Het bestuderen van mitochondriale structuur en functie in Drosophila Eierstokken

Het algemene doel van deze procedure is om methoden te demonstreren voor het bestuderen van mitochondriale structuur en functie in levend evenals in gefixeerd weefsel in het modelorganisme drosophila melanogaster. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van mitochondriale biologie te beantwoorden. Zoals de regulerende mechanismen van mitochondriale functie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze een gedetailleerde analyse uitvoert van de mitochondriale structuur/functierelatie. Na het sorteren van vijf verdoofde vrouwelijke vliegen volgens het tekstprotocol, gebruikt u onder de dissectiemicroscoop twee paren pincetten om de thorax van de buik af te snijden. Breng vervolgens de buiken voorzichtig over naar de tweede put van de schotel.

Gebruik één paar pincetten om de buik aan het achterste uiteinde vast te houden, gebruik het andere paar pincetten om de eierstokken langzaam naar buiten te duwen. Gebruik vervolgens de pincetten om een individuele eierstok aan het ondoorzichtige achterste uiteinde vast te houden en verplaats deze voorzichtig naar de derde put van de schotel voor het scheiden of fixeren. Scheid voorzichtig de beschermende schede rond de eierstokken door een paar pincetten te gebruiken om het achterste uiteinde vast te houden en lichtjes te vegen met een scheidingsnaald van het achterste naar het voorste uiteinde.

Om polylysine gecoate kamers voor te bereiden, plaatst u twee gescheiden druppels van 20 microliter polylysine op de glazen bodem van een glasbodem petrischaal. Laat de platen een uur lang aan de lucht drogen bij 37 graden Celsius en schets de polylysine aan de onderkant van de plaat. Stel de scanparameters in op de confocale microscoop door de software voor beeldverwerving te openen en in het tabblad verwerving de juiste scanparameters in te stellen.

Vink de vakjes tijdreeks, verbleken en regio's aan om de individuele tabbladen te openen. Voer vervolgens de juiste verwervingsparameters in in elk tabblad. Plaats vervolgens een gedissecteerde en gescheiden eierstok op een gemarkeerd polylysine gecoat gebied en gebruik een scheidingsnaald om de eierstok uit te spreiden en de ovarialen te scheiden.

Plaats een druppel van 10 microliter insecten dissectiemedium op de eierstok, zorg ervoor dat het hele polylysine gecoate gebied bedekt is. Bedek vervolgens de petrischaal. Direct na het monteren van de eierstok, plaatst u het monster op het microscoopplatform en gebruikt u het oculaire om snel het veld van belang in het levende weefsel te lokaliseren.

Klik op live om een live beeld van het geselecteerde veld van belang te verkrijgen, klik vervolgens op stop om het live scannen te stoppen. Pas indien nodig de verwervingsparameters aan zodat het gedetecteerde fluorescerende signaal onder de verzadigingsniveaus ligt met de gedefinieerde achtergrond zoals ingesteld door de offsetwaarden aan te passen. Gebruik in het grafiektabblad het bezier-tekenhulpmiddel om een kleine ROI te tekenen om de fotoblekenzone op het beeld dat door scannen is verkregen af te bakenen.

Voer vervolgens beeldacquisitie uit door op start experiment te klikken. Om levend kleuring uit te voeren met fluorescerende mitochondriale kleurstoffen, verdunt u de voorraad kleurstoffen in warm dissectiemedium tot de uiteindelijke werkconcentraties. Nadat dissectie en scheiding eerder is gedemonstreerd, plaatst u de eierstokken in 200 microliter kleuroplossing in een putje van een dissectieschaal.

Bedek de schotel met aluminiumfolie verpakt in een doos om het te beschermen tegen licht en incubeer het weefsel gedurende 10 minuten. Was vervolgens de gekleurde eierstokken door ze voorzichtig met behulp van pincetten in drie opeenvolgende putjes met medium zonder kleurstof te verplaatsen. Voor co-kleuring met TMRE, in de compatibele algemene mitochondriële kleurstof, voert u eerst kleuring uit met TMRE uit en brengt u het monster onmiddellijk over in de algemene mitochondriale kleurstof zonder het weefsel te wassen.

Nadat het wassen en monteren van de eierstokken zoals eerder in deze video is gedemonstreerd, om confocale beeldvorming op het monster uit te voeren, vinkt u het vakje z-sectie aan om het tabblad te openen. Draai de focuswiel naar de onderkant van het monster terwijl het wordt gescand en klik op set-first om de onderste z-sectie te definiëren. Beweeg vervolgens het focuswiel in de tegenovergestelde richting om de bovenste sectie te definiëren.

Voer beeldacquisitie uit door op start experiment te klikken. In het geval van live xvivamicroscopie, moeten de gegevens binnen 15 minuten na het monteren van het weefsel worden verkregen, anders kunnen de experimentele resultaten worden beïnvloed door veranderingen in de fysiologie als gevolg van de afstervende weefsel. Plaats onmiddellijk na het dissecteren onder een afzuigkap eierstokken in 200 microliter vers PFA op kamertemperatuur in het putje van een glazen dissectieschaal.

Incubeer het weefsel gedurende 15 minuten om het te fixeren. Na het wassen van de eierstokken in PBS volgens het tekstprotocol, terwijl ze nog in PBS zijn, scheidt u de eierstokken om voorzichtig de beschermende vezelschede te verwijderen die de toegang van het antigeen van het antilichaam kan belemmeren. Maakt de gescheiden eierstokken permeabel door ze in een microfusebuis met 500 microliter 0,5 procent tritan x 100 in PBS te plaatsen.

Plaats vervolgens de buis in een bedekt bakje en stel het in om 25 RPM's gedurende 30 minuten te schudden. Verwijder de PBS/TX volgens het tekstprotocol en blokkeer het weefsel door 200 microliter BSA opgelost in 0,5 procent PBS/TX toe te voegen. Incubeer de monsters op de rocker bij kamertemperatuur gedurende één uur.

Na het verwijderen van de blokkeeroplossing, voegt u anti-rabid desycline E en anti-muis ATPB-antilichamen toe. Incubeer het weefsel op de rocker bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Na de incubatie, gebruikt u PBS-TX om de eierstokken drie keer gedurende 15 minuten elke keer te wassen.

Voeg vervolgens 200 microliter van de juiste secundaire antilichamen en vers PBS-TX toe en incubeer gedurende één uur bij