Name: Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessen uit een analyse van maïs Leaf Development (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Leer laser microdissectie RNA-seq voor transcriptoomanalyse in maïs. Deze methode kwantificeert transcriptaccumulatie in specifieke celgebieden om genexpressie te vergelijken tussen mutanten en wildtype.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken S. Heek voor de lopende samenwerking en het stimuleren van discussies over tongetje ontwikkeling. Dit werk wordt ondersteund door de National Science Foundation Subsidies MCB 1052051 en IOS-1848478.

OPMERKING: Fix weefsel voor histologische analyse tegelijk dat weefsel wordt vastgesteld LM. Onderzoek gekleurde coupes voor morfologische kenmerken die later LM zal begeleiden. Bij het vergelijken mutant met wild-type, uitgevoerd in situ hybridisatie of immuunlokalisatie het domein waar het gen van interesse tot expressie wordt gebracht (hier LG1) definiëren. 1. Tissue Fixatie en verwerking <ol><li> Grow flats maïs zaailingen tot twee weken oud zijn onder normale omstandigheden 6. </li><li> Ontleden uiteinden van scheuten van zijprofielen (figuur 4). <ol><li> Accijnzen zaailing net onder de bodem lijn. </li><li> Met behulp van een scheermesje, verwijder dunne plakjes van de basis van de stengel (delen 1, Figuur 4A) tot een ovaal van culm omringd door één of twee rijpe bladeren zichtbaar (figuur 4B). </li><li> Maak nog een bezuiniging van ongeveer 10 mm boven de basis (cut 2, Figuur 4A).Deze 10 mm segment zal de SAM en jonge bladprimordia bevatten. </li><li> Draai het segment 10 mm, zodat de onderkant naar boven wijst. Maak twee sneden parallel aan de laterale as, zodat een stukje weefsel 2-3 mm dik wordt verkregen (delen 3 en 4, figuur 4B). Gooi de buitenste twee delen en behouden van de centrale slice voor fixatie en inbedding. LET OP: buitenste bladeren kunnen worden bijgesneden en weggegooid. </li></ol></li><li> Fix weefsel en het proces voor het inbedden. <ol><li> Zorgen dat alle materialen voor gebruik in daaropvolgende stappen RNase vrij. Behandel oplossingen met diethylpyrocarbonaat (DEPC) (1 ml DEPC per liter oplossing. Incubeer overnacht met af en toe schudden en autoclaaf). Bak glaswerk in een oven bij 200 ° C of hoger gedurende ten minste 6 uur en behandelen kunststofmateriaal met RNase decontaminatie oplossing. </li><li> Dag 1: Dompel weefsel plakjes in ~ 10 ml van Farmer&#39;s fix (3: 1 ethanol: azijnzuur) in glazen flacon op ijs. Nadat alle monsters zijn ontleed, gelden stofzm om luchtbellen en hulp penetratie van fixatief te verwijderen. Houd onder vacuüm gedurende 10 min vervolgens het vacuüm langzaam los. Vervang fixatief en incuberen bij 4 ° C geïncubeerd onder zacht schudden. </li><li> Dag 2: Incubeer in de volgende reeks van oplossingen, ~ 10 ml elk, 1 uur elk, allemaal met voorzichtig schudden; 85% ethanol bij 4 ° C, 95% ethanol bij 4 ° C, 100% ethanol bij 4 ° C, 100% ethanol bij 4 ° C, 100% ethanol bij 4 ° C, 1: 1 ethanol: xyleen bij kamertemperatuur, 100% xylenen bij kamertemperatuur 100% xylenen bij kamertemperatuur. LET OP: Xylenes zijn giftig bij contact met en inademing. Werk in een zuurkast en het gebruik van de juiste handschoenen. </li><li> Voeg paraffine weefselverwerkingsproces medium pellets tot ongeveer het halve volume van xylenen en incubeer overnacht bij kamertemperatuur onder zacht schudden. </li><li> Dag 3: Breng de ampul naar 60 ° C oven tot de korrels smelten. Giet oplossing en te vervangen door vers gesmolten weefsel inbedding medium. Verander het medium nog tweemaaltijdens de Dag. </li><li> Dag 4: Change weefselverwerkingsproces medium een ​​keer in de ochtend. Keer terug naar 60 ° C oven tot de middag. </li></ol></li><li> cast blokken <ol><li> Plaats inbedding mallen op hete plaat van weefsel inbedding station. Gebruik een tang om de weefselmonsters te dragen aan de inbedding vormen met het snijvlak naar beneden. Vul de mal met gesmolten paraffine en plaats de verankering ring bovenop de matrijs. Transfer naar een koud bord totdat paraffine is gestold. Bewaar de paraffineblokken bij 4 ° C in een luchtdichte doos met silicagel. </li></ol></li></ol> 2. Snijden en Slide Voorbereiding <ol><li> Snij 10 micrometer secties op een microtoom 25. </li><li> Onderzoek linten en kies mediaan secties. Mediaan secties zijn die welke de SAM, welke als een koepel van cellen omgeven door bladprimordia omvatten. </li><li> Mount secties op dia&#39;s. <ol><li> Plaats dia&#39;s die geschikt zijn voor LM zijn (ofwel RNase vrij ofgebakken) op 42 ° C warmer schuiven en enkele druppels van 50% ethanol-oplossing van toepassing op de dia te dekken. </li><li> Float secties op ethanol-oplossing totdat de secties hebben uitgebreid. LET OP: Drijvende secties op ethanol oplossing in plaats van water houdt RNA in een neergeslagen staat het verminderen van RNA degradatie. </li><li> Kantel glijbaan en verwijder overtollig ethanol-oplossing door aspiratie met een wegwerp overdracht pipet. Gebruik niet-pluizende doekjes om weg lont extra ethanol-oplossing. </li><li> Droge slides bij 42 ° C gedurende enkele uren of een nacht. WINKEL glijdt bij 4 ° C in een luchtdichte doos met silicagel. </li></ol></li><li> Deparaffinize glijdt op de dag van gebruik. <ol><li> Bereid drie glazen Coplin potten bevatten; 100% xyleen (xylenen I), 100% xyleen (xylenen II) en 100% ethanol (~ 50 ml van elke oplossing). </li><li> Met zuivere tang om dia overdragen onderdompelen dia in xylenen I 2 min, xylenen II gedurende 2 minuten en 100% ethanol gedurende 1 minuut. </li><li> drain gleedes on-pluizende doekjes en drogen aan de lucht bij kamertemperatuur. </li></ol></li></ol> 3. Microdissection van Blade, tongetje en schede Monsters van Plastochron 7 Leaf Primordia <ol><li> Zet de dia&#39;s op het podium van LM microscoop. Gebruik vijf of zes dia&#39;s voor elke repliceren, met gebruikmaking van vijf secties per slide. OPMERKING: Weefsel gemeenschappelijk gebruik voor een enkele herhaling is weergegeven in figuur 5. </li><li> Onderzoek dia&#39;s en identificeren van de vijf meest mediaan hoofdstukken over elke dia, met behulp van de SAM apex als centraal referentiepunt. Opmerking: Dit kan bij lage vergroting, meestal 5X doel voldoende. </li><li> Gebruik 10X en 20X objectief, geven de plaats van het tongetje de plastochron 7 blad primordium van elke sectie. Het tongetje is zichtbaar als een bult uitsteekt uit het adaxiale oppervlak van het blad primordium zijn. Markeer deze positie met behulp van de tekening instrument van de LM software; selecteert u het pictogram potlood, de cursor naar de juiste positiaan en klik en sleep de muis om te tekenen. LET OP: Een 10X of 20X objectief is geschikt voor deze en de volgende stappen. Bij gebruik zijgedeeltes zullen de twee zijden van elk blad primordium aanwezig in elke sectie (Figuur 2A) zijn. </li><li> Met de liniaal gereedschap en het rechthoekige tekeninstrument meten 100 urn hoog rechthoeken gecentreerd op de ligule van elke sectie (rode rechthoeken, Figuur 2A, 2B). Deze zullen de &quot;tongetje&quot; monster. <ol><li> Om de liniaal tool te gebruiken; selecteert u het pictogram heerser, de cursor naar het ene uiteinde van het te meten object, klikken en slepen om het object te meten. De lengte van de heerser zal worden getoond op het scherm. </li><li> Om een ​​rechthoek te tekenen; selecteert u het pictogram rechthoek, de cursor op een punt dat een hoek van de rechthoek zal zijn, klik en sleep om een ​​rechthoek van de juiste grootte te trekken. Of selecteer de rechte lijn tekenprogramma en teken vier rechte lijnen. </li><li> maatregel 100 pm rechthoeken gepositioneerd 50 pm boven en onder het &quot;ligule&quot; rechthoek. LET OP: Deze zal de &quot;Blade&quot; en &quot;schede&quot; monsters, respectievelijk (groene en blauwe rechthoeken, figuur 2A, 2B). Op basis van onze histologische gegevens, een 100 pm rechthoek omvat het gehele ligule regio. Equivalente porties van blad en mantel werden zodanig gekozen dat soortgelijke hoeveelheden weefsel werden verzameld voor elk. Afstandhouders van 50 urn werden gebruikt om te voorkomen dat regio tongetje weefsel per ongeluk in het blad of vel microdissections. </li></ol></li><li> Microdissect gemeten rechthoeken (figuur 2D - 2F) 7, 8, 9, het verzamelen tongetje, Blade en schede monsters in afzonderlijke buizen. Gebruik de lasergesneden functie via weefselsectie langs de omtrek van het geselecteerde domein te snijden. Gebruik de catapult functie om de rechthoek van weefsel voortbewegen van de glijbaan en in het deksel van de buis (figuur 2D - 2F). </li></ol> 4. Microdissection van Blade, tongetje en schede adaxial epidermale Monsters van Plastochron 7 Leaf Primordia <ol><li> Selecteer secties en gebruik maken van de heerser hulpmiddel tot 100 micrometer hoog segmenten gericht op de plastochron 7 tongetje te meten, zoals beschreven in hoofdstuk 3 (boven). <ol><li> Selecteer alleen de adaxial epidermale cellen van elk 100 micrometer hoog &quot;Blade&quot; en &quot;schede&quot; segment (groen en blauw selecties, figuur 2C) met een overzicht met de tekening tool. De epidermis is de buitenste cellaag; de adaxiale zijde het dichtst bij de SAM. </li><li> Voor de &quot;tongetje&quot; sample, selecteert u alleen de cellen van de opkomende ligule hobbel zoals beschreven in paragraaf 3.3 (rood selectie, figuur 2C). </li></ol></li><li> Microdissect geselecteerde regio&#39;s, het verzamelen van Blade, tongetje en Sheath epidermismonsters in afzonderlijke buizen, zoals beschreven in paragraaf 3.5. </li></ol> 5. Microdissection van Plastochron 6 Leaf Primordia van LG1-R en Wild-type Broers en zussen <ol><li> Grow scheiden families van mutant (LG1-R) en wild-type planten. </li><li> Fix en proces shoot toppen voor LM, zoals beschreven in de secties 1,2-1,4. Fix wild-type en mutant uiteinden van scheuten in afzonderlijke flesjes om hen gescheiden te houden. Monsters van dezelfde planten worden gefixeerd en verwerkt voor in situ hybridisatie. </li><li> Bepalen waar LG1 wordt getranscribeerd in wildtype siblings, door het uitvoeren van in situ hybridisatie LG1 6, 26, 27. Meet de positie van LG1 transcript ophoping van de basis van het blad primordium in meerdere monsters (figuur 1E). </li><li> Op basis van in situ hybridisatie data, kiest deel van blad primordium dat omvat de regio waar LG1 wordt getranscribeerd. In dit geval, 400-900 urn van de basis van plastochron 6 bladprimordia (paars rechthoeken, Figuur 2A). </li><li> Microdissect geselecteerd gedeelte van bladprimordia, zoals beschreven in paragraaf 3.5, verzamelen LG1-R en wildtype monsters in afzonderlijke buisjes. </li></ol> 6. Breng RNA Extraction Buffer <ol><li> Solliciteer 50 ui RNA-extractie buffer om gemicrodissecteerde weefsel en ga verder met RNA-extractie. Ga verder met RNA-extractie, RNA-amplificatie, bibliotheek bouw, sequencing en bioinformatica analyse zoals beschreven in referentie 6. </li></ol>

<ol><li>Becraft, P. W., Bongard-Pierce, D. K., Sylvester, A. W., Poethig, R. S., Freeling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liguleless-1+gene+acts+tissue+specifically+in+maize+leaf+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The liguleless-1 gene acts tissue specifically in maize leaf development.</a> Dev Biol. 141 (1), 220-232 (1990).</li>
<li>Sylvester, A. W., Cande, W. Z., Freeling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+and+differentiation+during+normal+and+liguleless-1+maize+leaf+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Division and differentiation during normal and liguleless-1 maize leaf development.</a> Development. 110 (3), 985-1000 (1990).</li>
<li>Moreno, M. A., Harper, L. C., Krueger, R. W., Dellaporta, S. L., Freeling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((liguleless1+encodes+a+nuclear-localized+protein+required+for+induction+of+ligules+and+auricles+during+maize+leaf+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">liguleless1 encodes a nuclear-localized protein required for induction of ligules and auricles during maize leaf organogenesis.</a> Genes Dev. 11 (5), 616-628 (1997).</li>
<li>Emerson, R. A. The inheritance of the ligule and auricle of corn leaves. Neb. Agr. Exp. Sta. An. Rep. 25, 81-85 (1912).</li>
<li>Moon, J., Candela, H., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Liguleless+narrow+mutation+affects+proximal-distal+signaling+and+leaf+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Liguleless narrow mutation affects proximal-distal signaling and leaf growth.</a> Development. 140 (2), 405-412 (2013).</li>
<li>Johnston, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+Analyses+Indicate+That+Maize+Ligule+Development+Recapitulates+Gene+Expression+Patterns+That+Occur+during+Lateral+Organ+Initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic Analyses Indicate That Maize Ligule Development Recapitulates Gene Expression Patterns That Occur during Lateral Organ Initiation.</a> Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).</li>
<li>Schmid, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes%3A+laser-assisted+microdissection+and+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing.</a> PLoS One. 7 (1), e29685(2012).</li>
<li>Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+cells+from+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of cells from plant tissues.</a> Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).</li>
<li>Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%2C+a+tool+for+the+global+analysis+of+gene+expression+in+specific+plant+cell+types%3A+identification+of+genes+expressed+differentially+in+epidermal+cells+or+vascular+tissues+of+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize.</a> Plant Cell. 15 (3), 583-596 (2003).</li>
<li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18 (9), 1509-1517 (2008).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Brooks, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+shoot+meristem+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Microdissection of shoot meristem functional domains.</a> PLoS Genet. 5 (5), e1000476(2009).</li>
<li>Cai, S., Lashbrook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stamen+abscission+zone+transcriptome+profiling+reveals+new+candidates+for+abscission+control%3A+enhanced+retention+of+floral+organs+in+transgenic+plants+overexpressing+Arabidopsis+ZINC+FINGER+PROTEIN2%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stamen abscission zone transcriptome profiling reveals new candidates for abscission control: enhanced retention of floral organs in transgenic plants overexpressing Arabidopsis ZINC FINGER PROTEIN2.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1305-1321 (2008).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nat Genet. 42 (12), 1060-1067 (2010).</li>
<li>Eveland, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+modules+controlling+maize+inflorescence+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Regulatory modules controlling maize inflorescence architecture.</a> Genome Res. 24 (3), 431-443 (2014).</li>
<li>Takacs, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+the+maize+shoot+apical+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of the maize shoot apical meristem.</a> Plant Cell. 24 (8), 3219-3234 (2012).</li>
<li>Aida, M., Ishida, T., Tasaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shoot+apical+meristem+and+cotyledon+formation+during+Arabidopsis+embryogenesis%3A+interaction+among+the+CUP-SHAPED+COTYLEDON+and+SHOOT+MERISTEMLESS+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis: interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes.</a> Development. 126 (8), 1563-1570 (1999).</li>
<li>Ishida, T., Aida, M., Takada, S., Tasaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+CUP-SHAPED+COTYLEDON+genes+in+gynoecium+and+ovule+development+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of CUP-SHAPED COTYLEDON genes in gynoecium and ovule development in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 41 (1), 60-67 (2000).</li>
<li>Takada, S., Hibara, K., Ishida, T., Tasaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CUP-SHAPED+COTYLEDON1+gene+of+Arabidopsis+regulates+shoot+apical+meristem+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation.</a> Development. 128 (7), 1127-1135 (2001).</li>
<li>Nardmann, J., Ji, J., Werr, W., Scanlon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maize+duplicate+genes+narrow+sheath1+and+narrow+sheath2+encode+a+conserved+homeobox+gene+function+in+a+lateral+domain+of+shoot+apical+meristems%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The maize duplicate genes narrow sheath1 and narrow sheath2 encode a conserved homeobox gene function in a lateral domain of shoot apical meristems.</a> Development. 131 (12), 2827-2839 (2004).</li>
<li>Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Fluorescence activated cell sorting.</a> Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).</li>
<li>Birnbaum, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+map+of+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A gene expression map of the Arabidopsis root.</a> Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).</li>
<li>Brady, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+root+spatiotemporal+map+reveals+dominant+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns.</a> Science. 318 (5851), 801-806 (2007).</li>
<li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li>
<li>Ruzin, S. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuzin%2C+SE+%22Plant+microtechnique+and+microscopy%22">Plant microtechnique and microscopy</a>. , Oxford University Press. New York; Oxford. (1999).</li>
<li>Jackson, D., Veit, B., Hake, S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/43253604_Expression_of_maize_KNOTTED1_related_homeobox_genes_in_the_shoot_apical_meristem_predicts_patterns_of_morphogenesis_in_the_vegetative_shoot">Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot.</a> Development. 120, 405-413 (1994).</li>
<li>Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+for+the+precise+localization+of+transcripts+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants.</a> J Vis Exp. (57), e3328(2011).</li>
<li>Day, R. C., McNoe, L., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+global+RNA+amplification+and+its+use+for+high-throughput+transcript+analysis+of+laser-microdissected+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Plant+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of global RNA amplification and its use for high-throughput transcript analysis of laser-microdissected endosperm.</a> Int J Plant Genomics. , 61028(2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Experimenteel design is een kritische factor in RNA-seq experimenten. Belangrijkste overwegingen zijn de precieze domein (en) en het ontwikkelingsstadium (en) te analyseren, en welke vergelijkingen worden gemaakt. Het is cruciaal om te denken in termen van vergelijkingen, omdat de output is typisch een lijst van genen die gede tussen twee of meer voorwaarden. Zoals bij alle experimenten, is het belangrijk om slechts één variabele veranderen tegelijk. Bijvoorbeeld, bij het vergelijken van verschillende domeinen blad, bla...

Maïs blad een ideaal model voor de vorming van ontwikkelings- gebieden te bestuderen bij morfogenese, aangezien het een duidelijke grens tussen het mes en schede die vatbaar is voor genetische dissectie (Figuur 1A). Tijdens de vroege stadia van bladontwikkeling, een lineaire band kleinere cellen, de preligule band (PLB), verdeelt het blad primordium in vooraf blad en pre-mantel domeinen. Een pony-achtig tongetje en driehoekige oorschelpen ontwikkelen van de PLB (Figuur 1 A, C, D). Genetische screens hebben geïdentificeerd mutaties die het mes-schede grens verstoren. Bijvoorbeeld recessieve liguleless1 (LG1) mutaties te verwijderen en de ligule oorschelpen 1, 2, 3, 4 (figuur 1B). In situ hybridisatie toonde dat LG1 transcript ophoopt op de PLB en opkomende tongetje, waardoor het een uitstekende marker voor tongetje ontwikkeling 5, 6 (figuur 1E). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55004/55004fig1.jpg" /> Figuur 1: Wild-type en liguleless1-R maïs bladeren. (A) Blade-omhulsel grensgebied van volwassen wild-type blad met tongetje en oorschelp structuren. (B) Blade-omhulsel grensgebied van volwassen liguleless1-R blad met afwezigheid van tongetje en oorschelp structuren. Bladeren in A en B zijn gesneden in de helft langs de hoofdnerf. (C) langsdoorsnede door wild-type blad primordium. Monster is verwerkt en gekleurd voor histologische analyse. Het initiërende tongetje blijkt als een bult uitsteekt uit het vlak van het blad (pijlpunt). (D) Longitudinal sekteion door middel van wild-type blad primordium. Monster is verwerkt LM zoals beschreven in de tekst. Arrowhead geeft initiëren tongetje. (E) LG1 in situ hybridisatie van shoot apex laterale langsdoorsnede. Sterretjes geven LG1 transcript ophoping aan de PLB van de P6 blad primordium. Pijlen geven voet van P6 primordium. Bar geeft meting van de basis van de primordium de PLB. Schaalbalk in A en B = 20 mm. Schaal bars in CE = 100 urn. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie-6 (Copyright American Society of Plant Biologen). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55004/55004fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> In deze studie werd LM RNA-Seq gebruikt om een ​​reeks van genen die differentieel tot expressie (DE) geeft bij het mes omhulsel grens ten opzichte van andere delen van het blad primordium en ide<html> ntify genen die in DE LG1-R mutanten ten opzichte van wild-type broers en zusters. LM RNA-Seq is een werkwijze voor het kwantificeren transcript accumulatie in specifieke cellen of cellulaire domeinen 7. LM systemen combineren een laser en een microscoop met een digitale camera. Doorsnede weefsel wordt aangebracht op objectglaasjes en bekeken door de microscoop. De LM-software bevat meestal tekentools waarmee de gebruiker kan worden geselecteerd gebied te schetsen voor microdissectie. De laser snijdt langs de lijn, en het gekozen weefsel wordt gekatapulteerd van de glijbaan en in een buis boven de dia opgeschort. LM kan de gebruiker nauwkeurige domeinen, inclusief specifieke cellagen en zelfs individuele cellen 8, 9 microdissect. RNA kan dan worden geëxtraheerd uit het weefsel gemicrodissecteerde. Vervolgens worden de RNA-component gebruikt Seq volgende generatie sequencing van cDNA-bibliotheken gegenereerd uit het geëxtraheerde RNA sequentie 10,= &quot;xref&quot;&gt; 11. Belangrijkste voordelen van LM RNA-seq zijn de mogelijkheid om transcript ophoping kwantificeren welbepaalde domeinen en het vermogen om de hele transcriptoom gelijktijdig 7 profileren. De techniek is bijzonder geschikt voor probing vroege ontwikkelingsgebeurtenissen wanneer het interessegebied vaak microscopisch. Eerdere studies hebben gebruikt LM gecombineerd met microarray technologie ontwikkelingsprocessen te bestuderen in planten 9, 12, 13. RNA-Seq heeft het voordeel kwantificeren transcripten over een breed dynamisch bereik, waaronder lage-genen tot expressie, en voorafgaande sequentie-informatie is niet vereist 10, 11. Bovendien LM RNA-Seq heeft het potentieel om ontwikkelings belangrijk genen die kunnen ontbreken in mutagenese schermen door genetische redundantie of letaliteit van het verlies-van- markerenfunctie mutant. Ontwikkelings belangrijk genen, zoals smalle sheath1 (NS1) en bekervormige cotyledon2 (cuc2), vaak specifieke expressiepatronen van slechts één of enkele cellen 17, 18, 19, 20. Velen zijn uitgedrukt alleen tijdens de vroege ontwikkelingsstadia en niet in het rijpe orgaan. Wanneer gehele organen of grote domeinen worden geanalyseerd, worden deze celspecifieke transcripten verdund en kunnen niet meer conventionele analyses worden gedetecteerd. Door toe te staan ​​analyses van precies gedefinieerde domeinen, LM RNA-Seq maakt deze weefsel-specifieke genen te identificeren en te kwantificeren. Cruciaal voor het succes van de hier beschreven experimenten een grondige histologische analyse dat de selectie van de geschikte ontwikkelingsstadium en domein voor analyse geleid en nauwkeurige MeasureMent van celweefsel domeinen LM. Opdat equivalente domeinen bemonsterd over alle replicaten werd weefsel vanuit bladprimordia in hetzelfde ontwikkelingsstadium en gemicrodissecteerde domeinen opzichte van morfologische oriëntatiepunten gemeten zoals de opkomende ligule (figuur 2). Het is bekend dat sommige genen tot expressie gebracht in een gradiënt van de top tot de basis van het blad. Door het meten van nauwkeurige domeinen variëren door bemonstering vanaf verschillende plaatsen langs het blad proximaal-distale as werd minimaal gehouden (figuur 3A). Door microdissecting domeinen van dezelfde grootte, variatie door het differentiële verdunning van celspecifieke transcripten werd verlaagd (Figuur 3B). Zijdelingse langsliggers die de shoot apex gebruikt voor microdissections. Deze doorsneden loodrecht op de hoofdnerf marge as (Figuur 4). Met alleen secties die de SAM bevatten zorgt ervoor dat gelijkwaardige laterale regio&#39;s vanbladprimordia worden geanalyseerd. In monsters verwerkt en deelbaar LM, de eerste morfologische tekenen van uitgroei tongetje een bult op de adaxiale kant door periclinale celdelingen in de adaxiale epidermis (figuur 1D, figuur 2). Er werd vastgesteld dat de opkomende ligule betrouwbaar kan worden geïdentificeerd plastochron 7 stadium bladprimordia. We waren geïnteresseerd in genen die tot expressie in het gehele tongetje regio, inclusief de nieuwe tongetje en de cellen onmiddellijk distaal dat de oorschelp vormen. Om te waarborgen dat gelijkwaardige weefsel selecties gemaakt, werd het tongetje bult als morfologisch landmark en 100 urn rechthoek gecentreerd op de ligule bult werd geselecteerd LM (figuur 2A, 2B). Equivalent sized rechthoeken van pre-blad en pre-mantel geselecteerd uit dezelfde bladprimordia. Analyses van liguleless mutant planten presenteerde een andere challeNSE; LG1-R mutanten geen tongetje dus deze morfologische eigenschap kan niet worden gebruikt om het gebied te selecteren LM vormen. In plaats daarvan, het domein van LG1 transcript accumulatie in wildtype bladprimordia werd bepaald, en een gebied dat domein zou omvatten gedefinieerd. Deze voorlopige analyses werden uitgevoerd op zaailingen van dezelfde planten als werden gebruikt voor de uiteindelijke analyse, omdat eerder werk heeft aangetoond dat de ligging van de PLB afhankelijk van groeiomstandigheden. In situ hybridisatie aangegeven dat LG1 transcripten accumuleren in de PLB van P6 bladprimordia (figuur 1E). We selecteerden een domein 400-900 urn van de basis van de bladprimordia dat het domein van LG1 expressie (paarse bouwstenen, figuur 2A) omvat en gevangen deze equivalente gebieden van wildtype en LG1-R planten. De variatie in genetische achtergrond en groeiomstandigheden minimaliseren bij vergelijking transcript accumulatie in LG1-R en wild-type planten, scheiden families van mutanten en wild-type broers en zussen werden gebruikt.

<table><tbody><tr><td>Diethyl pyrocarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>159220</td><td>Gebruikt voor RNase behandeling van oplossingen</td></tr><tr><td>Razor blades&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>RNase Zap</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020-250ML</td><td>RNase ontsmettingsoplossing</td></tr><tr><td>Ethanol absolute 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28184</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur, glazuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Glazen flesjes - 22 ml</td><td>VWR</td><td>470206-384</td><td></td></tr><tr><td>Xyleen, histologisch kwaliteit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056-4L</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Voorwerpvorm, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td><td>VWR</td><td>15154-072</td><td></td></tr><tr><td>Inbeddingsringen</td><td>VWR</td><td>15154-303</td><td></td></tr><tr><td>Silica gel zakjes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71206-01</td><td>Droogmiddel voor opslag van paraffine blokken</td></tr><tr><td>Oven</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0503</td><td>De oven moet een temperatuur van 60 &deg;C handhaven</td></tr><tr><td>Paraffine inbedding station</td><td>Leica&nbsp;</td><td>EG1160</td><td></td></tr><tr><td>Microtoom</td><td>Leica&nbsp;</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Dia warmer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71317-10</td><td></td></tr><tr><td>Coplin potjes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70316-02</td><td></td></tr><tr><td>Laser microdissector</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KIMWIPES&trade; Delicate Task Wipers</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Stropvrije doekjes voor het wegvegen van overtollige oplossingen van microscoopglaasjes</td></tr><tr><td>Membrane Slide 1.0 PEN</td><td>Zeiss</td><td>415190-9041-000</td><td>Glaaspannetjes voor laser microdissectie</td></tr><tr><td>Zelfklevende dop 200 ondoorzichtig</td><td>Zeiss</td><td>415190-9181-000</td><td>Buisjes voor laser microdissectie</td></tr><tr><td>PicoPure RNA Isolation Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>KIT0204</td><td></td></tr></tbody></table>

experimental design for laser microdissection rna-seq: lessen uit een analyse van maïs leaf development

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Genen met een belangrijke rol in de ontwikkeling hebben vaak ruimtelijk en / of tijdelijk beperkte expressie patronen. Vaak zijn deze gen-transcripten worden niet gedetecteerd of niet geïdentificeerd als differentieel tot expressie (DE) in transcriptoom analyses van de hele plant organen. Laser Microdissection RNA-Seq (LM RNA-Seq) is een krachtig hulpmiddel om genen die DE zijn in specifieke ontwikkelingsstoornissen domeinen te identificeren. De keuze van cellulaire domeinen microdissect en vergelijken, en de nauwkeurigheid van de microdissections zijn cruciaal voor het succes van de experimenten. Hier zijn twee voorbeelden illustreren ontwerp overwegingen voor transcriptomics experimenten; LM een RNA-seq analyse van genen die gede langs de maïs blad proximale-distale as bepalen en een tweede experiment om genen die in DE liguleless1-R (LG1-R) identificeren mutanten vergeleken met wild type. Sleutelelementen die hebben bijgedragen aan het succes van deze experimenten werden histologische en si gedetailleerdetu hybridisatie analyses van het gebied te analyseren, winkelwagentje bladprimordia bij equivalente ontwikkelingsstadia, het gebruik van morfologische bezienswaardigheden gebieden selecteren voor microdissectie en microdissectie van nauwkeurig afgemeten domeinen. Dit artikel geeft een gedetailleerd protocol voor de analyse van ontwikkelings-domeinen door LM RNA-Seq. De hier gepresenteerde gegevens illustreren hoe de geselecteerde regio voor microdissectie de resultaten beïnvloedt.

Met de LM schema geschetst in figuur 2, ongeveer 2 um 1,000,000-1,500,000 weefsel werd verzameld voor elk repliceren in de hele cel-lagen LM (figuur 5), en 200.000 pm2 per nabootsen adaxial de epidermis LM. Ongeveer 2.500.000 urn 2 van weefsel werd verzameld voor elk repliceren in de LM-R van LG1 en wildtype bladprimordia. Twee ronden van lineaire amplificatie RNA leverde microgram hoeveelheden RNA per r...

Veel ontwikkelingsbelangrijke genen hebben cel- of weefselspecifieke expressiepatronen. Dit artikel beschrijft LM RNA-seq experimenten om genen te identificeren die differentieel tot expressie worden gebracht op de grens tussen het blad en de schede van maïs en in lg1-R mutanten in vergelijking met het wildtype. De experimentele overwegingen die hier worden besproken, zijn van toepassing op transcriptomische analyses van andere ontwikkelingsverschijnselen.

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessen uit een analyse van maïs Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

Het algemene doel van deze methode is het kwantificeren van transcriptaccumulatie in specifieke cellen of cellulaire domeinen, zodat vergelijkingen kunnen worden gemaakt tussen verschillende domeinen of tussen gelijkwaardige domeinen in mutante en wild-type monsters. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals hoe orgaandomeinen worden gespecificeerd of hoe specifieke mutaties de genexpressie beïnvloeden. Het grote voordeel van deze techniek is dat transcriptaccumulatie kan worden gekwantificeerd in minuscule, precies gedefinieerde domeinen die te klein zijn om met de hand te dissecteren.Voordat u met deze procedure begint, kweek vlakjes van maïszaailingen onder standaardcondities tot ze twee weken oud zijn. Om de scheuttoppen voor laterale secties te dissecteren, snijdt u eerst een zaailing net onder de grondlijn af. Gebruik vervolgens een scheermes om dunne plakjes van de basis van de stengel te verwijderen totdat een ovaal van rust omgeven door een of twee volgroeide bladeren zichtbaar is.Maak een andere snede ongeveer 10 millimeter boven de basis. Dit 10-millimetersegment bevat de topscheutmeristeem in jonge bladprimord

experimental-design-for-laser-microdissection-rna-seq-lessons-from-an

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Laser microdissection werd toegepast op de gen expressie profilering te analyseren in specifieke compartimenten van Drosophila vleugel schijf onderworpen aan een gelokaliseerde...

Laser Microdissection Toegepast op gen expressie profilering van de subset van cellen uit de Drosophila Wing Disc

In deze video-artikel stellen we een methode voor het isoleren van een of...

Laser capture microdissectie van Drosophila Perifere neuronen

Een dubbelstrengs RNA interferentie (dsRNAi) techniek wordt toegepast om down-reguleren van de maïs cinnamoyl co-enzym A-reductase (ZmCCR1) gen tot lagere planten ligninegehalte. Lignine down-regulatie van de celwand wordt gevisualiseerd door microscopische analyses en gekwantificeerd door de Klason methode. Compositionele veranderingen in hemicellulose en cellulose geanalyseerd.

Lignine Neerregeling van<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi en Klason Lignine Analyse

Hier presenteren we een protocol voor laser-geassisteerde microdissectie van specifieke plantencellen voor transcriptioneel profileren. Hoewel het protocol geschikt is voor verschillende soorten en celtypen, is de focus op zeer ontoegankelijke cellen van de vrouwelijke kiemlijn die belangrijk zijn voor seksuele en apomictische reproductie in het kruisbloemigengeslacht Boechera.

Laser-assisted Microdissection (LAM) als een tool voor Transcriptionele Profiling van individuele cel Types

Het kwantificeren van celdeling en expansie is van cruciaal belang voor het begrijpen van de groei van hele planten. Hier presenteren we een protocol om cellulaire parameters te berekenen die de groeisnelheid van maïsbladeren bepalen en benadrukken we het gebruik van deze gegevens voor het onderzoeken van moleculaire groei-regulerende mechanismen door het richten van ontwikkelingsstadium-specifieke bemonsteringsstrategieën.

Kinematische analyse van de celdeling en Expansion: Het kwantificeren van de cellulaire basis van groei en Sampling Developmental Zones in<em&gt; Zea Mays</em&gt; Leaves

Wij bieden een nieuwe methode om het contrast X-ray absorptie van maïs weefsel geschikt voor het scannen van gewone microcomputed-tomografie. Op basis van CT-beelden, introduceren we een set van beeldverwerking workflows voor verschillende maïs materialen effectief uitpakken microscopische fenotypes van vaatbundels van maïs.

Micron-schaal fenotypering technieken van maïs vaatbundels gebaseerd op de X-ray Microcomputed tomografie

Dit protocol beschrijft de laser Capture micro dissectie voor de isolatie van kraakbeen en bot uit verse bevroren delen van de muis embryo. Kraakbeen en botten kunnen snel worden gevisualiseerd door Cresylacetaat-Violet kleuring en precies worden verzameld om RNA van hoge kwaliteit te leveren voor transcriptomische analyse.

Laser Capture Microdissectie van de muis embryonale kraakbeen en bot voor genexpressie analyse

Hier gepresenteerd is een protocol voor laser-capture microdissection (LCM) van plantaardige weefsels. LCM is een microscopische techniek voor het isoleren van gebieden van weefsel op een contaminatievrije manier. De procedure omvat weefselfixatie, paraffine inbedding, sectioning, LCM en RNA extractie. RNA wordt gebruikt in de downstream weefselspecifieke, tijdelijk opgeloste analyse van transcripto's.

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing voor ruimtelijke en temporale weefsel-specifieke genexpressie analyse in planten

Er wordt een protocol beschreven dat lasermicrodissectie gebruikt om individuele nematodenweefsels te isoleren voor RNA-sequencing. Het protocol vereist geen soortspecifieke genetische toolkits, waardoor genexpressieprofielen kunnen worden vergeleken tussen verschillende soorten op het niveau van single-tissue monsters.

Laser microdissectie voor species-agnostische single-tissue toepassingen

Maïsblad primordia zijn diep verwarmd en gerold, waardoor ze moeilijk te bestuderen zijn. Hier presenteren we methoden voor het voorbereiden van dwarsdoorsneden en ontrolde hele bergen van maïsblad primordia voor fluorescentie en confocale beeldvorming.

Verbeterde methoden voor het voorbereiden van dwarsdoorsneden en het uitrollen van hele bergen van primordia van maïsbladeren voor fluorescentie en confocale beeldvorming

Leer laser microdissectie RNA-seq voor transcriptoomanalyse in maïs. Deze methode kwantificeert transcriptaccumulatie in specifieke celgebieden om genexpressie te vergelijken tussen mutanten en wildtype.

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessen uit een analyse van maïs Leaf Development

Meer video's verkennen