geladen Proteoliposomes.

Wij bieden een protocol voor in vitro zelforganisatie testen van geest en mij op een ondersteunde lipide dubbelgelaagde in een open huis. Daarnaast beschrijven we hoe omsluiten de bepaling in lipide-geklede PDMS microcompartments na te bootsen in vivo voorwaarden door reactie opsluiting.

In Vitro Reconstructie van het zelf-organiserende eiwit patronen op ondersteunde lipide Bilayers

De biologische membraan fusie wordt gekatalyseert door gespecialiseerde fusie proteïnen. Het meten van de fusogenic eigenschappen van eiwitten kan worden bereikt door lipide mengen assays. We presenteren een methode voor het zuiveren van recombinant fruitvliegje atlastin, een eiwit dat bemiddelt homotypic fusie van de ER, reconstitutie aan voorgevormde liposomen, en testen voor fusie capaciteit.

Reinigingsmiddel-bijgestaan reconstitutie van recombinant fruit vliegje Atlastin in liposomen voor lipide-mengt analyses

Mitochondriale fusie is een belangrijke homeostatische reactie die ten grondslag ligt aan mitochondriale dynamiek. Hier beschreven is een in vitro reconstitution systeem om mitochondriale binnenmembraan fusie die membraan tethering, docking, hemifusion, en porie opening kan oplossen. De veelzijdigheid van deze aanpak bij het verkennen van celmembraansystemen wordt besproken.

Een modelmembraanplatform voor het reconstrueren van mitochondriale membraandynamica

Dit protocol beschrijft een efficiënte celvrije methode voor de productie van hoogwaardig proteoliposoom door middel van een bilayer-dialysemethode met behulp van een tarwecelvrij systeem en liposomen. Deze methode biedt geschikte middelen voor functionele analyse van membraaneiwitten, screening van medicijndoelen en ontwikkeling van antilichamen.

Celvrije productie van proteoliposomen voor functionele analyse en antilichaamontwikkeling gericht op membraaneiwitten

Dit protocol beschrijft de vorming van cel nabootsende uni-lipide en multi-lipide blaasjes, ondersteunde lipide bilayers en gesuspendeerde lipide bilayers. Deze in vitro modellen kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan lipidetypen op te nemen en kunnen worden gebruikt om verschillende molecuul- en macromolecuulinteracties te onderzoeken.

Assemblage van cellimitiek ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayer modellen voor de studie van moleculaire interacties

In dit manuscript demonstreren we de experimentele technieken om het F-actinecytoskelet in te kapselen in gigantische unilamellaire lipideblaasjes (ook wel liposomen genoemd), en de methode om een cortex-biomimicking F-actinelaag te vormen aan de binnenste folder van het liposoommembraan.

In vitro Reconstitutie van het Actin Cytoskelet Inside Giant Unilamellar Vesicles

Dit artikel introduceert een eenvoudige reconstitutie in één pot van cytoskeletale netwerken in fasegescheiden reuzenblaasjes. De methode kan worden veralgemeend en toegepast op inkapseling of opsluiting van een breed scala aan biomoleculen.

In vitro Reconstitutie van cytoskeletale netwerken in fasegescheiden gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's)

Leer hoe je lipide-proximale eiwit-eiwit interacties in vitro reconstitueert met steigerliposomen. Deze methode onderzoekt hoe accessoire lipiden interacties aan het mitochondriale buitenmembraan beïnvloeden.

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren In Vitro

Meer video's verkennen