Röntgenfluorescentie (XRF)
Bron: Laboratorium van Dr. Lydia Finney — Argonne National Laboratory
Röntgenfluorescentie is een geïnduceerde, uitgestraalde straling die kan worden…
1. Voorbereiding van de Silicium Nitride Ramen
- Gebruik omgekeerde pincetten om een raam op te pakken (silicium nitride ramen zullen breken als ze vallen).
- Plaats het raam op een glazen plaat, met de platte kant omhoog.
- Bevestig kleine stukjes plakband aan de zijkanten van het raam en gebruik deze om de ramen aan de onderkant van de kweekschaal te bevestigen.
- Steriliseer de ramen in kweekschalen met UV-straling. Dit kan worden bereikt met de automatische crosslink-instelling op een UV-crosslinkingkast, gevolgd door verdere UV-bestraling onder de UV-lamp in de laminaire flowkap gedurende ongeveer 1 uur.
2. Het plateren van de cellen op de gesteriliseerde silicium nitride ramen
- Houd de schaal met een hoek van ongeveer 45°.
- Voeg media toe door te pipetten naar de zijkant van de schaal en verminder langzaam de hoek om het raam met media te bedekken.
- Voeg cellen toe aan de kweekschaal, op dezelfde manier, en incubeer.
- Observeer de cellen af en toe met een lichtmicroscoop om te bepalen wanneer ze klaar zijn om te gebruiken.
3. Fixatie en drogen van cellen
- Verwijder in een laminaire flowkap het media door voorzichtig te aspireren terwijl de schaal wordt gekanteld zoals hierboven beschreven.
- Voeg PBS toe, pipetten naar de zijkant van de schaal terwijl deze onder hoek wordt vastgehouden. Verminder langzaam de hoek om het raam met PBS te bedekken.
- Verwijder de PBS door voorzichtig te aspireren.
- Pipetten naar de zijkant van de schaal, en terwijl deze onder hoek wordt vastgehouden, voeg 4% PFA/PBS, pH 7 toe om de cellen te bedekken. Laat 20 min. op kamertemperatuur staan.
- Verwijder het PFA/PBS mengsel en verwijder als gevaarlijk materiaal.
- Voeg PBS toe, pipetten zoals hierboven beschreven.
- Herhaal stappen 3.5 en 3.6 tweemaal.
- Verwijder de PBS door voorzichtig te aspireren.
- Voeg 20 mM PIPES, 200 mM sucrose, pH 7 toe.
- Verwijder de PIPES/sucrose door voorzichtig te aspireren.
- Herhaal stappen 2.8 en 2.9 tweemaal.
- Dep de randen en de achterkant van het raam snel af met een Kimwipe, en zet het raam vervolgens op een schone oppervlakte, zoals een rubberen rooster, om te drogen.
4. Röntgenfluorescentiebeeldvorming van cellen
- Zodra het monster droog is, controleer de aanwezigheid van cellen op de ramen met een lichtmicroscoop.
- Gebruik nagellak om de ramen op een aluminium houder te bevestigen die door de straallijn wordt geleverd.
- Plaats de aluminium houder in een kinematische montage en plaats deze vervolgens op de juiste positie op het brandpunt van de optica in de röntgenmicroscoop, en onder een hoek van ongeveer 45° ten opzichte van de invallende röntgenstraal, gemonteerd op de monster nanopositioneringsfasen.
- Verlaat het röntgenmicroscoop instrumentgebied (meestal een hutje gemaakt van loodwanden) en open de sluiter. Voer de resterende stappen op afstand uit.
- Gebruik ofwel een zoneplaat, ofwel Kirkpatrick-Baez spiegels om de monochromatische röntgenstraal (meestal 10 keV in energie) te focussen tot een sub-micron spotgrootte.
- Gebruik de nanopositionerings monsterfasen, en bekijk de positie van de röntgenstraal op het monster met een vooraf gekalibreerd downstream scintillatorcamera, bepaal de juiste breedte en hoogte van de rasterscan om gegevens van het monster te verzamelen.
- Met de golflengte-dispersieve silicium drift detector op 90° ten opzichte van de invallende straal, en ongeveer 3 mm of minder van het monster, verzamel een testspectrum met een verblijfsduur van 1-2 sec.
- Bekijk het testspectrum, kies een geschikte verblijfsduur voor de scan, om voldoende signaal-ruis te bieden voor de elementen van belang.
- Kies een geschikte resolutie voor de scan, een die niet aanzienlijk kleiner is dan de spotgrootte van de straal op het monster, noch groter dan de interessante kenmerken in het monster.
- Programmeer de scan in de scanning software en verzamel het beeld.
Röntgenfluorescentie, of XRF, spectroscopie is een niet-destructieve analytische techniek die wordt gebruikt om elementaire analyse van monsters bij kamertemperatuur uit te voeren.
XRF kan worden toegepast op een breed scala aan monsters, waaronder biologische, forensische, omgevings- en zelfs kunstwerken. De monsters kunnen ook verschillende vormen aannemen, zoals poeders, kristallen en vloeistoffen. Bij XRF wordt een monster bestraald met een straal X-stralen die het ertoe brengt secundaire X-stralen met een lagere energie uit te zenden, die fluorescente straling worden genoemd.
Hoewel het wordt aangeduid als een fluorescentietechniek, verschilt XRF van traditionele fluorescentiemicroscopie doordat het geen lagere energie zichtbaar licht of lichtactieve moleculen gebruikt.
Deze video introduceert de basisprincipes van XRF en laat zien hoe elementaire kaarten van een biologisch monster kunnen worden verzameld.
Wanneer een foton met voldoende energie botst met een atoom, wordt de energie geabsorbeerd en wordt een van de elektronen van de buitenste schil aangeslagen. Terwijl het elektron zich ontspant, zendt het een secundair foton uit, meestal met een lagere energie. Dit proces staat bekend als fluorescentie. In tegenstelling tot fotonen met lagere energie, zoals die welke worden gebruikt in fluorescentiemicroscopie, zijn röntgenfotonen voldoende energetisch om strakke gehouden elektronen uit een binnenste schil volledig te verdrijven. Een elektron uit een hogere energie schil zal dan in de vacature vallen. Er wordt een foton vrijgelaten dat evenredig is aan het energieverschil tussen de twee schalen. Elk element zendt een uniek setje fotonen, of spectrum, uit die kan worden gebruikt om het element te identificeren en de aanwezige hoeveelheid te bepalen. Dit fenomeen staat bekend als röntgenfluorescentie.
Zodra een elementair spectrum is verzameld, kunnen de signalen van elementen van belang worden geïsoleerd. Metingen kunnen worden genomen op meerdere locaties over een monster, waardoor een afbeelding wordt gegenereerd, één pixel per keer. Dit proces staat bekend als rasterscannen. Afbeeldingen van alle elementen van belang kunnen vervolgens worden gegenereerd. Deze elementaire kaarten leveren waardevolle informatie over het monster op. Met een begrip van XRF ben je nu klaar om een biologisch celmonster voor te bereiden om elementaire kaarten te genereren.
Om te beginnen, bereid en steriliseer eerst een siliciumnitride venster, dat het monster tijdens de scan op zijn plaats zal houden. Wees voorzichtig, want ze zijn erg kwetsbaar. Orienteer het venster zodat het met de platte kant naar boven ligt. Plaats vervolgens het venster in een kweekschaal en hecht het aan de schaal met behulp van kleine stukjes plakband.
Steriseer ten slotte het siliciumnitride venster gedurende 1 uur met UV-straling.
Nu het venster is gesteriliseerd, kan het monster eraan worden bevestigd. Houd eerst de kweekschaal onder een hoek en voeg media toe aan de zijkant van de schaal. Verminder langzaam de kanteling om het venster te bedekken. Voeg cellen op dezelfde manier toe aan de schaal en incubeer.
Observeer de cellen periodiek onder een lichtmicroscoop totdat ze klaar zijn om te gebruiken.
In een laminaire stromingskast, aspireer voorzichtig het medium van de schaal.
Spoel vervolgens de cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing om overtollig medium te verwijderen.
Aspireer de PBS en fixeer de cellen met paraformaldehyde. Verwijder na 20 minuten het mengsel en doe het weg als gevaarlijk afval.
Verwijder het venster uit de schaal en dep snel de randen en de achterste inkeping van het venster met een Kimwipe. Leg het venster op een schone ondergrond om te drogen.
Zodra het monster droog is, verifieer de aanwezigheid van cellen op het venster met een lichtmicroscoop.
Bevestig het venster met heldere nagellak aan een aluminium houder.
Plaats de monstershouder in de instrumentmontage en plaats vervolgens de montage op de positioneringsfase van de röntgenmicroscopen.
Plaats het monsterscherm op het brandpunt van de röntgenmicroscoopoptiek, met een hoek van 45 graden ten opzichte van de invallende straal.
Verlaat het instrumentgebied en voer de resterende stappen op afstand uit om blootstelling aan röntgenstralen te minimaliseren.
Open de sluiter en gebruik optiek om de monochromatische röntgenstraal tot een sub-micrometer spotgrootte te focussen.
De positie van de spot kan worden afgebeeld met een voorgecalibreerde camera. Gebruik de positioneringsfasen om de juiste breedte en hoogte te bepalen die nodig is om over het monster te rasteren.
Verzamel een testspectrum van het element van belang met een verblijftijd van 1 à 2 seconden.
Kies uit het testspectrum een geschikte scantijd om een voldoende signaal-ruisverhouding voor de elementen van belang te bieden.
Bepaal vervolgens de resolutie die nodig is voor het monster. De resolutie moet kleiner zijn dan de kenmerken van belang, maar groter dan de spotgrootte. Programmeer ten slotte de scan in de scansoftware en verzamel het beeld.
In dit experiment werd een elementaire kaart van een cel uitgevoerd voor verschillende elementen. Veel metalen, zoals koper, ijzer en zink zijn belangrijke voedingsstoffen in de cel en werden duidelijk binnen de cel geïdentificeerd.
Door te bepalen waar elk metaal zich in de cel bevindt, kan waardevolle informatie worden verkregen over de normale cellulaire processen. Bovendien kunnen metaalgebaseerde ziekten worden begrepen.
Röntgenfluorescentie wordt gebruikt in een breed scala aan wetenschappelijke velden. De niet-destructieve aard van XRF maakt het gebruik ervan mogelijk in de studie van historische artefacten. Kunsthistorici gebruiken de techniek om de oorspronkelijk gebruikte pigmenten in kunstwerken te bepalen. Dit kan informatie over het werk verduidelijken, zoals de herkomst, kleuren die na verloop van tijd zijn vervaagd en de authenticiteit. Forensische wetenschappers gebruiken XRF ook bij onderzoek op misdaadplekken. Wanneer een pistool wordt afgevuurd, wordt het omringende gebied bedekt met pistoolschotresten. Pistoolschotresten bevatten buskruit, ontstekingsprimer en metaal uit de huls en de kogel. De met XRF verzamelde informatie kan de dader en het
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does X-ray fluorescence differ from traditional fluorescence microscopy?
XRF uses high-energy X-ray photons that expel tightly held electrons from inner shells, whereas traditional fluorescence microscopy uses lower-energy visible light and light-active molecules. X-ray photons are energetic enough to cause inner-shell ionization, producing characteristic fluorescent radiation unique to each element that enables elemental identification and quantification.
Q2: What happens when an X-ray photon collides with an atom in XRF?
A high-energy X-ray photon expels an electron from an inner shell of the atom. An electron from a higher-energy shell then falls into the vacancy, releasing a secondary photon proportional to the energy difference between the two shells. This emitted photon is characteristic of the specific element and forms the basis of elemental identification.
Q3: What types of samples can be analyzed using X-ray fluorescence?
XRF can be applied to biological, forensic, environmental, and art samples in various forms including powders, crystals, and liquids. The non-destructive nature of XRF makes it ideal for analyzing historical artifacts, crime scene evidence, and paleontological fossils without damaging the original material.
Q4: How are elemental maps generated in XRF analysis?
Once an elemental spectrum is collected, signals of elements of interest are isolated and measured at multiple locations across a sample through raster scanning. This pixel-by-pixel process generates images for all elements of interest, producing elemental maps that reveal the spatial distribution and concentration of specific elements within the sample.
Q5: Why is sample preparation important before XRF analysis of biological cells?
Proper sample preparation ensures cells adhere securely to the silicon nitride window and remain intact during analysis. Sterilization with UV radiation, fixation with paraformaldehyde, and careful handling prevent contamination and cell damage, enabling accurate elemental mapping and reliable identification of metals like copper, iron, and zinc within cellular structures.
Q6: What information can forensic scientists obtain from XRF analysis of gunshot residue?
Gunshot residue contains gunpowder, ignition primer, and metal from the casing and bullet. XRF identifies the elemental composition of this residue, providing information that can identify the culprit and weapon used in crime scene investigations through the characteristic metal signatures present in the residue.
Q7: How does XRF contribute to understanding paleontological specimens?
By characterizing the elemental composition of fossils using XRF, researchers gain new information about long-extinct life forms. Better-preserved samples can reveal the elemental composition of soft tissues that deteriorated millions of years ago, providing insights into ancient organisms and their biological processes.