Name: Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Leer hoe u meervoudige fosforyleringen van intrinsiek ontvouwde eiwitten identificeert met NMR-spectroscopie, gebruikmakend van Tau-eiwit als casestudy. Deze methode onthult structuur-functierelaties en ondersteunt therapeutisch onderzoek naar eiwitinteracties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De NMR-faciliteiten werden gefinancierd door de Région Nord, CNRS, Pasteur Institute of Lille, Europese Gemeenschap (FEDER), Frans Ministerie van Onderzoek en de Universiteit van Wetenschappen en Technologieën van Lille. We danken de steun van de TGE RMN THC (FR-3050, Frankrijk), FRABio (FR 3688, Frankrijk) en Lille NMR en RPE Gezondheid en Biologie kernfaciliteit. Ons onderzoek wordt ondersteund door subsidies van de LabEx (Laboratory of Excellence) DISTALZ (Ontwikkeling van Innovatieve Strategieën voor een Transdisciplinaire benadering van de ziekte van Alzheimer), EU ITN TASPPI en ANR BinAlz.

1. Productie van 15 N, 13 C-Tau (figuur 1) <ol><li> Transformeer pET15b-Tau recombinant T7 expressieplasmide 13,14 in BL21 (DE3) competent Escherichia coli bacteriële cellen 15. Opmerking: het cDNA dat codeert voor de langste (441 aminozuurresiduen) Tau isovorm gekloneerd tussen Ncol en Xhol restrictieplaatsen in het plasmide pET15b. <ol><li> Meng voorzichtig 50 pl competente BL21 (DE3) cellen, vormen 1-5 x 10 7 koloniën per ug plasmide DNA met 100 ng plasmide DNA in een 1,5 ml plastic buis. LET OP: Codon-gebruik geoptimaliseerd bacteriestammen voor eukaryotische cDNA expressie niet essentieel zijn voor het menselijk Tau te produceren. </li><li> Plaats het celmengsel op ijs gedurende 30 min en vervolgens heat shock gedurende 10 seconden bij 42 ° C. Plaats de buis opnieuw op ijs gedurende 5 min en voeg 1 ml kamertemperatuur LB (Luria-Bertani) medium. Incubeer de bacteriële suspensie bij 37 ° C gedurende 30 minuten onder voorzichtigagitatie. </li></ol></li><li> Verspreid met een entoog 100 gl celsuspensie gelijkmatig op een agarplaat van LB-medium met 100 ug / ml ampicilline antibioticum. </li><li> Incubeer de selectieplaat 15 uur bij 37 ° C. </li><li> Houd de selectieplaat bij 4 ° C tot verder gaat met de kweekstap, gedurende maximaal 2 weken ongeveer. OPMERKING: een glycerol stock van bacteriecultuur (50% glycerol), bewaard bij -80 ° C, kan worden bereid aan de kweek op een later stadium. </li><li> Voeg 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 100 mM CaCl2, 10 ml 100x MEM vitamine complement, 1 ml 100 mg / ml ampicilline tot 1 liter autoclaaf M9 zouten (6 g Na 2 HPO 4, 3 g KH 2PO 4 , 0,5 g NaCl). OPMERKING: Een wit precipitaat wordt bij toevoeging van CaCl2 oplossing van de M9 zouten die snel verdwijnt vormen. </li><li> Oplosbaar 300 mg 15 N, C-13 compleet medium, 1 g 15NH4Cl en 2 g 13 C 6-glucose in 10 ml van M9 medium. Filter-steriliseren van de isotoop oplossing met behulp van een 0,2 pm filter, direct in het M9 medium. </li><li> Schorsen met een entoog een kolonie van pET15b-Tau getransformeerde bacteriën uit de selectieplaat in 20 ml LB medium aangevuld met 100 ug / ml ampicilline. </li><li> Incubeer het geënte medium bij 37 ° C gedurende 6 uur. </li><li> Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) aan 1 ml van een tienvoudige verdunning bacteriekweek in een plastic cuvet spectrometer. Opmerking: Troebelheid van de bacteriecultuur overeenkomt met OD600 van 3,0-4,0 aangeeft dat verzadiging groeifase bereikt. </li><li> Voeg 20 ml van de verzadigde LB cultuur 1 liter M9 kweekmedium gesupplementeerd met ampicilline (100 ug / ml eindconcentratie), in 2 L Erlenmeyer kolf plastic war. </li><li> Plaats de kolf in een programmeerbare incubator ingesteld op 10 °C en 50 rpm. Programmeer de incubator vroeg schakelen naar 200 rpm en 37 ° C in de ochtend van de volgende dag. </li><li> Meten OD 600 op 1 ml bacteriekweek in een plastic cuvet spectrometer. Voeg 400 ul van 1 M IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside 1) voorraadoplossing (bewaard bij -20 ° C) bij OD 600 bereikt een waarde van ongeveer 1,0 voor de expressie van recombinant tau-eiwit te induceren. </li><li> Verdere incubatie bij 37 ° C gedurende nog eens 3 uur. Verzamelen van de bacteriecellen door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 20 min. </li><li> Bevries de bacteriële pellet bij -20 ° C. Blijf ingevroren tot zuivering, gedurende langere tijd indien nodig. </li></ol> 2. Zuivering van 15 N, 13 C-Tau (figuur 2) <ol><li> Autoclaaf kation-uitwisseling (CEX) zuivering buffers bij 121 ° C onder 15 psi gedurende 20 min. Buffers opslag bij 4 ° C. </li><li> Ontdooi de bacteriële cel pellet en resuspendeer in 45 ml grondigopvraging CEX A buffer (50 mM NaPi pH 6,5, 1 mM EDTA) aangevuld met vers proteaseremmer cocktail 1x (1 tablet) en DNAsel (2000 eenheden). </li><li> Breek de bacteriële cellen met een hoge druk homogenisator bij 20.000 psi. 3-4 passes nodig. Centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 40 minuten om onoplosbare materialen te verwijderen. </li><li> Verwarm de bacteriële cel extract gedurende 15 minuten bij 75 ° C met een waterbad. OPMERKING: een witte neerslag wordt waargenomen na een paar minuten. </li><li> Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 20 min en houden de supernatant die de warmtestabiele tau-eiwit. </li><li> Bewaar bij -20 ° C tot de volgende zuiveringsstap indien nodig. </li><li> Voer een kation-uitwisselingschromatografie op een sterke CEX harsrijke als 5 ml bed kolom met een snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) (zie figuur 3A). <ol><li> Stel debiet tot 2,5 ml / min. </li><li> Equilibreren de kolom in CEX A buffer </li><li> Laad de 60-70 ml heated-extraheren met behulp van een monster Tau pomp, of als alternatief pomp A, afhankelijk van het systeem. Verzamel het doorstroomkanaal voor analyse te controleren of Tau-eiwit efficiënt binden aan de hars (zie 2.8). </li><li> Was de hars met CEX een buffer totdat de absorptie bij 280 nm weer de uitgangswaarden. </li><li> Elueer Tau uit de kolom met een drie-stappen NaCl gradiënt verkregen door een geleidelijke verhoging van CEX B buffer (CEX Een buffer met 1 M NaCl). Programmeer de FPLC als volgt: de eerste stap van de gradiënt tot 25% CEX B buffer in 10 kolomvolumes (CV) met 250 mM NaCl, vervolgens moeten 50% CEX B buffer binnen 5 CV bereikt 500 mM NaCl, en derde stap tot 100% CEX B buffer in 2 CV te bereiken 1 M NaCl. 1,5 ml fracties te verzamelen in de elutiestappen. </li></ol></li><li> Analyseren 10 ul van de tijdens de elutiestap door SDS-PAGE (12% acrylamide SDS-gel) en Coomassie kleuring (Figuur 3 A) 16 fracties verzameld. Controleer de belasting stap op de column ook door analyzing 10 ul van het doorstroomkanaal. </li><li> Kies de fracties die Tau en bundelen deze fracties voor de volgende stap. </li><li> Voer een buffer uitwisseling over Tau-bevattende samengevoegde fracties (Figuur 3 B). <ol><li> Equilibreren een ontzoutingskolom van 53 ml G25 hars gepakt bed (26 x 10 cm) in 50 mM ammoniumbicarbonaat (vluchtige buffer) met een FPLC systeem. </li><li> Set debiet tot 5 ml / min. Injecteer de Tau monster op de kolom via een 5 ml injectie lus. Verzamel fracties overeenkomend met de absorptiepiek bij 280 nm. </li><li> Herhaal de injectie 3-4 keer, afhankelijk van het volume van de oorspronkelijke CEX zwembad. </li></ol></li><li> Bereken de hoeveelheid gezuiverd tau-eiwit door het piekoppervlak van het chromatogram bij 280 nm (1 mg Tau komt overeen met 140 ml mAU *). OPMERKING: De extinctiecoëfficiënt van Tau-eiwit bij 280 nm M -1 7550 cm -1. Tau geen Trp residuen bevatten. </li><li> Pool alle Tau fracties. </li><li> Aliquot het monster in buisjes die het equivalent van 1 tot 5 mg Tau. Kies deze buizen zodat het volume van de oplossing klein is vergeleken met het volume van de buis (bijvoorbeeld 5 ml oplossing in een 50 ml buisje). </li><li> Punch gaten in de buis caps met behulp van een naald. Freeze Tau monsters bij -80 ° C. </li><li> Lyophilize Tau monsters. Gelyofiliseerde Tau eiwit bij -20 ° C gedurende langere tijd worden bewaard. </li></ol> 3. In vitro fosforylering van 15 N-Tau <ol><li> Los 5 mg gelyofiliseerd Tau in 500 gl fosforylering buffer (50 mM Hepes · KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl). </li><li> Voeg 2,5 mM ATP (25 gl 100 mM voorraadoplossing bewaard bij -20 ° C), 1 mM DTT (1 ui 1 M voorraadoplossing bewaard bij -20 ° C), 1 mM EGTA (2 pi van een 0,5 M voorraad oplossing), 1x proteaseremmer cocktail (25 pl van een 40x voorraad verkregen door het oplossen 1 tablet in 1 ml buffer fosforylering) en 181; M geactiveerd His-ERK2 (250 pl in instandhoudingsbuffer 10 mM Hepes, pH 7,3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl en 10% glycerol, bewaard bij -80 ° C) in een totaal monstervolume van 1 ml. OPMERKING: De geactiveerde His-ERK2 kunnen interne 5,8 worden bereid door fosforylering van MEK-kinase. </li><li> Incubeer 3 uur bij 37 ° C. </li><li> Verwarm het monster bij 75 ° C gedurende 15 min ERK kinase inactiveren. </li><li> Centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 15 min. Verzamelen en te bewaren supernatant. </li><li> Ontzouten het eiwit monster in 50 mM ammonium bicarbonaat toepassing van een kolom van 3,45 ml G25 hars gepakt bed (1,3 x 2,6 cm), die geschikt is voor een 1 ml monster. </li><li> Voer een 12% SDS-PAGE 16 met 2,5 pi van het eiwit monster zowel de integriteit en efficiënte fosforylering (figuur 4) controleren. </li><li> Lyofiliseren de gefosforyleerd tau monster. Bewaar het poeder bij -20 ° C. </li></ol> 4. Overname van NMR Spectra (Figuur 5) <ol><li> Oplosbaar 4 mg gevriesdroogd 15 N, 13 C-ERK-gefosforyleerd tau in 400 gl NMR buffer (50 mM NaPi of 50 mM Tris gedeutereerd d11 .CL, pH 6,5, 30 mM NaCl, 2,5 mM EDTA en 1 mM DTT). </li><li> Voeg 5% D 2 O gebied vergrendeling van de NMR-spectrometer en 1 mM TMSP (3- (trimethylsilyl) propionzuur-2,2,3,3-d4-natriumzout)) als interne referentie NMR signaal. Voeg 10 ul van 40x voorraadoplossing van volledige proteaseremmer cocktail. </li><li> Breng het monster in een 5 mm NMR-buis met een elektronische spuit met een lange naald of Pasteur pipet. Sluit de NMR-buis met de zuiger. Verwijder eventuele luchtbel gevangen tussen zuiger en vloeistof door de zuiger bewegingen. </li><li> Plaats de NMR-buis in een spinner. Pas de verticale positie in de spinner met de juiste dikte van de NMR meetkop gebruikt, zodat de meeste van de monsteroplossing wordt in de NMR-spoel. </li><li> Start de luchtstroom: klik lift in het systeem venster magneet controle. Plaats het spinner met de buis in de luchtstroom aan de bovenkant van de magneet boring. Stop de luchtstroom (klik lift) en laat de buis in plaats binnen de sonde hoofd in de magneet dalen. </li><li> Ingestelde temperatuur tot 25 ° C (298 K). </li><li> Voer semi-automatische afstemming en aanpassing van de sonde hoofd tot overbrenging van het vermogen te optimaliseren. Typ atmm op de opdrachtregel. </li><li> Zet de spectrometer frequentie met behulp van de D 2 O-signaal van het opgenomen op de deuterium kanaal monster. Klik sluis in het systeem venster magneet controle. </li><li> Start de shimming procedure homogeniteit van het magneetveld geoptimaliseerd ter plaatse van het monster. Typ topshim gui op de opdrachtregel om de shim venster te openen. Klik op Start in de shim venster. Controleer de resterende B0 standaard variatie waarde om te controleren of shims optimaal zijn (minder dan 2 Hz is goed). </li><li> Kalibreer de p1 parameter (lengte van een protonradiofrequentiepuls in psec), die nodig zijn om een ​​90 ° rotatie van proton spins verkrijgen. Doel voor de 360 ° puls met behulp van een 1D spectrum van water protonen (Figuur 6). </li><li> Stel de frequentieverspringing door de o1 parameter (in Hz) het proton waterfrequentie in de 1D spectrum (figuur 6). </li><li> Start acquisitie van een 1D proton spectrum (pulssequentie met Watergate sequentie voor water signaal onderdrukking, bijvoorbeeld zggpw5) om signalen uit de steekproef (Figuur 7) te controleren. Pas het aantal scans de relatieve eiwitconcentratie. Typ zg op de opdrachtregel om de overname te starten. </li><li> Opgezet extra parameters voor de aankoop van een 2D [1 H, 15 N] HSQC spectrum (pulssequentie hsqcetfpf3gpsi figuren 8-9). <ol><li> Voor een 15 N, 13 C gelabelde monster, los te koppelen 13 C gedurende de 15N indirecte evolutie. </li><li&gt; Stel het aantal punten en de spectrale breedte (ppm) in het 1 H (F2) en 15 N (F1) afmetingen. OPMERKING: Pas het aantal verkrijging gegevenspunten het veld spectrometer evenveel Hz per punt houden en te beperken ontkoppeling tijden: Gebruik 3072 punten 900 MHz en 2048 punten op 600 MHz, in het 1 H-maat. </li><li> Optimaliseer extra parameters in de pulssequenties, die overeenkomen met vertragingen, pols lengtes, offset frequenties, vermogensniveaus. Type ased op de opdrachtregel om alle parameters die relevant zijn voor het experiment te geven. </li></ol></li><li> Stel de parameters voor de aanschaf van een 3D [1 H, 15 N, 13 C] HNCACB spectrum (pulssequentie hncacbgpwg3d, figuur 10A) bij 600 MHz. </li><li> Stel parameters voor een 3D [1 H, 15 N, 15 N] HNCANNH experiment (pulssequentie hncannhgpwg3d) op 600 MHz. Stel het aantal punten tot 2048 in de 1 H en 64en 128 punten in de twee 15 N dimensies. Definieer de spectrale breedtes 14, 25, 25 delen per miljoen (ppm) gecentreerd op 4,7, 119, 119 ppm in het 1 H, 15 N en 15 N dimensies. Duur van de overname met 16 scans is 1 dag en 22 uur. </li></ol> 5. Identificatie van fosforylatieplaatsen <ol><li> Proces spectra met behulp van het verzamelen en verwerken NMR software. <ol><li> Uitvoeren van een Fourier transformatie van de gegevens (figuur 7). Type ft voor een 1D spectrum, XFB voor een 2D-spectrum of ft3d voor een 3D-spectrum, op de opdrachtregel. </li><li> Fase en vindplaats alle spectra (figuur 7C) met de interactieve ramen. </li></ol></li><li> Identificeer resonanties plaats in de 2D HSQC mogelijk overeenkomen met gefosforyleerd Ser en Thr residuen (Figuur 9, red box). </li><li> Extract vliegtuigen (dwz 2D 1 H- 13C spectra) van3D 1 H- 15 N- 13C spectrum met de 15 N chemische verschuivingen resonanties plaats in het 2D. Gebruik de cursor dimensie 2 (w2) aan de 15 N frequentie overeenkomt met het vlak (w1-w3) zichtbaar worden gemaakt (Figuur 10B) te kiezen. </li><li> Pluk de resonantie frequenties van &#39;CA&#39; en &#39;CB&#39; 13C kernen van de &#39;i&#39; en &#39;I-1 &quot;residuen (zwakkere set van signalen in vergelijking met die van de i residu) voor elke [1 H, 15 N] resonantie van belang in de HNCACB 3D-spectrum door te klikken op de resonantie, in de pointer mode menu vinden / toevoegen piek, de chemische verschuiving waarde toe te voegen in een piek lijst met bestanden. <ol><li> Identificeer het type i residu pSer of PTHR door vergelijking van de chemische verschuivingen in de piek lijst waarden van CA en CB chemische verschuivingen van pSer en PTHR 17. </li><li> Identificeer de aanwezigheid van een Pro-residu op de positie i + 1 door een karakteristiek bijkomend 2 ppm verschuiving of de CA chemische verschuiving waarde 18. </li><li> Vergelijk de chemische verschuivingswaarden van de CA en CB resonanties die overeenkomen met de i-1 residu tot een lijst van chemische verschuivingen voorspeld Tau aminozuurresiduen 19 de aard van het residu identificeren de i-1 positie. </li></ol></li><li> Pluk de resonantie frequenties van 15 N kernen van de &#39;i&#39; en &#39;I-1 &quot;residuen voor elke [1 H, 15 N] resonantie van belang in de HNCANNH spectrum. </li><li> Vergelijk de 15 N chemische verschuivingswaarden de chemische verschuiving toewijzing van het tau-eiwit 20-23. </li><li> Vergelijk de geïdentificeerde dipeptiden met Tau sequentie met de sequentie specifieke opdracht vast. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We hebben NMR spectroscopie gebruikt om enzymatisch gemodificeerde Tau monsters te karakteriseren. De recombinante expressie en zuivering hier beschreven voor de volledige lengte humaan tau-eiwit kan eveneens worden gebruikt om mutant tau of tau domeinen produceren. Isotopisch verrijkte eiwit is nodig voor NMR-spectroscopie, noodzakelijk recombinante expressie. Identificatie van fosforylatieplaatsen vereist resonantie opdracht en een 15 N, 13 C dubbel gemerkt eiwit. Gezien de kosten van isotopen wo...

Een van de belangrijkste uitdagingen van de gezondheidszorg in de 21e eeuw zijn neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD). Tau is een microtubule-geassocieerde eiwit dat microtubulusvorming (MT) stimuleert. Tau is eveneens betrokken bij verschillende neurodegeneratieve aandoeningen, zogenaamde tauopathieën, waarvan de bekendste is AD. In deze aandoeningen, is Tau self-aggregaten in gepaarde spiraalvormige filamenten (PHF) en vond gewijzigd op vele residuen door posttranslationele modificaties (PTMs), zoals fosforylering 1. Fosforylering van tau-eiwit is betrokken bij zowel de regulering van de fysiologische functie van MT stabilisatie en pathologische verlies van functie die AD neuronen kenmerkt. Bovendien Tau eiwit, indien geïntegreerd in PHF&#39;s bij zieke neuronen, onveranderlijk hypergefosforyleerd 2. In tegenstelling tot normale Tau dat 2-3 fosfaatgroepen bevat, de hypergefosforyleerde Tau in PHF&#39;s bevat 5-9 Phosphate 3 groepen. Hyperfosforylering van Tau overeen zowel met een stijging van stoichiometrie bij sommige sites en fosforylering van extra sites die pathologische plaatsen van fosforylering worden genoemd. Er bestaat echter overlapping tussen AD en normale volwassen patronen van fosforylering, ondanks kwantitatieve verschillen in het niveau 4. Hoe specifiek fosforylering gebeurtenissen invloed functie en disfunctie van Tau blijft grotendeels onbekend. Wij streven ernaar om Tau regelgeving ontcijferen door PTMs op moleculair niveau. Om het begrip van de moleculaire aspecten van Tau verdiepen, we moeten technische uitdagingen aan te pakken. Ten eerste, Tau is een intrinsiek ongeordend eiwit (IDP) als geïsoleerd in oplossing. Dergelijke eiwitten missen welomschreven driedimensionale structuur onder fysiologische omstandigheden en vereisen specifieke biofysische methoden om hun functie (s) en structurele eigenschappen te bestuderen. Tau is een paradigma voor de groeiende klasse van ontheemden, vaak geassocieerd metaandoeningen zoals neurodegeneratieve ziekten, vandaar toenemend belang om de moleculaire randvoorwaarden die hun functie te begrijpen. Ten tweede karakterisering van Tau fosforylering is een analytische uitdaging, met 80 mogelijke fosforylatieplaatsen plaatsen langs de sequentie van de langste 441 aminozuur Tau isovorm. Een aantal antilichamen ontwikkeld tegen gefosforyleerde epitopen van tau en worden gebruikt voor detectie van pathologische tau in neuronen of hersenweefsel. Fosforylering evenementen kunnen plaatsvinden op ten minste 20 locaties doelwit van-proline gerichte kinases, de meeste van hen in de buurt binnen de Proline-rijke regio. De kwalitatieve (welke sites?) En kwantitatieve (wat stoichiometrie?) Karakterisering is moeilijk, zelfs door de meest recente MS-technieken 5. NMR-spectroscopie kan worden gebruikt om ontvouwen eiwitten die sterk dynamische systemen samengesteld uit ensembles conformeren zijn onderzoeken. Hoge-resolutie NMR-spectroscopie was toepased zowel structuur en functie van het tau-eiwit te onderzoeken. Bovendien, de complexiteit van Tau fosforylering profiel geleid tot de ontwikkeling van moleculaire technieken en nieuwe analysemethoden via NMR voor het identificeren van fosforylatieplaatsen 6-8. NMR als een analytische methode het identificeren van tau fosforylatieplaatsen op algemene wijze, visualisatie van de single-site modificaties in één experiment en kwantificering van de mate van Fosfaatopname. Dit punt is van essentieel belang, omdat hoewel fosforylering studies op Tau in overvloed in de literatuur, de meeste van hen zijn uitgevoerd met antilichamen, waardoor een grote mate van onzekerheid over de volledige profiel van fosforylering en daarmee de werkelijke impact van individuele fosforylering gebeurtenissen. Recombinant kinasen waaronder PKA, glycogeen-synthase kinase 3β (GSK3ß), Cycline-afhankelijke kinase 2 / cycline A (CDK2 / CycA), Cycline-afhankelijke kinase 5 (CDK5) / p25 activator eiwitten, extracellulaire signaalgereguleerde kinase 2 (ERK2) en microtubule-affiniteit-regulerende kinase (MARK), waarbij fosforylatie activiteit ten opzichte Tau vertonen, kunnen worden bereid in een actieve vorm. Bovendien worden Tau mutanten die het mogelijk maken de gerichte Tau proteïne isovormen met goed gekarakteriseerde fosforylering patronen die de fosforylering van Tau code ontcijferen. NMR spectroscopie wordt vervolgens gebruikt om enzymatisch gemodificeerde Tau monsters 6 karakteriseren - 8. Hoewel in vitro fosforylering van Tau is moeilijker dan pseudo-fosforylatie zoals door mutatie van geselecteerde Ser / Thr in glutaminezuur (Glu) residuen, deze aanpak heeft zijn voordelen. Inderdaad, noch de structurele gevolgen noch wisselwerkingsparametingen van fosforylatie altijd worden nagebootst door glutaminezuur. Een voorbeeld is de turn motief waargenomen rond 202 fosfoserine (pSer202) / fosfothreonine 205 (pThr205), die niet is weergegeven door Glu mutaties 9. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Hier is de bereiding van een isotoop gemerkte Tau voor NMR studies worden eerst beschreven. Tau-eiwit gefosforyleerd door ERK2 wordt gewijzigd op tal van sites beschreven als pathologische plaatsen van fosforylering, en dus een interessant model van gehyperfosforyleerd Tau vertegenwoordigt. Een gedetailleerd protocol van Tau in vitro fosforylering door recombinant ERK2 kinase wordt gepresenteerd. ERK2 wordt geactiveerd door fosforylering door mitogeen geactiveerde proteïne kinase / ERK kinase (MEK) 10-12. Naast de bereiding van gemodificeerde, isotopisch gemerkte Tau-eiwit, is de NMR strategie voor de identificatie van de PTMs beschreven.

<table><tbody><tr><td>pET15B recombinant T7 expressieplasmide</td><td>Novagen</td><td>69257</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>BL21(DE3) transformatie competente E. coli bacteriën</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td>Bewaar bij -80 &deg;C</td></tr><tr><td>Geautoclaveerde LB Bouillon, Lennox&nbsp;</td><td>DIFCO</td><td>240210</td><td>Bacteriegroeimedium</td></tr><tr><td>MEM vitamine complementen 100x</td><td>Sigma</td><td>58970C</td><td>Bacteriegroeimedium Supplement</td></tr><tr><td>15N, 13C-ISOGRO compleet medium poeder</td><td>Sigma</td><td>608297</td><td>Bacteriegroeimedium Supplement</td></tr><tr><td>15NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>299251</td><td>Isotop</td></tr><tr><td>13C6-Glucose</td><td>Sigma</td><td>389374</td><td>Isotop</td></tr><tr><td>Protease remmertabletten&nbsp;</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>1 tablet in 1 ml is 40x oplossing die bewaard kan worden bij -20 &deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>EUROMEDEX</td><td>1307</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Homogenisator (EmulsiFlex-C3)</td><td>AVESTIN</td><td></td><td>Lyse wordt uitgevoerd bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Unstained Protein MW Marker</td><td>Pierce</td><td>266109</td><td></td></tr><tr><td>Actieve humane MEK1 kinase, GST getagd</td><td>Sigma</td><td>M8822</td><td>Bewaar bij -80 &deg;C</td></tr><tr><td>AKT&Auml; Pure chromatografie systeem</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>HiTrap SP Sepharose FF (5 ml kolom)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5156-01</td><td>Cation uitwisselings chromatografie kolommen</td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 Desalting</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5087-01</td><td>Eiwitdesalting kolom</td></tr><tr><td>PD MidiTrap G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9180-08</td><td>Eiwitdesalting kolom</td></tr><tr><td>Tris D11, 97% D</td><td>Cortecnet</td><td>CD4035P5</td><td>Gedeutereerd NMR buffer</td></tr><tr><td>5 mm Symmetrische Microtube SHIGEMI D2O (set van 5 binnen &amp; buitenpijp)&nbsp;</td><td>Euriso-top</td><td>BMS-005B</td><td>NMR Shigemi Buizen</td></tr><tr><td>eVol kit-elektronische spuitstarterkit</td><td>Cortecnet</td><td>2910000</td><td>Pipetteren</td></tr><tr><td>Bruker 900 MHz AvanceIII met een triple resonantie cryogene probehead</td><td>Bruker</td><td></td><td>NMR spectrometer voor data acquisitie</td></tr><tr><td>Bruker 600 MHz Avance met een triple resonantie cryogene probehead</td><td>Bruker</td><td></td><td>NMR spectrometer voor data acquisitie</td></tr><tr><td>TopSpin 3.1</td><td>Bruker</td><td></td><td>Acquisitie en verwerkingssoftware voor NMR experimenten</td></tr><tr><td>Sparky 3.114</td><td>UCSF (T. D. Goddard en D. G. Kneller)</td><td></td><td>NMR data analyse software</td></tr></tbody></table>

nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Aggregaten van het neuronale Tau-eiwit worden gevonden in neuronen van patiënten met de ziekte van Alzheimer. De ontwikkeling van de ziekte gaat gepaard met verhoogde, abnormale fosforylering van Tau. In het verloop van de moleculaire onderzoek naar Tau-functies en -disfuncties in de ziekte, wordt nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie gebruikt om de meerdere fosforyleringen van Tau te identificeren. We presenteren hier gedetailleerde protocollen van recombinante productie van Tau in bacteriën, met isotopenverrijking voor NMR-studies. Er worden zuiveringsstappen beschreven die gebruik maken van de hittestabiliteit en hoge iso-elektrische punt van Tau. Het protocol voor in vitro fosforylering van Tau door recombinant geactiveerd ERK2 maakt het mogelijk om meerdere fosforyleringen te genereren. Het eiwitmonster is klaar voor data-acquisitie bij het afronden van deze stappen. De parameterinstelling om te beginnen met opnemen op de spectrometer wordt vervolgens beschouwd. Ten slotte wordt de strategie om fosforylatieplaatsen van gemodificeerd Tau te identificeren, gebaseerd op NMR-gegevens, uitgelegd. Het voordeel van deze methodologie in vergelijking met andere technieken die worden gebruikt om fosforylatieplaatsen te identificeren, zoals immunodetectie of massaspectrometrie (MS), wordt besproken.

Figuur 3A toont een grote absorptiepiek bij 280 nm waargenomen tijdens de elutiegradiënt. Deze piek komt overeen met gezuiverd tau-eiwit zoals te zien op de acrylamidegel boven het chromatogram. Figuur 3B toont een goed gescheiden absorptiepiek bij 280 nm en piek geleidbaarheid, zodat ontzouten van het eiwit efficiënt. Figuur 4 toont eiwit gel-shift waargenomen met SDS-PAGE-analyse 16 kenmerkend meerdere proteïne fosforylatie (vergelijk lanen 2 en 3). Figuur 6 to...

We beschrijven hier een methode om meerdere fosforylaties van een intrinsiek ongeordend eiwit te identificeren door middel van Kernspinresonantiespectroscopie (NMR), met behulp van het Tau-eiwit als casestudie. Recombinant Tau wordt isotopisch verrijkt en gemodificeerd in vitro door een kinase voorafgaand aan gegevensverwerving en analyse.

Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Het algemene doel van deze methodologie is om meerdere fosforyleringen van een intrinsiek ongeordend eiwit te identificeren door middel van kernspinresonantiespectroscopie met gebruik van tau-eiwit als case study. Deze methode kan helpen om een sleutelvraag in moleculaire regulatie gerelateerd aan ziekte te beantwoorden, zoals de impact van fosforylering op de interactie van het eiwit met zijn moleculaire partner. Het grote voordeel van deze techniek is dat we specifieke fosforyleringen in een ongeordend eiwit kunnen identificeren en deze kunnen linken aan structurele en functionele veranderingen.Deze methode kan inzicht bieden in de functie. Het kan ook worden toegepast op andere eiwitten, zoals de ongeordende restanten van het DNA-eiwit van het aPtc-virus. De toepassingen van deze techniek reiken tot therapie door de ontwikkeling van eiwit-, eiwit-interactieremmende remmer. Deze methode zal worden gedemonstreerd door Clement Danis, Clement Despres, Luiza Bessa en Hamida Merzougui, de PhD-studenten van onze groep.Meng voorzichtig 50 microliter competente BL21-cellen met 100 nanogram plasmide-DNA, wat 10 tot 15 miljoen kolonies per microgram plasma-DNA vormt in een plastic buisje van 1,5 milliliter. Plaats het celmengsel 30 minuten op ijs en schok het vervolgens gedurende 10 seconden met warmte bij 42 graden Celsius. Plaats het buisje vervolgens vijf minuten terug op ijs voordat u een milliliter Luria Bertani of LB-medium op kamertemperatuur toevoegt.Incubeer de bacteriesuspensie gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius onder zachte roering. Verspreid met behulp van een verspreider 100 microliters van de celsuspensie gelijkmatig over een agarplaat van LB-medium met 100 microgram per milliliter ampicilline-antibioticum. Incubeer de selectieplaat gedurende 15 uur bij 37 graden Celsius.Los vervolgens 300 milligram van stikstof 15 en koolstof 13 verrijkt medium op, één gram stikstof 15 ammoniumchloride en twee gram koolstof 13 gelabelde glucose in 10 milliliter M9-medium. Filter steriliseer de isotoopoplossing direct in het M9-medium met behulp van een 0,2 micron filter. Gebruik een Pasteur-pipet om een kolonie van de recombinante plasma getransformeerde bacteriën van de selectieplaat te suspenderen in 20 milliliter LB-medium, aangevuld met 100 microgram per milliliter ampicilline.Incubeer het geïnoculeerde medium gedurende ongeveer zes uur bij 37 graden Celsius. Meet de optische dichtheid bij 600 nanometer of OD600 met behulp van een milliliter van een tienvoudige verdunning van bacteriecultuur in een plastic spectrometercuvet. Voeg vervolgens 20 milliliter van de verzadigde LB-cultuur toe aan één liter M9-groeimedium aangevuld met ampicilline in een tweeliter Erlenmeyer glazen culturenflask met wartels.Plaats de culturenflask in een programmeerbare incubator ingesteld op 10 graden Celsius en 50 RPM. Programmeer de incubator om vroeg op de ochtend van de volgende dag over te schakelen naar 200 RPM en 37 graden Celsius. Meet de OD600 op één milliliter bacteriecultuur in een plastic spectrometercuvet.Voeg 400 microliters van een molaaire IPTG-stockoplossing toe wanneer de OD600 een waarde van ongeveer 1,0 bereikt om de expressie van recombinant tau-eiwit te induceren. Na het incuberen van de bacteriecellen gedurende drie uur bij 37 graden Celsius, verzamel ze door centrifugatie bij 5.000 keer g gedurende 20 minuten. Ontdooi de bacteriecelpellet en suspendeer deze grondig in 45 milliliter kationenuitwisselingsbuffer A, vers aangevuld met 1x proteaseremmercocktail DNasel 1.Verstoor de bacteriecellen met behulp van een hogedrukhomogenisator bij 20.000 PSI, drie tot vier doorgangen zijn nodig om de cellen voldoende te verstoren. Centrifugeer de verstoorde cellen bij 20.000 keer g gedurende 40 minuten om het onoplosbare materiaal te verwijderen. Verhit het bacteriecelextract gedurende 15 minuten bij 75 graden Celsius met behulp van een waterbad.Na enkele minuten zal een witte neerslag worden waargenomen. Centrifugeer vervolgens het verhitte extract gedurende 20 minuten bij 15.000 keer g en bewaar het supernatant dat het hittestabiele tau-eiwit bevat. Voer vervolgens kationenuitwisselingschromatografie uit op een sterke CEX-hars verpakt als een 5 milliliter bedkolom met behulp van een fast protein liquid chromatography systeem.Stel de stromingssnelheid in op 2,5 milliliter per minuut en breng de kolom in evenwicht in CEX A-buffer. Laad vervolgens de 60 tot 70 milliliter verhitte tau-extract met behulp van een monsterpomp, verzamel het doorstromende voor analyse om te verifiëren dat het tau-eiwit efficiënt aan de hars bindt. Was de hars met CEX A-buffer tot de absorptie bij 280 nanometer terugkeert naar de basislijnwaarde.Programmeer de FPLC met een gradiënt tot 25% CEX B-buffer in 10 kolomvolumes om 250 millimolar natriumchloride te bereiken. Volg dit met 50% CEX B-buffer in vijf kolomvolumes om 500 millimolar natriumchloride te bereiken. Verhoog vervolgens de gradiënt tot 100% CEX B-buffer in twee kolomvolumes om één molar natriumchloride te bereiken.Verzamel 1,5 milliliter fracties tijdens de elutiestappen. Voer vervolgens een bufferuitwisseling uit op de tau-bevattende gepoolde fracties. Breng een ontzoutingskolom in evenwicht met een 53 milliliter G25-hars verpakte bed in 15 millimolar ammoniumbicarbonaatbuffer met behulp van een FPLC-systeem.Stel de stromingssnelheid in op vijf milliliter per minuut en injecteer het tau-monster op de kolom via een injectielus van vijf milliliter. Verzamel de fracties die overeenkomen met de absorptiepiek bij 280 nanometer. Pool alle tau-fracties voordat u het monster in de buisjes verdeelt.Kies deze buisjes zodat het volume van de oplossing klein is in vergelijking met het volume van de buis. Prik vervolgens gaten in de buiskoppen met behulp van een naald voordat u de tau-monsters bevriest bij min

nuclear-magnetic-resonance-spectroscopy-for-identification-multiple

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video demonstrates the use of nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) techniques to identify multiple phosphorylations in a protein. The phosphorylation of a protein at specific amino acid causes the deshielding of the neighboring amide hydrogen, which generates the spectral difference.

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy to Identify Multiple Phosphorylations in Proteins

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering en karakterisering van plantaardig eiwit complexen. We zien dat door immunoprecipitatie een eiwit in een complex, zodat we kunnen zijn post-translationele modificaties en zijn interactie partners identificeren.

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Peptide competitiebepalingen worden veel gebruikt in een verscheidenheid aan moleculaire en immunologische experimenten. Dit document beschrijft een gedetailleerde methode voor een in vitro oligopeptide-concurrerende kinase-analyse en de bijbehorende validatieprocedures, die nuttig kunnen zijn om specifieke fosforyleringsplaatsen te vinden.

Oligopeptide Concurrentie Assay voor Fosforylatie Site Bepaling

Structuren van supramoleculaire eiwit samenstellingen met atomaire resolutie zijn van groot belang vanwege hun cruciale rol in een verscheidenheid van biologische fenomenen. Hierin presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van high-resolution structurele studies op onoplosbare en niet-kristallijne macromoleculaire eiwit samenstellen door magie-angle spinning solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (MAS SSNMR).

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Cycline-afhankelijk kinase 1 (Cdk1) wordt geactiveerd in de G2-fase van de celcyclus en regelt veel cellulaire routes. Hier presenteren we een protocol voor een kinase in vitro assay met Cdk1, dat voorziet in de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites vaststelling van cellulaire doelen van deze belangrijke kinase.

Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

Een protocol voor de toepassing van paramagnetische relaxatieverbetering NMR-spectroscopie om zwakke en voorbijgaande inter- en intramoleculaire interacties in intrinsiek ongeordende eiwitten te detecteren, wordt gepresenteerd.

Paramagnetische relaxatieverbetering voor het detecteren en karakteriseren van zelfassociaties van intrinsiek ongeordende eiwitten

Het huidige protocol beschrijft monstervoorbereiding en gegevensanalyse om eiwitfosforylering te kwantificeren met behulp van een verbeterde single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

Een geoptimaliseerde single-molecule pull-down test voor kwantificering van eiwitfosforylering

Hier presenteren we een protocol voor de verrijking van endogene fosfoproteïnefosfatasen en hun interagerende eiwitten uit cellen en weefsels en hun identificatie en kwantificering door op massaspectrometrie gebaseerde proteomica.

Een op massaspectrometrie gebaseerde benadering om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren

Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie kan de structurele eiwitdynamica op een residuspecifieke manier karakteriseren. We bieden een hands-on protocol voor het opnemen van NMR 15N, R1 en R2 relaxatie en {1H}-15N heteronucleair Overhauser effect (hetNOE) experimenten, gevoelig voor de picoseconden tot nanoseconden tijdschaal.

NMR 15N relaxatie-experimenten voor het onderzoek van de picoseconde tot nanoseconde structurele dynamica van eiwitten

Leer hoe u meervoudige fosforyleringen van intrinsiek ontvouwde eiwitten identificeert met NMR-spectroscopie, gebruikmakend van Tau-eiwit als casestudy. Deze methode onthult structuur-functierelaties en ondersteunt therapeutisch onderzoek naar eiwitinteracties.

Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten (Video) | JoVE Journal

Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten

Meer video's verkennen