1D Dunne-laags chromatografie uitvoeren
1. TLC Plates
- Vastgebruikte adsorbentia voor TLC zijn silicagel, alumina en cellulose. TLC platen zijn commercieel verkrijgbaar met verschillende eigenschappen. Kies een TLC plaat en snijd deze op een geschikte grootte (ongeveer 5 cm x 5 cm is voldoende voor de meeste toepassingen). Voor TLC platen met een glazen rug, score het glas met een liniaal en een glazen snijder, breek dan voorzichtig langs de lijn.
2. Spotting
- Los het monster op in een geschikt oplosmiddel om een ongeveer 1% oplossing te maken. Indien mogelijk moet het oplosmiddel nonpolair zijn. Fracties uit kolomchromatografie en andere verdunde oplossingen kunnen worden gebruikt zonder verdunning als het opgeloste materiaal een concentratie heeft tussen de 0,2% en 2,0%.
- Markeer de basislijn met een potlood op ongeveer 1,0 cm van de onderkant van de plaat. Plaats de punten ten minste 1,0 cm van de rand van de plaat en label ze gepast.
- Punten kunnen worden aangebracht met een glazen capillair. Om de TLC plaat te spotten, dompel de capillair in de oplossing om een kleine hoeveelheid vloeistof op te nemen. Raak voorzichtig de punt aan op de gewenste locatie op de TLC plaat en verwijder hem onmiddellijk.
- Alternatief, breng punten aan met een microliter spuit door ongeveer 1 μL oplossing voor elke toepassing te leveren.
- Punten kunnen achtereenvolgens op elke locatie worden aangebracht, zorg ervoor dat u het oppervlak van de adsorbent niet verstoort met de spotter. Laat het oplosmiddel tussen toepassingen drogen.
3. Het kiezen van een ontwikkelingsoplosmiddel
- Het is voor te verkieuren om het minst polaire oplosmiddel mogelijk te gebruiken voor een goede scheiding. Gangbare oplosmiddelen voor TLC zijn hexaan, ethylacetaat, dichloromethaan en methanol (Tabel 1).
- Een gemakkelijke manier om een geschikte mobiele fase te vinden is door de TLC plaat met een monster te spotten. Breng voldoende oplosmiddel rechtstreeks op de punt aan om een cirkel van oplosmiddel met een diameter van 1–2 cm te vormen. Markeer de omtrek van de cirkel. Bij visualisatie zal een geschikt oplosmiddel goed gescheiden ringen laten zien, waarbij de buitenste ring ongeveer 50% van de afstand van het centrum tot de oplosmiddelfront ligt.
- Het kan noodzakelijk zijn om de polariteit van de mobiele fase aan te passen door twee mengbare oplosmiddelen te kiezen en ze in verschillende verhoudingen te testen. Voorbeelden van gangbare mengsels zijn hexanen met ethylacetaat en dichloromethaan met methanol.
4. Ontwikkeling
- Plaats de bespoten TLC plaat in een ontwikkelingskamer die het geschikte ontwikkelingsoplosmiddel bevat. De oplosmiddellijn moet onder de op de TLC plaat aangegeven basislijn liggen.
- De ontwikkelingskamer kan een pot met een deksel zijn, of een beker bedekt met aluminiumfolie of plastic folie. Gebruik de kleinste beschikbare container die de TLC plaat kan herbergen.
- Laat het oplosmiddel de bovenrand van de plaat niet bereiken. Wanneer de oplosmiddelfront (de grens waar de natteel deel van de adsorbent eindigt) 5–10 mm van de bovenkant van de plaat is, verwijder dan de TLC plaat uit de ontwikkelingskamer en markeer de oplosmiddelfront met een potlood voordat het oplosmiddel droogt.
5. Visualisatie
- Gekleurde punten kunnen onmiddellijk worden gevisualiseerd en met een potlood worden gemarkeerd. Vaak zijn punten niet zichtbaar en moeten daarom op een andere manier worden gevisualiseerd.
- Vaak bevat de TLC adsorbent een fluorescerende indicator. Punten kunnen worden gevisualiseerd met behulp van een handbediende ultraviolette (UV) lamp. Verbindingen die fluorescentie dempen, zullen als donkere punten verschijnen wanneer de plaat wordt bestraald met kortgolf (254 nm) UV-licht. Fluorescerende verbindingen zullen heldere punten produceren wanneer ze worden bestraald met UV-licht van een geschikte golflengte. Markeer het centrum van elke punt met een potlood.
- Punten kunnen ook worden gevisualiseerd door een visualiserend reagens of kleurstof op de TLC plaat aan te brengen. Het visualiserende reagens kan worden aangebracht door de plaat in het reagens te dompelen, of door de plaat af te vegen met een wattenbolletje gedrenkt in een niet-corrosieve reagens.
- Een 20% oplossing van fosfomolybdinezuur in ethanol is nuttig voor de visualisatie van de meeste organische verbindingen. De punten verschijnen bij het verwarmen van de plaat met een heteluchtpistool of in een oven.
- Andere reagentia kunnen worden gebruikt voor de visualisatie van specifieke klassen van verbindingen. Ninhydrinereagens wordt bijvoorbeeld gebruikt voor aminozuurvisualisatie en 2,4-dinitrofenylhydrazine voor aldehyden en ketonen.
6. Analyse
- De retardatiefactor (Rf) is de verhouding van de afstand die een verbinding op een TLC plaat aflegt tot de afstand die het oplosmiddel aflegt. Dit kan worden bepaald door de afstand van de basislijn tot het centrum van de punt te meten en de waarde te delen door de afstand van de basislijn tot de oplosmiddelfront.
- De Rf van een verbinding is karakteristiek voor zijn fysische eigenschappen en afhankelijk van factoren zoals temperatuur, monstersteekproefgrootte, en dikte en activiteit van de adsorbent, temperatuur en monstersteekproefgrootte.
- Om te bevestigen dat een onbekende identiek is aan een bekende verbinding, moet een standaard op dezelfde TLC plaat worden gespot. Identieke stoffen zullen dezelfde karakteristieke Rf hebben.
Bron: Laboratorium van Dr. Yuri Bolshan — University of Ontario Institute of Technology
Dünnschichtchromatographie (TLC) is een chromatografische meth…
1. TLC Plates
- Vastgebruikte adsorbentia voor TLC zijn silicagel, alumina en cellulose. TLC platen zijn commercieel verkrijgbaar met verschillende eigenschappen. Kies een TLC plaat en snijd deze op een geschikte grootte (ongeveer 5 cm x 5 cm is voldoende voor de meeste toepassingen). Voor TLC platen met een glazen rug, score het glas met een liniaal en een glazen snijder, breek dan voorzichtig langs de lijn.
2. Spotting
- Los het monster op in een geschikt oplosmiddel om een ongeveer 1% oplossing te maken. Indien mogelijk moet het oplosmiddel nonpolair zijn. Fracties uit kolomchromatografie en andere verdunde oplossingen kunnen worden gebruikt zonder verdunning als het opgeloste materiaal een concentratie heeft tussen de 0,2% en 2,0%.
- Markeer de basislijn met een potlood op ongeveer 1,0 cm van de onderkant van de plaat. Plaats de punten ten minste 1,0 cm van de rand van de plaat en label ze gepast.
- Punten kunnen worden aangebracht met een glazen capillair. Om de TLC plaat te spotten, dompel de capillair in de oplossing om een kleine hoeveelheid vloeistof op te nemen. Raak voorzichtig de punt aan op de gewenste locatie op de TLC plaat en verwijder hem onmiddellijk.
- Alternatief, breng punten aan met een microliter spuit door ongeveer 1 μL oplossing voor elke toepassing te leveren.
- Punten kunnen achtereenvolgens op elke locatie worden aangebracht, zorg ervoor dat u het oppervlak van de adsorbent niet verstoort met de spotter. Laat het oplosmiddel tussen toepassingen drogen.
3. Het kiezen van een ontwikkelingsoplosmiddel
- Het is voor te verkieuren om het minst polaire oplosmiddel mogelijk te gebruiken voor een goede scheiding. Gangbare oplosmiddelen voor TLC zijn hexaan, ethylacetaat, dichloromethaan en methanol (Tabel 1).
- Een gemakkelijke manier om een geschikte mobiele fase te vinden is door de TLC plaat met een monster te spotten. Breng voldoende oplosmiddel rechtstreeks op de punt aan om een cirkel van oplosmiddel met een diameter van 1–2 cm te vormen. Markeer de omtrek van de cirkel. Bij visualisatie zal een geschikt oplosmiddel goed gescheiden ringen laten zien, waarbij de buitenste ring ongeveer 50% van de afstand van het centrum tot de oplosmiddelfront ligt.
- Het kan noodzakelijk zijn om de polariteit van de mobiele fase aan te passen door twee mengbare oplosmiddelen te kiezen en ze in verschillende verhoudingen te testen. Voorbeelden van gangbare mengsels zijn hexanen met ethylacetaat en dichloromethaan met methanol.
4. Ontwikkeling
- Plaats de bespoten TLC plaat in een ontwikkelingskamer die het geschikte ontwikkelingsoplosmiddel bevat. De oplosmiddellijn moet onder de op de TLC plaat aangegeven basislijn liggen.
- De ontwikkelingskamer kan een pot met een deksel zijn, of een beker bedekt met aluminiumfolie of plastic folie. Gebruik de kleinste beschikbare container die de TLC plaat kan herbergen.
- Laat het oplosmiddel de bovenrand van de plaat niet bereiken. Wanneer de oplosmiddelfront (de grens waar de natteel deel van de adsorbent eindigt) 5–10 mm van de bovenkant van de plaat is, verwijder dan de TLC plaat uit de ontwikkelingskamer en markeer de oplosmiddelfront met een potlood voordat het oplosmiddel droogt.
5. Visualisatie
- Gekleurde punten kunnen onmiddellijk worden gevisualiseerd en met een potlood worden gemarkeerd. Vaak zijn punten niet zichtbaar en moeten daarom op een andere manier worden gevisualiseerd.
- Vaak bevat de TLC adsorbent een fluorescerende indicator. Punten kunnen worden gevisualiseerd met behulp van een handbediende ultraviolette (UV) lamp. Verbindingen die fluorescentie dempen, zullen als donkere punten verschijnen wanneer de plaat wordt bestraald met kortgolf (254 nm) UV-licht. Fluorescerende verbindingen zullen heldere punten produceren wanneer ze worden bestraald met UV-licht van een geschikte golflengte. Markeer het centrum van elke punt met een potlood.
- Punten kunnen ook worden gevisualiseerd door een visualiserend reagens of kleurstof op de TLC plaat aan te brengen. Het visualiserende reagens kan worden aangebracht door de plaat in het reagens te dompelen, of door de plaat af te vegen met een wattenbolletje gedrenkt in een niet-corrosieve reagens.
- Een 20% oplossing van fosfomolybdinezuur in ethanol is nuttig voor de visualisatie van de meeste organische verbindingen. De punten verschijnen bij het verwarmen van de plaat met een heteluchtpistool of in een oven.
- Andere reagentia kunnen worden gebruikt voor de visualisatie van specifieke klassen van verbindingen. Ninhydrinereagens wordt bijvoorbeeld gebruikt voor aminozuurvisualisatie en 2,4-dinitrofenylhydrazine voor aldehyden en ketonen.
6. Analyse
- De retardatiefactor (Rf) is de verhouding van de afstand die een verbinding op een TLC plaat aflegt tot de afstand die het oplosmiddel aflegt. Dit kan worden bepaald door de afstand van de basislijn tot het centrum van de punt te meten en de waarde te delen door de afstand van de basislijn tot de oplosmiddelfront.
- De Rf van een verbinding is karakteristiek voor zijn fysische eigenschappen en afhankelijk van factoren zoals temperatuur, monstersteekproefgrootte, en dikte en activiteit van de adsorbent, temperatuur en monstersteekproefgrootte.
- Om te bevestigen dat een onbekende identiek is aan een bekende verbinding, moet een standaard op dezelfde TLC plaat worden gespot. Identieke stoffen zullen dezelfde karakteristieke Rf hebben.
Dunnschichtchromatografie, of TLC, is een chromatografische methode die wordt gebruikt om mengsels van niet-vluchtige verbindingen te scheiden, vaak gebruikt in de organische chemie.
TLC wordt uitgevoerd op een glas- of kunststofondersteunde plaat. Er wordt een basislijn op de plaat aangegeven, samen met labels. Het te onderzoeken mengsel en referentiestoffen worden opgelost in een geschikt oplosmiddel en in kleine vlekjes aangebracht nabij de onderkant van de TLC-plaat. De plaat wordt in een pot geplaatst, en een oplosmiddel?(de mobiele fase)?scheidt het mengsel op basis van fysische eigenschappen van elke component.
Ondanks het feit dat instrumenten zwaardere scheidingstechnieken meer oplosvermogen hebben dan TLC, zijn het de snelheid en lage kosten die TLC een aantrekkelijke techniek maken voor kwalitatieve analyse onderweg. Deze video zal de voorbereiding, werking en analyse van dunnschichtchromatografie demonstreren.
Chromatografische technieken omvatten een stationaire en mobiele fase. Bij TLC bestaat de stationaire fase uit een dunne laag materiaal die op de plaat is bevestigd. Het materiaal is een polaire stof, zoals silicagel. De mobiele fase is een apolaire vloeistof die door capillaire werking omhoog beweegt over de adsorberende laag. Terwijl de mobiele fase omhoog beweegt over de plaat, sleept hij de componenten van elke vlek mee, die vervolgens worden gescheiden op basis van polariteit.
Verbindingen die minder polair zijn, zullen meer tijd in de mobiele fase doorbrengen omdat deze omhoog wordt getrokken op de plaat. Verbindingen die meer polair zijn, worden meer aangetrokken door de stationaire fase en zullen daarom niet zo ver omhoog bewegen op de plaat.
De scheiding vindt plaats in een ontwikkelingscontainer. Dit kunnen potten met deksel of bekers zijn die bedekt zijn met aluminiumfolie. Gebruik de kleinste beschikbare container die de TLC-plaat kan bergen om de scheiding te versnellen.
De mobiele fase, of ontwikkelingsoplosmiddel, moet zo apolair mogelijk zijn voor een goede scheiding. Hier wordt een eluotropische reeks voor silicagel getoond, een lijst van veelvoorkomende mobiele fasen in volgorde van toenemende extractiekracht.
Een aantal mobiele fasen kan gelijktijdig worden getest. Breng op een schone plaat het opgeloste monster meerdere keren aan, op minstens 2 cm afstand. Breng voldoende mobiele fase aan op elke vlek om een cirkel van 1-2 cm in diameter te vormen.
Markeer de afstand die de mobiele fase aflegt. Als de mobiele fase niet polair genoeg is, zal het monster dicht bij de oorspronkelijke vlek blijven. Als de mobiele fase te polair is, zal het hele monster met de oplosmiddelvoorkant meedwalen. Een geschikte mobiele fase zal goed gescheiden ringen laten zien, waarbij de buitenste ring ongeveer 50% van de afstand tot de oplosmiddelvoorkant beslaat.
Indien nodig kunnen twee mengbare mobiele fasen in verschillende verhoudingen worden gemengd om de gewenste eigenschappen te verkrijgen. Hier was een 1:1-mengsel van ethylacetaat en hexaan te polair, maar een 1:20-mengsel was passend gescheiden.
Met de gekozen mobiele fase bent u klaar om de plaat te ontwikkelen.
Om de procedure te starten, snijdt u een commercieel verkrijgbare TLC-plaat op de gewenste maat. Als de plaat een glazen achterkant heeft, snijdt u deze met een glazen snijder en breekt u voorzichtig langs de lijn.
Markeer met een potlood een basislijn op ongeveer 1 cm van de onderkant van de plaat. Markeer de plaats waar de monsters zullen worden aangebracht langs de lijn. Zorg ervoor dat de vlekken minimaal 1 cm van de rand en 3 mm uit elkaar zijn. Label ze passend.
Vaste monsters moeten worden opgelost in een geschikt oplosmiddel. Veelvoorkomende oplosmiddelen zijn hexanen, ethylacetaat of dichloormethaan. Gebruik het minst polaire oplosmiddel dat het monster zal oplossen.
Zuig het monster/oplosmiddelmengsel op met een glazen capillair. Raak voorzichtig met de punt de gewenste plaats op de TLC-plaat aan en verwijder deze onmiddellijk. Het is belangrijk om de stationaire fase niet te verstoren.
Houd de vlek zo klein mogelijk, omdat dit leidt tot een betere scheiding. Als er meer monster nodig is, kunnen vlekken achtereenvolgens op elke locatie worden aangebracht. Laat het oplosmiddel drogen tussen toepassingen. Een stroom lucht kan worden gebruikt om minder vluchtige oplosmiddelen te drogen.
De TLC-plaat is nu klaar om te worden ontwikkeld. Plaats een stuk filterpapier op de bodem van de pot om de dampdruk te verhogen. Voeg de mobiele fase toe tot een diepte die de basislijn niet bereikt. Sluit de pot af wanneer deze niet in gebruik is, zodat de oplosmiddeldampen niet ontsnappen.
Plaats de gevlekte TLC-plaat voorzichtig in de ontwikkelingsschaal. Zorg ervoor dat de mobiele fase onder de basislijn ligt. Observeer de voortgang van de oplosmiddelvoorkant? de voorste rand van de mobiele fase? terwijl deze snel omhoog beweegt over de plaat.
Laat de mobiele fase niet de bovenrand van de plaat bereiken, omdat monstersbanden zullen beginnen uit te breiden via diffusie. Zodra de oplosmiddelvoorkant de bovenkant nadert, verwijdert u de plaat uit de ontwikkelingskamer en markeert u de oplosmiddelvoorkant met een potlood voordat het oplosmiddel droogt.
Als de verbindingen niet gekleurd zijn, kan een UV-lamp worden gebruikt om de vlekken te visualiseren. De verbinding zal de achtergrondfluorescentie van de plaat blokkeren. Stel de lamp in op de korte golfinstelling en verlicht de droge plaat. Teken met een potlood alle zichtbare vlekken onder de lamp om. Teken met een potlood alle zichtbare vlekken onder de lamp om.
Een andere mogelijke visualisatietechniek is het gebruik van kaliumpermanganaat, een oxidatiemiddel. Duik met behulp van een pincet de plaat in de permanganaatkleur.
Verwijder en dep overtollig oplosmiddel af met een papieren handdoek. Verwarm de plaat voorzichtig met een heteluchtpistool in een afzuiging om de vlekken zichtbaar te maken. Gebruik een potlood om eventuele zichtbare vlekken te markeren.
Zodra de vlekken zijn gevisualiseerd, kan de stof van belang worden vergeleken met standaarden, zo
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between the stationary phase and mobile phase in thin layer chromatography?
In TLC, the stationary phase is a thin layer of polar adsorbent material, typically silica gel, fixed to a glass or plastic plate. The mobile phase is a non-polar liquid that moves up the plate by capillary action, carrying sample components with it. Compounds separate based on their interactions with both phases.
Q2: How does polarity affect compound separation on a TLC plate?
Less polar compounds spend more time in the mobile phase and travel farther up the plate. More polar compounds are attracted to the polar stationary phase and do not migrate as far. This differential movement based on polarity allows the separation of mixture components.
Q3: What should you look for when choosing an appropriate mobile phase for TLC?
An appropriate mobile phase should be non-polar and produce well-separated rings, with the outermost ring about 50% of the distance to the solvent front. If the mobile phase is too non-polar, the sample remains near the baseline. If too polar, all sample migrates with the solvent front. Two miscible solvents can be mixed to achieve desired properties.
Q4: Why is it important to keep the TLC spot small during sample application?
Keeping the spot small leads to better separation and resolution of compounds on the plate. If more sample is needed, multiple applications can be made at the same location, allowing the solvent to dry between applications. This prevents disturbing the stationary phase and ensures optimal separation results.
Q5: What is the retardation factor and how is it calculated?
The retardation factor, or Rf, is the ratio of the distance a compound travels to the distance the mobile phase travels. It is calculated by measuring the distance from the baseline to the spot and dividing by the distance from the baseline to the solvent front. Rf values depend on solvent choice, adsorbent thickness, temperature, and sample size.
Q6: How can you visualize colorless compounds on a TLC plate?
Colorless compounds can be visualized using a UV lamp set to short wave, which causes the compound to block the background fluorescence of the plate. Alternatively, potassium permanganate, an oxidizing agent, can be used as a stain. The plate is dipped in the stain and heated in a fume hood to reveal spots.
Q7: What are some practical applications of thin layer chromatography in research?
TLC can monitor chemical reaction progression by tracking starting material and product bands over time. It can separate and isolate specific compounds from natural sources for further analysis. TLC can also be used in bioassays to identify compounds with antimicrobial properties by placing separated bands on bacterial cultures.
Chapters in this video
0:00
Overview
1:08
Principles of Thin Layer Chromatography
2:08
Choosing a Mobile Phase
3:30
Spotting the TLC Plate
4:51
Development and Visualization
6:34
Analysis
7:41
Applications
9:22
Summary
Videos from this collection: