Name: Het bestuderen van mitochondriale structuur en functie in Drosophila Eierstokken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Ontdek methoden voor het analyseren van mitochondriale structuur en functie in levend en gefixeerd Drosophila melanogaster weefsel. Deze technieken onthullen regulerende mechanismen van mitochondriale functionaliteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Leena Patel en Diamond Woodard voor hun hulp bij de bereiding van het Drosophila-medium en Dr. Igor Chesnokov voor het verstrekken van toegang tot de stereomicroscoop met bijbehorende camera.

<ol><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li>
<li>Youle, R. J., van der Bliek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fission%2C+fusion%2C+and+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fission, fusion, and stress.</a> Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).</li>
<li>Mitra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fission-fusion+as+an+emerging+key+regulator+of+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation.</a> Bioessays. , (2013).</li>
<li>Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+division%3A+molecular+machinery+and+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions.</a> Curr Opin Cell Biol. 23 (4), 427-434 (2011).</li>
<li>Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+functions+of+mitochondrial+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Physiological functions of mitochondrial fusion.</a> Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).</li>
<li>Liesa, M., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+in+the+regulation+of+nutrient+utilization+and+energy+expenditure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure.</a> Cell Metab. 17 (4), 491-506 (2013).</li>
<li>Hoppins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The regulation of mitochondrial dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).</li>
<li>Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+4%2C+Analysis+of+mitochondrial+dynamics+and+functions+using+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).</li>
<li>Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRP1-dependent+mitochondrial+fission+initiates+follicle+cell+differentiation+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis.</a> J Cell Biol. 197 (4), 487-497 (2012).</li>
<li>Klusza, S., Deng, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+the+crossroads+of+differentiation+and+proliferation%3A+precise+control+of+cell-cycle+changes+by+multiple+signaling+pathways+in+Drosophila+follicle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells.</a> Bioessays. 33 (2), 124-134 (2011).</li>
<li>Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+epithelial+stem+cells+and+their+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of epithelial stem cells and their niches.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (3), 447-457 (2012).</li>
<li>Parker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mitochondrial+pool+of+cyclin+E%2C+regulated+by+Drp1%2C+is+linked+to+cell-density-dependent+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation.</a> J Cell Sci. 128 (22), 4171-4182 (2015).</li>
<li>Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperfused+mitochondrial+state+achieved+at+G1-S+regulates+cyclin+E+buildup+and+entry+into+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).</li>
<li>Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+mitochondrial+axonal+transport+and+membrane+potential+without+increased+reactive+oxygen+species+production+in+a+Drosophila+model+of+Friedreich+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia.</a> J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).</li>
<li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation%3A+another+inconvenient+truth%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).</li>
<li>Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+the+Drosophila+follicle+cell+epithelium+produces+%26%2334%3Bfalse+clones%26%2334%3B+with+apparent+polarity+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces &#34;false clones&#34; with apparent polarity phenotypes.</a> Biol Open. 2 (12), 1313-1320 (2013).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+cell+cycle+progression+during+development+as+revealed+by+the+tenured+mutation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila.</a> Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).</li>
<li>Tipping, M., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+context-dependent+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis.</a> J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).</li>
<li>Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+in+Drosophila%3A+Imaginal+Discs+as+a+Model+for+Epithelial+Tumor+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation.</a> Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).</li>
<li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Kritische stappen in het protocol Photobleaching: Het voorkomen van onnodige fotobleken van TL-monsters absoluut noodzakelijk is om het uitvoeren van efficiënte confocale microscopie. Daarom moet de tijd gebruikt om monsters te lokaliseren door het oculair of beeldopname parameters via levende scanmodus worden geminimaliseerd om fotobleken te minimaliseren. Weefselbeschadiging: Aangezien mitochondria worden beschouwd als de sensoren van ce...

Mitochondriën zijn klassiek beschreven als de cellulaire powerhouse, omdat zij de belangrijkste zetels van de energieproductie in gedifferentieerde cellen. Bovendien mitochondria spelen een cruciale rol in de stofwisseling, warmteontwikkeling, lipide modificatie, calcium en redox homeostase, de orkestratie van cell signaling processen, etc 1. Mitochondriën ook een actieve rol bij de inductie van celdood 2, evenals regulering van de celcyclus 3 spelen. Dergelijke multifunctionaliteit roept de volgende fundamentele vragen: a) hoe mitochondriën presteren al deze functies gelijktijdig en b) zijn er specifieke mitochondriale zwembaden of subzones die gespecialiseerd zijn voor verschillende functies? In dit verband is het belangrijk op te merken dat de multifunctionele mitochondriën dynamisch van vorm, afmeting en structuur die afzonderlijke cellen en dat de steady-state vorm mitochondriën variëren tussen celtypen. Tientallen jaren van onderzoek uit verschillende labretorica suggereren dat de wijziging van de mitochondriale vorm, grootte en structuur, collectief genoemd mitochondriale dynamiek, is cruciaal voor het handhaven van verschillende mitochondriale functies 4,5,6. Deze bevindingen opmerkingen de mogelijkheid mitochondriën hun multifunctionaliteit kan bereiken vanwege de structurele dynamiek. Uitgebreide inspanningen worden gedaan om de mitochondriale structuur-functie relatie te begrijpen. De dynamiek van mitochondriale structuur wordt voornamelijk onderhouden door hun vermogen om splitsing en fusie gebeurtenissen ondergaan met elkaar. Splijting van grote mitochondria omzet in kleinere mitochondriale elementen, terwijl fusie tussen twee kleinere mitochondria ze over in een grotere mitochondriale element 7. Bovendien kan voorbijgaande fusie van twee mitochondria opkomen bij het mengen van de inhoud mogelijk. De splitsing en fusie gebeurtenissen van de binnenste en buitenste membranen worden zorgvuldig geregeld door specific sets van eiwitten. De kern splijting machine is samengesteld uit dynamin gerelateerd eiwit 1 (Drp1), die wordt gerekruteerd uit het cytosol naar de mitochondria van de interactie met bepaalde bonafide mitochondriale eiwitten (bijvoorbeeld Fis1 of Mff1), terwijl Drp1 functie ook kan worden geregeld andere eiwitten op het oppervlak mitochondriale 4. Hoewel Drp1 werkt op de buitenste membraan, de splitsing vaardigheden invloed hebben op de binnenste membraan ook. De orkestratie van de splitsing van de buitenste en binnenste mitochondriële membranen is niet goed begrepen. Anderzijds is fusie van het binnenste membraan beheerst de kern door de activiteiten van Opa1, terwijl mitofusins regelen de fusie van het buitenste membraan 5. Het saldo van het tegengaan van kernsplijting en kernfusie gebeurtenissen van mitochondria dicteren de steady-state mitochondriale vorm in een cel. Bijvoorbeeld, onderdrukking van mitochondriale splitsing leiden tot volledig en ongehinderd fusie, terwijl de overactiviteit van mitochondriënl splitsing zou leiden tot fragmentatie van mitochondria 3. De studie van de mitochondriale structuur-functie relatie omvat voornamelijk twee elkaar aanvullende benaderingen: a) analyses van de cellulaire en organismaal fenotypes na genetische manipulatie van mitochondriale splitsing / fusie-eiwitten en b) directe beoordeling van mitochondriale structuur en functie. Het is opmerkelijk dat genetische analyses de directe werking van het molecuul op de hand (in dit geval mitochondriale splitsing / fusie-eiwitten) niet altijd kan blijken, aangezien de fenotypes kunnen worden veroorzaakt door secundaire effecten. Het is daarom van het grootste belang te ontwikkelen en te gebruiken hulpmiddelen om mitochondriale structuur en functie direct bestuderen. Elke beoordeling van de mitochondriale structuur omvat verschillende microscopie gereedschappen. Het gebruik van fluorescentie microscopie van levende cellen is sterk gevorderd de studies van mitochondriale dynamiek, omdat mitochondriale dynamiek kan worden gecontroleerd, zowel kwalitatief als quantitattend met de juiste fluorescentiemicroscopie en -technieken 8. Fluorescentie-microscopie instrumenten ontwikkeld om mitochondriale structuur en functie te bestuderen in levende en vaste Drosophila melanogaster weefsels ophelderen van het belang van mitochondriale dynamiek in vivo 9. Deze en verwante werkwijzen worden beschreven, met als doel het bestuderen mitochondriale structuur en functie in de Drosophila eierstok. De Drosophila eierstok bestaat uit kiemlijn en somatische lijnen, die voortvloeien uit hun volwassen stamcellen die in de germarium 10,11 bevinden. Zestien syncytieel kiemcellen (GC) krijgen ingekapseld door somatische follikel cellen (FCS) aan individuele ei kamers die naar voren komen uit de germarium (figuur 1) te vormen. Eén van de 16 GC gecommit om een ​​eicel te worden, en de resterende 15 GC ontwikkelen tot verpleegkundige cellen die de groei van de eicel kamerhouderVergemakkelijking van de rijping van de eicel voordat het wordt gelegd. De meerderheid van de FC&#39;s ondergaan 9 ronden van mitotische delingen voordat ze de mitotische celcyclus verlaten terminaal differentiëren in een patroon epitheliale cellaag bestaande uit anterior follikelcellen (AFCs), posterior follikelcellen (PFK&#39;s) en hoofdlichaam cellen (MBCS) . De opeenvolgende ei kamers zijn verbonden door steel cellen die gedifferentieerd cellen die ook zijn afgeleid van het FK vroeg in de ontwikkeling. Mitochondriale vorm gereguleerd door de mitochondriale kernsplijting eiwit Drp1 is actief betrokken bij het proces van differentiatie tijdens de normale ontwikkeling van de Drosophila eierstokkanker FC laag 9,12. De in deze studies de betrokkenheid van Drp1 in Drosophila follikel cellaag ontwikkeling identificeren werkwijzen worden hier beschreven.

<table><tbody><tr><td>Grace's Media (Insect Dissecting Medium)</td><td>Fisher Scientific</td><td>30611031-2</td><td></td></tr><tr><td>41 Paraformaldehyde AQ</td><td>Electronic Microscopy Sciences</td><td>50-259-99</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Green (overall mitochondrial stain)</td><td>Life Technologies</td><td>m7514</td><td>Reconstitute en verdeel in aliquoten</td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>87917-25MG</td><td>Reconstitute en verdeel in aliquoten</td></tr><tr><td>MitoSox (Mito-Ros stain)</td><td>Life Technologies</td><td>m36008</td><td>Reconstitute en verdeel in aliquoten</td></tr><tr><td>PolyLysine</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN15017625</td><td></td></tr><tr><td>Fly Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-515</td><td></td></tr><tr><td>Fly Conicals</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-355</td><td></td></tr><tr><td>Fly Vial Flugs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS273</td><td></td></tr><tr><td>Fly Conical Flugs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS 277</td><td></td></tr><tr><td>Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS153</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cyclin E Antibody (d-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc- 33748</td><td></td></tr><tr><td>ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker</td><td>AbCam</td><td>ab14730</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-175-144</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Fisher Scientific</td><td>H100</td><td></td></tr><tr><td>Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-252</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Mat Tek Corp&nbsp;Glass Bottom Mircrowell Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Active Dried Yeast</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10140001</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Technologies</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Moria Nickel Plated Pin Holder</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7194</td><td></td></tr><tr><td>Fly Pad</td><td>Fly stuff</td><td>59-118</td><td></td></tr><tr><td>Blowgun</td><td>Fly stuff</td><td>54-104</td><td></td></tr><tr><td>Blowgun needle</td><td>Flystuff</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Analyses software</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Analyses software</td><td>Open source</td><td>Image J</td><td></td></tr><tr><td>Research Macro Zoom Microscope</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono&nbsp;</td><td>QImaging</td><td>QIC-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>QCapture Pro 5.1</td><td>QImaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

het bestuderen van mitochondriale structuur en functie in drosophila eierstokken

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analyse van de mitochondriële structuur-functierelatie is vereist voor een grondig begrip van de regulerende mechanismen van de mitochondriële functionaliteit. Fluorescentiemicroscopie is een onmisbaar hulpmiddel voor de directe beoordeling van de mitochondriale structuur en functie in levende cellen en voor het bestuderen van de mitochondriële structuur-functierelatie, die voornamelijk wordt gemoduleerd door de moleculen die de splitsings- en fusiegebeurtenissen tussen mitochondriën regelen. Dit artikel beschrijft en demonstreert specifieke methoden voor het bestuderen van mitochondriale structuur en functie in levend evenals in gefixeerd weefsel in het modelorganisme Drosophila melanogaster. Het weefsel van keuze hier is de Drosophila-eierstok, die kan worden geïsoleerd en geschikt gemaakt voor ex vivo levende confocale microscopie. Verder beschrijft het artikel hoe de mitochondriale splitsingseiwit, Drp1, genetisch kan worden gemanipuleerd in Drosophila-eierstokken om de betrokkenheid van Drp1-gedreven mitochondriale splitsing in het moduleren van de mitochondriële structuur-functierelatie te bestuderen. Het brede gebruik van dergelijke methoden wordt aangetoond in reeds gepubliceerde evenals in nieuwe gegevens. De beschreven methoden kunnen verder worden uitgebreid naar het begrijpen van de directe invloed van voedingsstoffen en/of groeifactoren op de mitochondriale eigenschappen ex vivo. Gezien het feit dat mitochondriale verstoring ten grondslag ligt aan de etiologie van verschillende ziekten, wordt verwacht dat de beschreven innovatieve methoden die zijn ontwikkeld in een genetisch hanteerbaar modelorganisme, Drosophila, aanzienlijk zullen bijdragen aan het begrip van de mechanistische details van de mitochondriële structuur-functierelatie en aan de ontwikkeling van mitochondria-gerichte therapeutische strategieën.

De beschreven werkwijzen kunnen worden gebruikt om de mitochondriale structuur en functie te bestuderen in levende en vaste Drosophila eierstokken (Figuur 2B). Verschaft zijn enkele voorbeelden van verwachte resultaten verkregen met de beschreven werkwijzen. Dissectie van de Drosophila eierstok: Wanneer verder ontleed moeten de gescheiden buik (figuur 3B) vanaf het geh...

Analyse van de structureel-functionele relatie van de mitochondriën is vereist voor een grondig begrip van de regulerende mechanismen van de functionele werking van mitochondriën. Specifieke methoden voor het bestuderen van de structuur en functie van mitochondriën in levende en gefixeerde Drosophila eierstokken worden in dit artikel beschreven en gedemonstreerd.

Het bestuderen van mitochondriale structuur en functie in Drosophila Eierstokken

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Het algemene doel van deze procedure is om methoden te demonstreren voor het bestuderen van mitochondriale structuur en functie in levend evenals in gefixeerd weefsel in het modelorganisme drosophila melanogaster. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van mitochondriale biologie te beantwoorden. Zoals de regulerende mechanismen van mitochondriale functie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze een gedetailleerde analyse uitvoert van de mitochondriale structuur/functierelatie. Na het sorteren van vijf verdoofde vrouwelijke vliegen volgens het tekstprotocol, gebruikt u onder de dissectiemicroscoop twee paren pincetten om de thorax van de buik af te snijden. Breng vervolgens de buiken voorzichtig over naar de tweede put van de schotel.Gebruik één paar pincetten om de buik aan het achterste uiteinde vast te houden, gebruik het andere paar pincetten om de eierstokken langzaam naar buiten te duwen. Gebruik vervolgens de pincetten om een individuele eierstok aan het ondoorzichtige achterste uiteinde vast te houden en verplaats deze voorzichtig naar de derde put van de schotel voor het scheiden of fixeren. Scheid voorzichtig de beschermende schede rond de eierstokken door een paar pincetten te gebruiken om het achterste uiteinde vast te houden en lichtjes te vegen met een scheidingsnaald van het achterste naar het voorste uiteinde.Om polylysine gecoate kamers voor te bereiden, plaatst u twee gescheiden druppels van 20 microliter polylysine op de glazen bodem van een glasbodem petrischaal. Laat de platen een uur lang aan de lucht drogen bij 37 graden Celsius en schets de polylysine aan de onderkant van de plaat. Stel de scanparameters in op de confocale microscoop door de software voor beeldverwerving te openen en in het tabblad verwerving de juiste scanparameters in te stellen.Vink de vakjes tijdreeks, verbleken en regio's aan om de individuele tabbladen te openen. Voer vervolgens de juiste verwervingsparameters in in elk tabblad. Plaats vervolgens een gedissecteerde en gescheiden eierstok op een gemarkeerd polylysine gecoat gebied en gebruik een scheidingsnaald om de eierstok uit te spreiden en de ovarialen te scheiden.Plaats een druppel van 10 microliter insecten dissectiemedium op de eierstok, zorg ervoor dat het hele polylysine gecoate gebied bedekt is. Bedek vervolgens de petrischaal. Direct na het monteren van de eierstok, plaatst u het monster op het microscoopplatform en gebruikt u het oculaire om snel het veld van belang in het levende weefsel te lokaliseren.Klik op live om een live beeld van het geselecteerde veld van belang te verkrijgen, klik vervolgens op stop om het live scannen te stoppen. Pas indien nodig de verwervingsparameters aan zodat het gedetecteerde fluorescerende signaal onder de verzadigingsniveaus ligt met de gedefinieerde achtergrond zoals ingesteld door de offsetwaarden aan te passen. Gebruik in het grafiektabblad het bezier-tekenhulpmiddel om een kleine ROI te tekenen om de fotoblekenzone op het beeld dat door scannen is verkregen af te bakenen.Voer vervolgens beeldacquisitie uit door op start experiment te klikken. Om levend kleuring uit te voeren met fluorescerende mitochondriale kleurstoffen, verdunt u de voorraad kleurstoffen in warm dissectiemedium tot de uiteindelijke werkconcentraties. Nadat dissectie en scheiding eerder is gedemonstreerd, plaatst u de eierstokken in 200 microliter kleuroplossing in een putje van een dissectieschaal.Bedek de schotel met aluminiumfolie verpakt in een doos om het te beschermen tegen licht en incubeer het weefsel gedurende 10 minuten. Was vervolgens de gekleurde eierstokken door ze voorzichtig met behulp van pincetten in drie opeenvolgende putjes met medium zonder kleurstof te verplaatsen. Voor co-kleuring met TMRE, in de compatibele algemene mitochondriële kleurstof, voert u eerst kleuring uit met TMRE uit en brengt u het monster onmiddellijk over in de algemene mitochondriale kleurstof zonder het weefsel te wassen.Nadat het wassen en monteren van de eierstokken zoals eerder in deze video is gedemonstreerd, om confocale beeldvorming op het monster uit te voeren, vinkt u het vakje z-sectie aan om het tabblad te openen. Draai de focuswiel naar de onderkant van het monster terwijl het wordt gescand en klik op set-first om de onderste z-sectie te definiëren. Beweeg vervolgens het focuswiel in de tegenovergestelde richting om de bovenste sectie te definiëren.Voer beeldacquisitie uit door op start experiment te klikken. In het geval van live xvivamicroscopie, moeten de gegevens binnen 15 minuten na het monteren van het weefsel worden verkregen, anders kunnen de experimentele resultaten worden beïnvloed door veranderingen in de fysiologie als gevolg van de afstervende weefsel. Plaats onmiddellijk na het dissecteren onder een afzuigkap eierstokken in 200 microliter vers PFA op kamertemperatuur in het putje van een glazen dissectieschaal.Incubeer het weefsel gedurende 15 minuten om het te fixeren. Na het wassen van de eierstokken in PBS volgens het tekstprotocol, terwijl ze nog in PBS zijn, scheidt u de eierstokken om voorzichtig de beschermende vezelschede te verwijderen die de toegang van het antigeen van het antilichaam kan belemmeren. Maakt de gescheiden eierstokken permeabel door ze in een microfusebuis met 500 microliter 0,5 procent tritan x 100 in PBS te plaatsen.Plaats vervolgens de buis in een bedekt bakje en stel het in om 25 RPM's gedurende 30 minuten te schudden. Verwijder de PBS/TX volgens het tekstprotocol en blokkeer het weefsel door 200 microliter BSA opgelost in 0,5 procent PBS/TX toe te voegen. Incubeer de monsters op de rocker bij kamertemperatuur gedurende één uur.Na het verwijderen van de blokkeeroplossing, voegt u anti-rabid desycline E en anti-muis ATPB-antilichamen toe. Incubeer het weefsel op de rocker bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Na de incubatie, gebruikt u PBS-TX om de eierstokken drie keer gedurende 15 minuten elke keer te wassen.Voeg vervolgens 200 microliter van de juiste secundaire antilichamen en vers PBS-TX toe en incubeer gedurende één uur bij

studying-mitochondrial-structure-and-function-in-drosophila-ovaries

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft het gebruik van micro-injectie en een hoge resolutie beeldvorming in...

Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo

De kinetochoor is waar de SAC initieert het signaal het toezicht op de mitotische segregatie van de zuster chromatiden. Een methode wordt beschreven om de werving en de omzet van een van de kinetochoor eiwitten en de coördinatie te visualiseren met het chromosoom beweging...

Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytieel Embryo&#39;s

Deze video beschrijft de algemene anatomie van de Drosophila-eierstok en bevat een methode om eierstokken te ontleden voor levende of vaste beeldvorming.

Melanogaster van Drosophila Eierstokdissectie: een techniek voor ex vivo weefselpreparaat

Mitochondria spelen een centrale rol in de regulatie van metabolisme en homeostase. Subtiele veranderingen in mitochondriaal metabolisme die de fysiologie van organismen beïnvloeden, kunnen moeilijk te detecteren zijn in metabolomics-studies van hele organismen. Hier beschrijven we een isolatiemethode die de detectie van subtiele metabolische verschuivingen in Drosophila melanogaster verbetert.

Voorbereiding van mitochondriaal verrijkte fracties voor Metabole analyse in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila oogenese blijft uitzonderlijk nuttig in de studie van mitochondriale proliferatie en overerving. Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol dat wordt gebruikt om het replicerende mitochondriale DNA (mtDNA) in Drosophila volwassen eierstokken te labelen met 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), wat het mogelijk maakt om mechanismen te ontdekken die geassocieerd zijn met mitochondriale overerving die voorheen discutabel waren.

In Situ Labeling van mitochondriaal DNA-replicatie in Drosophila volwassen Eierstokken van Edu kleuring

We presenteren protocollen voor het verzamelen, voorbereiden en beeldvorming van volwassen Drosophila eicellen. Deze methoden maken de visualisatie van chromosoomgedrag en spindelassemblage en -functie tijdens meiose mogelijk.

Technieken voor Imaging prometaphase metafase van de meiose I in Fixed<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

In dit protocol tonen we de toepassing van seriële-sectie Elektronentomografie ophelderen van mitochondriale structuur in Drosophila indirecte vlucht spier.

3D mitochondriale ultrastructuur van Drosophila indirecte vlucht spier geopenbaard door seriële-sectie Elektronentomografie

In dit document wordt een methode voor het meten van zuurstofverbruik met behulp van hoge-resolutie respirometrie in permeabel thoraxes van Drosophila beschreven. Deze techniek vereist een minimale hoeveelheid weefsel in vergelijking met de klassieke mitochondriale isolatie-techniek en de verkregen resultaten meer fysiologisch relevant zijn.

Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

Het keldermembraan is essentieel voor weefsel- en orgaanmorfogenese tijdens de ontwikkeling. Om de mechanismen die leiden tot de juiste plaatsing van deze structuur beter te begrijpen, beschrijft het gepresenteerde protocol methoden om de intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten in epitheelcellen te visualiseren en te karakteriseren met behulp van confocale en superresolutiemicroscopie.

Confocale en superresolutie beeldvorming van gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten tijdens Drosophila Oogenesis

Hier presenteren we een respirometrieprotocol met hoge resolutie om bio-energetica in PINK1B9-null mutante fruitvliegjes te analyseren. De methode maakt gebruik van het SUIT-protocol (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

Analyse van de mitochondriale functie in een Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-mutant met behulp van respirometrie met hoge resolutie

Ontdek methoden voor het analyseren van mitochondriale structuur en functie in levend en gefixeerd Drosophila melanogaster weefsel. Deze technieken onthullen regulerende mechanismen van mitochondriale functionaliteit.

Het bestuderen van mitochondriale structuur en functie in Drosophila Eierstokken

Meer video's verkennen