3D Whole-hart myocard Tissue Analyse
12 april 2017
Dit protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor de vergelijking van 3D gehele hart hartspierweefsel met MRI. Dit is bedoeld voor nauwkeurige vaststelling van intramyocardiale injecties in het infarct grensgebied van een chronische varkensmodel van myocardiaal infarct.
Vertaling}Het algemene doel van dit protocol is om een gestructureerde en reproduceerbare methode voor 3D-bewerking van volledig hartweefsel te faciliteren die kan worden gebruikt om de doeltreffendheid van intramyocardial injecties in de infarctgrenszone te beoordelen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van cardioregeneratieve geneeskunde te beantwoorden, zoals de ontwikkeling en optimalisatie van injectietechnieken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een gestandaardiseerde en reproduceerbare methode biedt voor 3D-bewerking van volledig hartweefsel.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de ontwikkeling van regeneratieve harttherapieën en het valideren van de nauwkeurigheid van normale afgiftetechnieken. Het doel van deze hartstamceltherapie is om cellen te injecteren in de infarctgrenszone voor stimulatie van lokale vasculogenese en bescherming van cardiomyocyten. Het vastleggen van het hart in de einddiastolische fase vereist oefening en geduld.
Een visuele demonstratie van deze stappen is cruciaal. Begin met het scheiden van het pericardium van het met microbead geïnjecteerde hart, waarbij de atria en ventrikels intact blijven. Wanneer al het weefsel is verwijderd, gebruik Klinkenberg-schaar om de opgaande aorta ongeveer een centimeter boven de aortaklep te disseceren en snijd de inferieure cavale en pulmonale aders ongeveer een centimeter van het atrium af.
Nadat de top van het hart aan de bodem van de plastic inbeddingscontainer is bevestigd om drijfvermogen te voorkomen, plaats 2-0 hechtingen door het resterende deel van de aorta naar de randen van de container en fixeer het hart. Zorg ervoor dat het hart gecentreerd is en de wanden van de container niet raakt. Wanneer het orgaan is bevestigd in een end-diastolische geometrie, gebruik pincetten om de inferieure cavale ader vast te grijpen en gebruik een spuit van 50 milliliter om langzaam vers bereide agar van 50 tot 60 graden Celsius in het rechter atrium te injecteren via de superieure cavale ader totdat zowel het rechter atrium als ventrikel volledig gevuld zijn.
Om een ingebed hart te verkrijgen dat zo dicht mogelijk bij de einddiastolische geometrie lijkt, bevestig de apex van de linker ventrikel aan de bodem van de container en vul de rechter ventrikel met agar terwijl de longaders geklemd zijn. Plaats vervolgens een pincet op de longaders en steek voorzichtig een nieuwe met agar gevulde 50 milliliter spuit in retrograde richting door de aortakleppen. Injecteer langzaam de oplossing in de linker ventrikel totdat de ventrikel en het linker atrium volledig gevuld zijn, waarbij de aorta wordt geklemd zodra de linker ventrikel is gevuld.
Giet nu de resterende agar in de container totdat het hart volledig bedekt is en plaats twee stijve plastic buizen in de inbeddingscontainer om als referentiestructuren te dienen tijdens de beeldregistratie. Plaats vervolgens het hart bij twee tot zeven graden Celsius gedurende ten minste vier uur om de agar te laten stollen. Na magnetische resonantiebeeldvorming, draai de container ondersteboven en laat lucht tussen de agar en de zijden van de container om de vaste agaroplossing en het hart uit de container te verwijderen.
Verwijder de plastic staven. Gebruik vervolgens een vleessnijder om de agarblok en het hart in vijf millimeter plakken van de apex tot de basis van het hart te snijden, parallel aan de bodem van het agarblok, om de hoek van de plakken hetzelfde te houden als in de verkregen magnetische resonantiebeelden. Wanneer alle plakken zijn verkregen, kleurt u de weefselmonsters in TTC.
Na 15 minuten, fotografeer de plakken aan beide kanten onder een haaks hoek, spoel vervolgens de secties voorzichtig in 0,9%zoutoplossing. Om de monsters met behulp van fluorescentiemicroscopie te bekijken, selecteert u beeldvorming in fluorescentiemodus op de variabele modusscanner en stelt u de pixelgrootte in op 100 bij 100 micrometer. Selecteer voor het eerste filterblok een bandpassfilter dat overlapt met de emissiegolflengte van de parelkerf in kanaal een, vervolgens een bandpassfilter voor het tweede filterblok buiten de emissiegolflengte in kanaal twee.
Selecteer vervolgens het juiste filterblok, stel de fotomultiplierbuis in op de juiste spanning en de excitatielaser op de excitatiegolflengte die het dichtst bij die van de geïnjecteerde microbeads ligt. Nadat alle afbeeldingen zijn verkregen, segmenteert u in de juiste postverwerkingssoftware het myocardium en de endo- en epicardiale linker ventrikelgrenzen in de magnetische resonantiebeelden, gevolgd door een vergelijkbare segmentatie van het myocardium en injectieplaatsen in de fluorescentieafbeeldingen. Interpoleer vervolgens lineair de geregistreerd beeldsegmenten van beide kanten van de plakken om de oorspronkelijke monsterdikte te reconstrueren en om een 3D-model van de gegevens te creëren.
Met het hart vastgezet in een eind-diastolische geometrie zoals zojuist gedemonstreerd, slaagde de agar er in dit representatieve experiment in om aan het hartweefsel te hechten, waardoor het weefsel op de gewenste hoek met gelijke snedediktes kan worden gesneden. In zowel de 2D-fluorescentie- als magnetische resonantiebeelden zijn de littekens en injectieplaatsen duidelijk te onderscheiden. TTC-gekleurd weefsel en late gadoliniumversterkte magnetische resonantiebeelden bieden een controle voor littekenbeoordeling in fluorescentiebeeldvorming.
Post-processing beeldvorming maakt de reconstructie van de 3D-geometrie van het ex vivo-hart mogelijk op basis van de segmentaties en fluorescentiebeelden, waardoor beoordeling van de 3D-injectie-nauwkeurigheid mogelijk is. In deze studie werden de injectiedeposito's en de infarctgrenszone beschermd op de endocardiale wand en de afstanden tussen de projecties op het endocardial oppervlak werden gemeten. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals chirurgische evaluatie, infarctgroottekwantificering of validatie van andere driedimensionale beeldvormingsmodaliteiten worden uitgevoerd.
We hebben deze techniek gebruikt om de nauwkeurigheid van injectie in de infarctgrenszone te beoordelen. Dit onderzoek werd uitgevoerd om cardioregeneratieve therapie voor hartfalen te verbeteren. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het hart voorbereidt, hoe u cardiaal weefsel inbedt en verwerkt en hoe u fluorescentiebeeldvorming van cardia
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een nieuwe methode voor de 3D-vergelijking van myocardweefsel van het gehele hart met MRI. Deze methode vergemakkelijkt de beoordeling van intramyocardiale injecties in de randzone van het infarct bij een chronisch varkensmodel van myocardinfarct.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Cardiovasculair onderzoek
- Cardiale regeneratieve geneeskunde
- Myocardinfarct
Achtergrond
- Intramyocardiale injecties zijn van cruciaal belang voor cardiale therapieën.
- Gestandaardiseerde methoden voor weefselverwerking zijn noodzakelijk voor reproduceerbaarheid.
- 3D-beeldvormingstechnieken verbeteren de nauwkeurigheid van injectiebeoordelingen.
- Deze studie richt zich op de randzone van het infarct in een porcine model.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een gestructureerde methode voor de 3D-verwerking van weefsel van het gehele hart.
- Het beoordelen van de nauwkeurigheid van de targeting bij intramyocardiale injecties.
- Het optimaliseren van injectietechnieken in de cardioregeneratieve geneeskunde.
Gebruikte methoden
- Protocol voor de verwerking van 3D-weefsel van het gehele hart.
- Magnetic Resonance Imaging (MRI) voor weefselvergelijking.
- Chronisch varkensmodel van myocardinfarct.
- Technieken voor het vastleggen van de einddiastolische fase.
Belangrijkste Resultaten
- Een gestandaardiseerde methode verbetert de reproduceerbaarheid bij de weefselverwerking.
- Verhoogde nauwkeurigheid bij het beoordelen van de injectieplaats.
- Potentiële implicaties voor regeneratieve therapieën voor het hart.
- Validatie van injectietechnieken voor verbeterde resultaten.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor de 3D-beoordeling van myocardiaal weefsel.
- Het ondersteunt de ontwikkeling van effectieve cardiale therapieën.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze gestandaardiseerde aanpak.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Nauwkeurige targeting bij intramyocardiale injectie is essentieel voor het evalueren van cardiale regeneratieve therapieën, waarbij foutieve toediening de beoordeling van de effectiviteit in preklinische modellen kan beïnvloeden. Dit protocol maakt gestandaardiseerde 3D-verwerking van het volledige hartweefsel mogelijk om de injectienauwkeurigheid binnen de randzone van het infarct te kwantificeren, wat bijdraagt aan de mechanistische risicoreductie van interventies op basis van stamcellen en biologica. Door reproduceerbare ruimtelijke validatie te bieden, wordt de voorspellende betrouwbaarheid van vroege beslissingen bij de ontdekking van cardiovasculaire therapeutische kandidaten verbeterd.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de precieze afgifte van regeneratieve stoffen naar de randzone van het infarct te valideren.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerde methode om het risico bij de interactie met het doelwit te verminderen door middel van nauwkeurige ruimtelijke bevestiging van de depositie van biologische stoffen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve 3D-ruimtelijke read-outs die de standaardisatie van assays voor intramyocardiale toedieningssystemen ondersteunen.
- Operationele waarde: Faciliteert de preparatie van gevalideerde weefselcoupes voor downstream fluorescence- en MRI-gebaseerde analyseworkflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de validatie van ziekterelevante systemen door injectienauwkeurigheid te koppelen aan functionele resultaten in modellen van chronisch myocardinfarct.
- Operationele waarde: Waarborgt translationele continuïteit van discovery tot preklinische validatie door de weefselverwerking over verschillende onderzoekslocaties te standaardiseren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het continuüm van ontdekking door post-injectie validatie mogelijk te maken na identificatie van een lead en voorafgaand aan preklinische effectiviteitsstudies, waardoor wordt gegarandeerd dat de waargenomen biologische effecten toe te schrijven zijn aan de correcte anatomische toediening.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door te bevestigen of geïnjecteerde biologica de beoogde micro-omgeving van de infarctborderzone bereiken.
- Screening: Maakt assays gereed door gestandaardiseerde weefselsnijden, imaging en 3D-reconstructie voor een consistente evaluatie van de afgifte van verbindingen of cellen.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (bijv. afstanden van injectie tot de borderzone) die een objectieve vergelijking van afgiftechnieken mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Zorgt voor preklinische continuïteit door te valideren dat regeneratieve stoffen worden afgezet in de anatomisch gedefinieerde infarctborderzone, in lijn met de doelstellingen voor mechanische risicoreductie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor weefselverwerking dat toepasbaar is op meerdere cardiale regeneratieve programma's en injectiemodaliteiten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanistische ambiguïteit te verminderen over de vraag of therapeutische effecten voortkomen uit een correcte doelwitinteractie.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie tussen laboratoria door middel van gedefinieerde protocollen voor inbedding, coupesnijden en beeldvorming.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door fout-positieve resultaten als gevolg van off-target injecties uit te filteren, waardoor de kapitaalefficiëntie wordt verhoogd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde voortgangsbeslissingen mogelijk door de levering op de doelplaats te bevestigen voordat er wordt geïnvesteerd in kostbare functionele uitkomststudies.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de verwerking van hartweefsel, MRI en fluorescentie-imaging voor nauwkeurige segmentatie en 3D-reconstructie.
- Afhankelijk van toegang tot MRI-systemen, scanners met variabele modi en post-processing software die in staat is tot beeldregistratie en 3D-modellering.
- Maakt standaardisatie tussen teams noodzakelijk voor de oriëntatie van het inbedden, de snijdikte en de kleuringsprotocollen om de vergelijkbaarheid van gegevens te garanderen.
- Aanpassing aan verschillende modelsystemen kan correcties vereisen in de inbeddingstemperatuur, de snijhoek en de timing van de kleuring, afhankelijk van de grootte en samenstelling van het weefsel.
- Praktische beperkingen omvatten weefseldeformatie tijdens het inbedden en de noodzaak van een precieze geometrische vastlegging in einddiastole om de anatomische getrouwheid te behouden.
