Name: Experimenteel protocol voor het opsporen Cyanobacteriën In vloeibare en vaste monsters met een antilichaam Microarray Chip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Leer een fluorescerende microarray-immunoassay om cyanobacteriën in vloeibare en vaste monsters op te sporen. Deze methode biedt snelle resultaten binnen enkele uren en ondersteunt milieumonitoring en waterbeheer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Antonio Quesada aan de Universidad Autónoma de Madrid voor het verstrekken van cyanobacteriën stammen. Dit werk werd gefinancierd door de Subdirección General de Proyectos de Investigación van de Spaanse Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), verleent geen. AYA2011-24803 en ESP2014-58494-R.

1. Bereiding van immunogenen <ol><li> Cyanobacterial groeien elke stam in het overeenkomstige kweekmedium onder in Tabel 1 beschreven omstandigheden. OPMERKING: groeimedium en kweekomstandigheden voor elke cyanobacteriën stam zijn weergegeven in tabel 1. Alle cyanobacteriële stammen, met uitzondering van K17, behoren tot de groep Antonio Quesada uit Autonoma University (Madrid, Spanje). Het antilichaam tegen Planktothrix rubescens werd gegenereerd uit een natuurlijke steekproef van de monospecifieke bloei van deze cyanobacterie van Vilasouto reservoir (Noord-Spanje). </li><li> Kwantificeren van het aantal cellen met een cel telkamer door optische microscopie ongeveer 10 8 cellen / ml van een late exponentiële of stationaire groeifase verkrijgen. </li><li> Oogst cellen van 5 ml kweek door centrifugatie bij 2000 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in een 10-mL tube met 5 ml 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS) tot ongeveer 10 8 cellen te verkrijgen / ml. </li><li> Meng en lyseren de cellen van de suspensie door sonicatie gedurende 5 cycli, 30 s elk, met 30 tot 60-s pauze op ijs, een draagbare, handbediende ultrasone processor of door dompelen van de buis in het waterbad van cel disruptor op maximale amplitude (30 kHz). </li><li> Herhaal stap 1,3-1,5 voor elke stam van de cyanobacterie. LET OP: Sonicatie produceert cel verstoring en cellulaire inhoud release. Terwijl proteïnen en polysacchariden goede immunogenen specifieke moleculen, zoals lipiden en nucleïnezuren, kan een humorale immunogene respons zelf opwekken. Daarom moeten ze binden aan dragers, zoals polysacchariden of eiwitten, de moleculaire complexiteit verhogen. Bovendien, sonicatie brengt intracellulaire materiaal antilichaamproductie kan leiden. </li></ol> 2. Productie van polyklonale antilichamen <ol><li> Bereid de eerste immunogen dosis door het mengen van 0,5 ml van het ultrasoon cellysaat verkregen in stap 1,5 met 0,5 ml compleet Freund&#39;s adjuvans. Leveren aan de exploitant van een dier faciliteit voor het polyklonale konijn antilichaam productie. </li><li> Bereid drie doses zoals eerder voor verder gebruik als geheugen verhoogt de antilichaamproductie proces mengen 0,5 ml van dezelfde homogenaat / lysaat verkregen in stap 1,5 met 0,5 ml onvolledig Freund&#39;s adjuvans. Geef ze aan het dier mogelijk om de antilichaamproductie kunnen voldoen. </li><li> Herhaal de stappen 2,1 en 2,2 voor elke nieuwe antilichamen productieproces. LET OP: Normaal gesproken, de productie van antilichamen wordt toevertrouwd aan gespecialiseerde dier faciliteiten of bedrijven, omdat de juiste licenties en opleiding nodig zijn om te werken met dieren. Het bedrijf levert een relatieve enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) meting van de hoeveelheid antigeen-specifieke antilichamen aanwezig in het serummonster. </li></ol> 3. Antibody Purificatie <ol><li> Zuiver het immunoglobuline G (IgG) fractie uit zowel de immuun- en pre-immuunserum in stap 2 verzameld door proteïne-A affiniteitschromatografie. Sommige commerciële zuivering kits, gebaseerd op de cartridge systemen goed werken; volg de instructies provider. </li><li> Wanneer de zuivering kit biedt geen ontzouting systeem wijzigt de buffer na de elutie van de gezuiverde antilichamen tegen PBS 0,1x, hetzij door dialyse of door centrifugale filterinrichtingen met een 100-kDa (of lager) membraan poriegrootte. </li><li> Bepaal de antilichaamconcentratie door meting van de absorptie bij 280 nm of met colorimetrische werkwijzen, zoals 23 Bradford, Lowry 24 of bicinchoninezuur (BCA) 25. Opmerking: Het is belangrijk om te voorkomen waaronder aminegroepen in de elutiebuffer (bijvoorbeeld Tris buffers) omdat ze concurreren met het antilichaam voor binding aan vaste oppervlakken geactiveerd met epoxygroepen. na purification, is het belangrijk om de antilichaam activiteit met ELISA testen. </li></ol> 4. Fluorescentie antilichaam Labeling <ol><li> Label de gezuiverde antilichamen verkregen gedeelte 3 met een fluorochroom (bijvoorbeeld een ver-rode fluorescerende kleurstof) door het oplossen van een commerciële flesje met kleurstof etikettering 1 mg eiwit in 100 gl dimethylsulfoxide (DMSO). Voeg 2 pi van de opgeloste kleurstof elk antilichaam preparaat bij een concentratie van 2 mg / ml in een uiteindelijk volume van 50 ul in 50 mM fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 8,5). </li><li> Handhaaf de labelingsreacties onder voortdurend roeren gedurende 1 uur bij omgevingstemperatuur en 1200 rpm op een trilplaat. </li><li> Zuiver het gemerkte antilichamen door gelpermeatiechromatografie (bijvoorbeeld met behulp van een gel met een fractionering bereik tussen 1,5 en 30 kDa opgesloten in een kolom), na van de leveranciers. </li><li> Meet de absorptie bij 280 nm en bij 650 nm in eluaten en bereken het labeleng efficiëntie volgende leverancier aanbevelingen. OPMERKING: tot 50 x 50-pl-antilichaam labeling reacties kunnen worden uitgevoerd met een enkele flacon van de fluorescerende kleurstof voor het merken 1 mg eiwit. Het wordt aanbevolen om de buizen met aluminiumfolie of, als alternatief bedekken, ondoorzichtige 0,5 ml buizen om doofprocessen voorkomen na stap 4,3. IgG antilichamen wordt optimale labeling bereikt met 3-7 mol van de kleurstof per mol antilichaam. </li></ol> 5. CYANOCHIP Production <ol><li> Antilichamen en controles in printoplossing <ol><li> Bereid 30 pi van elk gezuiverd antilichaam in printoplossing door het mengen van elk antilichaam bij 1 mg / mL in een commercieel 1x eiwit printing buffer met 0,01% (v / v) Tween 20 (een niet-ionogeen detergens), allen als eindconcentraties. Opmerking: Als alternatief kan een antilichaam-oplossing 20% ​​glycerol, 1% (w / v) sucrose (of trehalose als conserveermiddel) en 0,01% (v / v) Tween 20 in carbonaatbuffer (pH 8,5) bevatten. </li><li> Bereid 30 pi van de printoplossing als controles: (a) 1x eiwit printing buffer met 0,01% (v / v) Tween 20, (b) proteïne-A gezuiverde pre-immune serum bij 1 mg / mL in 1x eiwit printing buffer 0,01% (v / v) Tween 20, en (c) runderserumalbumine (BSA) bij 1 mg / mL in 1x eiwit printing buffer met 0,01% (v / v) Tween 20. </li><li> Bereid 30 pi van een fluorescent gemerkte gezuiverde pre-immune serum bij verschillende concentraties (bijvoorbeeld van 50 ug / ml tot 1 ug / ml) in 1x eiwit printing buffer met Tween 20, zoals in stap 5.1.1. Deze monsters zullen worden gebruikt als fluorescerende merkers kader en relatieve fluorescentie na kwantificatie spotten. </li><li> Voeg 30 ul per putje van de printing oplossingen bereid in stappen 5.1.1, 5.1.2 en 5.1.3 van de hoogste kwaliteit 384-putjes voor microarray fabricage, zoals polypropyleen. OPMERKING: Eiwit printing buffer verhoogt de kwaliteit en stabiliteit van de antilichamen en Tween 20 homogeniseert spot morphology en bouwt eiwitkoppeling up. Het wordt aanbevolen de 384-well microplaat bij 4 ° C voor gebruik te houden. Bewaar bij -20 ° C voor langere tijd. Polypropyleen heeft een lage DNA, eiwitten, celextract, en kleine moleculen intrinsieke binding. </li></ol></li><li> Antilichaam printen op een microscoopglaasje LET OP: Druk de antilichamen op geactiveerd microscoopglaasjes met behulp van verschillende array-platforms, zoals contact, split-naald, of non-contact apparaten, zoals piëzo-elektrische printers of &quot;inkjet&quot; technologieën. In dit werk is de CYANOCHIP routinematig gedrukt door contact met behulp van een robotsysteem (Arrayer) in staat spotten nL hoeveelheden van de antilichamen op de micrometer schaal. <ol><li> Stel de omgevingsomstandigheden van de drukkerij tot 20 ° C en 40-50% relatieve vochtigheid. </li><li> Stel de schuif substraten (bv 75- x 25-mm-epoxy geactiveerde microscoop glasplaatjes) meerdere identieke antilichaam arra voerenys op elke dia. </li><li> Spot elk gezuiverd antilichaam, met inbegrip van controles en de referentie-frame, in een drievoud vlekpatroon; onder deze omstandigheden, de vlekken 180-200 urn in diameter. </li><li> Na het afdrukken verlaat de dia ten minste 30 minuten bij omgevingstemperatuur te laten drogen en bewaar ze bij 4 ° C; voor het werken in het veld, kan de dia worden getransporteerd en opgeslagen bij omgevingstemperatuur gedurende verscheidene maanden. OPMERKING: De CYANOCHIP wordt gedrukt in een drievoud plek microarray formaat met 3 x 8 identieke microarray per objectglaasje of 9 identieke arrays in een 1 x 9 microarray-formaat. Elke array grootte niet groter dan de reactiekamer afmetingen voor een 24-well pakking (gewoonlijk 7,5 x 6,5 mm in een 3 x 8 hybridisatiekamer) zijn. </li><li> Voordat u de microarray milieu monsters te analyseren, gebruiken FSMI aan de werkende verwatering voor elk antilichaam in een titratie curve te bepalen. Voor elk antilichaam, een standaard concentratie van het overeenkomstige immunogen (10 maart - 10 april cellen / ml) en seriële verdunningen van de fluorescerende antilichaam (tussen 1: 500 en 1: 32.000). De optimale antilichaamconcentratie overeen met 50% van de maximale signaalintensiteit verkregen in de titratiecurve. Ook moet de gevoeligheid en specificiteit voor elk antilichaam bepaald zoals beschreven in Blanco et al. 22. </li></ol></li></ol> 6. Voorbereiding van de Environmental Multianalyte Extracten voor de TL-Sandwich Microarray Immunoassay (FSMI) <ol><li> Multianalyte uittreksel uit een vloeibaar monster <ol><li> Neem 1 - 100 ml van het vloeibare monster met een steriele injectiespuit (bijvoorbeeld water uit de kust van een waterreservoir); de hoeveelheid monster is sterk afhankelijk van de potentiële concentratie van het doelwit. </li><li> Concentreer de cellen door het passeren van het watermonster door een 3 urn poriegrootte, 47 mm diameter polycarbonaatfilter; een celconcentratietussen 10 maart - 10 augustus cellen / ml is wenselijk positieve detectie, maar de werkelijke concentratie onbekend. </li><li> Herstel de in het filter met 1 ml van een gemodificeerde Tris-gebufferde zoutoplossing Tween 20 versterkt buffer (TBSTRR; 0,4 M Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl en 0,1% Tween 20) biomassa door schrapen met een spatel in een 15-mL buis. </li><li> Homogeniseren en te splitsen met behulp van een draagbare ultrasone processor, zoals beschreven in stap 1,5, of gewoon door en neer te pipetteren meerdere malen; Dit bereidt het monster voor analyse door de microarray. </li></ol></li><li> Multianalyte uittreksel uit een vast monster <ol><li> Weeg tot 0,5 g van de vaste monster (bijvoorbeeld, rock, de bodem of sedimenten) in een 10-mL buis en optellen tot 2 ml TBSTRR. </li><li> Ultrasone trillingen door onderdompeling van de sonicator probe in de buis, door dompelen van de buis in het waterbad van een krachtige sonicatorhoorn, of door een handbediende sonicator. Voer ten minste 5 x 30-scycli bij 30 kHz, stoppend voor 30 s terwijl op ijs. </li><li> Filter zand, klei en andere grof materiaal te verwijderen met een 10 ml spuit gekoppeld met een diameter 10 tot 12 mm, 5- tot 20-um poriegrootte nylon filterhouder. Schuif de monsterhouder door de filter in een 1,5 ml buis. Als het filter verzadigde vetzuren, schudden de suspensie in de injectiespuit en breng het naar een nieuwe; Dit bereidt het filtraat materiaal van de immunoassay (stap 7). OPMERKING: De buffercapaciteit van TBSTRR afhankelijk van het type monster. Het is belangrijk om de immunoassay onmiddellijk na de bereiding van het milieu extract dragen naar het effect van enzymatische afbraak van de analyten voorkomen. Alternatief voeg proteaseremmers in het milieu extract en bevriezen bij -80 ° C tot de volgende stap. </li></ol></li></ol> 7. Fluorescerende Sandwich Microarray Immunoassay (FSMI) <ol><li> Het blokkeren van de CYANOCHIP OPMERKING: Vlak voor het gebruik, de behandeling van de pEDRUKT glijdt alle vrije epoxygroepen op het schuifblok en de overmaat van niet-covalent gebonden antilichamen te verwijderen. <ol><li> Dompel de microarray in 0,5 M Tris-HCl (pH 9) met 5% (w / v) BSA oplossing op een schoon oppervlak (bijvoorbeeld petrischaal of een 50 ml buis) onder zacht roeren van een tuimelschakelaar platform 5 min. Als alternatief, leg de glijbaan naar beneden op een 100- tot 200-ul druppel van de bovenstaande oplossing met de microarray plekken waarvoor zij staat. Verlof voor 3-5 min en dan verder. </li><li> pick voorzichtig op de dia met behulp van plastic getipt pincet; proberen te raken microarray zones te vermijden. Elimineer de overtollige vloeistof door zachtjes kloppen de glijbaan op een papieren handdoek. Ondergedompeld in 0,5 M Tris-HCl (pH 8) met 2% (w / v) BSA oplossing gedurende 30 minuten onder zacht roeren van een rocker platform. </li><li> Droog de slede door het uitvoeren van een korte centrifugatie (200-300 g gedurende 1 minuut) met een commercieel microcentrifuge aangepast voor microscoopglaasjes. Als alternatief, droog de dia door zacht ont kloppeno een papieren handdoek. </li></ol></li><li> Incubatie van de multianalyte monsterextract met de microarray <ol><li> Stel de schuif in een commerciële microarray hybridisatie cassette met 24 putten voor meerdere microarrays; volg de instructies provider. </li><li> Na preparaat en cassette montage pipet tot 50 pl van het monster of extract een verdunning in TBSTRR in elk putje van de cassette. </li><li> Herhaal stap 7.2.2 voor elk monster te analyseren. </li><li> Als een blanco controle Pipetteer 50 ul buffer TBSTRR in ten minste twee afzonderlijke putjes van de cassette. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder mengen door pipetteren elke 15 minuten of door het verlaten onder mild schudden. Alternatief incubeer gedurende 12 uur bij 4 ° C. OPMERKING: Gebruik andere incubatie pakkingen als functie van de microarray patroon. De tijd en temperatuur van de incubatie in stap 7.2.5 empirische parameters die gewoonlijk afhankelijk zijn van de affiniteit en binding kimet be- trekking van elke gekoppelde antigeen-antilichaam. </li></ol></li><li> het wassen <ol><li> Verwijder de monsters door de invoering van de cassette naar beneden en voorzichtig kloppen op een schone, absorberend papier. </li><li> Was de putjes door het toevoegen van 150 pi van TBSTRR een ieder, en verwijderen van de buffer, zoals hierboven. </li><li> Herhaal stap 7.3.2 drie keer. </li></ol></li><li> Incubatie met fluorescerende detector antilichamen <ol><li> Voeg 50 ul van een mengsel dat het antilichaam 17 tegen cyanobacteriën-stam antilichamen, elk gelabeld met het fluorochroom in TBSTRR met 1% (w / v) BSA. Bepaal de concentratie van elk fluorescerend antilichaam in het mengsel (0,7-2 ug / ml) door het uitvoeren titratie experimenten van elk antigeen / antilichaam pair 22. </li><li> Incubeer gedurende 1 uur bij omgevingstemperatuur, zoals beschreven in stap 7.2.5, of 12 uur bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Uitwassen van de fluorescerende antilichamen &lt;/ Strong&gt; <ol><li> Verwijder de ongebonden fluorescente antilichamen, zoals in stap 7,3. </li><li> Demonteer de cassette en dompel de dia in 0.1x PBS (bijvoorbeeld in een 50-mL buis) voor een snelle spoelen. </li><li> Droog de dia als in stap 7.1.3. </li></ol></li></ol> 8. Scannen op Fluorescentie <ol><li> Scan de glijbaan voor fluorescentie op emissiemaximum fluorescentiepiek voor ver-rode fluorescerende kleurstof in een scanner voor fluorescentie. Haal een paar beelden van de microarrays bij verschillende scanning parameters, in het algemeen door het verlagen van de laser gain-waarde. LET OP: Vermijd verzadigde vlekken (&gt; 65.000 fluorescentie tellingen) -ze zijn uit de schaal en kunnen kwantificeren fouten te introduceren. </li></ol> 9. Beeldverwerking en data-analyse <ol><li> Gebruik een commerciële software voor het analyseren en kwantificeren; De software levert metingen van de fluorescentie-intensiteit (FI, mediaan of gemiddelde van alle pixels van een enkele spot) voor each spot van de hele microarray. Trek de lokale achtergrond rond de spots: FI = FI spot - FI lokale achtergrond. </li><li> Sla de FI data en open ze met behulp van een spreadsheet-programma. </li><li> Gebruik de waarden verkregen voor de lege arrays als de negatieve controle om de valse positieven te identificeren en te verwijderen. Pas de volgende vergelijking om de FI voor elk antilichaam spot te berekenen: FI = (FI monster - FI blanco), waarbij FI monster = FI spot - FI lokale achtergrond in de microarrays uitgevoerd met monsterextracten en FI blank = FI spot - FI lokale achtergrond in het lege microarrays. </li><li> Breng een extra uitschakeldrempel van 2- tot 3-maal de gemiddelde van de FI van de gehele microarray om de kans op valse positieven te minimaliseren; Dit is met name relevant voor slechte kwaliteit microarray beelden en een lage signaal-ruis verhoudingen. </li><li> Maak percelen en / of het uitvoeren van verdere analyse als dat nodig is. </li&gt; </ol>

<ol><li>Simis, S. G. H., Peters, S. W. M., Gons, H. J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.4319/lo.2005.50.1.0237/abstract">Remote sensing of the cyanobacterial pigment phycocianin in turbid inland water.</a> Limnol. Oceanogr. 50 (1), 237-245 (2005).</li>
<li>Zamyadi, A., McQuaid, N., Prevost, M., Dorner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+potentially+toxic+cyanobacteria+using+an+online+multi-probe+in+drinking+water+sources%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Environ.+Monit%22%5BJournal%5D)">Monitoring of potentially toxic cyanobacteria using an online multi-probe in drinking water sources.</a> J. Environ. Monit. 14, 579-588 (2012).</li>
<li>Msagati, T. A. M., Siame, B. A., Shushu, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+for+the+isolation%2C+detection+and+quantification+of+cyanobacterial+hepatotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods for the isolation, detection and quantification of cyanobacterial hepatotoxins.</a> Aquat. Toxicol. 78 (4), 382-397 (2006).</li>
<li>Weller, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoassays+and+biosensors+for+the+detection+of+cyanobacterial+toxins+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Immunoassays and biosensors for the detection of cyanobacterial toxins in water.</a> Sensors. 13 (11), 15085-15112 (2013).</li>
<li>Baker, J. A., Neilan, B. A., Entsch, B., McKay, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cyanobacteria+and+their+toxigenicity+in+environmental+samples+by+rapid+molecular+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Identification of cyanobacteria and their toxigenicity in environmental samples by rapid molecular analysis.</a> Environ. Toxicol. 16 (6), 472-482 (2001).</li>
<li>Li, H., Singh, A. K., McIntyre, L. M., Sherman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+in+response+to+hydrogen+peroxide+and+the+putative+PerR+regulon+of+Synechocystis+sp.+Strain+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression in response to hydrogen peroxide and the putative PerR regulon of Synechocystis sp. Strain PCC 6803.</a> J. Bacteriol. 186 (11), 3331-3345 (2004).</li>
<li>Anderson, D. M., Cembella, A. D., Hallegraeff, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+harmful+algal+blooms%3A+paradigm+shifts+and+new+technologies+for+research%2C+monitoring%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Mar.+Sci%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding harmful algal blooms: paradigm shifts and new technologies for research, monitoring, and management.</a> Ann. Rev. Mar. Sci. 4, 143-176 (2012).</li>
<li>Dittami, S. M., Pazos, Y., Laspra, M., Medlin, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+testing+for+the+presence+of+toxic+algae+monitoring+programme+in+Galicia+%28NW+Spain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Pollut.+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Microarray testing for the presence of toxic algae monitoring programme in Galicia (NW Spain).</a> Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20, 6778-6793 (2013).</li>
<li>Kegel, J. U., Del Amo,, Medlin, Y., K, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+Project+MIDTAL%3A+its+methods+and+samples+from+Arcachon+Bay%2C+France%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Pollut.+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Introduction to Project MIDTAL: its methods and samples from Arcachon Bay, France.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20 (10), 6690-6704 (2013).</li>
<li>Marcheggiani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+emerging+and+re-emerging+pathogens+in+surface+waters+close+to+an+urban+area%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Environ.+Res.+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Detection of emerging and re-emerging pathogens in surface waters close to an urban area.</a> Int. J. Environ. Res. Public Health. 12 (5), 5505-5527 (2015).</li>
<li>Fernández-Calvo, P., Näke, C., Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Gómez-Elvira, J., Parro, V. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032063306002017">A multi-array competitive immunoassay for the detection of broad-range molecular size organic compounds relevant for astrobiology.</a> Planet. Space Sci. 54 (815), 1612-1621 (2006).</li>
<li>Parro, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParro%2C+V+%22Antibody+microarrays+for+environmental+monitoring.+Handbook+of+Hydrocarbon+and+Lipid+Microbiology%22">Antibody microarrays for environmental monitoring. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. 2699-2710 (2010).</li>
<li>Fan, Z., Keum, Y. S., Li, Q. X., Shelver, W. L., Guo, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+immunoassay+detection+of+multiple+environmental+chemicals+on+protein+microarrays+using+DNA%2Fdye+conjugate+as+a+fluorescent+label%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Environ.+Monit%22%5BJournal%5D)">Sensitive immunoassay detection of multiple environmental chemicals on protein microarrays using DNA/dye conjugate as a fluorescent label.</a> J. Environ. Monit. 14 (5), 1345-1352 (2012).</li>
<li>Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Moreno-Paz, M., Patricia Cruz-Gil, P., Gómez-Elvira, J., Parro, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+200-Antibody+microarray+biochip+for+environmental+monitoring%3A+Searching+for+universal+microbial+biomarkers+through+immunoprofiling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A 200-Antibody microarray biochip for environmental monitoring: Searching for universal microbial biomarkers through immunoprofiling.</a> Anal. Chem. 80 (21), 7970-7979 (2008).</li>
<li>Delehanty, J. B., Ligler, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microarray+immunoassay+for+simultaneous+detection+of+proteins+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria.</a> Anal. Chem. 74 (21), 5681-5687 (2002).</li>
<li>Ligler, F. S., Taitt, C. R., Shriver-Lake, L. C., Sapsford, K. E., Shubin, Y., Golden, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+biosensor+for+detection+of+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Array biosensor for detection of toxins.</a> Anal. Bioanal. Chem. 377 (3), 469-477 (2003).</li>
<li>Rucker, V. C., Havenstrite, K. L., Herr, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+microarrays+for+native+toxin+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Antibody microarrays for native toxin detection.</a> Anal. Biochem. 339 (2), 262-270 (2005).</li>
<li>Kang, J., Kim, S., Kwon, Y. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/BF03216477">Antibody-based biosensors for environmental monitoring.</a> Toxicol. Environ. Health. Sci. 1 (3), 145-150 (2009).</li>
<li>Herranz, S., Marazuela, M. D., Moreno-Bondi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+portable+array+biosensor+for+multisample+microcystin+analysis+in+freshwater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Automated portable array biosensor for multisample microcystin analysis in freshwater samples.</a> Biosens. Bioelectron. 33 (1), 50-55 (2012).</li>
<li>Shlyapnikov, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+simultaneous+ultrasensitive+immunodetection+of+five+bacterial+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid simultaneous ultrasensitive immunodetection of five bacterial toxins.</a> Anal. Chem. 84 (13), 5596-5603 (2012).</li>
<li>Szkola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simultaneous+detection+of+ricin%2C+staphylococcal+enterotoxin+B+and+saxitoxin+by+chemiluminescence-based+microarray+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Rapid and simultaneous detection of ricin, staphylococcal enterotoxin B and saxitoxin by chemiluminescence-based microarray immunoassay.</a> Analyst. 139, 5885-5892 (2014).</li>
<li>Blanco, Y., Quesada, A., Gallardo-Carreño, I., Jacobo Aguirre,, Parro, J., V, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYANOCHIP%3A+An+antibody+microarray+for+high-taxonomical-resolution+cyanobacterial+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">CYANOCHIP: An antibody microarray for high-taxonomical-resolution cyanobacterial monitoring.</a> Environ. Sci. Technol. 49 (3), 1611-1620 (2015).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Sensitive+Method+for+the+Quantitation+of+Microgram+Quantities+of+Protein+Utilizing+the+Principle+of+Protein-Dye+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.</a> Anal. Chem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+Bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using Bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Rivas, L. A., Aguirre, J., Blanco, Y., González-Toril, E., Parro, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graph-based+deconvolution+analysis+of+multiplex+sandwich+microarray+immunoassays%3A+applications+for+environmental+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Graph-based deconvolution analysis of multiplex sandwich microarray immunoassays: applications for environmental monitoring.</a> Environ. Microbiol. 13 (6), 1421-1432 (2011).</li>
<li>Blanco, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+prokaryotic+community+and+metabolisms+in+south+african+deep-mine+biofilms+through+antibody+microarrays+and+graph+theory%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Deciphering the prokaryotic community and metabolisms in south african deep-mine biofilms through antibody microarrays and graph theory.</a> PloS One. 9 (2), e114180(2014).</li>
<li>Gas, F., Baus, B., Queré, J., Chapelle, A., Dreanno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+and+quantification+of+the+marine+toxic+algae%2C+Alexandrium+minutum%2C+using+a+super-paramagnetic+immunochromatographic+strip+test%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Rapid detection and quantification of the marine toxic algae, Alexandrium minutum, using a super-paramagnetic immunochromatographic strip test.</a> Talanta. 147, 581-589 (2016).</li>
<li>Parro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOLID3%3A+a+multiplex+antibody+microarray-based+optical+sensor+instrument+for+in+situ+life+detection+in+planetary+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">SOLID3: a multiplex antibody microarray-based optical sensor instrument for in situ life detection in planetary exploration.</a> Astrobiology. 11, 15-28 (2011).</li>
<li>McKay, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Icebreaker+Life+Mission+to+Mars%3A+a+search+for+biomolecular+evidence+for+life%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">The Icebreaker Life Mission to Mars: a search for biomolecular evidence for life.</a> Astrobiology. 13, 334-353 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier wordt een multiplex fluorescerende sandwich immunoassay met de CYANOCHIP, een 17-antilichaam microarray voor de detectie en identificatie van een breed scala van cyanobacteriën genera, beschreven 22. Deze blauwalgen vormen de meest voorkomende bodemdieren en plankton genera in zoetwaterhabitats, sommigen van hen zijn toxine producenten. Onlangs heeft de fluorescentie immunoassay format gebruikt om micro-organismen en / of bioanalytes identificeren milieutoepassingen <sup class="xref...

De detectie en monitoring van micro-organismen in complexe natuurlijke microbiële gemeenschappen zijn van cruciaal belang op vele gebieden, met inbegrip van medische biologie, ecologie van het milieu, en astrobiology. Cyanobacteriën zijn prokaryotische micro- organismen bekend om hun vermogen om bloemen (excessieve proliferatie) van cellen vormen in zoet water. Ze zijn alomtegenwoordig en vele soorten kunnen toxinen produceren, wat niet alleen een risico betekent voor de gezondheid, maar ook een ecologische impact. In dit verband is het essentieel om snelle en gevoelige methode voor de vroege detectie van cyanobacteriën en / of toxinen in grond en water te ontwikkelen. Voor dit doel is een multiplex fluorescerende sandwich microarray immunoassay (FSMI) is ontwikkeld als instrument voor waterbeheerders om hen te helpen bij het maken van beslissingen en, bijgevolg, bij de uitvoering van de juiste water management programma&#39;s. Een breed scala aan methoden ontwikkeld voor het opsporen en identificeren van cyaanobacterial cellen en cyanotoxines in grond en water, zoals optische microscopie, moleculaire biologie, en immunologische technieken. Deze methoden kunnen sterk variëren in de informatie die zij verstrekken. Microscopische technieken zijn gebaseerd op celmorfologie en de detectie van in vivo fluorescentie van cyanobacteriën pigmenten, zoals phycocyanin of chlorofyl a 1. Hoewel ze zijn snelle en goedkope methoden voor real-time en frequente controle die informeren over de aard en het aantal cyanobacteriën aanwezig is in een monster, hebben ze geen informatie over de mogelijke toxiciteit geven. Bovendien vereisen zij een bepaald niveau van deskundigheid, aangezien het vaak moeilijk om onderscheid te maken tussen nauw verwante soorten 2. Om deze beperkingen te overwinnen, moet lichtmicroscopie worden begeleid door zowel biologische en biochemische screeningstesten en fysisch-chemische methoden voor de identificatie en kwantificatie van cyanotoxines. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt;-enzyme linked immunosorbent assays (ELISA), eiwit fosfaat remmingstesten (PPIA) en neurochemische bij muizen zijn voorbeelden van biochemische screeningsassays voor de detectie van cyanotoxines. Terwijl de eerste twee zijn snelle en gevoelige methoden zijn valse positieven beschreven bij het gebruik van ELISA en PPIA tests worden beperkt tot drie typen gifstoffen. De muis bioassay is een kwalitatieve techniek met een lage gevoeligheid en precisie, en speciale vergunningen en opleiding vereist. Bovendien is het geen informatie over de aard van de giftige stoffen die aanwezig zijn in een monster te geven. Cyanotoxines kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd andere analytische werkwijzen, zoals hoge-prestatie vloeistofchromatografie (HPLC), vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS), gaschromatografie (GC), gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), of matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie vluchttijd (MALDI-TOF). Dit is echter alleen mogelijk als referentiestandaarden, die nodiged individuele toxine concentraties in complexe monsters te bepalen, zijn 3, 4. Bovendien zijn deze werkwijzen zijn tijdrovend; vereisen dure apparatuur, voorraden en monster voorbereiding; en moeten worden uitgevoerd door ervaren en gespecialiseerde medewerkers. Moleculair gebaseerde methoden zijn toegepast voor de komende decennia op te sporen, te identificeren en te kwantificeren cyanobacteriën en de bijbehorende cyanotoxines dankzij de sequentie-informatie gepubliceerd in het genoom databases (bv, National Center for Biotechnology Information, NCBI). Onder deze werkwijzen zijn op basis van de polymerasekettingreactie (PCR), waarbij het ontwerp van primersets voor DNA amplificatie vereist en afhankelijk voorkennis van DNA-sequenties van verschillende soorten cyanobacteriën. Terwijl gen detectie, zoals de phycocyanin operon, leidt tot een nauwkeurige identificatie op genus niveau, sommige soorten of stammen zijn onopgemerkt metdeze methode. Echter, toxine-coderende genen, bijvoorbeeld die welke behoren tot de microcystine operon, vergemakkelijken de identificatie van toxines in monsters waar de producenten schaars 5. Niettemin heeft de detectie van toxine markers door PCR niet noodzakelijkerwijs toxiciteit in het milieu. Bovendien is de set van primers ontwikkeld om het hele scala van soorten cyanobacteriën en toxine producenten aanwezig zijn in een monster te analyseren is nog onvolledig, en verder onderzoek moet worden gedaan om onbekende soorten te identificeren. Andere moleculaire technieken niet PCR-gebaseerde, zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en DNA microarrays. In de laatste twee decennia heeft microarray technologie aan belang gewonnen op vele toepassingsgebieden, met name in het milieu monitoring. DNA microarrays mogelijk maken onderscheid tussen soorten en analyten 4, 6, 7 </sup&gt;, 8, 9, 10, maar ze worden beschouwd als zeer omslachtig en tijdrovend taken die meerdere stappen (bijvoorbeeld microarray prestaties, DNA extractie, PCR amplificatie en hybridisatie) omvatten. Daarom minder tijdrovend assays op basis van antilichamen, zoals sandwich en competitieve immunologische microarrays, een essentieel en betrouwbare high-throughput werkwijze voor de detectie van meerdere analyten milieu 11, 12, 13 worden. Het vermogen van antilichamen om specifiek herkennen de doelverbindingen en kleine hoeveelheden analyten en eiwitten te detecteren, samen met de mogelijkheid van het produceren van antilichamen tegen vrijwel alle stoffen, maak antilichaam microarrays een techniek om milieuredenen. Bovendien is de mogelijkheid van het bereiken meerdere analyses alsingle assay, met detectiegrenzen variërend van ppb tot ppm, is een van de belangrijkste voordelen van deze methode 14. Antilichamen gebaseerde biosensoren bleken gevoelige en snelle instrumenten voor de detectie van een breed scala van pathogenen en toxinen in milieucontrole 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 zijn. Terwijl DNA werkwijzen omvatten verschillende stappen, het op antilichaam gebaseerde microarrays vereisen slechts een kleine steekproef preparaat dat hoofdzakelijk gebaseerd is op een korte lysisstap in een geschikte buffer oplossing. Delehanty en 15 League Meeste meldde de gelijktijdige detectie van eiwitten en bacteriële analyten in complexe mengsels van een antilichaam sandwich immunoassay voor het opsporen van een eiwitconcentratie van een 4 ppbd 10 4 cfu / ml cellen. Szkola et al. 21 is een voordelige en betrouwbare multiplex microarray voor de simultane detectie van proteotoxins en kleine toxines verbindingen die kunnen worden gebruikt als biologisch wapen ontwikkeld. Het gedetecteerde concentraties ricine toxine, met een detectiegrens van 3 ppb, in minder dan 20 minuten. Onlangs heeft de CYANOCHIP een antilichaam microarray-gebaseerde biosensor voor de in situ detectie van toxische en toxische cyanobacteriën beschreven 22. Dit microarray maakt de identificatie van potentiële cyanobacteriënbloeien, meestal in waterige omgevingen die moeilijk microscopisch identificeren. De detectiegrens van de microarray is 10 februari - 10 maart cellen voor de meeste soorten, het draaien van deze biosensor in een kosteneffectief instrument voor de multiplex detectie en identificatie van cyanobacteriën, zelfs op het niveau van soorten. Al deze eigenschappen maken de AntiboDY microarray techniek, met name de methode die in dit werk, sneller en eenvoudiger methode dan de bovengenoemde technieken. Dit werk toont twee voorbeelden van experimenten die een antilichaam microarray gebaseerde biosensor om de aanwezigheid van cyanobacteriën in bodem- en watermonsters te detecteren. Het is een eenvoudige en betrouwbare methode gebaseerd op een immunoassay format dat zeer kleine monsterhoeveelheden en zeer eenvoudige monstervoorbereiding vereist. De werkwijze vereist een korte tijd en kan gemakkelijk worden uitgevoerd in het veld.

<table><tbody><tr><td>0.22 mm pore diameter filters</td><td>Millipore</td><td>GSWP04700</td><td>Voor de bereiding van immunogenen</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; 5424R microcentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Voor de bereiding van immunogenen</td></tr><tr><td>Fosfaat bufferoplossing met zout (PBS) pH 7.4 (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011036</td><td>50 mM kaliumfosfaat, 150 mM NaCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Ultrasoon processor UP50H</td><td>Hielscher</td><td></td><td>Voor de bereiding van immunogenen</td></tr><tr><td>Complete Freund's adjuvant&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5881</td><td>Immunopotentiator</td></tr><tr><td>Incomplete Freud's adjuvant</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F5506</td><td>Voor booster injecties</td></tr><tr><td>Proteïne A antilichaam zuiveringskit&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PURE1A&nbsp;</td><td>Voor isolatie van IgG</td></tr><tr><td>Centrifugale filterapparaten MWCO&lt;100 kDa</td><td>Millipore</td><td>UFC510096-96K</td><td>Voor isolatie van IgG</td></tr><tr><td>Dialyse slangen, benzoyleerd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7884-10FT</td><td>Voor isolatie van IgG</td></tr><tr><td>Illustra Microspin G-50 kolommen&nbsp;</td><td>GE-HealthCare</td><td>GE27-5330-02</td><td>Voor isolatie van IgG</td></tr><tr><td>Bradford reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916-500 mL</td><td>Om de antilichaamconcentratie te meten</td></tr><tr><td>MicroBCA proteïne assay kit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23235</td><td>Om de antilichaamconcentratie te meten</td></tr><tr><td>Proteïne arraying buffer 2x</td><td>Whatman (Sigma Aldrich)&nbsp;</td><td>S00537</td><td>Print buffer; 30 - 40% glycerol in 1x PBS met 0.01% Tween 20</td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P9416</td><td>Nie-ionisch detergent</td></tr><tr><td>Rund serum albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9418</td><td>Controle&nbsp; voor printen; blokkeermiddel</td></tr><tr><td>384-wells microplaat</td><td>Genetix</td><td>X6004</td><td>Voor antilichaam printen</td></tr><tr><td>Robot arrayer voor meerdere slides</td><td>MicroGrid II TAS arrayer van Digilab</td><td></td><td>Voor antilichaam printen</td></tr><tr><td>Epoxy substraat glas slides</td><td>Arrayit corporation</td><td>VEPO25C</td><td>Solide ondersteuning voor antilichaam printen</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester&nbsp;</td><td>Molecular probes</td><td>A20006</td><td>Fluorochroom</td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D8418</td><td>Fluorochroom oplosmiddel</td></tr><tr><td>Heidolph Titramax vibrerende platform shaker</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Voor antilichaam labelen&nbsp;</td></tr><tr><td>Illustra Microspin G-50 kolommen&nbsp;</td><td>Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td>Voor zuivering van gelabelde antilichamen</td></tr><tr><td>Safe seal bruine 0.5 mL buisjes</td><td>Sarstedt</td><td>72,704,001</td><td>Voor opslag van gelabelde antilichamen&nbsp;</td></tr><tr><td>Nanodrop 1000 spectrofotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Om antilichaamconcentratie en labelefficiëntie te meten</td></tr><tr><td>3 &micro;m poriegrootte polycarbonaat 47 mm diameter filter</td><td>Millipore</td><td>TMTP04700</td><td>Om cellen te concentreren</td></tr><tr><td>1 M Trizma hydrochloride oplossing pH 8</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T3038</td><td>Voor TBSTRR voorbereiding; om slides te blokkeren</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S7653</td><td>Voor TBSTRR voorbereiding</td></tr><tr><td>20 &micro;m nylon filters&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>NY2004700</td><td>Voor omgevingsextract voorbereiding</td></tr><tr><td>10 - 12 mm filterhouders</td><td>Millipore</td><td>SX0001300</td><td>Voor omgevingsextract voorbereiding</td></tr><tr><td>Protease remmercocktail</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P8340</td><td>Voor omgevingsextract opslag</td></tr><tr><td>1 M Trizma hydrochloride oplossing pH 9</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T2819</td><td>Om slides te blokkeren</td></tr><tr><td>Heidolph Duomax 1030 schommelplatform shaker</td><td>VWR</td><td></td><td>Om slides te blokkeren; voor incubatieprocessen&nbsp;</td></tr><tr><td>VWR Galaxy miniarray microcentrifuge</td><td>VWR</td><td>C1403-VWR</td><td>Om slides te drogen</td></tr><tr><td>Multi-Well microarray hybridisatie cassette</td><td>Arrayit corporation</td><td>AHC1X24</td><td>Cassette voor 24 tests per slide</td></tr><tr><td>GenePix 4100A microarray scanner&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Scanner voor fluorescentie</td></tr><tr><td>GenePix Pro Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software voor beeldanalyse en kwantificering</td></tr></tbody></table>

experimenteel protocol voor het opsporen cyanobacteriën in vloeibare en vaste monsters met een antilichaam microarray chip

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Opwarming van de aarde en eutrofiëring maak wat aquatische ecosystemen gedragen als echte bioreactoren die een snelle en massale cyanobacteriën groei leiden; Dit heeft relevante gezondheids- en economische gevolgen. Veel stammen zijn cyanobacterial toxine producenten en slechts weinig cellen nodig om onherstelbare schade aan het milieu veroorzaken. Daarom, water-body overheden en administraties vereisen snelle en efficiënte systemen voor vroegtijdige waarschuwing verstrekken van betrouwbare gegevens om hun preventieve of curatieve beslissingen te ondersteunen. Dit manuscript meldt een experimenteel protocol voor de in het veld detectie van toxine-producerende cyanobacteriën stammen met behulp van een antilichaam microarray chip met 17 antilichamen (ABS) met taxonomische resolutie (CYANOCHIP). Hier, een multiplex fluorescerende sandwich microarray immunoassay (FSMI) voor de gelijktijdige bewaking van 17 cyanobacteriën stammen vaak gevonden bloeien in zoetwater ecosystemen, sommigen van hen toxine producenten, beschreven. Een microarray met multiple identieke herhalingen (maximaal 24) van de CYANOCHIP werd op een objectglaasje gedrukt gelijktijdig eenzelfde aantal monsters getest. Vloeibare monsters kunnen worden getest, hetzij door directe incubatie met de antilichamen (Abs) of na celconcentratie door filtratie door een 1- tot 3-um filter. Vaste monsters, zoals sedimenten en gemalen rotsen, eerst gehomogeniseerd en gedispergeerd met een handbediende ultrasonicator per incubatiebuffer. Zij worden dan gefilterd (5-20 pm) waardoor het ruwe materiaal te verwijderen en het filtraat wordt geïncubeerd met Abs. Immuunreacties worden onthuld door een uiteindelijke incubatie met een mengsel van de 17 fluorescentie gelabelde Abs en worden gelezen door een draagbare fluorescentiedetector. Het hele proces duurt ongeveer 3 uur, het meeste overeenkomt met twee 1-uur incubatie perioden. De uitvoer is een beeld, waarbij heldere vlekken corresponderen met de positieve detectie van cyanobacteriën markers.

Het beschrijft een multiplex immunoassay voor gelijktijdige identificatie van de meest relevante zoetwater cyanobacteriën soorten (Tabel 1) met de CYANOCHIP antilichaam microarray. De microarray kan een 3 x 8 microarray-formaat gedrukt op microscoopglaasjes zijn. Elke microarray bestaat uit een reeks 17 antilichamen gedrukt een drievoud vlekpatroon hun overeenkomstige pre-immune antistoffen en BSA als negatieve controles. De microarrays ook een fluorescerende frame met e...

De aanwezigheid van cyanobacteriëntoxines in zoetwaterreservoirs voor menselijke consumptie is een grote zorg voor waterbeheerautoriteiten. Om het risico van waterverontreiniging te evalueren, beschrijft dit artikel een protocol voor de detectie op locatie van cyanobacteriënstammen in vloeibare en vaste monsters door gebruik te maken van een antilichaam-microarray-chip.

Experimenteel protocol voor het opsporen Cyanobacteriën In vloeibare en vaste monsters met een antilichaam Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

Het algemene doel van deze procedure is om de aanwezigheid van meerdere cyanobacteriële stammen in vloeibare en vaste monsters te bepalen met behulp van een fluorescentie-microarray-immuno-assay. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van milieu, monitoring en waterbeheer, zoals de aanwezigheid van toxines geproduceerd door protoxine-producerende bacteriën voordat de bloei zichtbaar wordt voor het blote oog. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat meerdere cyanobacteriële stammen en meerdere monsters tegelijkertijd in een periode van drie, vier uur kunnen worden gemonitord, zowel in situ als in het laboratorium.Deze methode kan dus inzicht geven in biodiversiteit. Het kan ook worden toegepast op andere gebieden, zoals het monitoren van landbouwinstallaties, levensdetectie in omgevingen met spanning of planetaire exploratie. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode geen problemen ondervinden.Vanwege de eenvoud in de monsterverwerking en de eenvoudiger interpretatie van de resultaten. Na het produceren en zuiveren van antilichamen volgens het tekstprotocol, voeg 100 microliter DMSO toe aan een commerciële flacon met kleurstof voor labeling, één milligram eiwit. Zodra de kleurstof is opgelost, label de gezuiverde antilichamen door twee microliter van de kleurstof toe te voegen aan 50 microliter van elk antilichaampreparaat.Houd de labelreacties gedurende een uur op kamertemperatuur onder continue agitatie op een trillende platform. Na het zuiveren van de gelabelde antilichamen volgens het tekstprotocol, laadt u een kleine aliquot in een spectrofotometer en meet u de absorptie bij 280 en 650 nanometer. Bereken de labelefficiënties volgens de aanbevelingen van de leverancier.Om een CYANOCHIP te maken, bereidt u 30 microliter van elk gezuiverd antilichaam voor door één milligram per milliliter antilichaam in een 1X eiwitprintbuffer met 01%volume per volume Tween 20 te mengen. Bereid 30 microliter van de volgende printoplossingen voor als controles. 1X eiwitprintbuffer met 01%van volume per volume van Tween 20.Elk eiwit A gezuiverd preimmune serum op één milligram per milliliter in 1X eiwitprintbuffer met 01%Tween 20 en één milligram per milliliter BSA en 1X eiwitprintbuffer met 01%Tween 20. Voeg 30 microliter van de voorbereide printoplossingen per put toe aan de hoogwaardige 384-putjes microplaten. Na het instellen van de printrobot en slide-substraten volgens het tekstprotocol, spot alle antilichamen en de controles op de slides in een drievoudig spotpatroon met een diameter van ongeveer 180 tot 200 micron.Voor bemonstering in de omgeving, gebruikt u een steriele spuit om één tot 100 milliliter vloeistoffen te verzamelen en de cellen te concentreren door het monster door een filter met een poriegrootte van drie micron te laten lopen. Indien nodig, verzamelt u vaste monsters van rotsen of bodems en bewaart u deze in steriele buisjes. Monsters kunnen worden getest in een klein veldlab.Voeg één milliliter extractie-incubatiebuffer toe om de biomassa die in het filter is verzameld te herstellen en gebruik een spatel om het filter in een 15 milliliterbuis te schrapen. Met een handbediende ultrasone processor, of door meerdere keren op en neer te pipetten, wordt dit aggregaat en homogeniseert het monster. Weeg bovendien maximaal 0,5 gram van het vaste monster in een aparte 10 milliliterbuis en voeg maximaal twee milliliter extractiebuffer toe.Dompel een sonicator-sonde in de buis en soniceer met een handbediende ultrasone processor of ander ultrasoonapparaat. Terwijl u het monster op ijs houdt, voert u minimaal vijf cycli van 30 seconden uit bij 30 kilohertz, met een pauze van 30 seconden tussen de sonicaties. Om een filtraatextract voor de immuno-assay voor te bereiden, gebruikt u een 10 milliliterspuit gekoppeld aan een nylonfilterhouder met een poriegrootte van vijf tot 20 micron om de oplossing in een 1,5 milliliterbuis te filteren om zand, klei en ander grof materiaal te verwijderen.Leg de slide met de microarray-spots naar beneden op een druppel van 100 tot 200 microliter blokkerende oplossing en incubeer gedurende drie tot vijf minuten. Gebruik plastic-tipped pincetten en vermijd de microarray-zones, pak de slide voorzichtig op. Dompel de slide onder in een verse blokkerende oplossing en incubeer de slide met lichte agitatie gedurende 30 minuten.Om de slide te drogen, plaatst u deze in een centrifuge die is aangepast voor microscoopslides en draait u deze kort. Plaats de slide in een microarray-hybridisatiecassette met drie bij acht putjes volgens de instructies van de leverancier. Of, na het aanpassen van het antilichaamprintpatroon, stelt u een op maat gemaakte cassette in, zoals de hier getoonde, of gebruikt u eenvoudigweg dekglasjes voor de setup.Na montage van de slide en cassette, pipet tot 50 microliter van elk monsterextract of verdunning ervan in extractie-incubatiebuffer in elke put van de cassette. Of, laad monsters in andere incubatieapparaten of gebruik eenvoudigweg dekglasjes. Als blanco controle, pipet 50 microliter TBSTRR-buffer in ten minste twee aparte putjes van de cassette.Incubeer de monsters gedurende één uur bij kamertemperatuur en meng door elke 15 minuten te pipetteren, of incubeer gedurende 12 uur bij vier graden Celsius. Om de microarrays te wassen, plaatst u de cassette naar beneden en tikt u voorzichtig op schoon absorberend papier. Was vervolgens de putjes door 150 microliter extractie-incubatiebuffer aan elk toe te voegen en verwijder de buffer door op absorberend papier te tikken zoals eerder.Herhaal het wassen nog drie keer. Voeg aan elke put 50 microliter van het fluorescerende antilichaammengbereiding toe die de 17 anti-cyanobacteriële stamantilichamen bevat. Incubeer de monsters gedurende één uur bij kamertemperatuur of gedurende 12 uur bij vier graden Celsius.Om de microarrays te wassen, plaatst u de cassette voorzichtig naar beneden en tikt u er zachtjes op op schoon absorberend papier. Voeg vervolgens 150 microliter extractie-incubatiebuffer toe voordat u deze verwijdert door op een papieren handdoek te tikken. Herhaal het wassen drie keer.Haal vervolgens de cassette uit

experimental-protocol-for-detecting-cyanobacteria-liquid-solid

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Beschreven wij een procedure voor het uiteenvallen van colorectale kanker (CRC) levensvatbare enkele cellen, die vervolgens worden opgevangen op maat antilichaam microarrays herkennen van oppervlakte-antigenen (DotScan CRC microarray) te produceren. Subpopulaties van cellen gebonden aan de microarray kan worden geprofileerd door fluorescentie multiplexen behulp van monoklonale antilichamen gelabeld met een fluorescerende kleurstoffen.

Colorectal Cancer Cell oppervlakte-eiwit Profiling Met behulp van een antilichaam Microarray en fluorescentie Multiplexing

We hebben onlangs melding gemaakt van een nieuwe benadering voor het genereren van fluorogene DNAzyme probes die kan worden toegepast op het opzetten van een eenvoudige, "mix-and-lezen" TL-test voor bacteriële detectie. Deze speciale DNA probes katalyseren de splitsing van een chromofoor gemodificeerde DNA-RNA chimère substraat in aanwezigheid van ruwe extracellulaire mengsel (CEM) door een bepaald bacterie, waardoor vertaling bacteriële detectie in fluorescentiesignaal generatie. In dit...

Detectie van bacteriën met behulp van fluorogene DNAzymes

We beschrijven een elektrochemische sensor bepalingsmethode voor snelle bacteriële detectie en identificatie. De bepaling omvat een sensor-array gefunctionaliseerd met DNA oligonucleotide capture probes voor ribosomaal RNA (rRNA) species-specifieke sequenties. Sandwich hybridisatie van doelwit rRNA met de invangingsprobe en een mierikswortel peroxidase-linked DNA-oligonucleotide probe detector produceert een meetbare amperometrisch stroom.

Bacteriële Detection &amp; Identification gebruiken elektrochemische sensoren

This video describes the technique to study the protein expression in miRNA transfected lung cancer cells by using antibody microarray to measure specific gene expression. In the featured protocol, we perform antibody microarray for the identification of the activity of a combinatorial miRNA treatment in halting cell cycle and angiogenesis.

Antibody Microarray: A Technique to Study the Protein Expression of miRNA Treated Lung Cancer Cells

The video demonstrates a cell-based assay for detecting anti-aquaporin-4 immunoglobulin G using a biochip containing untransfected cells and transfected cells expressing aquaporin-4. This method has applications in diagnosing neuromyelitis optica spectrum disorders, confirmed by strong green fluorescence on the biochip.

An Assay to Detect Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G

This video demonstrates a method to detect the Cyanobacterial strains in an environmental sample using an antibody microarray chip. Samples carrying various bacteria interact with printed antibodies, and immunostaining with fluorophore-labeled anti-cyanobacterial-strain antibodies reveals the presence of specific cyanobacterial strains through fluorescence in distinct spots.

A Technique to Detect Cyanobacterial Strains Using an Antibody Microarray Chip

In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

Een protocol dat geïntegreerde concentratie, verrijking en eindpuntkleurmeting voor de detectie van door voedsel overgedragen ziekteverwekkers in grote volumes landbouwwater presenteert, wordt hier gepresenteerd. Het water wordt gefilterd door middel van Modified Moore Swabs (MMS), verrijkt met selectieve of niet-selectieve media, en de detectie wordt uitgevoerd met behulp van op papier gebaseerde analytische apparaten (µPAD) ingebed met bacteriële-indicatieve kleurmetingssubstraten.

Colorimetrische Papier-gebaseerde detectie van<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. En<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Van grote volumes of Agricultural Water

Cel-gebaseerde bepaling is een veel gebruikte methode om te detecteren serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. Deze methode kan worden toegepast op de klinische diagnose en wetenschappelijk onderzoek van neuromyelitis optisch spectrum stoornissen.

Menselijk Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G detectie van cel-gebaseerde Assay

Elektrowetting-gebaseerde digitale microfluidic is een techniek die gebruik maakt van een spanning-gedreven verandering in de schijnbare contacthoek van een microliter-volume druppel om de manipulatie te vergemakkelijken. Door dit te combineren met gefunctionaliseerde magnetische kralen, kunnen meerdere laboratoriumeenheden worden ingebracht voor monstervoorbereiding en identificatie van ziekteverwekkers met behulp van immunosorbent Assay (ELISA) met enzymgebonden immunosorbent assay.

Elektrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Verschillende bacteriële ziekteverwekkers kunnen luchtweginfecties veroorzaken en tot ernstige gezondheidsproblemen leiden als ze niet nauwkeurig worden gedetecteerd en onmiddellijk worden behandeld. Snelle en nauwkeurige detectie van deze ziekteverwekkers via lusgemedieerde isotherme amplificatie zorgt voor een effectief beheer en controle van luchtweginfecties in klinische omgevingen.

Snelle detectie van bacteriële pathogenen die infecties van de onderste luchtwegen veroorzaken via op microfluïdische-chips gebaseerde lus-gemedieerde isotherme amplificatie

Leer een fluorescerende microarray-immunoassay om cyanobacteriën in vloeibare en vaste monsters op te sporen. Deze methode biedt snelle resultaten binnen enkele uren en ondersteunt milieumonitoring en waterbeheer.

Experimenteel protocol voor het opsporen Cyanobacteriën In vloeibare en vaste monsters met een antilichaam Microarray Chip

Meer video's verkennen