Röntgenfluorescentie (XRF)

1. Voorbereiding van de Silicium Nitride Ramen

1. Gebruik omgekeerde pincetten om een raam op te pakken (silicium nitride ramen zullen breken als ze vallen).
2. Plaats het raam op een glazen plaat, met de platte kant omhoog.
3. Bevestig kleine stukjes plakband aan de zijkanten van het raam en gebruik deze om de ramen aan de onderkant van de kweekschaal te bevestigen.
4. Steriliseer de ramen in kweekschalen met UV-straling. Dit kan worden bereikt met de automatische crosslink-instelling op een UV-crosslinkingkast, gevolgd door verdere UV-bestraling onder de UV-lamp in de laminaire flowkap gedurende ongeveer 1 uur.

2. Het plateren van de cellen op de gesteriliseerde silicium nitride ramen

1. Houd de schaal met een hoek van ongeveer 45°.
2. Voeg media toe door te pipetten naar de zijkant van de schaal en verminder langzaam de hoek om het raam met media te bedekken.
3. Voeg cellen toe aan de kweekschaal, op dezelfde manier, en incubeer.
4. Observeer de cellen af en toe met een lichtmicroscoop om te bepalen wanneer ze klaar zijn om te gebruiken.

3. Fixatie en drogen van cellen

1. Verwijder in een laminaire flowkap het media door voorzichtig te aspireren terwijl de schaal wordt gekanteld zoals hierboven beschreven.
2. Voeg PBS toe, pipetten naar de zijkant van de schaal terwijl deze onder hoek wordt vastgehouden. Verminder langzaam de hoek om het raam met PBS te bedekken.
3. Verwijder de PBS door voorzichtig te aspireren.
4. Pipetten naar de zijkant van de schaal, en terwijl deze onder hoek wordt vastgehouden, voeg 4% PFA/PBS, pH 7 toe om de cellen te bedekken. Laat 20 min. op kamertemperatuur staan.
5. Verwijder het PFA/PBS mengsel en verwijder als gevaarlijk materiaal.
6. Voeg PBS toe, pipetten zoals hierboven beschreven.
7. Herhaal stappen 3.5 en 3.6 tweemaal.
8. Verwijder de PBS door voorzichtig te aspireren.
9. Voeg 20 mM PIPES, 200 mM sucrose, pH 7 toe.
10. Verwijder de PIPES/sucrose door voorzichtig te aspireren.
11. Herhaal stappen 2.8 en 2.9 tweemaal.
12. Dep de randen en de achterkant van het raam snel af met een Kimwipe, en zet het raam vervolgens op een schone oppervlakte, zoals een rubberen rooster, om te drogen.

4. Röntgenfluorescentiebeeldvorming van cellen

1. Zodra het monster droog is, controleer de aanwezigheid van cellen op de ramen met een lichtmicroscoop.
2. Gebruik nagellak om de ramen op een aluminium houder te bevestigen die door de straallijn wordt geleverd.
3. Plaats de aluminium houder in een kinematische montage en plaats deze vervolgens op de juiste positie op het brandpunt van de optica in de röntgenmicroscoop, en onder een hoek van ongeveer 45° ten opzichte van de invallende röntgenstraal, gemonteerd op de monster nanopositioneringsfasen.
4. Verlaat het röntgenmicroscoop instrumentgebied (meestal een hutje gemaakt van loodwanden) en open de sluiter. Voer de resterende stappen op afstand uit.
5. Gebruik ofwel een zoneplaat, ofwel Kirkpatrick-Baez spiegels om de monochromatische röntgenstraal (meestal 10 keV in energie) te focussen tot een sub-micron spotgrootte.
6. Gebruik de nanopositionerings monsterfasen, en bekijk de positie van de röntgenstraal op het monster met een vooraf gekalibreerd downstream scintillatorcamera, bepaal de juiste breedte en hoogte van de rasterscan om gegevens van het monster te verzamelen.
7. Met de golflengte-dispersieve silicium drift detector op 90° ten opzichte van de invallende straal, en ongeveer 3 mm of minder van het monster, verzamel een testspectrum met een verblijfsduur van 1-2 sec.
8. Bekijk het testspectrum, kies een geschikte verblijfsduur voor de scan, om voldoende signaal-ruis te bieden voor de elementen van belang.
9. Kies een geschikte resolutie voor de scan, een die niet aanzienlijk kleiner is dan de spotgrootte van de straal op het monster, noch groter dan de interessante kenmerken in het monster.
10. Programmeer de scan in de scanning software en verzamel het beeld.