Name: Het gebruik van Ex Vivo Whole-orgel imaging en kwantitatieve Tissue histologie van de Bio-verdeling van fluorescent gelabelde moleculen te bepalen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Leer ex vivo whole-organ imaging voor bioverdeling van fluorescent gelabelde verbindingen in hele dieren. Deze kosteneffectieve methode biedt snelle vergelijkingen tussen verschillende therapeutische stoffen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gedeeltelijke salarisondersteuning voor GLB wordt verstrekt door NIH-subsidie R01HL121527. JWDM wordt ondersteund door de Currier Fellowship in Neurologie.

Let op: alle dieren gebruik in dit protocol werd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Mississippi Medical Center goedgekeurd. 1. Behandeling van Dieren en weefsels <ol><li> Administratie en Sacrifice <ol><li> Verdoven van de dieren met behulp van 3% isofluraan voor 5 min en controleer de diepte van anesthesie door het observeren van de afwezigheid van de teen-pinch reflex. Toepassen veterinaire zalf voor de ogen te voorkomen droogheid terwijl onder verdoving. </li><li> Weeg het dier en Pipetteer 50 mg / kg dosis van ofwel rhodamine gemerkte ELP, SynB1-ELP of Tat-ELP in een 1,5 ml buis. Opslaan 100 pi van de toegediende gemerkte verbindingen voor bereiding van standaard curves in latere stappen. Opmerking: Het is belangrijk dat normen uit dezelfde partij gemerkt eiwit toegediend aan dieren om verschillen van de variabiliteit van fluorescente merkingsefficiëntie voorkomen. Met het oog op de achtergrond FLUORES goed te verwijderencentie uit latere fluorescentiemetingen, moet een onbehandeld dier geofferd volgens dezelfde methoden / reagentia behandelde dieren. </li><li> Dien een intraveneuze injectie zoals eerder beschreven 1 met behulp van de staartader of de lies (die toegankelijk is via een 1 cm incisie in de lies). Voor analgesie, indien het maken van een incisie lies, bestuurt carprofen subcutaan toegediend in een dosis van 5 mg / kg en sensorcaine toepassing op de incisie voor het sluiten van een wond clip. Te beheren via de intranasale (IN) route, plaats het dier in rugligging. </li><li> Met behulp van een 2-pi pipet, het opstellen van een 1-pi druppel gemerkte verbinding. Verschuift u kop van het dier uit de narcose kraag om toegang tot de neusgaten toestaan. </li><li> Plaats de punt van de pipet om de opening van een enkele nare en langzaam op de zuiger, waardoor de druppel naar beneden te lopen het nare in de neusholte. Herhaal elke 1 min, afwisselend neusgaten elke druppel totdat de volledige dosis is adgediend. Opmerking: Het maximale volume toegediend via IN mag niet meer dan 10 - 15 pi muizen. </li><li> Laat de dieren in de rugligging onder narcose gedurende 10 minuten na de laatste toediening alvorens ze elk in een individuele kooi. Opmerking: Laat de dieren niet onbeheerd achter te laten totdat ze voldoende bewustzijn hebben herwonnen om borstligging handhaven. </li><li> 1 uur na toediening, re-verdoven van de dieren als voorheen en offeren ze via transcardial perfusie met behulp van PBS (210,0 mg / l KH 2 PO 4, 9,000.0 mg / l NaCl, 726 mg / l Na 2 HPO 4 .7H 2 O) op 10 ml / min voor een totaal van 20 ml. Opmerking: de perfusie van de dieren bij offer al het bloed uit de weefsels te verwijderen moet het extravasculaire concentratie van de gelabelde verbindingen vast te stellen. Perfusie reagentia kunnen leiden tot wijzigingen in de achtergrond fluorescentie en consistent moeten worden gehouden. De werkwijze van het offer dient consistent te zijnbinnen groepen. Verschillende methoden van opoffering kan resulteren in verschillende niveaus van bloed binnen de vasculatuur, veranderen de achtergrondfluorescentie van de weefsels. </li></ol></li><li> Het verzamelen van weefsels <ol><li> Bereid PBS zoals boven beschreven voor het spoelen van de weefsels verwijderd. Opmerking: Als een andere buffer werd gebruikt als perfusievloeistof, spoel weefsels in dezelfde buffer. </li><li> Verwijder het hart, longen, maag, lever, milt en nieren door eenvoudige dissectie. Kort spoelen in PBS voordat met behulp van lab doekjes droog te deppen of lont weg overtollig vocht en het plaatsen van de weefsels naar de beeldvorming mat. </li><li> Onthoofden de muis en verwijder de top van de schedel met behulp van bot frezen of rongeurs. Met behulp van een tang, verwijder voorzichtig de hersenen, het bijhouden van de olfactorische bollen intact. Spoel, droog en plaats deze op de meegeleverde imaging mat. </li><li> Aan het ruggenmerg te verwijderen via een snelle uitworp 7, het invullen van een 10-mL spuit met PBS en bevestig een afgestompt 18-gauge naald. Let op: 18 gauge fitsde volwassen wervelkanaal van veel muis lijnen. De vereiste diameter verschilt naargelang grootte van het dier. </li><li> Plaats het dier in de buikligging, ervoor te zorgen dat de opening van het wervelkanaal aan de onthoofding plaats is afgesneden en vrij van bloed. </li><li> Verwijder de huid rond de wervelkolom. Met behulp van scherpe bot snijders of schaar, snijden door de wervelkolom in de lumbale gedeelte direct rostraal van de heupen. </li><li> Kort spoelen met PBS om het wervelkanaal te visualiseren. Steek de naald in het wervelkanaal. Opmerking: De naald moet behaaglijk voelen en kunnen sommige langzame rollen heen en weer tijdens het inbrengen vereisen. Moet de naald helemaal los, kan een meer rostrale snede worden gemaakt of een grotere diameter naald nodig zou zijn. </li><li> Met duim en wijsvinger, druk uitoefenen op de wervelkolom rond de ingestoken naald. Druk de zuiger met matige en constante druk. Het ruggenmerg intact uit de rostrale opening uit te werpen in het ruggenmergkolom. Opmerking: de volledige verwijdering, spoelen en drogen van alle belangrijke organen redelijkerwijs kan worden afgerond in 5-7 min. Deze korte tijd voorkomt de noodzaak van langdurige opslag in PBS, die kunnen leiden tot overmatige blootstelling aan licht en de uitloging van gelabelde proteïnen uit het weefsel. </li></ol></li></ol> 2. Whole-orgel Ex Vivo Fluorescence Imaging <ol><li> Imaging parameters <ol><li> Start de afbeelding acquisitie software. In de rechterbenedenhoek van de overname control panel, klikt u op &quot;initialiseren.&quot; </li><li> Onder &#39;imaging-modus, &quot;selecteert u de&quot; fluorescerende &quot;checkbox. Onder &quot;exposure tijd&quot;, selecteer &quot;AUTO.&quot; </li><li> Onder &quot;binning&quot; te selecteren &quot;kleine&quot; en zet de F / Stop om 2. </li><li> Selecteer de 535-nm excitatie en 580 nm emissie filters. Opmerking: Dit zal variëren afhankelijk van het etiket. </li><li> Selecteer &quot;Field of View B&quot; en stel de target hoogte 0,3 cm. Opmerking: Dit zal variëren afhankelijk van het weefsel af te beelden. </li><li> Zodra de temperatuurindicator groen wordt (wat betekent dat de machine volledig geïnitialiseerd), plaatst de weefsels op de ontvangen zwarte achtergrond mat, zodat de weefsels volledig van elkaar gescheiden. Plaats de mat in de imager, ervoor te zorgen dat alle weefsels binnen het geselecteerde gebied net. Grotere en niet-homogene weefsels, zoals de lever geheel moet worden aangelegd teneinde overlap van de lobben verminderen. Opmerking: Weefsels kunnen samen in één enkele groep, waardoor een afbeelding op een enkel dier of alle weefsels van hetzelfde type tegemoet. Dit maakt analyse en organisatie gemakkelijker later. Als grote verschillen in fluorescentie-intensiteit tussen verschillende weefsels aanwezig zijn, is het het beste om ze afzonderlijk beeld of groepen van hetzelfde weefseltype als één belichtingstijd niet ideaal voor alle weefsels intensiteit. </li><li> Klik op &#39;Acquire&#39;. </li><li> Na beeldvorming, verwijder de weefsels onmiddellijk en op te slaan of te bevriezen ze voor de kwantitatieve histologie, zoals beschreven in stap 4. </li></ol></li></ol> 3. Normen en Beeldverwerking <ol><li> normen <ol><li> In PBS Maak tweevoudige seriële verdunningen van elk eiwit voor de behandeling van de dieren vanaf de oorspronkelijke concentratie, met een totaal van 15 verdunningen. Opmerking: Het concentratietraject moeten gericht zijn op de verwachte weefselconcentraties omvatten kunnen extra verdunningen van de oorspronkelijke monster vereist, afhankelijk van de uitgangsconcentratie. </li><li> Pipetteer 100 ul van elke standaard in elk putje van een zwarte 96-putjesplaat. Omvatten een bron van zuiver PBS als maatstaf voor de achtergrondfluorescentie te verkrijgen. </li><li> Afbeelding normen met dezelfde parameters voor weefsel imaging. </li><li> In de afbeelding acquisitie software &quot;Tool Palette&quot; onder &quot;ROI Tools&quot; selecteer de &quot;Region of Interest (ROI) &quot;Cirkel en trek de ROI rond één goed. Kopieer dat ROI op alle andere gevulde waterputten en klik op &#39;meten van de ROI. &quot; </li><li> Trek de gemiddelde waarde stralende efficiëntie van de zuivere PBS uit de waarden van de andere normen; Dit verwijdert de achtergrondfluorescentie. Zet de waarden ten opzichte van de bekende concentratie op een scatter plot. Opmerking: De resulterende vergelijking van de lineaire trendlijn kan dan worden gebruikt om de relatieve fluorescentie berekenen. </li></ol></li><li> Afbeelding verwerken <ol><li> In de afbeelding acquisitie software, selecteert u de freeform ROI gereedschap en trek ROI rond elk van de afzonderlijke weefsels. Klik op &quot;maatregel.&quot; </li><li> Met de verkregen gemiddelde stralende rendementsmetingen, trekt de gemeten waarden van de onbehandelde dieren voor elk weefseltype en plotten deze waarden op de eerder gemaakte standaardcurve. Opmerking: De resulterende relatieve fluorescentiewaarden een snelle en nauwkeurige momentopname van debiodistributie van de gemerkte verbinding. </li></ol></li></ol> 4. Kwantitatieve Tissue Histologie <ol><li> Voorbereiding en Bevriezing van weefsels voor het snijden <ol><li> Maak of kopen containers van voldoende omvang om de gekozen weefsel bevriezen en cryostaat te gebruiken. Wrapping aluminiumfolie rond een voldoende grootte en vorm object werkt goed. </li><li> Maak een mengsel van isopropanol en droog ijs met de helft van een 500-ml bekerglas met droog ijs en toevoegen van ~ 350 ml isopropanol zodat er voldoende vloeistof boven het droogijs bij bevriezing container gedeeltelijk onderdompelen. Opmerking: Vloeibare stikstof vaak tot de breuk van de optimale snijtemperatuur verbinding (OCT) en ingebedde weefsels en moet worden vermeden. </li><li> Vul de bevriezing container gedeeltelijk met oktober, ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Als er luchtbellen, werken de bubbels uit de oplossing met behulp van een tang of een soortgelijk implementeren. </li><li> Verwijder het weefselvan PBS en droog het grondig, hetzij door zachtjes te deppen met een lab doekje of door het aanraken van de randen van gevoelige weefsels naar een lab te vegen en waardoor de vloeistof lont weg. </li><li> Plaats het weefsel voorzichtig in de oktober in de bevriezing container, zodat niet te bellen te introduceren onder het weefsel. Zodra het weefsel is geplaatst, voeg oktober totdat het weefsel volledig bedekt. </li><li> Dompel de bevriezing container zoveel mogelijk is zonder dat de isopropanol in aanraking komt met de blootgestelde oktober in de houder komen. Toestaan ​​30-90 s (of potentieel voor groter weefsels) voor oktober en weefsel volledig bevriest voor bewaren bij -80 ° C voor zo lang als nodig is. </li></ol></li><li> Voorbereiding van de normen voor het snijden. <ol><li> Bereiden en passend label 1 ml spuiten voor eenmalig gebruik door het verwijderen van het van de cilinder, zodat de gehele lengte van de injectiespuit een diameter. Hierdoor zal de bevroren cilinder later worden geduwd. </li><li> Onsing oktober Maak een 15-stap tweevoudige seriële verdunning van de toegediende verbindingen, zoals met PBS werd gedaan eerder, maar met een uiteindelijk resulterende volume van 1 ml. Omvat één monster van pure oktober voor het verwijderen van de achtergrond fluorescentie waarden. </li><li> De viscositeit van oktober maakt adequate menging moeilijk. Omkeren van de buizen en laat de oktober compleet tot rust komen voordat u deze weer omkeren. Herhaal dit 10-20 keer om een ​​gelijkmatig mengsel te verzekeren. Houd de standaardoplossingen bij 4 ° C en tegen licht tijdens het mengen. </li><li> Na menging nogmaals bereid een mengsel van isopropanol en droog ijs, zoals voorheen. Opmerking: Vloeibare stikstof kan ook worden gebruikt in plaats van isopropanol / droogijs mengsel, op voorwaarde dat de injectiespuiten worden snel verwijderd nadat ze vast bevroren. </li><li> Teken de oktober norm in de spuit, en zorg ervoor dat zo weinig belletjes mogelijk in te voeren. Na het opstellen van de oktober-oplossing, direct dip de spuit direct in de isopropanol en laat de oplossing om volledig te bevriezenbinnen de spuit van 10 - 20 s. Bewaar de spuiten bij -80 ° C voor zo lang als nodig. </li></ol></li><li> Het snijden van weefsels en Normen <ol><li> Plaats beide weefsels en normen -20 ° C en voldoende tijd voor alle monsters op temperatuur te komen. Opmerking: de ideale scherpe temperatuur daalt over het algemeen rond de -10 ° C bereik voor de meeste weefsels, maar het hangt uiteindelijk af van weefsel grootte en vetgehalte en dient empirisch te worden verfijnd. </li><li> Met behulp van een cryostaat gesneden weefsels in 20 urn dikke plakken en zet ze op objectglaasjes, zoals eerder beschreven 8. Bewaar de objectglaasjes bij -20 ° C en houd ze tegen licht zoveel mogelijk tijdens het snijden en tot het scannen. Opmerking: Het is van belang dat de secties te meten adequaat is verdeeld door de gehele dikte van het weefsel. </li><li> Aan de normen op de cryostaat boorkop te monteren, neem de spuit uit de vriezer en warm het buiten voor 3-5 s door holding in de hand. Duw de zuiger tot een kort gedeelte (~ 1 cm) van de oktober cilinder buiten de spuit. <ol><li> Met behulp van een scheermesje, dwars door de cilinder en plaatst de resulterende cilinder sectie loodrecht op de boorkop, met behulp van oktober om het te houden op zijn plaats. Deze configuratie zou leiden tot welomschreven cirkels wordt gesneden. </li></ol></li><li> Snijd de cilinders bij 20 micrometer, het plaatsen van één snee van elke verdunning op een enkele dia, zodat één dia vertegenwoordigt de gehele standaard curve. Bewaar de objectglaasjes bij -20 ° C tot klaar voor scanning. </li></ol></li><li> Scannen en kwantificering <ol><li> Start de scan reeks software en klik op &quot;543 laser&quot; om de laser startup procedure te beginnen. Wacht 15 min voor de laser om klaar te krijgen. </li><li> Zodra de laser klaar is, verwijdert de schuiven van -20 ° C en zet ze in een grote, licht doorlaat temperatuur komen en drogen 3 min. Hiermee wordt voorkomen dat vocht ophoping in de slide scanner. </li><li> Plaats de dia in de dia houder op de dia scanner. Klik op &quot;scan&quot; en selecteer &quot;run gemakkelijk scan.&quot; </li><li> Stel de scanresolutie tot 50 pm. </li><li> Selecteer het eerste vakje &quot;Use&quot; onder &quot;Fluorofoor&quot; en selecteer &quot;TRITC.&quot; Stel de PMT Gain tot 80%. Opmerking: Deze instellingen zijn afhankelijk van de fluorofoor en de concentratie van de gelabelde moleculen. </li><li> Aan de linkerkant, ervoor te zorgen dat de scan gebied omvat de hele dia. Klik op &quot;Start.&quot; </li><li> Na het scannen, kies &quot;file&quot; en &quot;opslaan als&quot; en sla het beeld als een .tif. Let op: Slides van weefsels en normen moeten worden gescand op dezelfde instellingen. </li><li> Laad de resulterende afbeeldingen in ImageJ en selecteer ROI rond de weefsels en normen. Onder het tabblad &quot;analyseren&quot;, selecteer &quot;set metingen&quot; en selecteer &quot;betekenen grijswaarde.&quot; Klik op220; maatregel &quot;. Opmerking: Zoals voor het voorgaande techniek moet achtergrondfluorescentie worden afgetrokken van alle meetwaarden. </li><li> Plot van de gemiddelde grijswaarde metingen van de normen die ten opzichte van de bekende concentratie om een ​​standaard curve te creëren. Opmerking: De verkregen metingen van de weefsels dient in elk weefsel worden gemiddeld en uitgezet op die standaardcurve om de concentratie in het weefsel bepalen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Polypeptide+Drug+Carrier+for+Maternal+Delivery+and+Prevention+of+Fetal+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Drug+Target%22%5BJournal%5D)">A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure.</a> J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).</li>
<li>George, E. M., Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+purification+and+delivery+systems+%28PADS%29+for+therapeutic+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Vasc.+Cell%22%5BJournal%5D)">Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis.</a> Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermally+Targeted+Delivery+of+a+c-Myc+Inhibitory+Polypeptide+Inhibits+Tumor+Progression+and+Extends+Survival+in+a+Rat+Glioma+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model.</a> PLoS One. 8 (1), (2013).</li>
<li>Liu, H., Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+improved+blood%E2%80%93brain+barrier+permeability+of+endomorphin-1+using+the+cell-penetrating+peptide+synB3+with+three+different+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">The improved blood–brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages.</a> Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).</li>
<li>Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritoneal+absorption+of+macromolecules+studied+by+quantitative+autoradiography%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography.</a> Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).</li>
<li>Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+characterization+of+human+ovarian+cancer+cells+in+a+rat+model+of+intraperitoneal+antineoplastic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy.</a> J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).</li>
<li>Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li>
<li>Currle, D. S., Monuki, E. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+Freezing+and+Cryosectioning+E12.5+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.+JoVE%22%5BJournal%5D)">Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198(2007).</li>
<li>Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+penetrating+peptides+fused+to+a+thermally+targeted+biopolymer+drug+carrier+improve+the+delivery+and+antitumor+efficacy+of+an+acid-sensitive+doxorubicin+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative.</a> Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).</li>
<li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).</li>
<li>Vugmeyster, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+toxicology+of+therapeutic+proteins%3A+Advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges.</a> World J. Biol. Chem. 3 (4), 73(2012).</li>
<li>Stumpf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+and+microscopic+autoradiography+to+determine+tissue+distribution+of+biopharmaceuticals+-+Target+discoveries+with+receptor+micro-autoradiography+engendered+new+concepts+and+therapies+for+vitamin+D%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals - Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).</li>
</ol>

GLB is eigenaar van Leflore Technologies, LLC, een particulier bedrijf dat zich bezighoudt met de ontwikkeling van op ELP gebaseerde technologie voor geneesmiddelafgifte. Leflore Technologies heeft geen steun verleend voor de publicatie van dit artikel of voor het genereren van gegevens daarin.

Terwijl ex vivo hele orgel beeldvorming is over het algemeen eenvoudig, kan de naleving van een aantal fundamentele concepten en technieken de nauwkeurigheid van bio-distributie metingen te verbeteren. Korte golflengten van lichtervaring een hoge mate van verstrooiing en absorptie in de meeste weefsels, die aanzienlijk invloed op de bruikbaarheid van de korte-golflengte fluoroforen. Deze fluoroforen hebben een beperkte toepassing in diepe weefsel studies, maar ze zijn effectief gebruikt in experimenten te kijke...

Fluorescentielabelling is een gemakkelijk benut en effectieve werkwijze voor het bepalen van de biologische verdeling van verbindingen met een reeks van apparatuur die wordt veel laboratoria voorkomende. Fluoroforen zijn overal verkrijgbaar, relatief goedkoop en zijn in verschillende golflengten, zodat meerdere gelabelde moleculen gelijktijdig kunnen worden gebruikt zonder interferentie. Meeste fluoroforen hebben verschillende chemie voor conjugatie aan verschillende reactieve groepen op doelverbindingen, en het proces van conjugatie algemeen eenvoudiger voor de meeste types reactieve plaatsen. Bovendien moeten de voor de metingen van fluorescent gemerkte verbindingen apparatuur in veel laboratoria. Fluorescerende microscopen, imagers, en schuif scanners kunnen allemaal worden gebruikt in verschillende omstandigheden, waardoor het gebruik van fluorescerende labeling zeer toegankelijk. Fluorescerende merkers worden veelvuldig gebruikt om de biodistributie en kinetiek van verbindingen zowel in vivo als ex viv bepaleno met live imaging-apparaten, zoals de IVIS Spectrum Imager, en door middel van kwantitatieve weefsel histologie 2,3. Het gebruik van ex vivo geheel-orgaan beeldvorming met levende-beeldvorming is toegenomen in de tijd vanwege hun gebruiksgemak en het vermogen om snel een nauwkeurige vergelijking van de relatieve concentraties van gelabelde verbindingen te maken zonder dat de verdere verwerking van tissues4. Hoewel ex vivo gehele orgaan beeldvorming kan zorgen voor een gemakkelijke analyse en vergelijking, genereert geen een kwantitatieve maat absolute verbinding concentraties in weefsel. Dit komt door lichtverstrooiing effecten op organen intact. Aangezien lichtverstrooiing (en, in mindere mate, absorptie) afhankelijk van weefselgrootte en dichtheid kunnen geheel-orgaan imaging onderschatten weefselconcentraties in grote of dichte organen. Het formuleren van de juiste normen voor de absolute concentratie metingen is ook moeilijk omdat men de dikte moet nabootsenen dichtheid van elk orgaan. Anderzijds, hele organen beeldvorming is een snelle methode om de relatieve weefselconcentraties van een middel, en het is ideaal voor het vergelijken van de relatieve biodistributie van meerdere gerelateerde moleculen (zoals drug targeting studies). Een andere mogelijkheid is kwantitatieve fluorescentie histologie, een techniek afgeleid van de werkwijze van kwantitatieve autoradiografie gebruiken, absolute weefselconcentraties van een testmiddel 5,6 te verkrijgen. In plaats van het plaatsen van een hele dier of orgaan in een verbeelding apparaat, kwantitatieve weefsel histologie vereist dat elk weefsel worden gesneden, gemonteerd op dia&#39;s, gescand en individueel geanalyseerd. Normen van het testmiddel worden bereid en gesneden op dezelfde dikte als orgaanmonsters. Door snijden van alle organen en normen dezelfde dikte, is variatie door licht verstrooiing of absorptie verwijderd en weefsel fluorescentie-intensiteit kan fit met de standaardkromme om te bepalen absolute concentrantsoen. Hoewel deze methode, wanneer goed uitgevoerd, is kwantitatief, is arbeidsintensief en gemakkelijk verkeerd. Gezien de complexe aard van kwantitatieve histologie en de aanzienlijk hogere arbeidskosten in vergelijking met hele-orgaan beeldvorming, wordt het zinvol te onderzoeken waarbij elk proces het meest praktisch in gebruik bij het onderzoek van de biologische verdeling van fluorescent gemerkte verbindingen. Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van deze werkwijzen samen kunnen worden gebruikt om efficiënt vergelijken de biodistributie van rhodamine gemerkte elastine-achtig polypeptide (ELP), met of zonder toevoeging van de SynB1 of Tat-cel penetrerende peptiden, via de intranasale (IN) en intraveneuze (IV) toediening routes.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maleimidederivaten van fluoroforen (bijv. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide)</td><td>Thermo Fisher</td><td>T6027, A20342</td><td>Thiol-reactieve fluorescente kleurstoffen voor het labelen van eiwitten</td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing</td><td>Sigma</td><td>1002243569</td><td>PBS-buffer voor spoelen</td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4585</td><td>Gebruikt voor bevriezen en monteren</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Voor ex vivo beeldvorming van hele organen</td></tr><tr><td>Cryomicrotoom</td><td>Thermo</td><td></td><td>Voor cryosecteren</td></tr><tr><td>Fluorescentie-foliescanner</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Voor het scannen van folies</td></tr></tbody></table>

het gebruik van ex vivo whole-orgel imaging en kwantitatieve tissue histologie van de bio-verdeling van fluorescent gelabelde moleculen te bepalen

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescentielabelling is een gevestigde werkwijze voor behandeling van het lot van gelabelde moleculen onder verschillende experimentele omstandigheden, zowel in vitro als in vivo. Fluorescerende probes zijn bijzonder nuttig bij het bepalen van de biologische verdeling van toegediende grote moleculen kan toevoeging van een kleine moleculen fluorescent label is onwaarschijnlijk dat de kinetiek of biodistributie van de verbinding beïnvloeden. Diverse methoden bestaan ​​om de biodistributie die aanzienlijk verschillen in de hoeveelheid inspanning vereist en of de verkregen metingen een goed kwantitatief, maar via meerdere methoden in combinatie kunnen snel en doeltreffend systeem voor het analyseren van biologische verdelingen. Ex vivo geheel-orgaan beeldvorming is een werkwijze die kan worden gebruikt om snel de relatieve concentraties van fluorescerende moleculen kunnen vergelijken weefsels en tussen verschillende typen weefsels of behandelingsgroepen. Middels een beeldvormende platformulier ontworpen voor levende dieren of hele-orgel beeldvorming, fluorescentie binnen intact weefsel kan worden bepaald zonder verdere verwerking, bespaart tijd en arbeid, terwijl het verstrekken van een nauwkeurig beeld van de totale bio-distributie. Dit proces is ideaal experimenten poging om de weefselspecificiteit van een verbinding te bepalen of de vergelijking van meerdere verschillende verbindingen. Kwantitatieve weefsel histologie anderzijds vereist uitgebreide verdere behandeling van weefsels om een ​​kwantitatieve maat van de gemerkte verbindingen te maken. Om nauwkeurig te beoordelen bio-distributie, moeten alle weefsels van belang worden gesneden, gescand, en ten opzichte van standaard curves geanalyseerd om vergelijkingen te maken tussen weefsels of groepen maken. Kwantitatieve weefsel histologie is de gouden standaard voor het bepalen van absolute verbinding concentraties in weefsels. Hier beschrijven we hoe beide methoden samen effectief kan worden gebruikt om het vermogen van verschillende toedieningsmethoden een beoordelingnd verbinding wijzigingen bij het toewijzen en fluorescent gelabelde moleculen aan het centrale zenuwstelsel 1.

Onderstaande gegevens beschrijven de levering van drie verbindingen: een drug-delivery vector bekend als ELP en twee versies van ELP gemodificeerd met cel penetrerende peptiden (SynB1-ELP en Tat-ELP) 9. Alle drie verbindingen werden gelabeld met tetramethylrhodamine-5-maleïmide en geleverd via twee toedieningsroutes (IN en IV). Het doel van deze experimenten was om te bepalen welke verbinding en toedieningsweg zou resulteren in de beste penetratie in het centrale zenuwstelsel (CNS) 3. <p class=...

Ex vivo geheel-orgaan beeldvorming is een snelle werkwijze voor het bepalen van de relatieve concentraties van fluorescent gelabelde verbindingen binnen en tussen weefsels of behandelingsgroepen. Omgekeerd kwantitatieve fluorescentie histologie, terwijl arbeidsintensiever, maakt de kwantificering van de absolute weefselconcentraties van gelabelde moleculen.

Het gebruik van Ex Vivo Whole-orgel imaging en kwantitatieve Tissue histologie van de Bio-verdeling van fluorescent gelabelde moleculen te bepalen

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Het algemene doel van deze procedure is om snel de biodistributie van fluorescent gelabelde verbindingen in hele dieren te karakteriseren. Deze methode kan worden gebruikt om de biodistributie van eiwitgebaseerde therapeutische middelen te definiëren en om de effecten van targetingmoleculen op de geïnspireerde verdeling te bepalen. De voordelen van deze techniek zijn de over het algemeen lage kosten van de vereiste reagentia en de snelheid waarmee nauwkeurige vergelijkingen kunnen worden gemaakt tussen verschillende verbindingen.Gezien de snelle vooruitgang in de ontwikkeling van biologische producten, bieden deze technieken een gemakkelijke en nauwkeurige manier om de biodistributie van verbindingen in verschillende diermodellen te bepalen. Voor ex vivo beeldvorming van hele organen, opent u eerst de software voor beeldverwerving en klikt u op initialiseren. Selecteer onder beeldmodus het selectievakje fluorescent.Selecteer onder belichtingstijd automatisch. Selecteer onder binning klein en stel de F/Stop in op twee. Selecteer de juiste excitatie- en emissiefilters voor de labels die in het experiment worden gebruikt.Selecteer vervolgens veld van zicht B en stel de doelhoogte in o

the-use-ex-vivo-whole-organ-imaging-quantitative-tissue-histology-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Plant virale nanodeeltjes (VNPs) zijn veelbelovend platform voor toepassingen in de medische biologie. Hier beschrijven we de procedures voor plantaardige VNP vermeerdering, zuivering, karakterisering, en bioconjugatie. Ten slotte tonen we de toepassing van VNPs voor tumor homing en beeldvorming met behulp van een muis xenograft model en fluorescentie beeldvorming.

Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

In dit artikel presenteren we een methode om tumor bloedvaten analyseren in vivo met behulp van dynamische contrast-verbeterde fluorescentie videomicroscopie. Twee kwantitatieve parameters werden overgenomen: functionele capillaire dichtheid als gevolg van de doorbloeding van de tumor, en de index lekkage als gevolg van de lekkage van de endotheliale wand.

In vivo beeldvorming van tumorale angiogenese met behulp van fluorescentie confocale videomicroscopie

Complex weefsel massa, van organen tumoren, zijn samengesteld uit verschillende cellulaire elementen. We opgehelderd de bijdrage van cellulaire fenotypes binnen een weefsel met behulp van multi-gelabelde fluorescerende transgene muizen in combinatie met multiparameter immunofluorescentiekleuring gevolgd door spectrale unmixing naar cel oorsprong evenals karakteristieken van de cel op basis van eiwit expressie ontcijferen.

Kwantitatieve Multispectral Analyse Na Fluorescent Tissue Transplantatie voor Visualisatie van de Cel Origins, types en interacties

Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

Beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige werkwijze voor ex vivo beeldvorming van levende het tumorcel-stroma interacties binnen longmetastasen, gebruik fluorescente reporters in muizen. Gebruik draaiende schijf confocale microscopie Deze techniek maakt visualisatie van levende cellen gedurende ten minste 4 uur en kan worden aangepast om andere inflammatoire longaandoeningen bestuderen.

Ex vivo Live-Imaging van Lung metastase en hun Microenvironment

Doelgroepen gerichte sondes vertegenwoordigen een vernieuwend hulpmiddel voor het analyseren van de moleculaire mechanismen, zoals eiwituitdrukking in verschillende soorten ziekten (b.v., ontsteking, infectie en tumorvorming). In deze studie beschrijven we een kwantitatieve driedimensionale tomografische beoordeling van intestinale macrofaag infiltratie in een lymfkliertest model van colitis met F4/80-specifieke fluorescentie-gemedieerde tomografie.

Fluorescentie-gemedieerde tomografie voor de detectie en kwantificering van macrofaag-gerelateerde lymfkliertest darmontstekingen

Dit protocol beschrijft een techniek om verschillende celpopulaties in aftappen van lymfeklieren zonder veranderingen in de orgaan structuur te beeld.

Visualisering van lymfeklieren structuur en cellulaire lokalisatie met behulp van ex-vivo confocale microscopie

De beschreven aanpak combineert experimentele staart ader metastase assays met in vivo levende dierlijke beeldvorming zodat real-time monitoring van borstkanker metastase vorming en groei in aanvulling op de kwantificering van metastasen aantal en grootte in de longen.

Gecombineerd gebruik van staart ader metastase assays en real-time in vivo beeldvorming om borstkanker te kwantificeren gemetastaseerde kolonisatie en last in de longen

We beschrijven protocollen voor het beoordelen van de mate van transductie door cel-penetrerende peptiden met behulp van ex vivo imaging systemen, gevolgd door paraffine inbedding, sectie, en confocale fluorescerende microscopie met behulp van cardiale targeting peptide als voorbeeld. In ons protocol kan één dier worden gebruikt om beide soorten beeldvormingsbeoordeling van dezelfde organen te verkrijgen, waardoor het aantal dieren dat nodig is voor studies met de helft wordt gehalveerd.

In Vivo Beeldvorming van transduction efficiëntie van cardiale targeting Peptide

Het doel van dit protocol is om fluorescerend gelabelde liposomen te synthetiseren en flowcytometrie te gebruiken om in vivo lokalisatie van liposomen op cellulair niveau te identificeren.

Voorbereiding, toediening en beoordeling van in vivo weefselspecifieke cellulaire opname van fluorescerende kleurstof-gelabelde liposomen

Spectral Iterative Bleaching Extend Multiplexity (IBEX) bouwt voort op de basis IBEX-techniek door heparineblokkering toe te voegen om niet-specifieke binding te minimaliseren en gebruik te maken van spectrale detectie met computationele ontmenging om autofluorescentie te onderdrukken. Deze aanpak versnelt de beeldacquisitie en vermindert tegelijkertijd achtergrondbronnen, waardoor robuuste multi-ronde, high-parameter ruimtelijke proteomische analyses mogelijk zijn.

High-plex beeldvorming met behulp van spectrale confocale microscopie om niet-specifieke weefselfluorescentie te minimaliseren

Leer ex vivo whole-organ imaging voor bioverdeling van fluorescent gelabelde verbindingen in hele dieren. Deze kosteneffectieve methode biedt snelle vergelijkingen tussen verschillende therapeutische stoffen.

Het gebruik van Ex Vivo Whole-orgel imaging en kwantitatieve Tissue histologie van de Bio-verdeling van fluorescent gelabelde moleculen te bepalen (Video) | JoVE Journal

Het gebruik van Ex Vivo Whole-orgel imaging en kwantitatieve Tissue histologie van de Bio-verdeling van fluorescent gelabelde moleculen te bepalen

Meer video's verkennen