Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten

Het algemene doel van deze methodologie is om meerdere fosforyleringen van een intrinsiek ongeordend eiwit te identificeren door middel van kernspinresonantiespectroscopie met gebruik van tau-eiwit als case study. Deze methode kan helpen om een sleutelvraag in moleculaire regulatie gerelateerd aan ziekte te beantwoorden, zoals de impact van fosforylering op de interactie van het eiwit met zijn moleculaire partner. Het grote voordeel van deze techniek is dat we specifieke fosforyleringen in een ongeordend eiwit kunnen identificeren en deze kunnen linken aan structurele en functionele veranderingen.

Deze methode kan inzicht bieden in de functie. Het kan ook worden toegepast op andere eiwitten, zoals de ongeordende restanten van het DNA-eiwit van het aPtc-virus. De toepassingen van deze techniek reiken tot therapie door de ontwikkeling van eiwit-, eiwit-interactieremmende remmer. Deze methode zal worden gedemonstreerd door Clement Danis, Clement Despres, Luiza Bessa en Hamida Merzougui, de PhD-studenten van onze groep.

Meng voorzichtig 50 microliter competente BL21-cellen met 100 nanogram plasmide-DNA, wat 10 tot 15 miljoen kolonies per microgram plasma-DNA vormt in een plastic buisje van 1,5 milliliter. Plaats het celmengsel 30 minuten op ijs en schok het vervolgens gedurende 10 seconden met warmte bij 42 graden Celsius. Plaats het buisje vervolgens vijf minuten terug op ijs voordat u een milliliter Luria Bertani of LB-medium op kamertemperatuur toevoegt.

Incubeer de bacteriesuspensie gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius onder zachte roering. Verspreid met behulp van een verspreider 100 microliters van de celsuspensie gelijkmatig over een agarplaat van LB-medium met 100 microgram per milliliter ampicilline-antibioticum. Incubeer de selectieplaat gedurende 15 uur bij 37 graden Celsius.

Los vervolgens 300 milligram van stikstof 15 en koolstof 13 verrijkt medium op, één gram stikstof 15 ammoniumchloride en twee gram koolstof 13 gelabelde glucose in 10 milliliter M9-medium. Filter steriliseer de isotoopoplossing direct in het M9-medium met behulp van een 0,2 micron filter. Gebruik een Pasteur-pipet om een kolonie van de recombinante plasma getransformeerde bacteriën van de selectieplaat te suspenderen in 20 milliliter LB-medium, aangevuld met 100 microgram per milliliter ampicilline.

Incubeer het geïnoculeerde medium gedurende ongeveer zes uur bij 37 graden Celsius. Meet de optische dichtheid bij 600 nanometer of OD600 met behulp van een milliliter van een tienvoudige verdunning van bacteriecultuur in een plastic spectrometercuvet. Voeg vervolgens 20 milliliter van de verzadigde LB-cultuur toe aan één liter M9-groeimedium aangevuld met ampicilline in een tweeliter Erlenmeyer glazen culturenflask met wartels.

Plaats de culturenflask in een programmeerbare incubator ingesteld op 10 graden Celsius en 50 RPM. Programmeer de incubator om vroeg op de ochtend van de volgende dag over te schakelen naar 200 RPM en 37 graden Celsius. Meet de OD600 op één milliliter bacteriecultuur in een plastic spectrometercuvet.

Voeg 400 microliters van een molaaire IPTG-stockoplossing toe wanneer de OD600 een waarde van ongeveer 1,0 bereikt om de expressie van recombinant tau-eiwit te induceren. Na het incuberen van de bacteriecellen gedurende drie uur bij 37 graden Celsius, verzamel ze door centrifugatie bij 5.000 keer g gedurende 20 minuten. Ontdooi de bacteriecelpellet en suspendeer deze grondig in 45 milliliter kationenuitwisselingsbuffer A, vers aangevuld met 1x proteaseremmercocktail DNasel 1.

Verstoor de bacteriecellen met behulp van een hogedrukhomogenisator bij 20.000 PSI, drie tot vier doorgangen zijn nodig om de cellen voldoende te verstoren. Centrifugeer de verstoorde cellen bij 20.000 keer g gedurende 40 minuten om het onoplosbare materiaal te verwijderen. Verhit het bacteriecelextract gedurende 15 minuten bij 75 graden Celsius met behulp van een waterbad.

Na enkele minuten zal een witte neerslag worden waargenomen. Centrifugeer vervolgens het verhitte extract gedurende 20 minuten bij 15.000 keer g en bewaar het supernatant dat het hittestabiele tau-eiwit bevat. Voer vervolgens kationenuitwisselingschromatografie uit op een sterke CEX-hars verpakt als een 5 milliliter bedkolom met behulp van een fast protein liquid chromatography systeem.

Stel de stromingssnelheid in op 2,5 milliliter per minuut en breng de kolom in evenwicht in CEX A-buffer. Laad vervolgens de 60 tot 70 milliliter verhitte tau-extract met behulp van een monsterpomp, verzamel het doorstromende voor analyse om te verifiëren dat het tau-eiwit efficiënt aan de hars bindt. Was de hars met CEX A-buffer tot de absorptie bij 280 nanometer terugkeert naar de basislijnwaarde.

Programmeer de FPLC met een gradiënt tot 25% CEX B-buffer in 10 kolomvolumes om 250 millimolar natriumchloride te bereiken. Volg dit met 50% CEX B-buffer in vijf kolomvolumes om 500 millimolar natriumchloride te bereiken. Verhoog vervolgens de gradiënt tot 100% CEX B-buffer in twee kolomvolumes om één molar natriumchloride te bereiken.

Verzamel 1,5 milliliter fracties tijdens de elutiestappen. Voer vervolgens een bufferuitwisseling uit op de tau-bevattende gepoolde fracties. Breng een ontzoutingskolom in evenwicht met een 53 milliliter G25-hars verpakte bed in 15 millimolar ammoniumbicarbonaatbuffer met behulp van een FPLC-systeem.

Stel de stromingssnelheid in op vijf milliliter per minuut en injecteer het tau-monster op de kolom via een injectielus van vijf milliliter. Verzamel de fracties die overeenkomen met de absorptiepiek bij 280 nanometer. Pool alle tau-fracties voordat u het monster in de buisjes verdeelt.

Kies deze buisjes zodat het volume van de oplossing klein is in vergelijking met het volume van de buis. Prik vervolgens gaten in de buiskoppen met behulp van een naald voordat u de tau-monsters bevriest bij min