Low-Density primaire hippocampus Neuron Cultuur

Dit protocol werd oorspronkelijk gepubliceerd door Dr. Gary Bunker en zijn collega's; zij maken een hoge dichtheid en een hoogzuivere kweek van embryonale hippocampusneuronen mogelijk door de neuronen boven een gliale filterlaag te suspendere. Dit resultaat is superieur aan onze andere hippocampusresultaten, omdat het neuronen in staat stelt om te groeien bij lage dichtheden met weinig contaminerende gliale cellen. Dit resultaat is daarom ideaal voor resolutiebeeldvorming en functionele analyse van jonge en volwassen neuronen in kweek.

De nabewerking van dit protocol moet de aanpassing door nieuwe gebruikers versnellen, aangezien er tijdens de procedure verschillende cruciale fasen zijn die moeilijk te beschrijven zijn en die via deze methode worden begeleid. Dit protocol bestaat uit drie onafhankelijke populaties die nodig zijn voor het kweken van primaire neuronen van hoge kwaliteit. Deze processen omvatten gliale celkweek, het maken en coaten van dekglasjes en de preparatie van hippocampale zenuwcellen.

Om te beginnen moet er, zoals beschreven in het geschreven protocol, cortical weefsel van ratten in de vroege postnatale fase worden verkregen. Hoewel dit hier niet direct wordt getoond, dient men erop te letten dat de dissectiestap die later in dit protocol wordt getoond, vrijwel identiek is aan die voor de corticale dissectie. Om deze reden zullen de relevante stappen worden uitgelicht tijdens de procedure voor de hippocampale dissectie die later in deze video wordt getoond.

Beginnend bij stap zes van het geschreven protocol, verwijder het HBSS uit het verzamelde corticale weefsel en hak het weefsel vervolgens zo fijn mogelijk met een schaar. Voeg voldoende HBSS toe aan het gehakt weefsel om de weefselstukjes over te brengen naar een conische buis van 50 milliliter, en breng vervolgens het totale volume aan tot 12 milliliter door HBSS toe te voegen. Voeg telkens 1,5 milliliter van 2,5%trypsin en 10 milligram per milliliter DNA-oplossing toe, keer de buis om om te mengen en incubeer het resulterende mengsel vervolgens 12 minuten in een waterbad van 37 °C.

Tritureer het weefsel 10 tot 15 keer met een glazen Pasteurpipet en incubeer het vervolgens nog drie minuten in het waterbad. Zorg dat eventuele weefselstukjes naar de bodem van de buis zijn gezakt en filtreer vervolgens het supernatant in een conische buis van 50 milliliter die 5 milliliter BGS bevat. Voeg 13,5 milliliter HBSS en 1,5 milliliter 2,5&trypsin toe aan de buis met de resterende stukjes onverteerd weefsel, keer de buis om om te mengen en incubeer deze vervolgens nog 10 minuten in het waterbad.

Tritureer na incubatie het resterende weefsel 10 tot 15 keer en filtreer dit vervolgens in de buis met het initiële filtraat. Spoel daarna het filter door er nog eens 3 milliliters BGS doorheen te leiden. Op dit punt kan het filtraat over meerdere buisjes worden verdeeld om zowel het balanceren als de resuspensie van de celpellet te vereenvoudigen.

Centrifugeer de suspensies gedurende zes minuten bij 130 G. Let na centrifugatie op dat de onderkant van de pellet er lichtrood uitziet, vanwege de aanwezigheid van bloedcomponenten. Verwijder de supernatanten en voeg vervolgens 1 milliliter gliaal medium toe aan elke buis, waarbij u er op let de pellet niet te verstoren. Draag de delen van elke pellet die dit rode uiterlijk niet hebben over naar een nieuwe conische buis van 50 milliliter.

Voeg tot 2 milliliters glia-medium per pup toe om het gecombineerde weefsel opnieuw te suspenderen, en breng elke 2 milliliters van de suspensie over in 18 milliliters voorverwarmd glia-medium in een kweekfles van 75 centimeter squared. Incubeer de fles in een incubator bij 37 degrees Celsius en 5%CO2. Ververs de dag na het uitplaten van de cellen het medium in elke fles door vers glia-medium.

Houd er rekening mee dat de cultuur op dit moment een mengsel is van astrocyten en andere niet-doelcellen. Om niet-astrocyten te verwijderen, moeten de flessen ongeveer vier dagen na het uitzaaien krachtig worden geschud. Spoel hiervoor de flessen met HBSS, voeg vervolgens 10 milliliters verse HBSS toe aan elke fles en schud elke fles krachtig vijf tot 10 keer.

Zuig de HBSS af en spoel nog twee keer met HBSS. Voeg vervolgens 20 milliliters gliaal medium toe en plaats de flessen zoals eerder beschreven terug in de incubator. Let op dat, hoewel dit een intensief proces is, de astrocyten die voor de cultuur bedoeld zijn, sterk aan het oppervlak van de fles gehecht blijven.

Om de astrocytenkwekers te onderhouden, dient het medium twee keer per week te worden vervangen door vers glia-medium tot ze confluent zijn. Zodra ze confluent zijn, kunnen de cellen worden ingevroren voor toekomstig gebruik, zoals beschreven in het geschreven protocol. Glia moeten ten minste 14 dagen vóór de start van de neuronkweek in schalen worden geplaatst, zoals beschreven in het geschreven protocol.

Dompel de dekglasjes onder in geconcentreerd salpeterzuur en behandel ze 30 minuten lang met ultrasoon geluid bij kamertemperatuur. Wees voorzichtig, aangezien geconcentreerd salpeterzuur extreem corrosief is. Let er ook op dat sommige laboratoria er de voorkeur aan geven om de dekglasjes overnight in salpeterzuur te weken met behulp van keramische kleurrekjes.

Gooi het salpeterzuur zorgvuldig af in de zuurkast volgens de institutionele richtlijnen en spoel de dekglasjes vervolgens drie keer af met gedeïoniseerd water. Dompel de dekglasjes onder in water en sonicate ze opnieuw gedurende 30 minuten. Verwijder daarna het water en spoel de dekglasjes nogmaals drie keer af.

Dompel de dekglasjes onder in 50 milliliters water en autoclaveer ze vervolgens. Verwijder het water in een steriele laminaire flowkast en voeg 20 tot 30 milliliters ethanol toe om te spoelen. Voeg nogmaals 20 tot 30 milliliters ethanol toe en breng de dekglasjes en de ethanol vervolgens over naar een Petri schaal van 100 millimeter.

Breng de gekleurde dekglasjes met stompe pincetten over naar Petrischalen van 60 milliliter, vier tot vijf per schaal, en laat ze aan de lucht drogen door de dekglasjes tegen de rand van de schaal aan te leunen. Zodra het ethanol is verdampt, worden de dekglasjes weer horizontaal geplaatst. Smelt 10 gram paraffine in een hittebestendige glazen fles en houd deze op ongeveer 150 tot 200 °C.

De ideale temperatuur vereist mogelijk wat aanpassingen; onjuiste temperaturen kunnen ertoe leiden dat het moeilijk is om paraffinevoetjes van de juiste grootte te produceren. Dip een Pasteur-pipet in de paraffine en raak vervolgens snel drie punten nabij de rand van elk dekglas aan. Paraffine-druppels zullen stollen tot bolletjes van ongeveer 3 tot 5 millimeter hoog en 1 tot 2 millimeter in diameter, die dienen om een ruimte te creëren tussen de neuronen op het dekglas en de gliale monolayer eronder.

Neem de schaaltjes met de eerder bereide dekglasjes met paraffinevoetjes. Voeg 200 µL poly-L-lysine en boraatbuffer toe aan het oppervlak van elk dekglasje en laat de oplossing gedurende de nacht afgedekt bij kamertemperatuur op de dekglasjes rusten. Het oppervlak dat wordt gecoat, moet hetzelfde zijn als het oppervlak waarop de paraffinebolletjes zich bevinden.

Indien correct gereinigd, moet de poly-l-lysine gemakkelijk verspreiden om het oppervlak van het dekglas te bedekken. De volgende ochtend worden de dekglazen twee keer gewassen door ze telkens twee uur in steriel water te laten weken. Vervang na de laatste wasbeurt het water door 4 milliliters plating medium per schaaltje.

Let op dat het belangrijk is dat het oppervlak van de dekglasjes niet uitdroogt nadat ze zijn gecoat met poly-l-lysine. Plaats de schaaltjes met dekglasjes in een incubator op 37 °C. De gecoate dekglasjes moeten ten minste 24 uur worden geïncubeerd voordat de neuronencultuur wordt gestart.

Neem een drachtige rat van embryonale dag 18 of 19 en euthanaseer deze via een goedgekeurde methode. Bespuit de onderzijde van de rat met 70% ethanol en maak vervolgens een midline incisie vanaf de pubregio tot aan het einde van de buikholte. Om contaminatie te voorkomen, dient u er in deze stap zorgvuldig op toe te zien dat u alleen door de huid snijdt.

Steriliseer de dissectie-instrumenten met 70% ethanol en snijd vervolgens door de buikwand om de uterus bloot te leggen. Verwijder de twee uterushoorns en plaats deze in een steriel schaaltje. Verwijder in een steriele laminaire flow-kast de uterusmembranen rondom de foetussen, decapiteer ze vervolgens en plaats de koppen in een Petri-schaal van 100 millimeter met 20 milliliter HBSS.

Dissekeer de hersenen uit en plaats ze onmiddellijk in een Petrischaal van 60 millimeter met 2 milliliters HBSS op ijs. Verzamel slechts twee tot drie hersenen per schaal om voldoende ruimte te bieden voor de volgende stap. Verwijder onder een dissectiemicroscoop de hersenvliezen vanaf de middellijn van de cerebrale hemisferen.

Dissect vervolgens de hippocampi uit. Let erop dat de hippocampus kan worden herkend als een sikkelvormige structuur aan het mediale oppervlak van de corticale hemisfeer, en gemakkelijk te verwijderen is aangezien deze lateraal begrensd wordt door een ventrikel. Plaats de hippocampi, zodra ze zijn vrijgemaakt, in een Petri-schaal van 60 millimeter met 4,5 milliliters HBSS en houd deze op ijs.

Houd er rekening mee dat de tot nu toe gevolgde stappen ook gelden voor de corticale dissectie, met uitzondering van het feit dat de cortices worden bewaard in plaats van de hippocampi. Bij de corticale dissectie zou de volgende stap zijn om de cortex van de rest van de hersenen te scheiden, zoals hier wordt getoond, om vervolgens de cortices en HBSS te verzamelen zoals eerder beschreven. Zodra al het hippocampaal weefsel in HBSS is verzameld, wordt dit overgebracht naar een conische buis van 15 milliliter.

Voeg 5 milliliters 2,5%trypsine toe en incubeer dit gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Verwijder de trypsine-oplossing voorzichtig met een Pasteur-pipet, waarbij het hippocampale weefsel ongestoord op de bodem van de buis blijft. Was het weefsel tweemaal door voorzichtig 5 milliliters HBSS toe te voegen, 5 minuten te incuberen bij 37 graden Celsius en dit vervolgens opnieuw te verwijderen met een Pasteur-pipet, waarbij u ervoor zorgt dat het weefsel op de bodem niet wordt verstoord.

Tijdens het wachten op de eerder getoonde incubatiestap bereidt u twee varianten van vlamgepolijste pipetten voor de weefseldissociatie. Hiervoor stelt u de punt van de glazen Pasteurpipet kort bloot aan een vlam en inspecteert u vervolgens de punt van de pipet. Herhaal deze stap voor de eerste variant totdat de randen van de pipetpunt zijn afgevlakt, maar de diameter ongewijzigd blijft.

Herhaal dit voor de tweede keer totdat de randen zijn afgevlakt en de diameter van de tip met ongeveer de helft is verminderd. Het is belangrijk om te oefenen om de ideale diameter te vinden, zodat het weefsel wordt gedissocieerd tot enkelvoudige cellen zonder deze cellen tijdens het proces te beschadigen. Breng na de tweede wasbeurt het totale volume naar 5 milliliters door een voldoende volume HBSS aan het weefsel toe te voegen.

Tritureer het hippocampusweefsel eerst door ongeveer 10 keer door de normale pipet met gladde randen te halen, en vervolgens nog vijf tot 10 keer door de pipet met een kleinere tipdiameter. Het doel is om een homogene celluchtingsoplossing te verkrijgen met geen of zeer weinig weefselklontjes. Bepaal de celdichtheid met behulp van een hemocytometer.

Typische opbrengsten zijn ongeveer 800.000 tot één miljoen cellen per pup. Breng een voldoende volume van de celsuspensie over naar schalen met poly-l-lysine gecoate dekglasjes in 4 milliliters platingmedium, om een plaatdensiteit te verkrijgen van tussen 100.000 en 500.000 cellen per 60 millimeter schaal, afhankelijk van het beoogde experiment. Plaats de schalen in een 37 °C 5%CO2 incubator.

Na drie tot vier uur worden de dekglasjes met aangehechte neuronen overgebracht naar schaaltjes met gliale cellen en NBG-medium. Dit dient zodanig te gebeuren dat de zijde waarop de neuronen zijn gezaaid, naar beneden is gericht, richting de gliale cellaag. Voeg in totaal vier of vijf dekglasjes per glia-schaaltje toe.

Twee of drie dagen na het uitplaten wordt de aerocele-oplossing toegevoegd tot een eindconcentratie van vijf micromolair per schaal om de groei van gliale cellen te remmen. Voed de cellen één keer per week door bij elke voeding 2 milliliters van het oude medium te vervangen door 2,5 milliliters vers medium. Het extra toegevoegde medium dient om verdamping in de loop van de tijd te compenseren.

Slechts een gedeelte van het medium wordt vervangen om een consistente conditionering van het medium door de gliacellen te waarborgen. Deze culturen blijven doorgaans gedurende ten minste één maand gezond. Neuronen werden gefixeerd met 4%paraformaldehyde en vervolgens geïncubeerd in primaire antilichamen voor fluorescentie-imaging.

Zoals blijkt uit de Tau- en MAP2-immunokleuringen, ontwikkelen deze neuronen een uitgebreide arborisatie met goed ontwikkelde axonen en dendrieten. Mature neuronen ontwikkelen daarnaast synaptische spines, geïdentificeerd door de selectieve lokalisatie van Drebrin One, die nauw aansluiten op presynaptische specialisaties, geïdentificeerd door een synapse in one-immunokleuring. Deze primaire neuronen zijn uitermate geschikt voor functionele en structurele studies van neuronen en synapsen, waaronder onder andere studies naar signaaltransductie, neuronale polariteit, subcellular trafficking, en synapsontwikkeling en -plasticiteit.

Deze video dient ter ondersteuning van het begrip en de nauwkeurige uitvoering van verschillende cruciale stappen in dit protocol. Correcte naleving van de beschreven methode moet leiden tot gezonde neuronenculturen met een hoge dichtheid, uitgebreide arborisatie en morfologisch en functioneel goed ontwikkelde synapsen.