Name: Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever, Dermestes maculatus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Leer genfunctieonderzoek in Dermestes maculatus met embryonale en parentale RNA-interferentie. Deze methode maakt fenotypische analyse mogelijk zonder volledige genoomsequentie en ondersteunt ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Drs. Alison Heffer en Yong Lu voor het opzetten van het micro-injectieapparaat en het delen van hun onschatbare kennis en ervaring met betrekking tot insect RNAi. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (R01GM113230 aan L.P.).

1. Het grootbrengen van D. maculatus LET OP: Een kolonie van D. maculatus werd opgericht in het lab van de auteurs met behulp van volwassenen en larven gekocht commercieel. De soort identiteit werd gecontroleerd met behulp van DNA-barcoding 53. <ol><li> Het opzetten van een nieuwe kooi in het lab, verspreid een dun laagje houtkrullen in een middelgrote insect kooi (30,5 x 19 x 20,3 cm 3). Plaats een ~ 10 x 6 x 3 cm 3 brok piepschuim in de kooi om larven verbergen voor de verpopping laten. Voeg 20-50 kevers (zowel volwassenen of late instar larven). Kevers zal verbergen in de houtkrullen. </li><li> Voeg nat kattenvoer in een petrischaal of een gewicht van de boot. Bedek de kooi met mesh doek en plaats de kooi in een couveuse. </li><li> Voor het behoud van een broedkolonie in het lab, de temperatuur tussen de 25 en 30 ° C. D. maculatus groeit sneller bij hogere temperaturen, maar bevordert ook de groei van schimmels en mijten. Het handhaven van een te genezenthy kolonie Gebruik 25-28 ° C voor regelmatig onderhoudscentra en 30 ° C voor snel groeiende kolonie. De levenscyclus duurt ongeveer drie weken tot vier maanden, afhankelijk van omgevingsfactoren 50 (figuur 2). </li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig2.jpg" /> Figuur 2: D. maculatus Lab Colony. Foto van een typische D. maculatus insect kooi wordt getoond. Houtkrullen zijn verspreid te laten de kevers te verbergen. Kattenvoer wordt toegevoegd in een kleine petrischaal of een gewicht van de boot. Styrofoam is geplaatst in de kooi als een toevluchtsoord voor de uiteindelijke instar larven verpoppen. De hier getoonde kooi is 30,5 x 19 x 20,3 cm 3 en herbergt een paar honderd larven, poppen en volwassenen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54976/54976fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="4"><li> Leave eieren in de kooi te rijpen. Om de kolonie uit te breiden, nieuwe kooien vast met eieren (verzameld zoals beschreven in paragraaf 2), larven, of volwassenen, zoals hierboven. D. maculatus leggen eieren in de hele kooi, vooral in de buurt van de bron van voedsel. </li><li> Vervang nat kattenvoer ongeveer twee keer per week. LET OP: Als gevolg van de onaangename geur van nat kattenvoer, werden alternatieve voedselbronnen ook getest (zie Discussie). </li></ol> 2. Embryo Collection <ol><li> Voor het instellen van een verzameling, scheiden minstens 50 mannen en 50 vrouwen uit de kolonie. Jongvolwassenen zijn best. Plaats volwassenen in een mini-sized kooi (17,8 x 10,2 x 12,7 cm 3) zonder houtkrullen. Voeg kattenvoer in een gewicht van de boot. </li><li> Voordat u begint collectie, controleer dan de kooi zorgvuldig voor eventuele aanwezige embryo&#39;s en verwijder ze. Zet een uitgerekte katoenen bal in de kooi, en laat de kooi in een 30 ° C incubator. Na het juiste tijdvenster, zal de katoenen bal klaar voor de embryo collectie. </li><li> Vouweneen stuk zwarte bouw papier (A4-formaat) in de helft om een ​​plooi te maken, en dan ontvouwen. </li><li> Verwijder de uitgerekte katoenen bal uit de kooi. Verwijder volwassenen uit de katoenen bal en zet ze terug in de kooi. </li><li> Terwijl knijpen de uitgerekte katoenen bal heel voorzichtig, scheur het uit elkaar langzaam in dunne katoenen draden te laten de eieren vallen op het zwarte papier. OPMERKING: D. maculatus embryo&#39;s zijn kwetsbaar en moeilijk te zien in katoen. Ze kunnen gemakkelijk worden verpletterd als die de watten te hard. </li></ol> 3. dsRNA Voorbereiding <ol><li> DNA Template Voorbereiding voor dsRNA Synthesis <ol><li> Run 4-6 50 pi PCR-reacties met gebruik van primers die T7 promoter sequenties aan beide 5&#39;-uiteinden te amplificeren DNA-matrijs volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Zuiver PCR product op een commerciële PCR zuivering kit volgens de instructies van de fabrikant. De ideale eindconcentratie van DNA-matrijs is ≥100 ng / ul. </li></ol></li><li> Injectie Buffer Voorbereiding <ol><li> Bereid 100 ml injectie buffer (0,1 mM NaH 2PO 4, 5 mM KCl). Stel de pH tot 6,8 met 5 M NaOH. </li><li> WINKEL aliquots bij -20 ° C. </li></ol></li><li> dsRNA Synthesis <ol><li> Opzetten van een reactie in een 0,2 ml PCR buis op ijs en voeren een in vitro transcriptiereactie met T7 polymerase, volgens de instructies van de fabrikant, met behulp ~ 500 ng sjabloon per reactie. </li><li> Incubeer de buis bij 37 ° C overnacht. </li><li> Digest het DNA sjabloon met DNase, volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Verwarm de buis tot 94 ° C en houden op 94 ° C gedurende 3 min. </li><li> Het dsRNA annealen langzaam afkoelen van de buis 1 ° C / min totdat het 45 ° C na 1 uur bereikt. OPMERKING: Stappen 3.3.2 tot 3.3.5 kan worden uitgevoerd in een thermocycler. </li><li> Om neerslag van dsRNA ethanol, voeg 280 ulRNase-vrij water tot 20 ul van de reactie aan te passen aan een eindvolume van 300 pl. Voeg 30 gl 3 M NaOAc (pH 5,2) en 650 ui ethanol. Plaats de buis in -20 ° C vriezer gedurende de nacht. </li><li> Na centrifugeren bij 15.682 xg gedurende 30 min bij 4 ° C, was de dsRNA pellet met 70% ethanol. Droge pellet en lossen in 20 pi injectie buffer. </li><li> Meet de concentratie van het dsRNA met behulp van een spectrofotometer bij A260. De ideale concentratie 3-5 ug / ul. De kwaliteit door het uitvoeren van 5 ui van een 1:25 verdunning van dsRNA op een 1% agarose gel bij 90 V gedurende 30 minuten. Een enkele band van de verwachte grootte zal goed zichtbaar zijn. </li><li> Bewaar de dsRNA bij -20 ° C of kouder. OPMERKING: Verzamel RNAi knockdown experiment een controleorgaan dsRNA, die niet kan worden verwacht dat de werkwijze bestudeerd beïnvloeden. GFP dsRNA is een uitstekende controle voor de meeste experimenten. Voorbereiden en injecteer de controle dsRNA side-by-side met de experimental dsRNA. </li></ol></li></ol> 4. Montage van microinjector en micromanipulator OPMERKING: Zie afbeelding 3. <ol><li> Sluit stikstof of andere luchttoevoer naar de drukingangswaarde van een pneumatische pomp instrument. Als een pneumatische pomp niet beschikbaar is, druk uitoefenen met behulp van een 50 ml spuit verbonden met fijne buizen. </li><li> Sluit een voetschakelaar naar de externe connector van de pomp naar de uitwerpknop druk te regelen. </li><li> Bevestig een glazen capillaire houder van de eject druk poort van de pomp met buis. </li><li> Bevestig de capillaire houder op een micromanipulator in de buurt van een dissectie microscoop. </li></ol> 5. Embryonale RNAi OPMERKING: Figuur 4 toont een stroomdiagram van D. maculatus embryonale RNAi. <ol><li> eRNAi Voorbereiding <ol><li> Bereid een embryo verzamelen petrischaal deksel (90 mm diameter). Leg een stuk zwarte filter papier cover de binnenkant van het deksel. Zet een standaard microscoopglaasje op het zwarte papier. </li><li> Verdun dsRNA passende concentratie injectie buffer. Gebruik 2-3 gg / gl voor initiële experimenten. Altijd dsRNA op ijs voorafgaand aan de injectie. </li><li> Voeg kleurstof bij 1:40 verdunning van de dsRNA en pipet voorzichtig in enkele keren goed te mengen. </li></ol></li><li> Het verzamelen van embryo&#39;s voor Injectie OPMERKING: Bij 25 ° C, kernen in embryo 6-8 uur na eierleggende (AEL) migreren naar de periferie ei 53. Een cellulair blastoderm is gevestigd binnen 8 - 10 uur AEL 53. Ter controle embryo vóór cellulaire blastoderm fase worden gebruikt voor injectie, 0-3 uur AEL embryo worden aanbevolen voor gebruik 53. Embryo collectie, voorbereiding en de injectie meestal minder dan 2 uur als het glas haarvaten zijn in goede vorm. Daarom kan het hele proces binnen 5 uur AEL voltooid. <ol><li> Verzamel embryo&#39;s zoals beschreven in de stappen 2.2-2,5. </li><li> Tik op de zwarte bouw papier om embryo&#39;s te zetten in het verzamelen petrischaal deksel. </li><li> Plak dubbelzijdig tape langs de rand van de dia. </li><li> Met behulp van een kwast, breng de embryo&#39;s op de band loodrecht op de dia rand met de voorste of achterste einde aan de rand. Merk op dat de voorste en achterste einden van vroege embryo&#39;s niet gemakkelijk te onderscheiden, waardoor gemiddeld de helft wordt geïnjecteerd aan het achterste uiteinde ideale. </li></ol></li><li> Het laden van de dsRNA in de glazen capillaire <ol><li> Neem 2-4 ul van dsRNA in een 20 ul microloader pipet tip. </li><li> Steek de punt in een vooraf getrokken glazen capillaire (hierna naald) en voorzichtig pipet het dsRNA oplossing in de capillair. Bereid naalden van commerciële glas haarvaten met behulp van een micropipet trekker. Een voorbeeld van een ideale getrokken naald is getoond in figuur 5. De lengte en tapsheid van naalden moet mogelijk af worden geoptimaliseerdter injectie trials. </li><li> Bevestig de glazen capillair in het glas capillair houder. </li><li> Monteer de capillaire houder in de micromanipulator. </li></ol></li><li> DsRNA injecteren in embryo <ol><li> Breng voorzichtig de dia met embryo&#39;s op het podium van het ontleden microscoop. </li><li> Verplaats de schuif om één embryo naar het midden van het veld en de focus microscoop te brengen. </li><li> Plaats de punt van het capillair met de micromanipulator, terwijl op zoek naar de microscoop ontleden. Breng het uiteinde dicht bij het einde van de eerste embryo in de rij. </li><li> Schakel de stikstof of andere luchttoevoer. </li><li> Stel de elektromagnetische ingang keuzeschakelaar op vacuüm. </li><li> Stel de eject drukregelaar tot 10-15 psi. Stel de druk afhankelijk van de inrichting. </li><li> Open de capillaire indien nodig. Zodra het uiteinde open is, zal de gekleurde dsRNA oplossing de punt te vullen. </li><li> Beweeg de capillaire tip uit naar de e doorborenmbryo. Als de insteldruk ideaal worden geen embryonale fluïdum stroomt in de capillair. </li><li> Stap op de voetschakelaar dsRNA oplossing werpen in het embryo tot een vereiste hoeveelheid oplossing wordt uitgeworpen. Figuur 5 toont voorbeelden van embryomorfologie na geschikte en ongeschikte hoeveelheden oplossing zijn ingespoten. </li><li> Houd de capillaire tip binnen het embryo voor ~ 2 sec, en verwijder deze dan. </li><li> Verplaats het capillair naar de volgende embryo en herhaal de stappen 5.4.8 - 5.4.10 tot alle embryo&#39;s worden geïnjecteerd. Verander glazen capillair wanneer het verstopt raakt of breekt. </li></ol></li><li> Post-injectie Recovery en Incubation <ol><li> Na injectie, plaats de dia in een petrischaal. </li><li> Voeg een natte katoenen bal naar de petrischaal. Laat je niet door de katoenen bal raakt de dia. </li><li> Dek de petrischaal en wikkel het met afdichtende film. Label de schotel met de naam van de dsRNA, concentratie, datum, tijd, en het aantal geïnjecteerdeembryo. </li><li> Plaats de petrischaal in een 30 ° C incubator totdat de embryo&#39;s doorgeefluik. </li></ol></li></ol> 6. Parental RNAi <ol><li> Isoleren Poppen voor pRNAi <ol><li> Verzamel poppen uit de kolonie. </li><li> Sorteren mannelijke en vrouwelijke poppen onder de microscoop (zie figuur 6). Houd ze in twee afzonderlijke petrischalen in een 30 ° C incubator zodat geen paring plaatsvindt vóór injectie. </li><li> Controleer elke dag voor Bijlage In volwassenen. Verpopping duurt meestal 5-7 dagen bij 30 ° C. </li><li> Transfer Bijlage In mannen en vrouwen (zie figuur 6) twee afzonderlijke petrischaaltjes en hen voeden kattenvoer om de andere dag tot ze klaar zijn voor injectie. </li><li> Ga verder met de injectie zodra er genoeg vrouwen en mannen op de juiste leeftijd. Vrouwtjes 4-8 dagen na verpopping zijn best. Voor een typische analyse, 8 - worden 12 vrouwen gebruikt. Een gelijk aantal mannen zijn nodig voor het koppelen 54. </li></ol></li&gt; <li> Het injecteren van dsRNA in Vrouwelijke Buik <ol><li> Bereid dsRNA op ijs (5.1.2 en 5.1.3). </li><li> Bevestig een 32-gauge naald tot een 10 gl spuit. </li><li> Verdoven vrouwtjes op CO 2 het podium. </li><li> Laad dsRNA oplossing in de spuit, zonder toegang tot alle lucht. </li><li> Houd een vrouwelijke ventrale zijde naar boven met de ene hand en houd de spuit met de andere. </li><li> Zachtjes dringen de segmacoria (membraan) tussen sternites 2 en 3 met de punt van de naald. Figuur 7 toont een vrouwelijke tijdens de injectie. Als de naald het weefsel niet gemakkelijk penetreren, de hoek van de naald naar boven en drukt u langzaam. Plaats ongeveer 2 mm van de naald in het lichaam. </li><li> Controleer de spuit schaal, terwijl de zuiger langzaam te duwen, het injecteren van ~ 2 pl per vrouw. </li><li> Na het injecteren, houd de naald nog steeds minstens 5 seconden voordat u deze uit de buik van het vrouwtje. </li><li> Breng de geïnjecteerde vrouwtjes naar een petrischaal (90 mm diameter) en te voeden met kattenvoer. </li><li> Label de petrischaal met de dsRNA naam, hoeveelheid ingespoten, de datum en het aantal vrouwen. </li></ol></li><li> Post-injectie Recovery and Mating <ol><li> Incubeer de petrischaal in een 30 ° C incubator. </li><li> Na 24 uur, de overdracht geïnjecteerd vrouwtjes om een ​​mini kooi. </li><li> Toe te voegen aan de kooi een gelijk aantal niet-geïnjecteerde jonge mannen, en het etiket van de kooi. </li><li> Voeg een wegende boot met kattenvoer in de kooi. </li><li> Laat de kooi in een 30 ° C incubator om paring toe te staan. Na 24 uur moet beginnen vrouwtjes eieren leggen en embryo kan worden verzameld dagelijks of op gewenste tijdstippen. </li></ol></li></ol> 7. Fenotypische analyse na RNAi OPMERKING: Bij 30 ° C duurt ongeveer 55 uur om te broeden eieren 50. <ol><li> eRNAi levensvatbaarheid Analyse <ol><li> Bereken uitkomstpercentage het aantal uitgekomen larven tegenover het volledig number van geïnjecteerde embryo. Zorg ervoor dat u een negatieve controle injectie te nemen als embryo&#39;s kunnen worden geschaad of gedood door de injectie procedure. Typische luik tarieven variëren van 30% - 60%. Pas uitgekomen larven eten unhatched eieren. </li></ol></li><li> pRNAi levensvatbaarheid Analyse LET OP: Als vrouwelijke levensvatbaarheid wordt beïnvloed door het gen doelwit van RNAi, vrouwen ingespoten met specifieke dsRNA maar niet negatieve controle dsRNA zal beginnen te sterven. Als de productie van eieren of eieren leggen wordt beïnvloed, zal vrouwtjes gedeeltelijke of volledige steriliteit vertonen. Score vrouwelijke overleving in vergelijking met de negatieve controles en vergelijken het totale aantal gelegd door de experimentele en controle vrouwen (7.2.3) eieren. <ol><li> Het opzetten van embryo volgende stap 2.2. </li><li> Na 24 uur, het verzamelen van embryo&#39;s volgende stappen 2,4-2,5. </li><li> Tel het totale aantal embryo&#39;s. </li><li> Breng de embryo&#39;s een 90 mm petrischaal. Label de petrischaal met het gen gerichte, ophaaldag, en het aantal embryo&#39;s. </li&gt; <li> Incubeer de embryo&#39;s in een 30 ° C incubator totdat ze uitkomen. Sinds uitgekomen larven voeden zich met unhatched embryo&#39;s, check de petrischaal vaak en apart uitgekomen larven van unhatched embryo behulp van een tang (zie Discussie). </li><li> Tel het aantal uitgekomen embryo&#39;s en bereken het luik tarief. </li></ol></li><li> Het onderzoeken van de opperhuid Defecten in uitgekomen larven <ol><li> Verzamel uitgekomen larven in een 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> In een zuurkast, voeg 1 ml Fixation Solution. </li><li> Laat de microcentrifugebuis bij 4 ° C ten minste gedurende de nacht laten doordringen in de oplossing larvale weefsel. </li><li> Visualiseren, verwijder zoveel fixatief van de buis mogelijk te maken. </li><li> Spoel larven minstens drie maal met PBST. </li><li> Transfer larven een multiwell-glasplaat met PBST met een P-1000 pipetpunt met het afgesneden einde te verbreden. </li><li> Onder een microscoop ontleden, strek larven met behulp van een tang om gebreken te onderzoeken. ikt is van cruciaal belang uit te strekken larven gebreken als hun lichamen contract in fixatief te onderzoeken. </li></ol></li><li> Het onderzoeken van de opperhuid Defecten in Unhatched Larven Opmerking: Deze procedure is bruikbaar voor de behandeling van vroege embryonale fenotypes, vooral voor embryo&#39;s die niet overleven tot uitkomen. <ol><li> Voor pRNAi, voeg PBST in de petrischaal (7.2.4) en breng unhatched&#39;s naar een 1,5 ml microcentrifugebuis met een P-1000 pipetpunt met het uiteinde afgesneden. Voor eRNAi, voeg PBST in de petrischaal (5.5.4), borstel unhatched embryo&#39;s van de microscoop glijbaan en overbrengen naar een microcentrifugebuis. </li><li> Bevestig de embryo&#39;s met Fixation Solution en spoel ze met PBST voor visualisatie volgende stappen 7.3.2 - 7.3.6. </li><li> Met behulp van een tang, ontleden embryo&#39;s uit de eierschaal onder een dissectie microscoop in PBST. </li><li> Breng de embryo naar 1,5 ml microcentrifugebuis (~ 200 ul van embryo&#39;s in elke buis). </li><li> Verwijder zoveel solution mogelijk. </li><li> Voeg 1 ml 90% melkzuur / 10% EtOH. Laat de centrifugebuis in een 60 ° C incubator tenminste nacht. OPMERKING: Embryo&#39;s kunnen worden gelaten bij 60 ° C gedurende enkele dagen. </li><li> De embryo mount, pipet ze op een microscoopglaasje met een P-1000 pipetpunt met het uiteinde afgesneden. </li><li> Handmatig positioneren van de embryo&#39;s met een tang om een ​​ideale oriëntatie. </li><li> Bedek de embryo&#39;s met een cover-slip en te visualiseren onder de microscoop met behulp van DIC. </li></ol></li><li> Het onderzoeken van Cellulaire en Moleculaire defecten OPMERKING: Deze procedure is handig voor het onderzoeken van de onderliggende oorzaken van de cuticula fenotypes of dodelijkheid dat niet gepaard gaat met cuticula gebreken. <ol><li> Voor pRNAi, aparte embryo&#39;s uit katoenen ballen op de juiste ontwikkelingsfase en breng ze in een embryo verzamelen mand. De opvangbak kan hetzelfde of vergelijkbaar met die toegepast voor Drosophila embryo collections. <ol><li> Makende eimand uit een 25 ml plastic scintillatiebuisje met de bodem van het flesje verwijderd en een cirkel gesneden uit het deksel (ca. 1 cm diameter). Plaats een cirkel van super fijn gaas ongeveer 2,5 cm in diameter binnenkant van het deksel, en dan schroef de scintillatieflesje op en gebruik ondersteboven. </li><li> Aangezien het gaas gemakkelijk kan worden verwijderd zodra de embryo gewassen, dompel de maas in een microcentrifugebuis met water om embryo vasthouden aan de maas terug. </li></ol></li><li> Voor eRNAi op passend stadium, voeg PBST aan de petrischaal. Borstel de embryo&#39;s van de microscoop glijbaan en overbrengen naar een embryo verzamelen mand. OPMERKING: Fixatie, in situ hybridisatie, antilichaam kleuring en nucleaire kleuring protocollen is te vinden in Xiang et al. 2015 53. </li></ol></li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Terwijl een klein aantal geavanceerde modelsystemen (muizen, vliegen, wormen) werden ontwikkeld tijdens de 20 e eeuw, heeft de 21e eeuw gezien een golf van nieuwe dierlijke systemen worden ontwikkeld in laboratoria over de hele wereld. Deze nieuwe systemen kunnen wetenschappers vergelijkende, evolutionaire vragen die niet kunnen worden gesondeerd met behulp van alleen de &#39;standaard&#39; modelsystemen te pakken. Deze implementatie van nieuwe modellen vereist de snelle ontwikkeling van methoden v...

In 1998, Fire en Mello meldde dat dubbelstrengs RNA (dsRNA) remming van genfunctie kan induceren in Caenorhabditis elegans 1. Deze reactie veroorzaakt door dsRNA werd genoemd RNA interferentie (RNAi) en dergelijke RNAi-gemedieerde silencing werd gerapporteerd als zijnde geconserveerd in dieren, planten en schimmels 2-7. In planten en sommige dieren, RNAi functies systemisch, wat betekent dat het effect kan zich verspreiden naar andere cellen / weefsels waarbij dsRNA niet rechtstreeks geïntroduceerd (beoordeeld in 8-10). Wetenschappers hebben gebruik gemaakt van deze endogene cellulaire RNAi respons door het ontwerpen van dsRNA&#39;s om genen van belang gericht zijn gemaakt, waardoor de functie van genen neerhalen zonder direct het manipuleren van het genoom (beoordeeld in 11-14). RNAi is een krachtig hulpmiddel voor functionele studies vanwege de volgende voordelen. Eerst, zelfs met minimale informatie gensequentie, een gen kan worden gevist met RNAi. Dit is vooral belangrijk voor studies van niet-model organismen ontbreekt genomische of transcriptomics data. Ten tweede, in organismen waar RNAi respons robuust systemische RNAi-gemedieerde gen knockdown kan worden uitgevoerd op bijna elk ontwikkelingsstadium. Deze functie is zeer nuttig voor het bestuderen van de functie van pleiotrope genen. Ten derde, in sommige gevallen, RNAi effecten uitbreiden tot de gonaden en nageslacht, zodat fenotypes worden waargenomen bij nakomelingen 15,16. Dit fenomeen, bekend als ouderlijke RNAi (pRNAi), is bijzonder voordelig voor genen beïnvloeden embryonale ontwikkeling, talrijke nakomelingen van één ouder geïnjecteerd zonder directe manipulatie eieren kunnen worden onderzocht. Daarom pRNAi is de voorkeurswerkwijze. Indien pRNAi ineffectief, bijvoorbeeld voor genen die nodig zijn voor oogenesis, dan embryonale RNAi (eRNAi) worden gebruikt. Ten vierde kan RNAi worden gebruikt om het equivalent van een allelische reeks, dat de hoeveelheid dsRNA geleverd over een bereik kan worden gevarieerd wekken zwakke produceren sterke gebreken. Dergelijke gradatie van fenotypes kan nuttig zijn voor het begrijpen van genfunctie wanneer het gen is betrokken bij een complex proces en / of volledig verlies van functie dodelijk. Ten vijfde, de levering van dsRNA is over het algemeen gemakkelijk en haalbaar is, met name in dieren die robuuste systemische RNAi reacties. dsRNA kan worden ingevoerd door micro-injectie 1,5, het voeden / inname 17,18, weken, 19,20 en virus / bacteriën gemedieerde aflevering 21,22. Zesde, in tegenstelling tot sommige gentargeting / bewerken werkwijzen hoeft te screenen op organismen die de mutatie of genetische kruisingen aan homozygoten genereren bij gebruik RNAi uitvoeren. Daarom in vergelijking met vele andere technieken voor het bestuderen van genfunctie, RNAi is snel, goedkoop en kunnen worden toegepast voor grootschalige schermen 23-25. De brede toepasbaarheid van RNAi verschaft middelen functionele studies uit te voeren in een breed scala van organismen, het uitbreiden van het bereik van de soorten beschikbaar voor studie beyond de traditionele modelsystemen waarvoor genetische instrumenten ontwikkeld. Bijvoorbeeld, studies met niet-modelsystemen vereist om inzicht in de evolutie van genen en gen netwerken geven door vergelijking van de functies van orthologen voor soorten van verschillende modes of ontwikkeling vertonen duidelijke morfologische kenmerken 26-29. Deze types van studies zullen een beter begrip van de biologische diversiteit te voorzien, met gevolgen voor zowel toegepast en fundamenteel onderzoek. Omdat het grootste dier groep op de planeet, insecten zorgen voor een geweldige kans om de mechanismen te onderzoeken onderliggende diversiteit. Bovendien, insecten zijn over het algemeen klein, hebben korte levenscycli, hoge vruchtbaarheid, en zijn eenvoudig aan de achterzijde in het lab. In de afgelopen twee decennia, is RNAi is met succes toegepast bij insecten verspreid over orders, met inbegrip van Diptera (true vliegen) 5, Lepidoptera (vlinders en motten) 30, Coleoptera (kevers) 16,31, Hymenoptera (sawfleugens, wespen, mieren en bijen) 32, Hemiptera (wantsen), Isoptera (termieten) 34, Blattodea (kakkerlakken) 35, Orthoptera (krekels, sprinkhanen, sprinkhanen, en katydids) 36 en Phthiraptera (luizen) 37. Succesvolle toepassing van RNAi heeft verstrekt functionele gegevens voor onderzoek naar patronen in de vroege embryogenese (anterior-posterior as 32, dorsale-ventrale as 28, segmentatie 26,38), geslachtsbepaling 39,40, chitine / cuticula biosynthese 41, ecdyson signalering 42, sociaal gedrag 43, en nog veel meer. RNAi methoden ontwikkeld voor verschillende insectensoorten kunnen bijkomende voordeel dat zij mogelijk bruikbaar voor ongediertebestrijding (herzien 44-46) te zijn. RNAi effecten genspecifieke en soortspecifiek zijn, zolang als niet-geconserveerde gebieden worden gekozen voor targeting. Voor nuttige insecten zoals bijen en zijderupsen, gericht op genen die van vitaal belang voor het voortbestaan ​​vanvirussen of parasieten om besmetting te bestrijden kan een nieuwe strategie om deze soorten te beschermen 47,48 bieden. Dermestes Maculatus (D. maculatus), gangbare naam hide kever, wordt wereldwijd verspreid, met uitzondering van Antarctica. Als holometabolous insect, de D. maculatus levenscyclus omvat embryonale, larven, pupal en volwassen stadia (figuur 1). Omdat het voedt zich met vlees, wordt D. maculatus gebruikt in musea dode dieren schets maken en forensische entomologen kunt het gebruiken om het tijdstip van overlijden 49,50 te schatten. D. maculatus zich voedt met dierlijke producten zoals kadavers, gedroogd vlees, kaas, en de poppen / cocons van andere insecten en veroorzaakt daarmee schade aan huishoudens, opgeslagen voedsel, en de zijde, kaas en vlees-industrie 51,52. Het toepassen van RNAi in deze kever zou een efficiënte en milieuvriendelijke manier om de economische gevolgen te minimaliseren. Ons laboratorium heeft gebruikt D. maculatus als een nieuwe model insect segmentering 53 bestuderen. Naast het feit dat vatbaar lab fokken, D. maculatus van belang voor fundamenteel onderzoek omdat het een tussenproduct kiem ontwikkelaar, waardoor het een nuttige soorten naar de overgang tussen korte en lange kiem ontwikkeling bestuderen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig1.jpg" /> Figuur 1: Life Cycle van D. maculatus. Foto&#39;s van D. maculatus in verschillende levensfasen, zoals aangegeven. De levenscyclus van ei tot adult bedraagt ​​drie weken bij 30 ° C, maar meer bij lagere temperaturen. (A, F) Vers gelegd embryo&#39;s zijn wit tot lichtgeel en ovaal, ongeveer 1,5 mm in lengte. Embryogenese draait ~ 55 uur bij 30 ° C. (B, C en G) Larven hebben donkere gepigmenteerde strepen en zijn bedekt met borstels. Larven gaan door verschillende stadia, afhankelijk van de omgeving en hun lengte kan zich uitstrekken tot meer dan 1 cm. (D, H) </strong&gt; Young poppen zijn lichtgeel. Verpopping vindt ~ 5-7 dagen bij 30 ° C. (E, I) Kort na eclosion, verschijnt donkere pigmentvlekken op de volwassen kever lichaam. Volwassenen kunnen leven tot enkele maanden en een vrouwtje kan honderden embryo&#39;s lag over haar leven. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54976/54976fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Eerder toonden we aan dat RNAi is effectief in het neerhalen gen-functie in D. maculatus 53. Hier onze ervaring fokken D. maculatus kolonies in het laboratorium wordt gedeeld met stap-voor-stap protocollen voor zowel embryonale en ouderlijke RNAi set-up, injectie, na de injectie zorg en fenotypische analyse. De dsRNA-gemedieerde gen knockdown en analysemethoden hier geïntroduceerd bieden niet alleen gedetailleerde informatie voor de aanpak van vraagstukken in D. maculatus, maar ook potentiële betekenis for toepassing van RNAi in andere niet-model kever / insectensoorten.

<table><tbody><tr><td>Dermestes maculatus leve kevertjes</td><td>Ons lab of Carolina Biological Supply</td><td>#144168</td><td>Onze labstam werd geverifieerd door COI barcoding; stamvariatie van Carolina kan niet worden uitgesloten</td></tr><tr><td>Nat kattenvoer</td><td>Fancy Feast</td><td></td><td>Vleesvlokken met jus. Kan worden gekocht in de meeste dierenvoedings- en supermarkten</td></tr><tr><td>Droogreekvloer</td><td>Purina Puppy Chow</td><td></td><td>Kan worden gekocht in de meeste dierenvoedings- en supermarkten</td></tr><tr><td>Insectenkooi (maat medium, 30,5 x 19 x 20,3 cm)</td><td>Exo Terra</td><td>PT2260</td><td>Voor het onderhoud van de kolonie. Kan een grotere kooi gebruiken indien nodig</td></tr><tr><td>Insectenkooi (maat mini, 17,8 x 10,2 x 12,7 cm)</td><td>Exo Terra</td><td>PT2250</td><td>Voor embryocollectie</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td></td></tr><tr><td>Wattenbal</td><td>Fisher</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>Megascript T7 transcriptiekit</td><td>Fisher</td><td>AM1334</td><td>Voor 40 reacties</td></tr><tr><td>Pneumatische pomp</td><td>WPI</td><td>PV830</td><td></td></tr><tr><td>Capillairhouder</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>NARISHIGE</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Zwarte filterpapier (90&nbsp;mm)</td><td>VWR</td><td>28342-010</td><td></td></tr><tr><td>Voedselkleurstof (groen)</td><td>McCormick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicaat glas capillair</td><td>Hilgenberg</td><td>1406119</td><td></td></tr><tr><td>Naaldtrekker (micropipettrekker)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglasplaatje</td><td>WorldWide Life Sciences Division</td><td>41351157</td><td></td></tr><tr><td>Afdichtingsfilm (Parafilm M)</td><td>Fisher</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Model 801-sering (10&nbsp;&micro;l)</td><td>Hamilton</td><td>7642-01</td><td></td></tr><tr><td>Naald (32-gauge)&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>7762-05</td><td></td></tr><tr><td>Fixatieoplossing (Pampel's)</td><td>BioQuip Products, Inc.</td><td>1184C</td><td>Toxisch, moet worden behandeld in een afzuigkap</td></tr><tr><td>Pincet (DUMONT #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas (24 x 50 mm, nr. 1,5)</td><td>Globe Scientific</td><td>1415-15</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader pipettip</td><td>Fisher</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop voor embryo-injectie</td><td>Leica</td><td>M420</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop voor fenotypische visualisatie van larven</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discover. V12</td><td></td></tr><tr><td>DIC-microscopie</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Imager. M1</td><td></td></tr></tbody></table>

grootbrengen en double-stranded rna-gemedieerde gen knock-down in het verbergen kever, dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Vorderingen in de genomica hebben de mogelijkheid geboden om biodiversiteit op een ongekende schaal te onderzoeken. Echter, sequentie alleen zal niet informatief zijn zonder hulpmiddelen om genfunctie te bestuderen. De ontwikkeling en het delen van gedetailleerde protocollen voor het opzetten van nieuwe modelsystemen in laboratoria, en voor hulpmiddelen om functionele studies uit te voeren, is dus cruciaal voor het benutten van de kracht van genomica. Coleoptera (kevers) zijn de grootste clade van insecten en bezetten vrijwel alle typen habitats op de planeet. Naast het bieden van ideale modellen voor fundamenteel onderzoek, kunnen studies van kevers impact hebben op plaagbestrijding, aangezien ze vaak plagen zijn van huishoudens, landbouw en voedingsindustrieën. Gedetailleerde protocollen voor het kweken en onderhouden van D. maculatus laboratoriumkolonies en voor het uitvoeren van dsRNA-gemedieerde interferentie in D. maculatus worden gepresenteerd. Zowel embryonale als ouderlijke RNAi procedures - inclusief apparatuur opstelling, voorbereiding, injectie en herstel na injectie - worden beschreven. Methoden worden ook gepresenteerd voor het analyseren van embryonale fenotypes, inclusief levensvatbaarheid, patroondefekte in uitgekomen larven, en cuticula bereidingen voor niet uitgekomen larven. Deze tests, samen met in situ hybridisatie en immunokleuring voor moleculaire markers, maken D. maculatus een toegankelijk modelsysteem voor fundamenteel en toegepast onderzoek. Ze bieden ook nuttige informatie voor het vaststellen van procedures in andere opkomende insectenmodelsystemen.

Lab van de auteurs heeft RNAi-technologie wordt gebruikt om de functionele evolutie van genen die segmentatie bij insecten 53,55 bestuderen. Terwijl alle insecten zijn gesegmenteerd, de genen die dit proces verschijnen tijdens insect stralingen 26,38,56-63 te zijn gedivergeerd. Genetische schermen in Drosophila identificeerde een reeks van negen pair-rule segmentatie genen die verantwoordelijk zijn voor het bevorderen van de vorming van het lichaam van de s...

Hier presenteren we protocollen voor het kweken van een intermediair-kiem kever, Dermestes maculatus (D. maculatus) in het lab. We hebben ook protocollen voor de embryonale en ouderlijke RNAi en methodes te delen voor het analyseren van embryonale fenotypes voor bestudering van genfunctie in deze soort.

Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Het algemene doel van deze procedure is om genfunctie in Dermestes maculatus te onderzoeken, een nieuw insectenmodelsysteem, dat de diverse clade van kevers vertegenwoordigt en de studie van fundamentele en toegepaste onderzoeksvragen vergemakkelijkt. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de gebieden van ontwikkelingsbiologie, evolutionaire biologie en verder te beantwoorden, door het mogelijk te maken om genfunctie te testen in Dermestes-embryo's en volwassenen. Het grote voordeel van deze techniek is dat RNA-interferentie kan worden gebruikt om elk gen te targeten, enkel op basis van sequentie-informatie, zelfs in afwezigheid van een volledige genoomsequentie.De hier geïntroduceerde methoden bieden niet alleen een benadering om genfunctie in Dermestes te bestuderen. Ze kunnen ook worden toegepast om nieuwe insectenmodelsystemen te ontwikkelen en mogelijk om insectenplagen te bestrijden. Om een kweekkooi voor een D. maculatus voor te bereiden, spreidt u eerst een dunne laag houtsnippers in een middelgrote insectenkooi.Plaats een stuk styrofoam in de kooi om de larven een omgeving te geven, waarin ze kunnen poppen. Voeg twintig tot vijftig volwassen kevers of larven in h

rearing-double-stranded-rna-mediated-gene-knockdown-hide-beetle

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

In dit protocol combineren we RNAi-gemedieerde gensilencing...

RNAi-gemedieerde Gene Knockdown en<em&gt; In Vivo</em&gt; Urineproductie Assay in het volwassenenonderwijs Vrouw<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Muggen

In dit protocol beschrijven we twee strategieën die tegelijkertijd in honingbijen te onderdrukken twee genen (dubbel gen knockdown). Dan presenteren we hoe de proboscis extensie respons (PER) test om het effect van de dubbele gen knockdown op honingbij smaak perceptie bestuderen gebruiken.

RNAi-gemedieerde Dubbele Gene Knockdown en Smaak Perception Meting in Honingbijen (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

Terwijl dsRNA voeden in C. elegans is een krachtig hulpmiddel om gen-functie, de huidige protocollen voor grootschalige voeden schermen resulteren in variabele knockdown efficiëntie te beoordelen. We beschrijven een verbeterde protocol voor het uitvoeren van grootschalige RNAi voeden schermen die resulteert in een hoogst doeltreffend en reproduceerbare neerhalen van genexpressie.

Grootschalige Gene Knockdown in<em&gt; C. elegans</em&gt; Met behulp van dsRNA Feeding bibliotheken Robuuste verlies-van-functie Fenotypes Genereer

RNA-interferentie (RNAi) gebaseerde gen knockdown technieken vormen de kern van Tribolium onderzoek. Hier geven we een overzicht van onze larvale RNAi techniek Tribolium castaneum. Larvale RNAi is een eenvoudige, maar krachtige techniek die een snelle toegang tot verlies-van-functie fenotypes biedt, waardoor onderzoekers om de functie van genen te bestuderen in verschillende contexten.

Larvale RNA interferentie in de Rode Bloem Kever, Tribolium castaneum

Hier beschrijven we een werkwijze voor het remmen van genfunctie in ziektedragers muggen door het gebruik van chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes die worden opgenomen door larven.

Chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes gemedieerde gen silencing in Disease Vector muggenlarven

RNA-interferentie (RNAi) is een uiterst waardevol hulpmiddel voor het onthullen van genfunctie. De mogelijkheid om genen te targeten met behulp van RNAi tijdens pre-adulte stadia is echter beperkt in de belangrijkste menselijke malariavector Anopheles gambiae. We beschrijven een RNAi-protocol om genfunctie te verminderen via directe injectie tijdens de popontwikkeling.

RNAi Trigger delivery in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Poppen

Hier presenteren we een protocol om Cricket eieren te injecteren, een techniek die als basismethode dient in vele experimenten in de cricket, inclusief, maar niet beperkt tot, RNA-interferentie en genomische manipulatie.

Het injecteren van gryllus krekel eieren

RNA interferentie is een breed toepasbare, krachtige techniek voor het manipuleren van genexpressie in specifieke ontwikkelingsstadia. Hier beschrijven we de noodzakelijke stappen voor de implementatie van deze techniek in de aquatische duikkever Thermonectus marmoratus, van de verwerving van gensequenties tot het knockdownen van genen die de structuur of het gedrag beïnvloeden.

RNA Interferentie in aquatische kevers als een krachtig instrument voor het manipuleren van genexpressie op specifieke ontwikkelingstijdpunten

Wij bieden een gedetailleerd protocol voor elektroporatie-gemedieerde RNA interferentie in insecten van de orde Odonata (libellen en jonkvliegen) met behulp van de blauwstaartdamselfly (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) en de pied skimmer libelle (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Elektroporatie-gemedieerde RNA Interferentie Methode in Odonata

Hier wordt een protocol gepresenteerd van Helicoverpa armigera (Hübner) embryo micro-injectie en knock-out mutant identificatie gemaakt door CRISPR / Cas9 genoombewerking. Gemuteerde insecten maken verder onderzoek naar genfunctie en interactie tussen verschillende genen in vivo mogelijk.

Embryo Microinjectie en Knockout Mutant Identificatie van CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Het huidige protocol beschrijft stapsgewijze richtlijnen voor de RNAi-operatietechnieken in P. americana.

Toepassingen van RNA-interferentie in Amerikaanse kakkerlak

Leer genfunctieonderzoek in Dermestes maculatus met embryonale en parentale RNA-interferentie. Deze methode maakt fenotypische analyse mogelijk zonder volledige genoomsequentie en ondersteunt ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever, Dermestes maculatus

Meer video's verkennen