Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessen uit een analyse van maïs Leaf Development
5 maart 2017
Veel ontwikkelingsbelangrijke genen hebben cel- of weefselspecifieke expressiepatronen. Dit artikel beschrijft LM RNA-seq experimenten om genen te identificeren die differentieel tot expressie worden gebracht op de grens tussen het blad en de schede van maïs en in lg1-R mutanten in vergelijking met het wildtype. De experimentele overwegingen die hier worden besproken, zijn van toepassing op transcriptomische analyses van andere ontwikkelingsverschijnselen.
Het algemene doel van deze methode is het kwantificeren van transcriptaccumulatie in specifieke cellen of cellulaire domeinen, zodat vergelijkingen kunnen worden gemaakt tussen verschillende domeinen of tussen gelijkwaardige domeinen in mutante en wild-type monsters. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals hoe orgaandomeinen worden gespecificeerd of hoe specifieke mutaties de genexpressie beïnvloeden. Het grote voordeel van deze techniek is dat transcriptaccumulatie kan worden gekwantificeerd in minuscule, precies gedefinieerde domeinen die te klein zijn om met de hand te dissecteren.
Voordat u met deze procedure begint, kweek vlakjes van maïszaailingen onder standaardcondities tot ze twee weken oud zijn. Om de scheuttoppen voor laterale secties te dissecteren, snijdt u eerst een zaailing net onder de grondlijn af. Gebruik vervolgens een scheermes om dunne plakjes van de basis van de stengel te verwijderen totdat een ovaal van rust omgeven door een of twee volgroeide bladeren zichtbaar is.
Maak een andere snede ongeveer 10 millimeter boven de basis. Dit 10-millimetersegment bevat de topscheutmeristeem in jonge bladprimordia. Draai het 10-millimetersegment zodat de basis omhoog staat.
Maak twee sneden evenwijdig aan de laterale as om een plakje weefsel van twee tot drie millimeter dik te verkrijgen. Gooi de buitenste twee delen weg en bewaar de centrale plak voor fixatie en inbedding. Dompel de weefselplak in ongeveer 10 milliliter boerenfix in een glazen flesje op ijs.
Nadat alle monsters zijn gedissecteert, breng vacuüm aan om luchtbellen te verwijderen en het binnendringen van het fixeermiddel te vergemakkelijken. Houd het vacuüm 10 minuten vast en laat het vervolgens langzaam vrijkomen. Vervang het fixeermiddel en incubeer het gedurende een nacht bij vier graden Celsius met zacht schudden.
De volgende dag gaat u verder met het verwerken van de weefsels voor inbedding zoals beschreven in het protocol. Om paraffineblokken te gieten, plaats u inbeddingsvormen op een hotplate van de weefsel-inbeddingsstation en gebruik u een pincet om de weefselmonsters over te brengen naar de inbeddingsvormen met de snede naar beneden. Plaats de inbeddingsring op de bovenkant van de mal.
Vul elke mal aan met gesmolten paraffine. Breng de mallen over naar een koude plaat totdat de paraffine is gestold. Bewaar de paraffineblokken in een luchtdichte container met silicagel bij vier graden Celsius.
Secties worden gesneden uit paraffineblokken op een microtoom volgens standaardprocedures en mediale secties die het topscheutmeristeem omvatten, worden geselecteerd voor montage. Om de secties op dia's te monteren, plaatst u dia's die ofwel RNase-vrij zijn of gebakken op een diawarmer van 42 graden Celsius. Breng enkele druppels 50%ethanol-oplossing aan om elke dia te bedekken.
Leg de secties voorzichtig op de dia en laat de secties drijven in de ethanoloplossing totdat ze zijn uitgezet. Kantel vervolgens de dia en verwijder overtollig ethanol door aspiratie met een wegwerp-transferpipet. Gebruik pluisvrije doekjes om eventuele extra ethanoloplossing weg te vegen.
Laat de dia's drogen bij 42 graden Celsius gedurende enkele uren of een nacht. Wanneer de dia's droog zijn, bewaar ze in een luchtdichte container met silicagel bij vier graden Celsius. Deparaffiniseer de dia's op de dag van de microdissectie.
Bereid drie glazen Coplin-potten voor, twee potten die ongeveer 50 milliliter 100%xyleenten bevatten en een pot die ongeveer 50 milliliter 100%ethanol bevat. Dompel de dia's één minuut in xyleenten, xyleenten twee gedurende één minuut en 100%ethanol gedurende één minuut. Laat de dia's uitlekken op pluisvrije doekjes en laat ze op kamertemperatuur drogen.
Om deze procedure te beginnen, zet u de dia's vast op de tafel van de lasermicrodissectiemicroscoop. Een kritische factor voor het succes van lasermicrodissectie in RNasic-experimenten is het gebruik van morfologische en moleculaire markeringen om precieze domeinen voor microdissectie te selecteren. Bekijk de dia's met een 5X objectief en identificeer de vijf meest mediale secties op elke dia met behulp van de top van het scheutmeristeem als centrale referentiepunt.
Gebruik vervolgens een 10X of 20X objectief om de positie van de ligule op het plastochron zeven bladprimordium van elke sectie te identificeren. De ligule zal zichtbaar zijn als een bult die uitsteekt vanaf het adadxiaal oppervlak van het bladprimordium. Gebruik het tekengereedschap van de lasermicrodissectiesoftware om deze positie te markeren.
Selecteer het vrijhandstekenpictogram, beweeg de cursor naar de juiste positie en klik en sleep de muis om te tekenen. De volgende stap is het gebruik van de liniaal en het rechthoekige tekengereedschap om 100 micrometer hoge rechthoeken te meten die gecentreerd zijn op een ligule van elke sectie als de ligulemonsters. Om het liniaalgereedschap te gebruiken, selecteert u het liniaalpictogram, beweegt u de cursor naar een van de uiteinden van het te meten gebied en klikt en sleept u vervolgens om het gebied te meten.
De lengte van de liniaal wordt op het scherm weergegeven. Gebruik het liniaalgereedschap om een segment van 100 micrometer te meten dat is gecentreerd op een ligule. Om een rechthoek te tekenen, selecteert u het gereedschap voor het tekenen van rechte lijnen en tekent u vier rechte lijnen.
Op dezelfde manier meet u rechthoeken van 100 micrometer gepositioneerd 50 micrometer boven en onder de ligule-rechthoek. Dit zullen de monstermonsters zijn. Microdissecteert de gemeten rechthoeken met behulp van de lasercut-functie om door het weefselsectie langs de omtrek van het geselecteerde domein te snijden en de katapultfunctie om het rechthoekige weefsel uit de dia in de deksel van de buis te katapulteren.
Verzamel ligule-, blad- en omhulselmonsters in afzonderlijke buizen. Gebruik dezelfde procedure om blad-, ligule- en omhulseladaxiaal epidermale monsters van plastochron zeven bladprimordia te microdisseceren. Toepassen ten slot
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op het kwantificeren van transcriptaccumulatie in specifieke cellulaire domeinen in maïs. Hierbij wordt de nadruk gelegd op het belang van het begrijpen van verschillen in genexpressie op de grens tussen bladplaat en bladschede en in lg1-R mutanten vergeleken met het wild-type.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Genexpressie
- Transcriptomics
Achtergrond
- Ontwikkelingsbiologisch belangrijke genen vertonen cel- of weefselspecifieke expressiepatronen.
- Het begrijpen van deze patronen is cruciaal voor inzichten in de specificatie van organdomainen.
- Mutaties kunnen de genexpressie significant beïnvloeden, wat gevolgen heeft voor ontwikkelingsprocessen.
- Transcriptaccumulatie kan worden gekwantificeerd in kleine, gedefinieerde domainen.
Doel van de studie
- Om differentiële genexpressie te identificeren op de grens tussen de bladschijf en de bladschede van maize.
- Om de genexpressie in lg1-R-mutanten te vergelijken met wild-type monsters.
- Om een methode te bieden voor het analyseren van transcriptomische gegevens in de ontwikkelingsbiologie.
Gebruikte methoden
- LM RNA-seq experimenten om genexpressie te analyseren.
- Dissectie van scheuttoppen van maïszaailingen voor laterale sectie.
- Standaard groeicondities voor maïszaailingen voorafgaand aan de experimenten.
- Kwantificering van transcriptaccumulatie in specifieke cellulaire domeinen.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van genen met differentiële expressiepatronen op de grens tussen bladlamel en bladschede.
- Vergelijking van genexpressie in lg1-R-mutanten versus wildtype-monsters.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode bij het analyseren van kleine cellulaire domeinen.
- Inzichten in hoe specifieke mutaties de genexpressie tijdens de ontwikkeling beïnvloeden.
Conclusies
- De studie biedt een waardevolle methode voor transcriptomische analyse in de ontwikkelingsbiologie.
- Inzicht in genexpressiepatronen kan informatie verschaft over orgaanontwikkeling en de effecten van mutaties.
- Deze aanpak kan worden toegepast op andere ontwikkelingsfenomenen buiten maïs.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
RNA-Seq met laser-microdissectie maakt een precieze kwantificering van transcriptaccumulatie in nauw gedefinieerde weefseldomeinen van planten mogelijk, waardoor de uitdaging van ruimtelijk beperkte genexpressie, die vaak gemaskeerd wordt bij analyses van hele organen, wordt aangepakt. Deze aanpak vergroot de voorspellende betrouwbaarheid bij doelwitvalidatie door de biologische context van genregulatie te isoleren, wat risico-gecorrigeerde beslissingen in vroege ontdekkings- en functionele genomica-pipelines ondersteunt. Een nauwkeurige selectie van het domein en de getrouwheid van de microdissectie zijn essentieel voor het genereren van reproduceerbare, bruikbare transcriptomische gegevens die informeren over portfolio-triage en mechanische risicoreductie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar genfuncties in specifieke ontwikkelingsdomeinen mogelijk, waardoor de rollen van signaalpaden worden verduidelijkt.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door de effecten van mutaties of perturbaties op genexpressie te isoleren.
- Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij de selectie van targets door ruimtelijk beperkte differentiële expressie bloot te leggen.
- Faciliteert portfolio-triage door contextafhankelijke genactiviteit te onderscheiden.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde weefseldomeinen voor voor downstream transcriptomische workflows.
- Standaardiseert de monsterselectie met behulp van morfologische en moleculaire kenmerken voor reproduceerbaarheid.
- Genereert kwantitatieve genexpressie-outputs die geschikt zijn voor comparatieve analyse.
- Maakt betrouwbare evaluatie van kandidaatgenen of pathways mogelijk in gedefinieerde biologische contexten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijmt transcriptomische bevindingen met ziekte-relevante of ontwikkelingsbiomarkers waar van toepassing.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door nauwkeurige domeinspecifieke analyses mogelijk te maken.
- Biedt mechanistische risicoreductie door de ruimtelijke context van genregulatie te verduidelijken.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypothesetests tot de identificatie van lead-verbindingen, ter ondersteuning van zowel targetvalidatie als mechanistische studies in planten en potentieel andere modelsystemen.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetesten en pathway-verduidelijking door transcripten in gedefinieerde domeinen te kwantificeren.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve genexpressiedata voor assay-ontwikkeling en screeningreadiness.
- Analytics: Biedt metingen van differentiële expressie die een robuuste vergelijking tussen condities of genotypen mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt biomarker-afstemming en preklinische continuïteit wanneer ruimtelijke genexpressie relevant is.
- Bedrijfsbrede Hergebruik: Vestigt een herbruikbare workflow voor ruimtelijke transcriptomics over diverse ontwikkelings- of ziektestuursmodellen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van transcriptomische analyses.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door de biologische context te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en bevordering van targets mogelijk op basis van ruimtelijke genexpressiedata.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in histologie, microdissectie en transcriptomische analyse.
- Vereist toegang tot laser-microdissectie-instrumentatie en RNA-seq-infrastructuur.
- Necessiteert strikte standaardisatie tussen teams voor monsterselectie en domeindefinitie.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende weefseltypen of ontwikkelingsstadia.
- Precisie bij de domeinselectie en microdissectie is cruciaal voor de datakwaliteit en interpreteerbaarheid.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Tissue Fixation and Processing
3:03
Sectioning and Slide Preparation
4:57
Microdissection of Blade, Ligule, and Sheath Samples from Plastochron 7 Leaf Primordia
7:48
Results: Laser Microdissection RNA Sequencing Identifies Differentially Expressed Genes in Maize Leaf
9:38
Conclusion
