High Resolution Kwantitatieve Synaptic Proteome Profilering van Mouse Brain Regio Na Auditieve discriminatie Learning

Het algemene doel van deze proteomische benadering is de karakterisering van moleculaire reorganisatie bij synapsen na leren en geheugenvorming om basismechanismen en signaleringspaden te begrijpen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de hypothesevrije benadering, waardoor grootschalige kwantificering en karakterisering van post-translationele modificaties binnen synaptische proteomen mogelijk is. Onze gevestigde workflow maakt een correlatie mogelijk tussen een bepaalde moleculaire verandering en een specifiek gedrag.

Leren en geheugenformatie zijn gebaseerd op veranderingen in de synaptische efficiëntie, waardoor proteomische studies zich meer moeten richten op de analyse van synaptische structuren zoals synaptosomen dan op homogenaten van hersenweefsel. Proteomische resultaten vormen zeer complexe datasets en vereisen daarom bio-informatische verwerking. Begin de training door de testmuis in een zwak verlichte shuttlebox in een geluidsdichte kamer te plaatsen.

Gebruik een volledig computergestuurd leerschema voor auditieve discriminatie. Begin met een habituatieperiode van drie minuten stilte voordat de trainingssessie start. Tijdens de 'go'-trials moet het dier binnen zes seconden na de toonpresentatie de hindernis oversteken om een hit te scoren.

Tijdens no-go trials moet het dier gedurende de zes seconden van de toonpresentatie in het huidige compartiment van de shuttle box blijven. Voer 30 go trials en 30 no-go trials uit in een pseudo-gerandomiseerde volgorde, met een inter-trial interval van 20 seconden, zodat één sessie uit 60 trials bestaat en ongeveer 25 minuten duurt. Zodra alle trials zijn uitgevoerd, wordt de getrainde muis teruggeplaatst in de thuiskooi tot aan het offeren.

Nadat de muis is geofferd en de hersenen zijn verwijderd, lokaliseert u de auditieve cortex aan de hand van visuele oriëntatiepunten, waaronder bloedvaten en de vorm van het oppervlak. Gebruik vervolgens een scalpel en een naald om de auditieve cortex bilateraal te disseceren als een rechthoekig weefselblok. Disseceer de frontale cortex als een hersenplak tussen Bregma 3.56 en 1.54, met het chiasma opticum als oriëntatiepunt.

Disseceer het striatum als een hersenplakje tussen Bregma 1,54 en 0,5. Verwijder vervolgens voorzichtig het corticale weefsel. Disseceer de hippocampus door de hersenen te stabiliseren met de naald door het cerebellum en de cortex af te pellen, beginnend bij de occipitaalkwab.

Snelbevries de gedissecteerde hersenmonsters in vloeibare stikstof. Begin de zuivering van synaptosomen door het gedissecteerde hersenweefsel over te brengen naar homogenisatievaten die één milliliter ijskoude Buffer A bevatten. Homogeniseer vervolgens het weefsel bij 900 RPM met ongeveer 12 slagen. Centrifugeer de monsters bij 1.000 ×g gedurende 10 minuten.

Bewaar na de centrifugatie de supernatvloeistoffen. Homogeniseer de pellet opnieuw zoals voorheen en voeg de supernatvloeistoffen samen. Centrifugeer de gecombineerde supernatvloeistoffen gedurende 20 minuten bij 12.000 ×g. Resuspendeer de pellets in één milliliter homogenisatiebuffer en homogeniseer met zes slagen bij 900 RPM, gevolgd door centrifugatie bij 1.200 ×g gedurende 20 minuten.

Bereid tijdens de centrifugatie voor de productie van de P2-pellets sucrose-stapgradiënten in ultracentrifugeringsbuisjes voor. Begin met 2,5 milliliters 1,0 molair sucrosebuffer en gebruik vervolgens een glazen Pasteurpijpet om 1,5 milliliters 1,2 molair sucrosebuffer als sublaag aan te brengen. Voeg na de centrifugatie 0,5 milliliters 0,32 molair sucrosebuffer toe aan de P2-pellets.

Homogeniseer vervolgens opnieuw met zes slagen. Breng de gehomogeniseerde fracties aan bovenop de gradiënten. Plaats de beladen gradiënten in een swinging bucket rotor en centrifugeer deze vervolgens gedurende twee uur bij 85.000 ×g in een ultracentrifuge.

Zodra de centrifugatie is voltooid, wordt de bovenste laag van 0,32 molair sucrose weggegooid, inclusief het materiaal op de interface met de 1,0 molaire sucrosebuffer. Verzamel de synaptosomen op de interface van de één tot 1,2 molaire sucrosebuffer. Voeg 0,32 molaire sucrosebuffer toe aan de synaptosomale fractie in een ratio van 1,1.

Meng zorgvuldig en centrifugeer bij 150.000 ×g gedurende één uur. De synaptosomen bevinden zich in de pellet en kunnen worden resuspendeerd in een buffer voor verdere verwerking. Los de synaptosomen van elk hersengebied van een dier op in 20 tot 50 µL 8 M ureum door één uur op ijs te incuberen in een ultrasoon bad.

Verdun met één procent van een verwijderbaar detergent om een uiteindelijke concentratie van twee molair ureum te garanderen. Pipetteer, na het bepalen van de relatieve eiwithoeveelheden met behulp van SDS-PAGE, één derde van het restant van elk monster in een nieuwe buis. Voer de in-solution digest uit door twee millimolair DTT en 25 millimolair ammoniumbicarbonaat toe te voegen en het monster voorzichtig te vortexen.

Reduceer de monsters gedurende 45 minuten bij 20 graden Celsius. Voeg 10 millimolaire iota acedomide toe om cysteinresiduen te carbamidomethyleren en meng. Incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij 20 graden Celsius.

Voeg tot slot één µL van een trypsin-stockoplossing toe en incubeer 12 uur bij 20 °C. Om het zuur-splitbare detergent te verwijderen, wordt trifluorazijnzuur toegevoegd tot een eindconcentratie van 1% en wordt het mengsel nog een uur bij 20 °C geïncubeerd. Nadat de monsters 10 minuten zijn gecentrifugeerd bij 16 000 ×g, worden de supernatanten voorzichtig verzameld.

Plaats de kolom voor vaste-fase-extractie in een rek en equilibreer de matrix met twee milliliters methanol. Voeg na het wassen nog eens twee milliliters Buffer B toe en breng het monster over. Na drie keer wassen met Buffer B worden de peptiden geëlueerd door 200 microliters 70 procent acetonitril en 0,1 procent trifluorazijnzuur toe te voegen.

Droog vervolgens de gezuiverde monsters in een vacuümcentrifuge. In dit voorbeeld vertonen dieren die zijn getraind in de FM-toondiscriminietaak een stijgend percentage hits en een dalend percentage fout-positieven gedurende de trainingssessies. Significante discriminatie vindt plaats vanaf de vierde sessie.

De relatieve synaptische abundanties van geselecteerde eiwitten worden vergeleken tussen muizen die zijn getraind in de FM-toondiscriminatietaak en naïeve controlemuizen 24 uur na de eerste trainingssessie. Na training zijn de spiegels van het CYFP2-eiwit veranderd in alle bestudeerde regio's. Houd er rekening mee dat de dieren vaak intra-individuele variabiliteit vertonen.

Daarom wordt sterk aanbevolen om ten minste vijf of meer biologische replica's van goed gematchte diergroepen in de studie op te nemen. Eenmaal vastgesteld, kan deze techniek eenvoudig worden aangepast voor andere soorten. Zo is deze bijvoorbeeld gebruikt om leer-afhankelijke veranderingen in de eiwitexpressie in individuele fruitvliegenhersenen te monitoren.