Name: High Resolution Kwantitatieve Synaptic Proteome Profilering van Mouse Brain Regio Na Auditieve discriminatie Learning (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Leer hoe je synaptische proteomen kwantitatief analyseert na auditieve discriminatie bij muizen. Deze methode koppelt moleculaire veranderingen aan gedrag en onthult mechanismen van geheugenvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Yvonne Ducho en Kathrin Pohlmann bedanken voor uitstekende technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 779) en door de staat Saksen-Anhalt / Europees Fonds voor regionale ontwikkeling (EFRO) via het Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS).

<ol><li>Lamprecht, R., LeDoux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity and memory.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (1), 45-54 (2004).</li>
<li>Bingol, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+protein+degradation+by+the+ubiquitin+proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic protein degradation by the ubiquitin proteasome system.</a> Curr Opin Neurobiol. 15 (5), 536-541 (2005).</li>
<li>Richter, J. D., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+synaptic+plasticity+and+memory+last%3A+mechanisms+of+translational+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Making synaptic plasticity and memory last: mechanisms of translational regulation.</a> Genes Dev. 23 (1), 1-11 (2009).</li>
<li>Rosenberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+protein+expression+in+synaptic+plasticity+and+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The roles of protein expression in synaptic plasticity and memory consolidation.</a> Front Mol Neurosci. 7, 86(2014).</li>
<li>Scheich, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+semantics+of+learning+and+crossmodal+processing+in+auditory+cortex%3A+the+semantic+processor+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral semantics of learning and crossmodal processing in auditory cortex: the semantic processor concept.</a> Hear Res. 271 (1-2), 3-15 (2011).</li>
<li>Kähne, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+proteome+changes+in+mouse+brain+regions+upon+auditory+discrimination+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Synaptic proteome changes in mouse brain regions upon auditory discrimination learning.</a> Proteomics. 12 (15-16), 2433-2444 (2012).</li>
<li>Reichenbach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+dopamine+signalling+on+long-term+memory+formation+and+consolidation+in+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Differential effects of dopamine signalling on long-term memory formation and consolidation in rodent brain.</a> Proteome Sci. 13, 13(2015).</li>
<li>Kähne, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+rearrangements+after+auditory+learning%3A+high-resolution+profiling+of+synapse-enriched+protein+fractions+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Proteome rearrangements after auditory learning: high-resolution profiling of synapse-enriched protein fractions from mouse brain.</a> J Neurochem. , (2016).</li>
<li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+proteomics+of+rat+synaptic+proteins%3A+correlation-profiling+by+isotope-coded+affinity+tagging+in+conjunction+with+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+to+reveal+post-synaptic+density+specific+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Organelle proteomics of rat synaptic proteins: correlation-profiling by isotope-coded affinity tagging in conjunction with liquid chromatography-tandem mass spectrometry to reveal post-synaptic density specific proteins.</a> J Proteome Res. 4 (3), 725-733 (2005).</li>
<li>Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+postsynaptic+densities+from+various+brain+regions%3A+enrichment+of+different+types+of+postsynaptic+densities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities.</a> J Cell Biol. 86 (3), 831-845 (1980).</li>
<li>Smalla, K. H., Klemmer, P., Wyneken, U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmalla%2C+KH+%22The+Cytoskeleton+-+Imaging%2C+Isolation%2C+and+Interaction%22">The Cytoskeleton - Imaging, Isolation, and Interaction</a>. Dermietzel, R. , Humana Press. 265-282 (2012).</li>
<li>Smalla, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+glycoprotein+neuroplastin+is+involved+in+long-term+potentiation+at+hippocampal+CA1+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The synaptic glycoprotein neuroplastin is involved in long-term potentiation at hippocampal CA1 synapses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (8), 4327-4332 (2000).</li>
<li>Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal Chem. 68 (5), 850-858 (1996).</li>
<li>Thingholm, T. E., Larsen, M. R., Ingrell, C. R., Kassem, M., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TiO%282%29-based+phosphoproteomic+analysis+of+the+plasma+membrane+and+the+effects+of+phosphatase+inhibitor+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">TiO(2)-based phosphoproteomic analysis of the plasma membrane and the effects of phosphatase inhibitor treatment.</a> J Proteome Res. 7 (8), 3304-3313 (2008).</li>
<li>Carmona-Saez, P., Chagoyen, M., Tirado, F., Carazo, J. M., Pascual-Montano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENECODIS%3A+a+web-based+tool+for+finding+significant+concurrent+annotations+in+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">GENECODIS: a web-based tool for finding significant concurrent annotations in gene lists.</a> Genome Biol. 8 (1), 3(2007).</li>
<li>Bonn, S., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+alpha-+and+gamma-protocadherins+alters+their+presenilin-dependent+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of alpha- and gamma-protocadherins alters their presenilin-dependent processing.</a> Mol Cell Biol. 27 (11), 4121-4132 (2007).</li>
<li>Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+post-translational+modifications+on+synaptic%2C+nuclear%2C+and+histone+proteins+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain.</a> J Proteome Res. 8 (11), 4966-4982 (2009).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+hippocampal+phosphoproteome+of+Apodemus+sylvaticus+paralleling+spatial+memory+retrieval+in+the+Barnes+maze%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The differential hippocampal phosphoproteome of Apodemus sylvaticus paralleling spatial memory retrieval in the Barnes maze.</a> Behav Brain Res. 264, 126-134 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De studie geeft een methodologisch workflow geoptimaliseerd voor een nauwkeurige kwantitatieve profilering van synaptische veranderingen eiwitexpressie tijdens het leren en geheugen consolidatie in verschillende hersengebieden van muizen. De opstelling biedt de mogelijkheid om de eiwitexpressie op het niveau van één dierstudie ondanks de vereiste toepassing van ten minste drie technische replicaten per monster voor massaspectrometrische analyse. De methode houdt rekening met de bijzondere eiwitsamenstelling van de pre- en postsynapse bestaande uit hoogmoleculaire scaffold proteïnen moleculaire maar ook belangrijke mediator eiwitten lagermedium of lagere molecuulgewichten. De in-oplossing digesties van synaptosomale preparaten in een efficiënte productie en derhalve een oververtegenwoordiging van scaffold afgeleide peptiden. Dit op zijn beurt kan de analyse van kleinere of minder overvloedige eiwitten onderdrukken. De voorgestelde bereiding van SDS-PAGE fracties uit eenaliquot van elk monster gecombineerd met een in-gel digestie procedure parallel vergemakkelijkt de analyse van gemiddelde en lage abundantie proteïnen en vormt een sterk aanbevolen aanvullende methode. Na afzonderlijke massaspectrometrische toepassing van alle fracties verkregen uit een monster (bijvoorbeeld in oplossing verteren, in-gel verteren combinatie-fosfo verrijkte fracties) de overeenkomstige MS / MS datasets worden gecombineerd en verder berekend voor eiwit identificatie en kwantificering van PEAKS software of andere populaire software pakketten. Als alternatief, de individuele toepassing van-in-gel-vergisting afgeleide fracties van een monster (apart verwerkte gel-gebieden van een monster laan) en de fracties gegenereerd van de in-oplossing ontsloten monster (bv door ionenuitwisselingschromatografie) naar massaspectrometrie kan verhogen de analytische diepgang. Echter, deze uitgebreide workflow drastisch verhoogt de vereiste tijd voor LS-MS / MS data-acquisitie. voor generation van een gedetailleerde moleculaire opeenvolging van synaptische eiwit herschikkingen tijdens het leren en geheugenvorming een bepaald tijdsverloop van het proteomics profilering is vereist. Dit tijdsverloop kan onmiddellijk na of zelfs tijdens de eerste training en bestrijkt een fijnmazig tijdsbestek tot de prestaties van de dieren &#39;de asymptotische niveau van de leercurve bereikt na ca. 8-10 dagen van de opleiding (zie figuur 2 voor details). De analyse van fosforylering wijzigingen van synaptische eiwitten vereist een bijzondere aandacht voor de geselecteerde termijnen tijdens FMTD leren. Enerzijds signaling cascades initiëren synaptisch eiwit herschikkingen bekend worden geactiveerd door proteïne fosforyleringen en dephosphorylations in zeer vroege stadia van diertraining verwacht. Aan de andere kant zijn er langdurige modificaties van meerdere gefosforyleerde synaptische eiwitten bekend die de connectiviteit en assemblage in de s regulerenynaptic architectuur 19, 20. Die posttranslationele modificaties zijn zelfs op latere tijdstippen van het geheugen consolidatie verwacht. Het complex datasets gegenereerd door deze proteomics workflow nodig bioinformatic verwerking te identificeren deelnemende moleculaire wegen en belangrijke moleculen. Meta-analyse laat significante oververtegenwoordigd pathways die een rol spelen bij leer- en geheugenprocessen spelen.

Leren is gebaseerd op de vorming van herinneringssporen en het onderhoud. Het is algemeen aanvaard dat een onderliggende mechanisme een activiteit-afhankelijke vorming van nieuwe en / of herschikking van bestaande synaptische contacten tussen neuronen kunnen vormen. Op moleculair niveau hebben verscheidene eiwitmodificaties, subcellulaire relocalizations en veranderingen in de omzet van synaptische eiwitten beschreven 1-4 (Lamprecht, 2004 # 8). De meeste studies tot nu toe gericht op specifieke eiwitten niet op het wereldwijde maar complexe synaptische proteoom samenstelling. De huidige aanpak maakt het mogelijk een onbevooroordeelde screening voor synaptische proteoom veranderingen in de hersenen van muizen regio&#39;s na een leerproces experiment. Het is geschikt om tijdpunt afhankelijke moleculaire snapshots van het leren geïnduceerde reorganisatie van de synaptische architectuur maken. De beschreven workflow vereist een bepaald samenspel van verschillende specialisten in het gedrag van dieren, eiwit biochemie, massaspectrometrie en biolnformatics. De gekozen leerparadigma, namelijk frequentie gemoduleerde toon discriminatie (FMTD), is een goed gekarakteriseerde auditieve discriminatietaak bij knaagdieren 5. Leren en lange termijn geheugenvorming in deze shuttle box Go / No-Go-taak behelst mechanismen afhankelijk van toegenomen corticale dopamine signalering en eiwitsynthese. Dienovereenkomstig proteomische recente studies over gerbils en muizen lieten dopamine en leren geïnduceerde herschikkingen van synaptische plastic componenten in corticale, maar ook in meer basale hersengebieden die zogenaamd interactie tijdens FMTD leren en geheugen 6-8. Dit illustreert dat de vorming van het geheugen gaat om een ​​complex samenspel van de verschillende gebieden van de hersenen en dus kan verschillend worden geregeld binnen deze regio&#39;s op het proteoom niveau. Daarom is dissectie van geselecteerde corticale en subcorticale muizenhersenen regio&#39;s opgenomen in de workflow. Bovendien betrouwbare characterizatiop zelfs zwakke veranderingen in synaptische eiwitsamenstelling vereist een verrijking van pre- en postsynaptische compartimenten in plaats van het analyseren van ruwe homogenaten of membraanfracties 9. Daarom is de bereiding van synaptosomen gebruik vastgestelde protocollen vóór proteomische analyse beschreven om het detectieniveau en dynamisch bereik voor synaps-specifieke eiwitten 10,11 toenemen. Een essentiële voorwaarde voor het label-free high-resolutie massaspectrometrie te gebruiken voor de kwantitatieve doelen is een hoge mate van overeenstemming van eiwit monsters. Zoals eerder kleine veranderingen in synaptische eiwitsamenstelling naar verwachting zullen plaatsvinden na het leren, zal een label-free aanpak geschikt zijn om te vergelijken corresponderende eiwit verkregen uit opgeleid en naïeve muizen. Als alternatief, conditie-specifiek label strategieën van eiwitten / peptiden met behulp van stabiele isotopen (bijv TMT, iTRAQ, ICPL en SILAC) alsook MS2-based label gratis quantification (SWATH) zijn nuttig, maar ze zijn duurder dan de gekozen label-free aanpak of hebben speciale massaspectrometrie hardware. Sinds proteomics screenings vaak op complexe datasets, is bioinformatic verwerking aanbevolen voor de juiste interpretatie van de gegevens. Extra meta-analyses kan een beter begrip van potentiële moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan-paradigma gerelateerde veranderingen en de identificatie van de betrokken belangrijke cellulaire processen en signaalwegen te ondersteunen. Geschikte methoden zijn ook hieronder beschreven.

<table><tbody><tr><td>3 M Empore Solid Phase Extraction- Filter</td><td>3M Bioanalytical Technologies</td><td>4245SD</td><td>7 mm/3 ml</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td>164564</td><td>100 &micro;m x 2 cm, C18</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td>164569</td><td>75 &micro;m x 25 cm, C18</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3738.1</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (ACN)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AE70.2</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide (30%)</td><td>AppliChem</td><td>A0951</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydrogen carbonate&nbsp;&nbsp;</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide&nbsp;</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>44273</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate&nbsp; (APS)</td><td>AppliChem</td><td>A2941</td><td></td></tr><tr><td>Biofuge pico</td><td>Heraeus GmbH</td><td>75003280</td><td></td></tr><tr><td>Blue R-250&nbsp;</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>17525</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>17132901</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>Charles River&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cantharidin</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3322.1</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes for MLS-50</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes for TLA 100.1 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5417R centrifuge</td><td>VWR</td><td>22636138</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf A-8-11 rotor</td><td>VWR</td><td>5407000317</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Fluka</td><td>14265</td><td></td></tr><tr><td>GeneCodis</td><td>http://genecodis.cnb.csic.es/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gephi</td><td>https://gephi.org/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>A1123</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail&nbsp;</td><td>Pierce /Thermo Scientific</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer solution&nbsp;</td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>S11-001</td><td></td></tr><tr><td>Homogenization vessel 2 ml</td><td>Sartorius AG</td><td>854 2252</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Ingenuity Pathway Analysis</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide (IAA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory drilling drive &nbsp;K-ControlTLC 4957&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Kaltenbach &amp; Vogt GmbH</td><td>182997</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos Pro</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macs-mix tube rotator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Magic Scan 4.71</td><td>UMAX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AE71.2</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>364300</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>PEAKS 7.5</td><td>Bioinformatic Solutions&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase Inhibitor Cocktail 3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0044</td><td></td></tr><tr><td>PhosphoRS 3.1</td><td>IMP/IMBA/GMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>Plunger/pestle made of PTFE</td><td>Sartorius AG</td><td>854 2651</td><td></td></tr><tr><td>PotterS homogenizer</td><td>Sartorius AG</td><td>853 3024</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor complete mini</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Quantity One 4.5.1</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RapiGest</td><td>Waters</td><td>186002122</td><td></td></tr><tr><td>Shuttle box</td><td>Coulbourne Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecylsulfate (SDS)</td><td>AppliChem</td><td>A1112</td><td></td></tr><tr><td>Sodium molybdate</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>274.2</td><td></td></tr><tr><td>Sodium tartrate dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228729</td><td></td></tr><tr><td>SONOREX RK 156 Ultrasonic Bath</td><td>BANDELIN electronic GmbH &amp; Co. KG</td><td>305</td><td></td></tr><tr><td>Soundproof chamber</td><td>Industrial Acoustics Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethyl ethylene -1,2-diamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer basic</td><td>CallMedia</td><td>111000</td><td></td></tr><tr><td><a name="RANGE!A60">Titansphere TiO 5&micro;m</a></td><td>GL Sciences Inc. Japan</td><td>502075000</td><td></td></tr><tr><td>TLA 100.1 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>343840</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoro acetic acid&nbsp; (TFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris ( hydroxymethyl) aminomethane (TRIS)</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Gold</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Ultra HPLC&nbsp;</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tube</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td></td></tr><tr><td>Unijet II Refrigerated Aspirator</td><td>Uniequip Laborger&auml;te- und Vertriebs GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UNIVAPO 100 H Concentrator Centrifuge&nbsp;</td><td>Uniequip Laborger&auml;te- und Vertriebs GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>AppliChem</td><td>A1049</td><td></td></tr><tr><td>Water (high quality purifed)</td><td></td><td></td><td>Resistivity: > 18.2 M&Omega;*cm at 25 &deg;C&nbsp; Pyrogens: &lt; 0.02 EU/ml&

high resolution kwantitatieve synaptic proteome profilering van mouse brain regio na auditieve discriminatie learning

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

De moleculaire synaptische mechanismen die ten grondslag liggen aan auditief leren en geheugen zijn grotendeels onbekend. Hier wordt de werkwijze van een proteomische studie over auditief discriminerend leren bij muizen beschreven. In dit leerparadigma worden muizen getraind in een shuttle box Go/NoGo-taak om onderscheid te maken tussen stijgend en dalend frequentiegemoduleerde tonen om een milde elektrische voetschok te vermijden. Het protocol omvat de verrijking van synaptosomen uit vier hersengebieden, namelijk de auditieve cortex, frontale cortex, hippocampus en striatum, in verschillende trainingsfasen. Expressiepatronen van synaptische eiwitten verkregen van getrainde muizen worden vergeleken met naïeve controles met behulp van een proteomische aanpak. Om voldoende analytische diepte te bereiken, worden monsters op drie verschillende manieren gefractioneerd voorafgaand aan massaspectrometrie, namelijk 1D SDS-PAGE/in-gel-vertering, in-oplossingsvertering en fosfopeptide-verrijking.
Hoogwaardige proteomische analyse op een massaspectrometer en label-vrije kwantificering worden gebruikt om synaptische eiwitprofielen in fosfopeptide-gedepleteerde en fosfopeptide-verrijkte fracties van synaptosomale eiwitmonsters te onderzoeken. Een commercieel softwarepakket wordt gebruikt om eiwitten en fosfopeptiden met significant gereguleerde relatieve synaptische abundantieniveaus (getrainde/naïeve controles) te onthullen. Gemeenschappelijke en differentiële regulatiemodi voor het synaptische proteoom in de onderzochte hersengebieden van muizen na training werden waargenomen. Vervolgens worden meta-analyses die gebruikmaken van verschillende databases ingezet om onderliggende cellulaire functies en biologische paden te identificeren.

Figuur 1 geeft een overzicht van de complete workflow van kwantitatieve synaptische proteoom profilering van muizenhersenen regio&#39;s na auditieve leren discriminatie. Het begint met het dier training in een shuttle box. In het in figuur 2 bijvoorbeeld muizen begon aanzienlijke FM toon discriminatie in de 4e trainingssessie tonen, die op efficiënte leren. Dieren worden opgeofferd op geselecteerde tijdstippen voor hersengebied dissectie. De vereiste verrijking van synapsen kan ofwel worden bereikt door het bereiden van synaptosomen of alternatief door de bereiding van een PSD-verrijkte fractie, beide in detail beschreven in figuur 3. De PSD-verrijking methode ontwikkeld voor lage hoeveelheden weefsel, bijvoorbeeld 1 - 2 plakjes van de hippocampus van rattenhersenen 12, 18. Het vereist kleine buisjes, PTFE stampers passend bij deze buizen, en een laboratorium boren aandrijving voor het aandrijven van de stamper. Vanwege de bijzondere eiwitsamenstelling van synaptosomen, is het sterk aan te bevelen de bereiding van de monsters uit te voeren in twee verschillende, maar complementaire manieren. Steigers van de PSD vaak zeer hoogmoleculaire eiwitten zich in hoge stoichiometrie. In-digest oplossing is de beste manier om deze efficiënt te extraheren, maar kan leiden tot een overbemonstering van de gegenereerde peptidemengsel. De in-gel oplossing wordt uitgevoerd van hetzelfde monster parallel kunnen deze eiwitten gewicht hoog molecuulgewicht sluiten verkrijgen en de analyse van eiwitten met medium en lager molecuulgewicht. Voor een uitgebreide analyse beide soorten proteolytische digesties worden aanbevolen. De verschillende hoeveelheden weefsels van de onderzochte hersengebieden moeten worden bijgesteld het toegepaste materiaal voor betere vergelijking. Binnen de vier onderzochte hersengebieden auditieve cortex algemeen de beperkende omstandigheidof. Het materiaal van alle andere hersengebieden moeten zorgvuldig worden aangepast om de hoeveelheid van de auditieve cortex na bereiding van synaptosomen of PSD-verrijkte fracties (zie 3.1.1.). Typische gewicht van vers bereide hersengebieden van muizen zijn als volgt: auditieve cortex (AC): ~ 50 mg; hippocampus (HIP): ~ 90 mg; striatum (STR): ~ 120 mg en frontale cortex (FC): ~ 100 mg. De PSD-werkwijze van verrijking in paragraaf 2.3 beschreven leidde tot de identificatie van ongeveer 1500 verschillende eiwitten en ongeveer 250 verschillende fosfo-peptiden per hersengebied op het niveau van afzonderlijke dieren (Tabel 1). Proteoomanalyse 24 uur na de eerste trainingssessie bleek dat 7,3% van de geïdentificeerde eiwitten en 5,8% van de fosfo-peptiden significante (p &lt;0,05) kwantitatieve veranderingen in de synaptische expressie vergeleken met naïeve controles (tabel 1). Een opvallende tendens naar beneden Regulatie van synaptische steigers kunnen wijzen op een uitgesproken herschikking van de synaptische architectuur tijdens de vroege stadia van FMTD leren. De overgrote meerderheid van de gereguleerde eiwitten werden veranderd in een hersengebied-specifieke wijze, terwijl slechts 22% bleken te zijn geregeld in twee of meer hersengebieden. Zes geselecteerde voorbeelden worden getoond in figuur 4. Meta-analyse van het complex resultaten door IPA levert het bewijs voor de specifieke deelname / manipulatie van de volgende canonieke trajecten: &quot;-Clathrine endocytose Signaling&quot;, &quot;Axonal Guidance Signaling&quot;, &quot;Calcium Signaling&quot;, &quot;RhoA Signalering&quot;, &quot;Notch signalering &quot;,&quot; Verbouwing van epitheliale Adherens Knooppunten &quot;,&quot; Glutamaat Receptor Signaling &quot;,&quot; GABA Receptor Signaling &quot;,&quot; Dopamine Receptor Signaling &quot;en&quot; Synaptic langetermijnpotentiëring &quot;. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Enkele verrijking analyse onthulde significant oververtegenwoordigd biologische processen in de frontale cortex betreffende eiwittransport, celadhesie, fosforylering, endocytose, vesikel-gemedieerd transport, ontwikkeling en voorhersenen axonogenesis (figuur 5). In de auditieve cortex biologische processen, waaronder ion transport, vertaling, mRNA transport, eiwit transport en het leren waren merkbaar. De analyse van de eiwitfractie van de hippocampus detecteert aanzienlijk verrijkt processen bij ionentransport, celcyclus, vertaling, fosforylatie en zenuwstelsel ontwikkelingssysteem. In het striatum, oververtegenwoordigd biologische processen, waaronder mRNA transport-blaasje gemedieerd transport, axonogenesis, proteolyse, eiwit transport en endocytose werden gevonden. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig1.jpg" /> Figuur 1: Systematische Workflow van de methodologische benadering. Dit cijfer schematisch overzicht van de workflow van hoge resolutie kwantitatieve profilering van hersengebied specifieke synaptische eiwitsamenstelling. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig2.jpg" /> Figuur 2: Voorbeeld van de prestaties van Muizen in de FM-Tone Discriminatie Task. Dieren tonen een toenemende mate van de hits (blauwe curve) en een afnemend aantal valse alarmen (zwarte curve) in de loop van de trainingen. Significante discriminatie plaatsvindt van de vierde sessie. Foutbalken worden als SEM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een LAR bekijken</a>ger versie van deze figuur. <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig3.jpg" /> Figuur 3: Bereiding van de Synaptosome en PSD-verrijkte fractie. A: voorbereiding Synaptosome. B: PSD-verrijkte fractie preparaat. Beide figuren verklaren de gedetailleerde workflow van de voorbereiding van synaptosomen of als alternatief PSD-verrijkte fracties uit de hersenen weefsels. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig4.jpg" /> Figuur 4: Geselecteerde Kwantitatieve Proteoom resultaten. De relatieve abundanties van synaptische geselecteerde eiwitten vergelijkingen tussen muizen trained de FMTD opdracht (AV, n = 6) en naïeve controlemuizen (NV, n = 6) 24 uur na de eerste trainingssessie. De overvloed waarden werden berekend als gemiddelde van de piekoppervlakken van de drie meest intense peptiden van een eiwit. Eiwitten met significante veranderingen overvloed (AV / NV, t-test) gemarkeerd binnen plaatsen: * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,005. Error bars worden geleverd als SD. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig5.jpg" /> Figuur 5: Visualisatie van biologische pathways voor de frontale cortex door GeneCodis / Gephi. Enige belangrijke voorwaarden van de Gene Ontology (GO) database (http://geneontology.org) met betrekking tot &quot;Biologisch proces&quot; met een minimum eiwit nummer drie<html> Hier worden getoond. De knopen GO termen, de grootte van het knooppunt, de lijnbreedte en het aantal verbindingen van een bepaald knooppunt tonen het aantal eiwitten waarvoor deze term GO met andere knooppunten delen. Als gevolg van de &quot;Force Atlas&quot; methode Gephi, worden verwante knooppunten dicht bij elkaar clusteren. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> hersengebied </td><td> AC </td><td> FC </td><td> HEUP </td><td><html> 000 &quot;face =&quot; Calibri &quot;size =&quot; 3 &quot;&gt; STR </td><td> Σ </td></tr><tr><td> geïdentificeerde eiwitten </td><td> 1435 </td><td> 1758 </td><td> 1572 </td><td> 1507 </td><td> 6272 </td></tr><tr><td> gereguleerde eiwitten (p &lt;0,05) </td><td> 59 </td><td> 130 </td><td> 162 </td><td> 108 </td><td>face = &quot;Calibri&quot; size = &quot;3&quot;&gt; 459 </td></tr><tr><td> ↑ AV / NV </td><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 76 </td><td> 35 </td><td> 123 </td></tr><tr><td> ↓ AV / NV </td><td> 51 </td><td> 126 </td><td> 86 </td><td> 73 </td><td> 336 </td></tr><tr><td> geïdentificeerd phosphomoti<html> fs </td><td> 197 </td><td> 361 </td><td> 273 </td><td> 278 </td><td> 1109 </td></tr><tr><td> gereguleerde phosphomotifs (p &lt;0,05) </td><td> 8 </td><td> 22 </td><td> 21 </td><td> 14 </td><td> 65 </td></tr><tr><td> ↑ AV / NV </td><td> 4 </td><td>00000 &quot;face =&quot; Calibri &quot;size =&quot; 3 &quot;&gt; 17 </td><td> 5 </td><td> 9 </td><td> 35 </td></tr><tr><td> ↓ AV / NV </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 16 </td><td> 5 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Overzicht van een Proteomic Result. Deze tabel vat een representatief experiment proteomics getrainde muizen (AV, n = 6) 24 uur na de eerste training in vergelijking met hun naïeve controles (NV, n = 6). Desom van 459 gereguleerde eiwitten bevat overlappende regelgeving. 283 verschillende regelingen werden bepaald zoals hersenen specifiek. In detail zijn 57 proteïnen gereguleerd in twee hersengebieden werden 18 eiwit voorschriften gedetecteerd in drie hersengebieden slechts 2 proteïnen zijn gereguleerd in alle vier onderzochte hersengebieden. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> foutenmarges </td></tr><tr><td> voorloper massa (Fourier transformatie massaspectrometrie) </td><td> 10 ppm </td></tr><tr><td> fragment ion massa (lineaire ion trap) </td><td> 0,6 Da </td></tr><tr><td> Maximum gemiste splitsingen per peptide </td><td> 3 </td></tr><tr><td> vaste modificaties </td></tr><tr><td> in-gel digestie samples </td><td> Carbamidomethylation van Cysteine </td></tr><tr><td> in oplossing gedigereerde monsters </td><td> Methylthiolation van Cysteine </td></tr><tr><td> variabele modificaties </td><td> Oxidatie van Methionine </td></tr><tr><td></td><td> Deamidations van Asparagine en / of glutamine </td></tr><tr><td> Database </td><td> Uniprot / Sprot </td></tr><tr><td> taxonomie </td><td> muis </td></tr><tr><td> Statistische identificatie-acceptatie instellingen </td></tr><tr><td> de novo gemiddelde lokale vertrouwen (ALC) </td><td> &gt; 50% </td></tr><tr><td> Peptide-valse ontdekking rate (FDR, op basis van est. Decoy-fusion) </td><td> &lt;1% </td></tr><tr><td> Eiwit significantie (-10logP, op gemodificeerde T-test) </td><td> &gt; 20 </td></tr><tr><td> unieke peptiden / eiwitten </td><td> ≥ 1 </td></tr><tr><td> Kwantificering instellingen: </td></tr><tr><td> Peptiden gebruikt voor kwantificering indien: </td></tr><tr><td> Peptide betekenis (-10logP) </td><td> &gt; 30 </td></tr><tr><td> Peptidenidentificatie in </td><td> ≥ 50% van de monsters </td></tr><tr><td> Peptide signaalkwaliteit </td><td> &gt; 1 </td></tr><tr><td> Peptide gemiddelde oppervlakte </td><td> &gt; 1E5 </td></tr><tr><td> Peptide retentietijd tolerantie </td><td> &lt;5 min </td></tr><tr><td> Normalisatie </td><td> door de totale ionenstroom (TIC) </td></tr></tbody></table> Tabel 2: Instellingen voor eiwit Identification (stap 4.2.2).

De identificatie van moleculen en routes die synaptische plasticiteit en geheugen beheersen, is nog steeds een grote uitdaging in de neurowetenschappen. Hier wordt een workflow beschreven die zich richt op de relatieve kwantificering van synaptische eiwitten die vermoedelijk betrokken zijn bij de moleculaire reorganisatie van synapsen tijdens het leren en het consolideren van geheugen in een auditief leerparadijm.

High Resolution Kwantitatieve Synaptic Proteome Profilering van Mouse Brain Regio Na Auditieve discriminatie Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Het algemene doel van deze proteomische benadering is de karakterisering van moleculaire reorganisatie bij synapsen na leren en geheugenvorming om basismechanismen en signaleringspaden te begrijpen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de hypothesevrije benadering, waardoor grootschalige kwantificering en karakterisering van post-translationele modificaties binnen synaptische proteomen mogelijk is. Onze gevestigde workflow maakt een correlatie mogelijk tussen een bepaalde moleculaire verandering en een specifiek gedrag.Leren en geheugenformatie zijn gebaseerd op veranderingen in de synaptische efficiëntie, waardoor proteomische studies zich meer moeten richten op de analyse van synaptische structuren zoals synaptosomen dan op homogenaten van hersenweefsel. Proteomische resultaten vormen zeer complexe datasets en vereisen daarom bio-informatische verwerking. Begin de training door de testmuis in een zwak verlichte shuttlebox in een geluidsdichte kamer te plaatsen.Gebruik een volledig computergestuurd leerschema voor auditieve discriminatie. Begin met een habituatieperiode van drie minuten stilte voordat de trainingssessie start. Tijdens de 'go'-trials moet het dier binnen zes seconden na de toonpresentatie de hindernis oversteken om een hit te scoren.Tijdens no-go trials moet het dier gedurende de zes seconden van de toonpresentatie in het huidige compartiment van de shuttle box blijven. Voer 30 go trials en 30 no-go trials uit in een pseudo-gerandomiseerde volgorde, met een inter-trial interval van 20 seconden, zodat één sessie uit 60 trials bestaat en ongeveer 25 minuten duurt. Zodra alle trials zijn uitgevoerd, wordt de getrainde muis teruggeplaatst in de thuiskooi tot aan het offeren.Nadat de muis is geofferd en de hersenen zijn verwijderd, lokaliseert u de auditieve cortex aan de hand van visuele oriëntatiepunten, waaronder bloedvaten en de vorm van het oppervlak. Gebruik vervolgens een scalpel en een naald om de auditieve cortex bilateraal te disseceren als een rechthoekig weefselblok. Disseceer de frontale cortex als een hersenplak tussen Bregma 3.56 en 1.54, met het chiasma opticum als oriëntatiepunt.Disseceer het striatum als een hersenplakje tussen Bregma 1,54 en 0,5. Verwijder vervolgens voorzichtig het corticale weefsel. Disseceer de hippocampus door de hersenen te stabiliseren met de naald door het cerebellum en de cortex af te pellen, beginnend bij de occipitaalkwab.Snelbevries de gedissecteerde hersenmonsters in vloeibare stikstof. Begin de zuivering van synaptosomen door het gedissecteerde hersenweefsel over te brengen naar homogenisatievaten die één milliliter ijskoude Buffer A bevatten. Homogeniseer vervolgens het weefsel bij 900 RPM met ongeveer 12 slagen. Centrifugeer de monsters bij 1.000 ×g gedurende 10 minuten.Bewaar na de centrifugatie de supernatvloeistoffen. Homogeniseer de pellet opnieuw zoals voorheen en voeg de supernatvloeistoffen samen. Centrifugeer de gecombineerde supernatvloeistoffen gedurende 20 minuten bij 12.000 ×g. Resuspendeer de pellets in één milliliter homogenisatiebuffer en homogeniseer met zes slagen bij 900 RPM, gevolgd door centrifugatie bij 1.200 ×g gedurende 20 minuten.Bereid tijdens de centrifugatie voor de productie van de P2-pellets sucrose-stapgradiënten in ultracentrifugeringsbuisjes voor. Begin met 2,5 milliliters 1,0 molair sucrosebuffer en gebruik vervolgens een glazen Pasteurpijpet om 1,5 milliliters 1,2 molair sucrosebuffer als sublaag aan te brengen. Voeg na de centrifugatie 0,5 milliliters 0,32 molair sucrosebuffer toe aan de P2-pellets.Homogeniseer vervolgens opnieuw met zes slagen. Breng de gehomogeniseerde fracties aan bovenop de gradiënten. Plaats de beladen gradiënten in een swinging bucket rotor en centrifugeer deze vervolgens gedurende twee uur bij 85.000 ×g in een ultracentrifuge.Zodra de centrifugatie is voltooid, wordt de bovenste laag van 0,32 molair sucrose weggegooid, inclusief het materiaal op de interface met de 1,0 molaire sucrosebuffer. Verzamel de synaptosomen op de interface van de één tot 1,2 molaire sucrosebuffer. Voeg 0,32 molaire sucrosebuffer toe aan de synaptosomale fractie in een ratio van 1,1.Meng zorgvuldig en centrifugeer bij 150.000 ×g gedurende één uur. De synaptosomen bevinden zich in de pellet en kunnen worden resuspendeerd in een buffer voor verdere verwerking. Los de synaptosomen van elk hersengebied van een dier op in 20 tot 50 µL 8 M ureum door één uur op ijs te incuberen in een ultrasoon bad.Verdun met één procent van een verwijderbaar detergent om een uiteindelijke concentratie van twee molair ureum te garanderen. Pipetteer, na het bepalen van de relatieve eiwithoeveelheden met behulp van SDS-PAGE, één derde van het restant van elk monster in een nieuwe buis. Voer de in-solution digest uit door twee millimolair DTT en 25 millimolair ammoniumbicarbonaat toe te voegen en het monster voorzichtig te vortexen.Reduceer de monsters gedurende 45 minuten bij 20 graden Celsius. Voeg 10 millimolaire iota acedomide toe om cysteinresiduen te carbamidomethyleren en meng. Incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij 20 graden Celsius.Voeg tot slot één µL van een trypsin-stockoplossing toe en incubeer 12 uur bij 20 °C. Om het zuur-splitbare detergent te verwijderen, wordt trifluorazijnzuur toegevoegd tot een eindconcentratie van 1% en wordt het mengsel nog een uur bij 20 °C geïncubeerd. Nadat de monsters 10 minuten zijn gecentrifugeerd bij 16 000 ×g, worden de supernatanten voorzichtig verzameld.Plaats de kolom voor vaste-fase-extractie in een rek en equilibreer de matrix met twee milliliters methanol. Voeg na het wassen nog eens twee milliliters Buffer B toe en breng het monster over. Na drie keer wassen met Buffer B worden de peptiden geëlueerd door 200 microliters 70 procent acetonitril en 0,1 procent trifluorazijnzuur toe te voegen.Droog vervolgens de gezuiverde monsters in een vacuümcentrifuge. In dit voorbeeld vertonen dieren die zijn getraind in de FM-toondiscriminietaak een stijgend percentage hits en een dalend percentage fout-positieven gedurende de trainingssessies. Significante discriminatie vindt plaats vanaf de vierde sessie.De relatieve synaptische abundanties van geselecteerde eiwitten worden vergeleken tussen muizen die zijn getraind in de FM-toondiscriminatietaak en naïeve controlemuizen 24 uur na de eerste trainingssessie. Na training zijn de spiegels van het CYFP2-eiwit veranderd in alle bestudeerde regio's. Houd er rekening mee dat de dieren vaak intra-individuele variabiliteit vertonen.Daarom wordt sterk aanbevolen om ten minste vijf of meer biologische replica's van goed gematchte diergroepen in de studie op te nemen. Eenmaal vastgesteld, kan deze techniek eenvoudig worden aangepast voor andere soorten. Zo is deze bijvoorbeeld gebruikt om leer-afhankelijke veranderingen in de eiwitexpressie in individuele fruitvliegenhersenen te monitoren.

high-resolution-quantitative-synaptic-proteome-profiling-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft hoe u synaps nummer zowel in gedissocieerde neuronale cultuur en in de hersenen secties met behulp van immunocytochemie kwantificeren. Met behulp van vak-specifieke antilichamen, we label presynaptische terminals alsmede ten aanzien sites van postsynaptische specialisatie. We definiëren synapsen als punten van colocalization tussen de signalen die door deze markers.

Het kwantificeren van Synapsen: een immunocytochemie-gebaseerde test te Synapse Number Kwantificeer

This video demonstrates the immunofluorescence staining of a mouse brain slice to quantify the distribution of a specific presynaptic protein. The process involves blocking nonspecific sites, applying primary antibodies for the target protein and a reference marker, followed by secondary antibody labeling and nuclear counterstaining. The reference marker ensures accurate quantification by providing a consistent baseline, and the distribution of the presynaptic protein is analyzed across brain...

Quantifying the Distribution of a Presynaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

This video demonstrates a detailed step-by-step protocol for preparing frozen mouse brain tissue sections for downstream analyses.

Processing of a Mouse Brain for Downstream Analysis

Dit protocol beschrijft hoe neuronale activiteit tijdelijk en op afstand kan worden uitgeschakeld in discrete hersengebieden terwijl ratten bezig zijn met leren en geheugentaken. De aanpak combineert farmacogenetica (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) met een gedragsparadigma (zintuiglijke voorconditionering) dat is ontworpen om onderscheid te maken tussen verschillende componenten van leren.

Een methode voor het op afstand zwijgen neurale activiteit in Knaagdieren Tijdens Discrete Fasen van het Leren

We beschrijven een immunohistochemie protocol om het profiel van de hippocampus neuron activering studeren na blootstelling aan een ruimtelijke leertaak in een muismodel gekenmerkt door cognitieve tekorten van neurologische oorsprong. Dit protocol kan worden toegepast op zowel genetische of farmacologische muismodellen gekenmerkt door cognitieve tekorten.

Immunohistochemische Visualisatie van hippocampus Neuron activiteit na Ruimtelijke Leren in een muismodel van Neurodevelopmental Disorders

Hier beschrijven we een kwantitatieve benadering bij de vaststelling van de verdeling van een synaptic eiwit ten opzichte van een marker eiwit met immunofluorescentie kleuring, confocal microscopie en computer-gebaseerde analyse.

Kwantificeren van de heterogene verdeling van een Synaptic proteïne in de hersenen van de muis met immunofluorescentie

Dit manuscript beschrijft een experimenteel protocol voor het evalueren van de morfologische kenmerken en functionele status van het lint synapsen in normale muizen. Het huidige model is ook geschikt voor door lawaai geïnduceerde en leeftijdsgebonden cochlear synaptopathy-beperkte modellen. De correlatieve resultaten van eerdere muizen studies worden ook besproken.

Morfologische en functionele evaluatie van het lint synapsen op specifieke frequentiegebieden van de muis cochlea

Dit protocol is ontworpen om de activiteit van ubiquitin-proteasome System (UPS) in verschillende cellulaire compartimenten van de knaagdieren hersenen efficiënt te kwantificeren. Gebruikers zijn in staat om de werking van UPS in nucleaire, cytoplasmatische en synaptische fracties in hetzelfde dier te onderzoeken, waardoor de hoeveelheid tijd en het aantal dieren dat nodig is om deze complexe analyses uit te voeren, wordt verminderd.

Kwantificerende Subcellulaire Ubiquitin-proteasome activiteit in het knaagdier hersenen

We presenteren een protocol om de balans te evalueren tussen glutamaatafgifte en klaring bij enkele corticostriatale glutamatge synapsen in acute plakjes van volwassen muizen. Dit protocol maakt gebruik van de fluorescerende sensor iGluu voor glutamaat detectie, een sCMOS camera voor signaal verwerving en een apparaat voor brandpuntslaser verlichting.

Enkele Synapse indicatoren van glutamaat release en opname in acute hersenen plakjes van normale en Huntington muizen

Dit protocol schetst het gebruik van een op maat ontworpen opnameapparaat en elektroden om lokale veldpotentialen vast te leggen en de informatiestroom in de hippocampus en prefrontale cortex van de muis te onderzoeken.

Dubbele extracellulaire opnames in de hippocampus en prefrontale cortex van de muis

Leer hoe je synaptische proteomen kwantitatief analyseert na auditieve discriminatie bij muizen. Deze methode koppelt moleculaire veranderingen aan gedrag en onthult mechanismen van geheugenvorming.

High Resolution Kwantitatieve Synaptic Proteome Profilering van Mouse Brain Regio Na Auditieve discriminatie Learning

Meer video's verkennen