Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever, Dermestes maculatus

Het algemene doel van deze procedure is om genfunctie in Dermestes maculatus te onderzoeken, een nieuw insectenmodelsysteem, dat de diverse clade van kevers vertegenwoordigt en de studie van fundamentele en toegepaste onderzoeksvragen vergemakkelijkt. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de gebieden van ontwikkelingsbiologie, evolutionaire biologie en verder te beantwoorden, door het mogelijk te maken om genfunctie te testen in Dermestes-embryo's en volwassenen. Het grote voordeel van deze techniek is dat RNA-interferentie kan worden gebruikt om elk gen te targeten, enkel op basis van sequentie-informatie, zelfs in afwezigheid van een volledige genoomsequentie.

De hier geïntroduceerde methoden bieden niet alleen een benadering om genfunctie in Dermestes te bestuderen. Ze kunnen ook worden toegepast om nieuwe insectenmodelsystemen te ontwikkelen en mogelijk om insectenplagen te bestrijden. Om een kweekkooi voor een D. maculatus voor te bereiden, spreidt u eerst een dunne laag houtsnippers in een middelgrote insectenkooi.

Plaats een stuk styrofoam in de kooi om de larven een omgeving te geven, waarin ze kunnen poppen. Voeg twintig tot vijftig volwassen kevers of larven in het laatste stadium toe aan de kooi. Plaats nat kattenvoer in een petrischaal of weegbootje als voedselbron.

Dek de kooi af met een gaasdoek en plaats deze in een incubateur. Controleer de kooi voor het beginnen met embryoverzameling eerst zorgvuldig op aanwezige embryo's en verwijder deze. Zodra de kooi leeg is, plaatst u een uitgerekte katoenen bal in de kooi en incubeer de kolonie op 30 graden Celsius.

Na de juiste tijdsperiode, verzamelt u de katoenen bal, verwijdert u alle aanwezige volwassenen en plaatst u ze terug in de kooi. Over een stuk zwart constructiepapier knijpt u de katoenen bal voorzichtig en scheurt u deze langzaam in dunne filamenten, zodat alle aanwezige eieren op het zwarte papier vallen. Neem een standaard petrischaaldeksel en gebruik een stuk zwart filterpapier om de binnenkant te bedekken.

Lijm een stuk dubbelzijdig plakband langs de rand van een standaard microscoopglaasje. Plaats het microscoopglaasje op het zwarte filterpapier in het petrischaaldeksel. Neem het papier met de verzamelde embryo's en tik voorzichtig om de embryo's over te brengen naar het petrischaaldeksel.

Gebruik een penseel om de embryo's op het plakband loodrecht op het glaasje uit te lijnen, met het voorste of achterste uiteinde naar de rand. Om RNAi te starten, neemt u eerst 2-4 microliter dsRNA op in een 20 microliter micro loader pipettentip. Plaats de tip in een vooraf getrokken glas capillair, de zogenaamde naald, en pipetteert u de oplossing voorzichtig in de naald.

Bevestig de naald in een glas capillairhouder en monteer vervolgens de capillairhouder in de micromanipulator. Verplaats vervolgens voorzichtig het glaasje met embryo's erop naar het platform van de dissectiescoop. Verplaats het glaasje om één embryo in het midden van het veld te brengen en stel de microscoop scherp.

Terwijl u in de dissectiescoop kijkt, positioneert u de tip van het capillair met de micromanipulator. Breng de tip dicht bij het uiteinde van het eerste embryo in de rij. Schakel de stikstof- of luchttoevoer in en zet vervolgens de magneetklep ingangskeuzeschakelaar op vacuüm.

Pas de uitstotopdrukregelaar aan op 10-15 psi, afhankelijk van het apparaat. Open de capillair en de gekleurde dsRNA-oplossing zal de tip vullen, klaar voor injectie. Beweeg de capillairtip naar voren en prik voorzichtig het embryo.

Bij ideale drukinstellingen zal er geen embryonaal vocht in de capillair stromen. Druk op de voetschakelaar om dsRNA in het embryo te spuiten, totdat de juiste hoeveelheid is gedispenseerd. Laat de tip ongeveer twee seconden in het embryo en verwijder het vervolgens voorzichtig.

Zodra alle embryo's zijn geïnjecteerd, plaatst u het glaasje in een petrischaal. Voeg een natte katoenen bal toe aan de schaal, zorg ervoor dat deze niet in contact komt met het glaasje. Dek de petrischaal af en wikkel deze in een afdichtfolie.

Label het met het type dsRNA, concentratie, datum, tijd en aantal geïnjecteerde embryo's. Plaats de schaal ten slotte in een incubateur op 30 graden Celsius totdat de embryo's uitkomen. Om pRNAi uit te voeren, verzamelt u eerst poppen uit de kolonie.

Sorteer mannelijke en vrouwelijke poppen in twee afzonderlijke schalen en plaats deze in een incubateur op 30 graden Celsius. Controleer de schalen dagelijks op uitgekomen kevers en breng deze individuen over naar twee afzonderlijke petrischalen voor mannelijke en vrouwelijke volwassenen. Voer deze volwassenen en onderhoud de schalen om de dag, totdat er voldoende volwassenen uitgekomen zijn om met injectie te beginnen.

Zodra het volwassenenpool compleet is, verdoof een vrouwelijke kever en houd het individu met één hand op de buikzijde omhoog, terwijl u de spuit in de andere hand houdt. Prik voorzichtig de segmacoria-membraan tussen sternites 2 en 3. Controleer de schaal van de spuit en spuit langzaam ongeveer twee microliter per vrouwtje uit.

Na de injectie, houd de naald minimaal 5 seconden stil en trek deze vervolgens voorzichtig terug. Breng geïnjecteerde vrouwtjes over naar een petrischaal met kattenvoer. Label de schaal passend.

Plaats de schaal in een incubateur op 30 graden Celsius. Na 24 uur, breng de geïnjecteerde vrouwtjes over naar een mini-kooi en voeg een gelijk aantal niet-geïnjecteerde jonge mannetjes toe. Label de kooi en voeg kattenvoer toe.

Plaats de kooi in een incubateur op 30 graden Celsius, om paring mogelijk te maken. Het resulterende nageslacht kan dan worden onderzocht om de effecten van de pRNAi te bepalen. Deze afbeelding toont een nageslacht van een pRNAi-individu dat is geïnjecteerd met DS GFP, groen fluorescent proteïne als controle