Experimenteel protocol voor het opsporen Cyanobacteriën In vloeibare en vaste monsters met een antilichaam Microarray Chip

Het algemene doel van deze procedure is om de aanwezigheid van meerdere cyanobacteriële stammen in vloeibare en vaste monsters te bepalen met behulp van een fluorescentie-microarray-immuno-assay. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van milieu, monitoring en waterbeheer, zoals de aanwezigheid van toxines geproduceerd door protoxine-producerende bacteriën voordat de bloei zichtbaar wordt voor het blote oog. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat meerdere cyanobacteriële stammen en meerdere monsters tegelijkertijd in een periode van drie, vier uur kunnen worden gemonitord, zowel in situ als in het laboratorium.

Deze methode kan dus inzicht geven in biodiversiteit. Het kan ook worden toegepast op andere gebieden, zoals het monitoren van landbouwinstallaties, levensdetectie in omgevingen met spanning of planetaire exploratie. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode geen problemen ondervinden.

Vanwege de eenvoud in de monsterverwerking en de eenvoudiger interpretatie van de resultaten. Na het produceren en zuiveren van antilichamen volgens het tekstprotocol, voeg 100 microliter DMSO toe aan een commerciële flacon met kleurstof voor labeling, één milligram eiwit. Zodra de kleurstof is opgelost, label de gezuiverde antilichamen door twee microliter van de kleurstof toe te voegen aan 50 microliter van elk antilichaampreparaat.

Houd de labelreacties gedurende een uur op kamertemperatuur onder continue agitatie op een trillende platform. Na het zuiveren van de gelabelde antilichamen volgens het tekstprotocol, laadt u een kleine aliquot in een spectrofotometer en meet u de absorptie bij 280 en 650 nanometer. Bereken de labelefficiënties volgens de aanbevelingen van de leverancier.

Om een CYANOCHIP te maken, bereidt u 30 microliter van elk gezuiverd antilichaam voor door één milligram per milliliter antilichaam in een 1X eiwitprintbuffer met 01%volume per volume Tween 20 te mengen. Bereid 30 microliter van de volgende printoplossingen voor als controles. 1X eiwitprintbuffer met 01%van volume per volume van Tween 20.

Elk eiwit A gezuiverd preimmune serum op één milligram per milliliter in 1X eiwitprintbuffer met 01%Tween 20 en één milligram per milliliter BSA en 1X eiwitprintbuffer met 01%Tween 20. Voeg 30 microliter van de voorbereide printoplossingen per put toe aan de hoogwaardige 384-putjes microplaten. Na het instellen van de printrobot en slide-substraten volgens het tekstprotocol, spot alle antilichamen en de controles op de slides in een drievoudig spotpatroon met een diameter van ongeveer 180 tot 200 micron.

Voor bemonstering in de omgeving, gebruikt u een steriele spuit om één tot 100 milliliter vloeistoffen te verzamelen en de cellen te concentreren door het monster door een filter met een poriegrootte van drie micron te laten lopen. Indien nodig, verzamelt u vaste monsters van rotsen of bodems en bewaart u deze in steriele buisjes. Monsters kunnen worden getest in een klein veldlab.

Voeg één milliliter extractie-incubatiebuffer toe om de biomassa die in het filter is verzameld te herstellen en gebruik een spatel om het filter in een 15 milliliterbuis te schrapen. Met een handbediende ultrasone processor, of door meerdere keren op en neer te pipetten, wordt dit aggregaat en homogeniseert het monster. Weeg bovendien maximaal 0,5 gram van het vaste monster in een aparte 10 milliliterbuis en voeg maximaal twee milliliter extractiebuffer toe.

Dompel een sonicator-sonde in de buis en soniceer met een handbediende ultrasone processor of ander ultrasoonapparaat. Terwijl u het monster op ijs houdt, voert u minimaal vijf cycli van 30 seconden uit bij 30 kilohertz, met een pauze van 30 seconden tussen de sonicaties. Om een filtraatextract voor de immuno-assay voor te bereiden, gebruikt u een 10 milliliterspuit gekoppeld aan een nylonfilterhouder met een poriegrootte van vijf tot 20 micron om de oplossing in een 1,5 milliliterbuis te filteren om zand, klei en ander grof materiaal te verwijderen.

Leg de slide met de microarray-spots naar beneden op een druppel van 100 tot 200 microliter blokkerende oplossing en incubeer gedurende drie tot vijf minuten. Gebruik plastic-tipped pincetten en vermijd de microarray-zones, pak de slide voorzichtig op. Dompel de slide onder in een verse blokkerende oplossing en incubeer de slide met lichte agitatie gedurende 30 minuten.

Om de slide te drogen, plaatst u deze in een centrifuge die is aangepast voor microscoopslides en draait u deze kort. Plaats de slide in een microarray-hybridisatiecassette met drie bij acht putjes volgens de instructies van de leverancier. Of, na het aanpassen van het antilichaamprintpatroon, stelt u een op maat gemaakte cassette in, zoals de hier getoonde, of gebruikt u eenvoudigweg dekglasjes voor de setup.

Na montage van de slide en cassette, pipet tot 50 microliter van elk monsterextract of verdunning ervan in extractie-incubatiebuffer in elke put van de cassette. Of, laad monsters in andere incubatieapparaten of gebruik eenvoudigweg dekglasjes. Als blanco controle, pipet 50 microliter TBSTRR-buffer in ten minste twee aparte putjes van de cassette.

Incubeer de monsters gedurende één uur bij kamertemperatuur en meng door elke 15 minuten te pipetteren, of incubeer gedurende 12 uur bij vier graden Celsius. Om de microarrays te wassen, plaatst u de cassette naar beneden en tikt u voorzichtig op schoon absorberend papier. Was vervolgens de putjes door 150 microliter extractie-incubatiebuffer aan elk toe te voegen en verwijder de buffer door op absorberend papier te tikken zoals eerder.

Herhaal het wassen nog drie keer. Voeg aan elke put 50 microliter van het fluorescerende antilichaammengbereiding toe die de 17 anti-cyanobacteriële stamantilichamen bevat. Incubeer de monsters gedurende één uur bij kamertemperatuur of gedurende 12 uur bij vier graden Celsius.

Om de microarrays te wassen, plaatst u de cassette voorzichtig naar beneden en tikt u er zachtjes op op schoon absorberend papier. Voeg vervolgens 150 microliter extractie-incubatiebuffer toe voordat u deze verwijdert door op een papieren handdoek te tikken. Herhaal het wassen drie keer.

Haal vervolgens de cassette uit