Name: Inzicht in de interacties van aminozuren en peptiden met anorganische materialen met behulp van enkel-molecuul Force Spectroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Leer enkel-molecuul krachtspectroscopie met AFM om adhesiekrachten tussen aminozuren of peptiden en anorganische oppervlakken te meten. Deze methode biedt inzicht in moleculaire interacties voor oppervlaktechemie en materiaalontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Marie Curie International Reintegration Grant (EP7). P. D. erkent de steun van de Israel Council for Higher Education.

1. Tip Wijziging <ol><li> Purchase siliciumnitride (Si 3 N 4) AFM uitkragingen met siliconen tips (nominale cantilever straal van ~ 2 nm). </li><li> Reinig de AFM cantilever door dompelen in watervrije ethanol gedurende 20 min. Droog bij kamertemperatuur. Behandel dan de cantilevers door ze in O2 plasma gedurende 5 min. </li><li> Schorsen de schone tips hierboven (3 cm) een oplossing die methyltriethoxysilaan en 3- (aminopropyl) triethoxysilaan in een verhouding van 15: 1 (v / v) in een exsiccator onder een inerte atmosfeer (stikstof of argon ofwel) en sluit de exsiccator een vacuümpomp. Vacuüm gedurende 2 uur op een monolaag van deze twee soorten gemengde silaanverbindingen vormen. </li><li> Gebruik een metalen tiphouder (gefabriceerd voor dit proces) aan de uiteinden te plaatsen op een hete plaat. droog toen de uiteinden 10 minuten bij 70 ° C onder atmosferische omstandigheden. Voor het gebruik, het reinigen van de hete plaat, metalen houder en pincet met behulp van ethanol. </li><li> Koel de tips bij kamertemperatuur temperature en dompel de uiteinden in een oplossing van fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide (Fmoc-PEG-NHS, MW 5000 Da) met een concentratie van 5 mM in chloroform dat 0,5% (v / v) triethylamine gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Dompel de tips in chloroform gedurende 5 min en vervolgens dompelen in dimethylformamide (DMF) gedurende 5 extra minuten. Om de Fmoc-groep van het vastgehechte PEG moleculen deprotecteren, dip de uiteinden in 20% piperidine (v / v) in DMF gedurende 30 min. Dompel de tips in DMF gedurende 4 minuten en vervolgens in N-methyl-2-pyrrolidon (NMP) extra 4 minuten. Herhaal de opeenvolgende dompelen driemaal. </li><li> Voor koppeling van aminozuren, dompel de uiteinden in een oplossing die N-terminaal beschermd aminozuur (AA) / diisopropylethylamine (DIPEA) / 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyl- hexafluophosphate (HBTU), in een molaire verhouding van 1: 1: 1 bij een totale concentratie van 30 mM in 5 ml NMP gedurende 1,5 uur. </li><li> Voor peptide koppeling, dompel de tips in een 5 ml oplossing containing 40 mg van het beschermde peptide (N- terminale en zijketens, bijvoorbeeld Fmoc-Gln (Trt) -Pro-Ala-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Arg (PBF) Tyr (tBu) -COOH). , 15 mg 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfaat (HBTU) en 5 ml DIPEA in NMP gedurende 2 uur. </li><li> Dompel de tips in NMP voor 4 min. Om vervolgens de vrije ruimen / gereageerde NH2 beschermen door de acetylgroep, dip de uiteinden van 30 min in een mengsel van azijnzuuranhydride / DIPEA in een molaire verhouding van 4: 1 en een totale concentratie van 0,65 M in NMP. </li><li> Voor peptidekoppeling, voert twee extra stappen. <ol><li> Om de zijketens van het peptide ontschermen, dompel de uiteinden in een oplossing van 95% TFA, 2,5% triisopropylsilaan en 2,5% water gedurende 1 uur en daarna wassen met chloroform en DMF. </li><li> Om de Fmoc-groep van het peptide de uiteinden in 20% piperidine (v / v) in DMF te verwijderen, onderdompelen gedurende 30 min. </li></ol></li><li> Opeenvolgend Dompel de peptide / aminozuur-functionaliserend tips vier minuten elk in DMF (voor peptiden) of NMP (aminozuren), chloroform, 50% ethanol en water. Eindelijk droog de tip in de lucht. </li></ol> 2. Oppervlaktebehandeling <ol><li> Bereid mica. Klieven de substraten (9,9 mm diameter) voor elk gebruik met behulp van plakband. Vervolgens was de oppervlakken met triple gedestilleerd water (TDW). </li><li> Bereid TiO 2 gecoate silicium. <ol><li> Snijd de siliciumwafel (100) in 2 cm vierkantjes met een diamant pen. </li><li> Plaats het substraat in een 15 ml reageerbuis gevuld met aceton en ultrasone trillingen het voor vijf minuten in een ultrasoon bad. Plaats dan dit oppervlak in een 15 ml reageerbuis gevuld met isopropanol en ultrasone trillingen het voor 5 minuten. Droog de ondergrond met stikstof. </li><li> Los het surfactant (bijvoorbeeld Byk-348) in ethanol om een oplossing 5% (gewicht / volume) te bereiden. Voeg vervolgens 0,02 ml van de surfactantoplossing een 2 ml 30% TiO 2 dispersie. </li><li> Uit de resulterende oplossing, drop-cast 0.2 ml op een schone Si-substraat. </li><li> Deze gloeien-drop gegoten oppervlakken bij 250 ° C gedurende 2 uur in lucht. 41 </li></ol></li></ol> 3. Single-molecule Force Spectroscopie Metingen <ol><li> Bevestig het gewenste oppervlak van een metalen houder van de AFM met commercieel verkrijgbare tweecomponentenlijm. Plaats de metallische houder in de glazen houder van de AFM, die is gevormd als een kleine petrischaal. Vul deze houder met Tris buffer (50 mM pH = 7,4) of een gewenste drager. Plaats vervolgens de houder op het podium AFM onder de tip houder. </li><li> Kalibreer de AFM cantilevers met veerconstanten variërend van 10 tot 30 pN / nm, waarbij de thermische fluctuatie methode 26 (bij de AFM software) met een absolute onzekerheid van ongeveer 10%. </li><li> Meet de kracht van de interactie van de naderende aminozuur of peptide-gefunctionaliseerde tip aan het substraat totdat deze in contact komt met het substraat met een compressiekracht van ~ 200 pN en direct trek de tip aan verschillende snelheden, 0,1-0,8 um / s over een afstand van ~ 200 nm. </li></ol> 4. Data Analysis <ol><li> Zetten de doorbuiging waarden (V) te dwingen door de gevoeligheid van de fotodiode (V / m) uitbreiding en met de experimenteel bepaalde veerconstante. 42 Dit gebeurt automatisch door de AFM software. <ol><li> Om FD curves te verkrijgen met één enkel molecuul gebeurtenissen, verslag enkele honderden bochten (800-1,500). Verkrijgen twee pieken in één molecuul curve: de eerste piek geeft niet-specifieke interacties tussen de naaldpunt en het oppervlak en de tweede piek correspondeert met de specifieke interactie van het molecuul met het oppervlak. Wanneer de FD-curve meer dan deze twee pieken bevat, gooi ze van de berekening van de meest waarschijnlijke kracht. OPMERKING: Alleen enkele hechting gebeurtenissen worden op een rekening gehouden met (van 10 tot 30% van de curven). 43 </li></ol></li><li&gt; Om de schijnbare lading tarief, fit minstens 50 kracht versus afstand bochten met de worm-achtige keten (WLC) model 44 te berekenen enkel voorafgaand aan de breuk om een set van het laden tarieven, die vervolgens worden gebruikt voor het bereiden van histogrammen van krijgen de schijnbare laden tarieven. Leid de ontbinding krachten tussen de peptiden / aminozuren en oppervlak van de sprong van kracht na het scheiden van de cantilever van het substraat. </li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Stappen 1.3, 1.4 en 1.7 in het protocol dient met uitgebreide zorg en op een zeer zachte manier worden uitgevoerd. In stap 1,3, zou de tip niet in contact zijn met het silaan mengsel en de silanisatie proces dient in een inerte atmosfeer (vochtvrije) lopen. 45 Dit wordt gedaan teneinde meerlaagse vorming te voorkomen en omdat silaanmoleculen gemakkelijk worden gehydrolyseerd in aanwezigheid van vocht. 45 In stap 1,4, moeten de temperatuur en ti...

De interactie tussen eiwitten en anorganische mineralen leidt tot de constructie van composiet materialen met onderscheidende eigenschappen. Dit omvat materialen met hoge mechanische sterkte of unieke optische eigenschappen. 1, 2 Bijvoorbeeld, de combinatie van het eiwit collageen met minerale hydroxiapatiet genereert hard of zacht beenderen voor verschillende functionaliteiten. 3 Korte peptiden kunnen ook binden anorganische materialen met hoge specificiteit. 4 is 5, 6 de specificiteit van deze peptiden zijn gebruikt voor het ontwerpen van nieuwe magnetische en elektronische materialen, 7, 8, 9 fabriceren nanogestructureerde materialen, het groeien van kristallen, 10 en synthetiseren van nanodeeltjes. 11 Inzicht in de onderliggende mechanisme interacties tussen eiwitten en peptiden of anorganische materialen zullen daarom ons toelaten om nieuwe composietmaterialen te ontwerpen met een verbeterde adsorptie eigenschappen. Aangezien bovendien de interfase van implantaten met een immuunrespons bij eiwitten, beter begrip van de interacties van eiwitten met anorganische materialen ons vermogen om implantaten te ontwerpen verbeteren. Een ander belangrijk dat eiwitten omvat interactie met anorganische oppervlakken is de vervaardiging van antifouling materialen. 12, 13, 14, 15 Biofouling een ongewenste proces waarbij organismen hechten aan een oppervlak. Het heeft vele nadelige gevolgen voor ons leven. Bijvoorbeeld, biofouling bacteriën op medische hulpmiddelen leidt tot ziekenhuisinfecties. Biofouling van mariene organismen op boten en grote schepen verhoogt de<html> brandstofverbruik. 12, 16, 17, 18 Single-molecule force spectroscopie (SMF) met behulp van een AFM, kan direct de interacties tussen een aminozuur of een peptide met een substraat te meten. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 Andere werkwijzen zoals faagdisplay, 27, 28 kwartskristal microbalans (QCM) 29 of oppervlak plasmon resonantie (SPR) 29, 30, 31, 32,ref &quot;&gt; 33 meten van de interacties van peptiden en eiwitten aan anorganische oppervlakken in bulk. 34, 35, 36 Dit betekent dat de resultaten van deze methoden resultaten hebben betrekking op ensembles van moleculen of aggregaten. In SMF worden één of zeer weinig moleculen bevestigd aan de AFM tip en hun interacties met het gewenste substraat wordt gemeten. Deze benadering kan worden uitgebreid tot eiwitvouwing bestuderen door aan het eiwit van het oppervlak. Bovendien kan het worden gebruikt om interacties tussen cellen en eiwitten en de binding van antilichamen aan hun liganden te meten. 37, 38, 39, 40 Dit document beschrijft in detail hoe om ofwel peptiden of aminozuren hechten aan de AFM tip met behulp van silanol chemie. Bovendien, het papier legt uit hoe je kracht metingen uit te voeren en hoe het te analyserenresultaten.

<table><tbody><tr><td>Silicon nitride (Si3N4) AFM cantilevers met silicon tips</td><td>Bruker (Camarilo, CA, USA)</td><td></td><td>MSNL10, nominale cantileverstraal ~2 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Methyltriethoxysilaan&nbsp;</td><td>Acros Organics (New Jersey, USA)</td><td></td><td>Voor Silaylation van de AFM tip&nbsp;</td></tr><tr><td>3-(Aminopropyl) triethoxysilaan</td><td>Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israël)</td><td></td><td>Voor Silaylation van de AFM tip</td></tr><tr><td>Triisopropylsilaan</td><td>Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israël)</td><td></td><td>Gebruikt voor peptide deprotectie</td></tr><tr><td>N-Ethyldiisopropylamine</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, UK)</td><td></td><td>Gebruikt voor tip modificatie</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, UK)</td><td></td><td>Gebruikt voor tip modificatie</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, UK)</td><td></td><td>Gebruikt voor tip Fmoc deprotectie</td></tr><tr><td>Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide&nbsp; (Fmoc-PEG-NHS)</td><td>Iris Biotech GmbH (Duitsland, Duitsland)</td><td></td><td>Gebruikt als de covalente flexibele koppeling&nbsp; (MW = 5.000 Da)</td></tr><tr><td>2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorfosfaat (HBTU)</td><td>Alfa Aser (Heysham, Engeland)</td><td></td><td>Gebruikt als koppelingsreagens.&nbsp;</td></tr><tr><td>N-methyl-2-pyrrolidon (NMP)</td><td>Acros Organics (New Jersey, USA)</td><td></td><td>Gebruikt als oplosmiddel in Tip modificatie procedure</td></tr><tr><td>DMF (dimethylformamide)</td><td>Merck (Darmstadt, Duitsland)</td><td></td><td>Gebruikt als oplosmiddel in Tip modificatie procedure</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Bio-Lab (Jerusalem, Israël)</td><td></td><td>Gebruikt als oplosmiddel in Tip modificatie procedure</td></tr><tr><td>Ethanol (Anhydrous)</td><td>Gadot (Netanya, Israël)</td><td></td><td>Gebruikt als oplosmiddel in Tip modificatie procedure</td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur (TFA)</td><td>Merck (Darmstadt, Duitsland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuuranhydride</td><td>Merck (Darmstadt, Duitsland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptiden</td><td>GL Biochem (Shanghai, China).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenylalanine en Tyrosine&nbsp;</td><td>Biochem (Darmstadt, Duitsland)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% TiO2 dispersie in het mengsel van oplosmiddel 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) en Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP)</td><td>Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israël)</td><td></td><td>(30%) in het mengsel van oplosmiddel 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) en Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP). Gebruikt voor TiO2 substraat voorbereiding</td></tr><tr><td>Mica substraten</td><td>TED PELLA, INC. (Redding, California, USA)</td><td></td><td>9.9 mm diameter</td></tr></tbody></table>

inzicht in de interacties van aminozuren en peptiden met anorganische materialen met behulp van enkel-molecuul force spectroscopie

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

De interacties tussen eiwitten of peptiden en anorganische materialen leiden tot verschillende interessante processen. Bijvoorbeeld het mengen van proteïnen met mineralen leidt tot de vorming van composietmaterialen met unieke eigenschappen. Bovendien wordt het ongewenste proces van biofouling geïnitieerd door de adsorptie van biomoleculen, vooral proteïnen, op oppervlakken. Deze organische laag een hechtlaag voor bacteriën en kunnen ze interageren met het oppervlak. Inzicht in de fundamentele krachten die de interacties regelen van de organische-anorganische interface is daarom belangrijk voor veel gebieden van onderzoek en kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe materialen voor optische, mechanische en biomedische toepassingen. Deze paper toont een single-molecule kracht spectroscopie techniek die een AFM gebruikt om de hechting kracht tussen beide peptiden of aminozuren en goed gedefinieerde anorganische oppervlakken te meten. Deze techniek omvat een protocol voor het bevestigen van het biomolecuul aan de AFMtip via een covalente flexibele linker en single-molecule force spectroscopy metingen door atomic force microscope. Daarnaast wordt een analyse van deze metingen inbegrepen.

Figuur 1 toont de tip modificatie procedure. In de eerste stap, een plasmabehandeling verandert het oppervlak van de silicium nitride tip. De tip presenteert OH-groepen. Deze groepen zullen vervolgens reageren met silanen. Na afloop van deze stap wordt het oppervlak van de punt worden door vrije -NH2 groepen. Deze vrije amines vervolgens reageren met Fmoc -PEG-NHS, een covalente linker. De Fmoc groep van de PEG-linker wordt verwijderd door pipyridine een ontsc...

Hier presenteren we een protocol om de kracht van de interacties tussen een goed gedefinieerde anorganische oppervlak en ofwel peptiden of aminozuren door single-molecule force spectroscopy metingen te meten met behulp van een atomic force microscope (AFM). De resultaten van de meting informatie is belangrijk voor een beter begrip van het peptide-anorganisch materiaal interfase.

Inzicht in de interacties van aminozuren en peptiden met anorganische materialen met behulp van enkel-molecuul Force Spectroscopie

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Het algemene doel van de single-molecule force spectroscopy-techniek is om de adhesiekracht en de aard van de interacties tussen aminozuren of peptiden met verschillende oppervlakken te bepalen. Dit kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van oppervlaktechemie en kan worden gebruikt voor de ontwikkeling van nieuwe composieten en chordaten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het informatie biedt over de interactie tussen het gewenste molecuul en oppervlakken op het niveau van een enkele molecuul.Begin met het kopen van siliciumnitride AFM-cantileveren uitgerust met siliciumtips met een nominale cantileverradius van twee nanometer. Monteer de tip op de houder. Reinig elk van de AFM-cantileveren door ze 20 minuten in ethanol te dompelen en droog ze vervolgens op kamertemperatuur.Plaats vervolgens de tips in een plasmakamer en behandel de cantileveren door ze vijf minuten bloot te stellen aan zuurstofplasma. Bereid een oplossing met 15 delen methyltriethoxysilaan en één deel drie amino propyltriethoxysilaan en suspendeer de cantileveren drie centimeter boven de oplossing onder een inerte atmosfeer. Het is belangrijk dat de tips en de houder het silaangemengsel niet raken.Bovendien is de silaan zeer gevoelig voor vocht en daarom moeten deze tips in een inerte atmosfeer worden bewaard. Eenmaal verzegeld, sluit u de exsiccator aan op een vacuümpomp en brengt u een vacuüm aan gedurende twee uur aan om een monolaag van de twee soorten gemengde silaanverbindingen op het oppervlak van de cantilevers te vormen. Verwijder de tips voorzichtig en plaats ze op een hotplate voorverwarmd tot 70 graden Celsius.Laat de tips 10 minuten drogen. Koel de tips op kamertemperatuur af voordat u ze een uur in een oplossing van Fmoc-PEG-NHS bij kamertemperatuur onderdoopt. Dompel vervolgens de tips gedurende vijf minuten in chloroform en vervolgens vijf minuten in DMF.Na incubatie in DMF, ontdoet u de Fmoc-groepen van de aangehechte PEG-moleculen door de tips gedurende 30 minuten in een 20% piperidine-oplossing in DMF te dompelen. Dompel de tips vervolgens weer vier minuten in DMF en vervolgens vier minuten in N-Methyl-2-pyrrolidon. Om aminozuren op de tips te koppelen, dompelt u deze een uur en een half in een aminozuurkoppelingsoplossing met een totale concentratie van 30 millimolair en vijf milliliter N-Methyl-2-pyrrolidon.Om de resterende vrije of niet-reactieve PEG-residuen door de acetylgroep te beschermen, dompelt u de tips gedurende 30 minuten in een 0,65 molair mengsel van vier delen azijnzuuranhydride en één deel diisopropylethylamine en N-Methyl-2-pyrrolidon. Dompel vervolgens de peptide-aminozuur-gefunctionaliseerde tips sequentieel gedurende vier minuten in NMP, chloroform, 50% ethanol en water voordat u de tip uiteindelijk in de lucht droogt. Bevestig het gewenste testoppervlak aan een metalen houder van de AFM met commercieel verkrijgbare epoxy.Plaats vervolgens de metalen houder in de glazen houder van de AFM, die de vorm heeft van een kleine petrischaal. Vul de glazen houder met TRIS-buffer. Plaats vervolgens de metalen houder op de AFM-trap onder de tiphouder.Monteer vervolgens de AFM-tip op het optisch glas van de AFM. Plaats het optisch glasblok in de AFM-kop. En zet de AFM-kop op de trap.Kalibreer vervolgens de AFM-cantileveren met veerconstanten variërend van 10 tot 30 piconewton per nanometer. Een typische krachtmeting resulteert in een krachtafstandcurve zoals hier getoond. De eerste piek geeft niet-specifieke interacties tussen de tip en het oppervlak aan en de tweede piek verwijst naar het specifieke hechtingsevenement.Uit enkele honderden krachtafstandcurven is het mogelijk om een histogram te construeren door het aantal hechtingsgebeurtenissen tegen kracht uit te plotten. Het toepassen van een Gaussische fit op deze histogrammen zal de meest waarschijnlijke kracht bepalen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u AFM-tips chemisch kunt modificeren met aminozuren of peptiden en hoe u single-molecule force spectroscopy met behulp van AFM kunt uitvoeren.

insights-into-interactions-amino-acids-peptides-with-inorganic

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

This video demonstrates the self-assembly of amyloid peptides into a beta sheet-rich supramolecular structure using Fourier transform infrared spectroscopy. An infrared beam is passed through a crystal with a high refractive index, and energy absorption across the interface of the crystal and the sample is recorded. The secondary structures of the sample proteins are identified by analyzing their characteristic absorption peaks at specific regions of the infrared spectrum, which aids in...

A Fourier Transform Infrared Spectroscopy Technique to Study Peptide Self-Assembly

Cellulosomen zijn multi-enzymcomplexen die zijn ontworpen voor het verteren van cellulose. AFM-gebaseerde SMFS werd gebruikt om de mechanische eigenschappen en vouwconfiguratie van cellulosome-geassocieerde eiwitassemblages te bestuderen. We presenteren een complete workflow voor eiwit-immobilisatie, dataverzameling en data-analyse om de interacties van individuele receptor-ligandcomplexen te bestuderen die betrokken zijn bij cellulosome-assemblage.

Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie

Belangrijke stappen van eiwitfunctie, met name conformationele veranderingen in de ruggengraat en protonoverdrachtreacties, vinden vaak plaats op de microseconden tot milliseconden tijdschaal. Deze dynamische processen kunnen worden bestudeerd door middel van tijdopgeloste step-scan Fourier-transform infraroodspectroscopie, met name voor eiwitten waarvan de functie wordt geactiveerd door licht.

Proton Transfer en eiwitconformatie Dynamiek in lichtgevoelige eiwitten door Tijdsgeresolveerde Step-scan Fourier-Transform Infrared Spectroscopy

Er wordt een protocol gepresenteerd om een grote verscheidenheid aan enkele moleculen covalent aan een AFM-tip te koppelen. Procedures en voorbeelden om de adhesiekracht en vrije energie van deze moleculen op vaste ondergronden en bio-interfaces te bepalen, worden gegeven.

Onderzoekt Single Molecule Hechting van Atomic Force Spectroscopie

We beschrijven de gedetailleerde procedures en de strategieën voor het meten van de mechanische eigenschappen en mechanische ontvouwen trajecten van één eiwitmolecules met behulp van een atomic force microscope. We tonen ook representatieve resultaten als een referentie voor selectie en motivering van goed één eiwit molecuul opnames.

Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

Dit protocol beschrijft de covalente immobilisatie van eiwitten met een heterobifunctional silane koppelmiddel op siliciumoxide oppervlakken ontworpen voor de atomaire kracht microscopie gebaseerd enkel molecuul kracht spectroscopie die wordt geïllustreerd door de interactie van RrgA (pilus-1 tip antistoffen van S. pneumoniae) met fibronectine.

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

Hier presenteren we een protocol om eiwitmonomeer te vervoegen door enzymen die eiwitpolymeer vormen met een gecontroleerde sequentie en het op het oppervlak immobiliseren voor spectroscopiestudies met één molecuul.

OaAEP1-Gemedeerde Enzymatische Synthese en Immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor Single-Molecule Force Spectroscopie

Covalente gehechtheid van sondemoleculen aan atoomkrachtmicroscopie (AFM) cantilever tips is een essentiële techniek voor het onderzoek van hun fysieke eigenschappen. Dit stelt ons in staat om de rekkracht, desorptiekracht en lengte van polymeren te bepalen via AFM-gebaseerde single molecule force spectroscopie met een hoge reproduceerbaarheid.

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Tijd-opgeloste single-molecule eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering is een nuttige fluorescentiespectroscopische nabijheidssensor die gevoelig is voor lokale structurele veranderingen in eiwitten. Hier laten we zien dat het kan worden gebruikt om stabiele lokale conformaties in α-Synuclein te ontdekken, dat ook wel bekend staat als bolvormig ongestructureerd en onstabiel wanneer het wordt gemeten met behulp van de FRET-liniaal met een groter bereik.

Gebruik van time-resolved eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering om stabiele lokale conformaties één α-synucleïnemonomeer tegelijk te identificeren

Ensemble force spectroscopy (EFS) is een robuuste techniek voor mechanische ontvouwing en real-time detectie van een ensemble set van biomoleculaire structuren in biofysische en biosensing velden.

Ensemble Force Spectroscopie door Shear Forces

Plasmonische nanopincetten gebruiken gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie in gouden nanostructuren om afzonderlijke nanodeeltjes, waaronder eiwitten, op te vangen in een optisch veld op nanometerschaal. Veranderingen in het verstrooide signaal onthullen de aanwezigheid van eiwitten en de conformationele dynamiek, waardoor monitoring mogelijk is zonder fluorofoormodificaties of oppervlaktetethering.

Monitoring van conformationele dynamica van enkelvoudige ongemodificeerde eiwitten met behulp van plasmonische nanopincetten

Leer enkel-molecuul krachtspectroscopie met AFM om adhesiekrachten tussen aminozuren of peptiden en anorganische oppervlakken te meten. Deze methode biedt inzicht in moleculaire interacties voor oppervlaktechemie en materiaalontwikkeling.

Inzicht in de interacties van aminozuren en peptiden met anorganische materialen met behulp van enkel-molecuul Force Spectroscopie (Video) | JoVE Journal

Inzicht in de interacties van aminozuren en peptiden met anorganische materialen met behulp van enkel-molecuul Force Spectroscopie

Meer video's verkennen