High Resolution Kwantitatieve Synaptic Proteome Profilering van Mouse Brain Regio Na Auditieve discriminatie Learning
15 december 2016
De identificatie van moleculen en routes die synaptische plasticiteit en geheugen beheersen, is nog steeds een grote uitdaging in de neurowetenschappen. Hier wordt een workflow beschreven die zich richt op de relatieve kwantificering van synaptische eiwitten die vermoedelijk betrokken zijn bij de moleculaire reorganisatie van synapsen tijdens het leren en het consolideren van geheugen in een auditief leerparadijm.
Het algemene doel van deze proteomische aanpak is de karakterisering van moleculaire reorganisatie op synapsen na leren en geheugenvorming om basismechanismen en signaalroutes te begrijpen. Het grote voordeel van deze techniek is een hypothese-vrije aanpak, die grootschalige kwantificering en karakterisering van post-translatie en modificaties binnen synaptische proteomen mogelijk maakt. Onze gevestigde workflow staat een correlatie toe tussen een bepaalde moleculaire verandering en een specifiek gedrag.
Leer- en geheugenvorming zijn gebaseerd op veranderingen van synaptische efficiëntie en daarom zouden proteomische studies zich meer moeten richten op analyse van synaptische structuren zoals synaptosomen dan op homogenaten uit hersenweefsel. Proteomische resultaten vertegenwoordigen zeer complexe datasets en vereisen daarom bio-informatische verwerking. Begin met trainen door de testmuis in een zwak verlichte shuttle box in een geluiddichte kamer te plaatsen.
Gebruik een volledig computergestuurd leerschema voor auditieve discriminatie-leren. Begin met een habituatieperiode van drie minuten stilte voordat u met de trainingssessie begint. Tijdens 'go'-trials moet het dier de hindernis binnen zes seconden na het presenteren van de toon oversteken om een hit te scoren.
Tijdens 'no-go'-trials moet het dier zich gedurende zes seconden na het presenteren van de toon in het huidige compartiment van de shuttle box bevinden. Voer 30 'go'-trials en 30 'no-go'-trials uit in een pseudo-gerandomiseerde volgorde, met een interval van 20 seconden tussen de trials, zodat een sessie uit 60 trials bestaat en ongeveer 25 minuten duurt. Zodra alle trials zijn uitgevoerd, brengt u de getrainde muis terug naar de kooi tot het slachten.
Na het slachten van de muis en het verwijderen van de hersenen, localiseert u de auditieve cortex met behulp van visuele herkenningspunten, inclusief bloedvaten en de vorm van het oppervlak. Gebruik vervolgens een scalpel en naald om de auditieve cortex bilateraal te verwijderen als een rechthoekige weefselblok. Gebruik het chiasma opticum als herkenningspunt en snij de frontale cortex uit als een hersensnede tussen Bregma 3,56 en 1,54.
Snijd het striatum uit als een hersensnede tussen Bregma 1,54 en 0,5. En verwijder voorzichtig het corticale weefsel. Snijd de hippocampus uit door de hersenen te stabiliseren met de naald door de cerebellum en de cortex uit te rollen, beginnend bij de occipitale kwab.
Schok-bevries de gedissekteerde hersenmonsters in vloeibare stikstof. Begin met synaptosoom-zuivering door het gedissekteerde hersenweefsel over te brengen in homogenisatievaten die een milliliter ijskoud Buffer A bevatten. Homogeniseer vervolgens het weefsel bij 900 RPM met ongeveer 12 slagen. Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 1.000 keer G.
Behoud na de centrifugatie de supernatanten. Homogeniseer het pellet opnieuw zoals eerder en combineer de supernatanten. Spin de gecombineerde supernatanten gedurende 20 minuten bij 12.000 keer G. Re-suspendeer de pellets in een milliliter homogenisatiebuffer en homogeniseer met zes slagen bij 900 RPM, gevolgd door centrifugatie bij 1.200 keer G gedurende 20 minuten.
Tijdens de centrifugatie om de P2-pellets te produceren, bereidt u sucrose-stappengradienten voor in ultracentrifugebuizen. Begin met 2,5 milliliter 1,0 molaire sucrosebuffer en gebruik vervolgens een glazen Pasteurpipet om 1,5 milliliter 1,2 molaire sucrosebuffer sublaag te leggen. Voeg na de centrifugatie 0,5 milliliter 0,32 molaire sucrosebuffer toe aan de P2-pellets.
Homogeniseer vervolgens met zes slagen. Laad de gehomogeniseerde fracties bovenop de gradiënten. Plaats de geladen gradiënten in een zwenkrotor en draai vervolgens twee uur lang bij 85.000 keer G in een ultracentrifuge.
Zodra de centrifugatie voltooid is, gooit u de bovenste 0,32 molaire sucroselaag weg, inclusief het materiaal op het grensvlak met de 1,0 molaire sucrosebuffer. Verzamel synaptosomen op het grensvlak van de 1 tot 1,2 molaire sucrosebuffer. Voeg 0,32 molaire sucrosebuffer toe aan de synaptosoomfractie in een verhouding van 1,1.
Meng voorzichtig en draai gedurende een uur bij 150.000 keer G. Synaptosomen bevinden zich in het pellet en kunnen opnieuw worden opgehangen in een buffer voor verdere verwerking. Los de synaptosomen van elk hersengebied van een dier op in 20 tot 50 microliter 8 molaire ureum door één uur in een ultrasoon bad op ijs te incuberen.
Verdun met één procent van een verwijderbare detergent om een uiteindelijke concentratie van twee molaire ureum te verzekeren. Na het bepalen van de relatieve eiwitbedragen met behulp van SDS-PAGE, pipet een derde van de rest van elk monster in een nieuwe buis. Voer de in-oplossingsdigest uit door twee millimolair DTT en 25 millimolair ammoniumbicarbonaat toe te voegen en het monster voorzichtig te vortexen.
Verminder de monsters gedurende 45 minuten bij 20 graden Celsius. Voeg 10 millimolair iota acedomide toe om cysteïneresiduen te carbamidemethyleren en meng. Incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij 20 graden Celsius.
Voeg tenslotte een microliter trypsine-voorraadoplossing toe en incubeer gedurende 12 uur bij 20 graden Celsius. Om de zuur-afbreekbare detergent te verwijderen, voegt u trifluorazijnzuur toe tot een eindconcentratie van één procent en incubeert u nog een uur bij 20 graden Celsius. Na het centrifugeren van de monsters gedurende 10 minuten bij 16.000 keer G, verzamelt u voorzichtig de supernatanten.
Plaats de solid-phase extracțiekolom in een rek en breng het matrix in evenwicht met twee milliliter methanol. Na het wassen, voegt u nog eens twee milliliter Buffer B toe en laadt u het monster. Na drie keer wassen met Buffer B, elueert u de peptiden door 200 microliter 70 procent acetonitril en 0,1 procent trifluorazijnzuur toe te voegen.
Droog vervolgens de gezuiverde monsters in een vacuümcentrifuge. In dit voorbeeld laten dieren die zijn getraind op de FM-toondiscriminatietaak een toenemende snelheid van hits
Overzicht
Deze studie beschrijft een proteomische workflow gericht op het karakteriseren van moleculaire reorganisatie bij synapsen tijdens auditief leren en geheugenconsolidatie. De benadering richt zich op de kwantificering van synaptische eiwitten die bij deze processen betrokken zijn.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Proteomiek
- Synaptische plasticiteit
Achtergrond
- Begrip van synaptische plasticiteit is cruciaal voor inzichten in geheugenvorming.
- Proteomische studies kunnen veranderingen in synaptische structuren onthullen.
- Grootschalige kwantificering maakt hypothese-vrije analyse mogelijk.
- Bioinformatic verwerking is essentieel voor het hanteren van complexe datasets.
Doel van het onderzoek
- Karakteriseren van moleculaire veranderingen bij synapsen na het leren.
- Molecule veranderingen correleren met specifiek gedrag.
- Verbeteren van het begrip van signaalroutes betrokken bij geheugen.
Gebruikte methoden
- Auditief discriminatie leren bij muizen.
- Synaptosome zuivering uit hersenweefsel.
- Proteomische analyse met behulp van SDS-PAGE en in-oplossing vertering.
- Statistische vergelijking van eiwitniveaus tussen getrainde en naïeve muizen.
Belangrijkste resultaten
- Significante veranderingen in eiwitniveaus werden waargenomen na training.
- CYFP2 eiwitniveaus waren veranderd in verschillende hersengebieden.
- Gedragsverbeteringen werden opgemerkt bij getrainde muizen.
- De discriminatievermogen nam significant toe na verschillende trainingssessies.
Conclusies
- De studie biedt inzichten in synaptische veranderingen gerelateerd aan leren.
- Proteomische benaderingen kunnen effectief moleculaire veranderingen koppelen aan gedrag.
- Toekomstig onderzoek kan op deze bevindingen voortbouwen om geheugenmechanismen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-resolution quantitative synaptic proteome profiling enables discovery-stage teams to map molecular changes underlying learning and memory, directly informing target validation and mechanistic de-risking in CNS drug discovery. By correlating synaptic protein dynamics with behavioral outcomes, this workflow enhances predictive confidence for early portfolio decisions in neuropsychiatric and neurodegenerative research. The approach supports enterprise R&D by providing scalable, hypothesis-free proteomic data for cross-functional evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables unbiased identification of synaptic protein changes linked to behavioral phenotypes.
- Supports mechanistic de-risking by mapping post-translational modifications in disease-relevant brain regions.
- Facilitates functional target validation through quantitative comparison of trained versus control cohorts.
- Provides a foundation for prioritizing molecular targets based on learning-dependent regulation.
Screening & Assay Development
- Delivers validated synaptosome preparations for downstream proteomic and biochemical assays.
- Establishes reproducible workflows for quantitative protein and phospho-peptide measurement.
- Enables assay standardization across multiple brain regions and experimental conditions.
- Supports scalable screening of candidate modulators affecting synaptic proteome signatures.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular findings with behavioral endpoints for translational biomarker development.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by tracking synaptic changes across learning stages.
- Supports risk-adjusted advancement by linking proteomic shifts to functional outcomes.
- Provides mechanistic insights for preclinical model selection and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This proteomic workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and mechanistic de-risking in CNS pipelines.
- Discovery Biology: Quantitative synaptic profiling clarifies pathway engagement and molecular adaptation after behavioral training.
- Screening: Standardized synaptosome and peptide fractionation enable reproducible, quantitative readouts for compound evaluation.
- Analytics: Label-free quantification and statistical analysis provide robust comparative outputs across experimental groups.
- Translational Research: Correlation of molecular and behavioral data supports biomarker alignment and translational continuity.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable to other species and learning paradigms, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible proteomic workflows for cross-team adoption.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by linking molecular changes to functional outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on quantitative synaptic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, proteomics, and bioinformatics for data acquisition and analysis.
- Demands access to high-resolution mass spectrometry and robust computational infrastructure.
- Necessitates standardized protocols for synaptosome isolation and peptide fractionation across teams.
- Adaptable to various species and behavioral paradigms with appropriate validation.
- Biological variability mandates sufficient replicates and rigorous statistical analysis for reliable interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Auditory Discrimination Learning in the Shuttle Box (FMTD Paradigm)
2:28
Brain Dissection
3:43
Purification of Synaptosomes from Crude Brain Membrane Fractions
6:29
Sample Preparation for Mass Spectrometry Using In-solution Digest
9:02
Results: Synaptic Abundance of selected Proteins After FMTD Task Training
9:53
Conclusion
