Name: Het testen van de Vasculaire Invasieve Vermogen van kankercellen in zebravis ( Danio Rerio) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Leer hoe je de vasculaire invasieve capaciteit van kankercellen test in zebravisembryo's. Deze methode gebruikt fluorescentie-microscopie om celinvasie te beoordelen en versnelt onderzoek naar metastase.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken Peter Johnson van het Georgetown University Microscopy Core voor hulp bij het in beeld brengen van de zebravisembryo's. De Shared Resource voor Microscopie & Beeldvorming en de Zebrafish Shared Resource worden gedeeltelijk ondersteund door NIH/NCI grant P30-CA051008. Dit werk werd ook ondersteund door NIH/NCI CA71508 (AW) en CA177466 (AW).

Ethiek Verklaring: zebravis embryo&#39;s werden geproduceerd volgens een goedgekeurde IACUC protocol. Deze experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de Georgetown University Animal Care en gebruik Comite. 1. Organiseren Embryo&#39;s voor injectie en Create Stock Solutions <ol><li> Genereer vereiste zebravis larven kankercel vasculaire invasie te beoordelen. <ol><li> Opzetten paarsgewijze of groep in-cross paring met Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; ednrb1 B140 vis. LET OP: Wij gegenereerd Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; ednrb1 b140 zebravis, door het kruisen van Tg (kdrl: grcfp) zn1 25, die groene koraalrif fluorescerend eiwit tot expressie in endotheelcellen, met een lijn die pigmentcellen ontbreekt, mitfa b692; ednrb1 b140, ontwikkeld aan de zebravis International Resource Center. </li><li> Collect eieren, schoon en verwijder onbevruchte of misvormde embryo&#39;s de volgende dag 22. </li><li> Incubeer embryo&#39;s bij 28,5 ° C tot klaar voor injectie met kankercellen, te komen wanneer de zebravis embryo&#39;s zijn 2-dagen na de bevruchting (2 DPF). </li></ol></li><li> Maak injectie platen. <ol><li> Smelt 25 ml van 1,5% agarose in dH 2 O voor elke plaat. </li><li> Giet 12 ml van de agar in een 100 mm x 15 mm petrischaal en laat het uitharden. </li><li> Re-smelten en giet de resterende agarose in de plaat. </li><li> Zich onmiddellijk een kristal matrijs (3 mm x 7,2 cm breed x 7,5 cm), zodat het op een 30 graden hoek met de agarose en in het midden van de plaat. LET OP: Dit zal een steile 60 ° muur en een 30 ° hellende oprit te creëren. </li><li> Tape de glazen mal op zijn plaats en laat de agarose uitharden. </li><li> Verwijder voorzichtig de glazen mal en wees voorzichtig de agarose niet scheurt. OPMERKING: Matrijzen kunnen worden opgeslagen in dH 2 O bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Evenwicht injectie plaat met vis water (0,3 g / l zeezout). <ol><li> Spoel de plaat tweemaal met gedestilleerd water. </li><li> Evenwicht plaat door toevoeging van 10 ml water vissen op de plaat en plaats op shaker gedurende 10 min. </li><li> Evenwicht plaat een tweede keer met vis water. </li></ol></li><li> Split 2 dagen na de bevruchting (DPF) embryo&#39;s in injectie groepen door ze in gerechten met vis water 22. </li><li> Bereid herstel gerechten voor elke groep om gebruik te maken na de injectie. Zorg ervoor dat het herstel gerecht bevat 10 ml water vissen, plus penicilline (25 ug / ml) en streptomycine (50 ug / ml). </li><li> Bereid 2x tricaïne door toevoeging van 4 ml gebufferde tricaïne voorraad (4 mg / ml, 10 mM Tris, pH 7) met 50 ml water vis plus penicilline en streptomycine. </li><li> Los op 15 mg laag smeltpunt agarose in 10 ml 2x tricaïne oplossing voor een montage verdoving medium dat levende embryo&#39;s Imagin zal immobiliseren generereng. LET OP: Montage medium bestaat uit 1,5% agarose. </li><li> Trek micro-injectie naalden. <ol><li> Plaats glazen capillaire buis in een verticale pipet trekker. Trek lang taps pipetten met behulp van 20 mAmp huidige en een 2-coil verwarmingselement. </li></ol></li></ol> 2. Cellen Labeling Kanker met lipofiele fluorescerende kleurstof <ol><li> Handhaving van kankercellen in hun aanbevolen kweekomstandigheden. Opmerking: Deze lijnen werden in DMEM + 10% FBS: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 en SK-BR-3. Deze lijnen werden in RPMI + 10% FBS gehouden: HCC 1806 en T-47D. Alle cellijnen werden gedurende de incubatie bij 37 ° C en 5% CO2 gehandhaafd. </li><li> Genereer een enkele-celsuspensie door dissociatie een hechtende kweek van kankercellen. <ol><li> Was de cellen eerst met PBS en daarna behandelen met 0,05% trypsine-EDTA-oplossing. OPMERKING: Trypsine belichtingstijd is afhankelijk van de cellijn. </li><li> Neutraliseren van de trypsine oplossing serum-bevattende celkweek media na de cellen los te maken. </li></ol></li><li> Centrifugeer de trypsine-geneutraliseerde celsuspensie gedurende 5 minuten bij 200 xg, dan resuspendeer de celpellet in verse kweekmedia voor celtelling. </li><li> Tel de celsuspensie met behulp van een geautomatiseerde teller en gelijktijdig 1 miljoen cellen in 200 ul van celkweekmedia. <ol><li> Controleer levensvatbaarheid van de cellen met trypan blauwe kleurstof uitsluiting vóór injectie in zebravis embryo&#39;s. OPMERKING: Alleen levensvatbare cel populaties moet worden geïnjecteerd in de zebravis embryo&#39;s, zoals de injectie van dode cellen zal niet overeen met echte vasculaire invasie. </li></ol></li><li> Voeg 2 pl rode lipofiele kleurstof kanker celsuspensie voor een 1: 100 verdunning, meng en incubeer daarna het mengsel bij 37 ° C gedurende 20 min. OPMERKING: Concentratie van de kleurstof en etikettering tijd moet worden geoptimaliseerd voor elke cellijn. </li><li> Na de incubatie, voeg 1 ml vers medium aan de buis en centrifugeer 5 min bij200 x g. </li><li> Wegspoelen resterende fluorescerende kleurstof uit de kankercellen. <ol><li> Zuig het supernatant van de celpellet, resuspendeer de pellet in 1 ml vers kweekmedium, en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g. </li><li> Herhaal de wasstap nogmaals: zuig het supernatant, resuspendeer de celpellet in 1 ml vers medium en centrifugeer weer gedurende 5 minuten bij 200 x g. </li><li> Herhaal de wasstap derde: zuig het supernatant, resuspendeer de celpellet in 1 ml vers medium en centrifugeer weer gedurende 5 minuten bij 200 x g. </li></ol></li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet bevattende 1.000.000 gemerkte kankercellen in 500 pl vers medium. OPMERKING: kan 0,5 mM EDTA aan de media worden toegevoegd aan cel klonteren te voorkomen. </li></ol> 3. Cellen Injecteren Cancer in de Pre-cardiale Sinus van de zebravis embryo&#39;s <ol><li> Bevestig micro-injectie doseersysteem een ​​perslucht bron en zet the micro-injectie doseersysteem stroombron. <ol><li> Test druk door het indrukken van het voetpedaal. Een korte puls van lucht moeten uitstoten van de naaldhouder. </li></ol></li><li> Equilibreren de injectie platen tweemaal met 2x tricaïne oplossing. <ol><li> Voor elke equilibratie stap, voeg 20 ml 2x tricaïne oplossing van de injectieplaat en plaats op schudder gedurende 10 min. </li></ol></li><li> Gebruik plastic pipet een groep embryo transfer naar een klein schaaltje met het 2x tricaïne oplossing. </li><li> Backfill de micro-injectie injectienaald met kankercellen met behulp van een gel-loading pipet tip. <ol><li> Plaats de naald in een elektrode opslag pot met de punt naar beneden, zodat de cellen te vestigen in de buurt van de top. </li></ol></li><li> Transfer 20-30 narcose embryo&#39;s om een ​​injectie plaat door het verzamelen van de embryo&#39;s met veel 2x tricaïne in een plastic pipet. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Laat embryo&#39;s om zich te vestigen in de punt van de pipet. </li><li> Gently verdrijven embryo in de trog van de injectieplaat, verspreidt het embryo over de lengte van de goot. </li><li> Lijn embryo&#39;s met kop naar boven en buiken met uitzicht op de steile wand van de trog. LET OP: tricaïne oplossing moet betrekking hebben op zowel de trog lengte en het vlakke agarose oppervlak, embryo&#39;s alleen die woonachtig zijn in de trog. Embryo&#39;s zijn nu klaar voor injectie. </li></ol></li><li> Injecteer 50-100 kankercellen (2-5 nl) in de precardiac sinus van de zebravis embryo&#39;s met de micro-injectie doseersysteem. <ol><li> Bevestig de naald om de naald houder van een micromanipulator. </li><li> Plaats de injectieplaat onder de stereoscoop met 60 graden muur links en focus op de top embryo bij 25x vergroting. </li><li> Plaats de micromanipulator, zodat wanneer verlengd, zal de naald de embryo doorboren. </li><li> Verleng de naald op het oog, totdat het bijna het embryo raakt. </li><li> Op zoek onder de microscoop, uitlijnen van de naald zo thoed zal het embryo na verdere uitbreiding doorboren. </li><li> Doorboren het embryo door de dooierzak de punt net aan, maar niet in de pre-cardiale sinus. </li><li> Injecteren cellen door het indrukken van het voetpedaal. De kracht van de injectie verdrijft de cellen in het hart sinus. Trek de naald. </li><li> Met behulp van de rechter, uit te breiden en schuif de injectienaald. Met de linkerhand, maken kleine wijzigingen aanbrengen in de volgende embryo te positioneren. </li><li> Zet de naald op de elektrode opslag jar bij het opzetten van een andere plaat te injecteren. </li></ol></li><li> Breng de embryo&#39;s om het herstel gerecht zodra de gehele plaat wordt geïnjecteerd. <ol><li> Kantel de injectieplaat het embryo zwembad onderaan, wast resterende embryo&#39;s uit het dal, en het inzamelen van de plastic pipet. </li><li> Laat het embryo te vestigen in de bodem van de pipet. </li><li> Breng de embryo&#39;s om het herstel gerecht in een minimaal volume van tricaïne. </li></ol></li><li> Incubate herwinnen schotel bij 28 ° C gedurende 1 uur. <ol><li> Afzonderlijke levensvatbare zebravis embryo&#39;s van dode embryo&#39;s en ander puin. </li></ol></li><li> Incubeer gerecht bij 33 ° C tot klaar om te scoren, meestal 24-96 uur. Opmerking: Deze waarde wordt bepaald als een compromis tussen 37 ° C, de ideale temperatuur voor kankercellen en 28,5 ° C, de ideale temperatuur voor zebravis. </li></ol> 4. Scoren Extravasatie <ol><li> Verdoven de partij embryo&#39;s worden gescoord door ze in een schotel met tricaïne oplossing. </li><li> Plaats een verdoofd larven op een depressie microscopie dia in een druppel tricaïne. <ol><li> Orient larven zijdelings voor een optimale weergave van de staart regio. </li></ol></li><li> Tel het aantal kankercellen die met succes uit het vaatstelsel zijn binnengedrongen door te focussen op en neer door de staartgebied duidelijk onderscheiden intacte cellen. LET OP: Het beste is om ten minste twee personen die betrokken zijn bij t hebbenZijn werkwijze, waarbij de afzonderlijke punten de vis blind voor de experimentele conditie wordt beoordeeld. <ol><li> Score larven op samengestelde fluorescentiemicroscoop met de 10x objectief. Gebruik de 20x doelstelling voor een moeilijke gesprekken. </li></ol></li></ol> 5. Montage van embryo&#39;s op Slides en Latere Fluorescentie Imaging <ol><li> Smelt 1,5% agarose / tricaïne oplossing en breng aan 37 ° C. </li><li> Verdoven het embryo te beelden door het in tricaïne oplossing. </li><li> Breng het embryo in een druppel tricaïne oplossing van het beeld-vormoppervlak. Eventueel kan gebruik maken van een glazen bodem schaal of microscoopglaasje. </li><li> Gebruik een glazen pipet om het overtollige tricaïne oplossing te verwijderen, met behoud van het embryo op de beeldvorming oppervlak. </li><li> Overlay één druppel gesmolten agarose oplossing over het embryo. </li><li> Snel, voordat de agarose polymeriseert, gebruik dan een delicate instrument, zoals een wimper borstel, het embryo zijdelings te oriënteren voor de beeldvorming, het geven van extra zorghet embryo waarborgen wordt afgeplat langs het beeld-vormoppervlak. </li><li> Dompel de inmiddels gepolymeriseerd agarose daling onder tricaïne oplossing. </li><li> Betreft de live zebravis embryo tot microscopische beeldvorming. </li></ol> 6. Wijziging: Het inspuiten Kankercellen Into de dooierzak van de zebravis embryo&#39;s <ol><li> Bereid de micro-injectie doseersysteem en injectie platen zoals eerder beschreven in paragraaf (3) van dit protocol beschreven. </li><li> Label twee celpopulaties met contrasterende fluorescerende kleurstoffen zoals eerder beschreven in paragraaf (2), van dit protocol beschreven. </li><li> Injecteer 5-10 nl van 2 x 10 ^ 7 cellen / ml in de dooierzak. Houd het injectievolume constant identieke celaantallen injecteren (100-200 kankercellen) van elke celpopulatie NB: Men kan transparante zebravis embryo&#39;s ontbreekt fluorescerende vaatstelsel voor deze test gebruiken. Passieve ingang van deeltjes in de vasculatuur kan worden gecontroleerd door het injecteren van fluorescerende kralen (&lt;10 um) of, wijzigennative, een cellijn die niet intravsate. </li><li> Herstellen van de geïnjecteerde embryo&#39;s zoals eerder beschreven in paragraaf (3) van dit protocol en vervolgens screenen voor een succesvolle injecties. <ol><li> Gebruik een stereoscoop om het scherm en de overdracht van levensvatbare embryo&#39;s die met succes werden geïnjecteerd met een nieuw gerecht. OPMERKING: alle embryo&#39;s zou een consequent formaat massa van cellen die zich in de dooier te hebben. Embryo&#39;s worden verwijderd wanneer de massa grootte verschilt of indien cellen zich buiten de dooier. </li><li> Breng de levensvatbare embryo&#39;s naar een nieuw gerecht of kankercellen duidelijk worden gezien in de dooierzak. </li></ol></li><li> Incubeer gerecht bij 33 ° C tot klaar om te scoren, meestal 24 - 48 uur. Opmerking: Deze waarde wordt bepaald als een compromis tussen 37 ° C, de ideale temperatuur voor kankercellen en 28,5 ° C, de ideale temperatuur voor zebravis. </li><li> Te scoren intravasation, volg dan de in paragraaf beschreven richtlijnen (4) van dit protocol, maar in plaats daarvan tellen het aantal cancer cellen die met succes zijn binnengedrongen in het vaatstelsel van de caudale regio. </li></ol>

<ol><li>Cummings, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+progression+of+breast+cancer%3A+insights+from+50+years+of+autopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Path%22%5BJournal%5D)">Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies.</a> Am J Path. 232, 23-31 (2014).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Reymond, N., d'Água, B. B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+endothelial+barrier+during+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Crossing the endothelial barrier during metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li>
<li>Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+migration+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell migration in three dimensions.</a> Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).</li>
<li>Rahim, S., Üren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+electrical+impedance+based+technique+to+measure+invasion+of+endothelial+cell+monolayer+by+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+3D+vascularized+organotypic+microfluidic+assays+to+study+breast+cancer+cell+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li>
<li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+breast+cancer%3A+one+size+does+not+fit+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).</li>
<li>Mohanty, S., Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+metastasis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Experimental metastasis assay.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li>
<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).</li>
<li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Models of bone metastasis.</a> J Vis Exp. (64), e4260(2012).</li>
<li>Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+experimental+metastasis+to+bone+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow.</a> Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).</li>
<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+organ-specific+metastatic+potential+of+individual+breast+cancer+cells+and+primary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors.</a> J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).</li>
<li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).</li>
<li>Soares, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+murine+model+of+hepatic+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A preclinical murine model of hepatic metastases.</a> J Vis Exp. (91), e51677(2014).</li>
<li>Kienast, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).</li>
<li>Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+the+blood-brain+barrier+in+experimental+metastatic+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors.</a> J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).</li>
<li>Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+cancer+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a cancer model system.</a> Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).</li>
<li>Feitsma, H., Cuppen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a cancer model.</a> Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).</li>
<li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+of+the+day%3A+zebrafish+as+a+human+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).</li>
<li>Stoletov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+extravasation+dynamics+of+metastatic+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells.</a> J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).</li>
<li>Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-initiated+extravasation+of+cancer+cells+visualized+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish.</a> PeerJ. , (2014).</li>
<li>Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+human+cancer+cell+metastasis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish.</a> BMC Cancer. 13 (453), (2013).</li>
<li>Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -N., Rubinstein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+angiogenesis+drugs+in+a+live+fluorescent+zebrafish+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscl+Throm+Vas%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay.</a> Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).</li>
<li>Sharif, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+growth+density+modulates+cancer+cell+vascular+invasion+via+Hippo+pathway+activity+and+CXCR2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling.</a> Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).</li>
<li>Novoa, B., Figueras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+model+for+the+study+of+inflammation+and+the+innate+immune+response+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).</li>
<li>Kitamura, T., Qian, B. -Z., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+promotion+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell promotion of metastasis.</a> Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).</li>
<li>Tulotta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+signaling+between+human+CXCR4+and+zebrafish+ligands+by+the+small+molecule+IT1t+impairs+the+formation+of+triple-negative+breast+cancer+early+metastases+in+a+zebrafish+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).</li>
<li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li>
<li>Berens, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratin-associated+protein+5-5+controls+cytoskeletal+function+and+cancer+cell+vascular+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion.</a> Oncogene. , Epub ahead of print (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Deze techniek maakt gebruik van de zebravis model om de vasculaire invasieve vermogen van kankercellen (zie figuur 1) efficiënt testen. Hier pasten we de techniek om een panel van borstkankercellijnen teneinde een basislijn waarop andere onderzoekers vervolgens hun studies bouwen verschaffen (zie tabel 1, figuren 2-3). De waarneming dat MDA-MB-231-cellen gemakkelijk binnengevallen in de caudale regio van de zebravis embryo&#39;s zou deze cellijn ideaal voor het testen v...

Metastatische ziekte is een belangrijke oorzaak van kankersterfte en vele mechanismen waarmee kankercel disseminatie nog worden ontdekt 1. Om een ​​kankercel met succes uitzaaien, moet het eerst binnen te dringen door het stroma dat een primaire tumor omringt, in te voeren (intravasate) in de bloedsomloop, overleven in transit, afslag (extravasaat) uit de circulatie, en tot slot de oprichting van een microflora naar de verre orgaan met 2. Intravasation en extravasatie zijn dus cruciale stappen in de metastatische cascade, maar toch elke kankercel is niet inherent bedreven in het verstoren en het migreren door middel van endotheliale kruispunten 3. In feite zijn er een aantal unieke selectiedruk die kankercel vasculaire invasie omringen en de werkwijze kan verder worden beïnvloed door verschillende endogene en exogene factoren 4. Daarom, technieken die het agressieve gedrag van vergevorderde kanker sonde vaak gericht op vascular invasieve vermogen als middel om metastatische verspreiding te voorspellen. Verschillende modelsystemen bestaan om de studie van kankercel vasculaire invasie in vitro te vergemakkelijken. De meest gebruikte in vitro assays omvatten hetzij transwell systemen kankercelmigratie beoordelen via een endotheelbarrière 5 of elektrische cel-substraat Impedantie Sensing (ECIS) technologie om de real-time verstoring van een intacte endotheliale monolaag van kankercellen 6 volgen. Deze tests meestal niet over de vloeistofdynamica en stromale factoren die anders zouden beïnvloeden kankercel bijlage bij een endotheliale muur. Dit probleem is enigszins omzeild door perfusable vasculaire netwerken die voortvloeien uit de 3D-cultuur van endotheel met ondersteunende stromale cellen, en deze 3D-microfluïdische systemen vertegenwoordigen nu de voorhoede van de huidige in vitro opties 7,8. Toch zijn deze benaderingen laat de robuuste micromilieu van een functionele vaatstelselen derhalve slechts gedeeltelijk substituut voor in vivo modellen. De meest gebruikte in vivo model van vasculaire invasie van de muis, waarin experimentele metastase testen gewoonlijk uitgevoerd omdat dat dit op relatief korte tijdschaal en die in het algemeen indicatief voor metastatische vermogen 9. Deze testen omvatten directe injectie van kankercellen in het verkeer en daarmee het model van de eindfase van de metastase, namelijk extravasatie en kankercel kolonisatie van organen. De experimentele metastase testen verschillen, afhankelijk van de plaats van injectie kankercel en de organen uiteindelijk geanalyseerd. In het eerste assay soort worden kankercellen geïnjecteerd in de staartader van muizen en kankercellen zaaien in de longen wordt bewaakt 10,11. De tweede test omvat het uitvoeren van intracardiale injectie metastatische zaaien tegen het bot micro 12-14 leiden, maar ook de hersenen 15. In de derde proef, kanker cells worden geïnjecteerd in de milt om kolonisatie mogelijk van de lever 16 terwijl de vierde afgifteroute in de halsslagader verricht kankercellen naar de hersenen 17,18. Ongeacht de kankercel levering methode, orgel kolonisatie is de geaccepteerde experimentele eindpunt en wordt meestal bepaald via luminescentie, histologie, of PCR-gebaseerde technieken. Ondanks het fysiologische voordelen van het uitvoeren van experimentele metastase testen bij een murine gastheer deze experimenten moeten nog weken tot maanden in beslag en analyseren. De zebravis (Danio rerio) model is onlangs naar voren gekomen als een nieuw systeem kankervooruitgang 19,20 bestuderen, en maakt de beoordeling van kankercel vasculaire invasie in een functionele vaatstelsel gedurende een veel kortere tijdschaal vergelijking met muizen 21-24. De methode maakt gebruik van een transparante zebravis stam die het endotheel is gemarkeerd met een groene koraalrif fluorescent eiwit reporter aangedreven door de kdrl promoter, de zebravis receptor voor vasculaire endotheelgroeifactor 25. In de test worden kankercellen gemerkt met een fluorescerende marker en geïnjecteerd in de precardiac sinus van 2-dagen oude embryo&#39;s. Ergens tussen 48-96 uur na de injectie kankercellen die uit het vaatstelsel en in het caudale gebied van embryo zijn binnengedrongen kan efficiënt in een fluorescentiemicroscoop scoorde. Hier de techniek passen we een panel van veelgebruikte humane borstkankercellijnen tot grote verschillen in hun vasculaire invasieve vermogen aantonen. Verder tonen we aan dat het veranderen van de plaats van injectie het embryo dooierzak maakt de studie van heterogene cel interacties, kanker celpopulaties verschillend kunnen worden gelabeld met fluorescente kleurstoffen en geïnjecteerd in zebravisembryo&#39;s ontbreekt fluorescerende vasculatuur. In dit laatste assay kankercellen die de dooier zijn binnengedrongen en intravasated in de vasculature gescoord in het caudale gebied 24 tot 48 uur na injectie. Vanwege de effectiviteit en het gemak van dit model, worden zebravis toenemende mate toegepast om de vasculaire invasieve vermogen van kankercellen snel testen onder een fysiologische omgeving.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Dishes</td><td>Corning Incorporated</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass</td><td>Fisher Brand</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Dish</td><td>Corning Incorporated</td><td>3160-60</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, Low Melting</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, Molecular Grade</td><td>Bioline</td><td>BIO-41026</td><td></td></tr><tr><td>Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4"</td><td>A-M Systems, Inc</td><td>627000</td><td></td></tr><tr><td>David Kopf 700C Vertical Pipette Puller</td><td>Hofstra Group</td><td>3600</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Storage Jar, 1.0 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222)</td><td>Fluka</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Eyelash Brush</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>113</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Transfer Pipettes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Pipet Tips</td><td>Fisher Brand</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottom Dishes (12.0 mm)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>Glass Depression Slide</td><td>VWR</td><td>470005-634</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Salt, Sea Salt</td><td>Pentair</td><td>IS50</td><td></td></tr><tr><td>Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS20622B</td><td></td></tr><tr><td>SP8 Confocal Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E600</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-G Potassium</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP914-100</td><td></td></tr><tr><td>Petri Plates, 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Brand</td><td>&nbsp;FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer II</td><td>General Valve Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin Sulfate</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22885</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafish&nbsp;</td><td>Georgetown Zebrafish Shared Resources</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

het testen van de vasculaire invasieve vermogen van kankercellen in zebravis (<em&gt; danio rerio</em&gt;)

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

Vasculair binnendringen en extravasatie van kankercellen is een kenmerk van metastatische progressie. Traditionele in vitro modellen van kankercel-invasie van endotheel missen doorgaans de vloeistofdynamica waaraan binnendringende cellen in vivo anders worden blootgesteld. Echter, in vivo systemen zoals muismodellen, hoewel fysiologisch relevanter, vereisen langere experimentele tijdschalen en stellen unieke uitdagingen met betrekking tot monitoring en data-analyse. Hier beschrijven we een zebravistest die deze technische kloof probeert te overbruggen door een snelle beoordeling van vasculaire invasie en extravasatie van kankercellen mogelijk te maken. De aanpak omvat het injecteren van fluorescerende kankercellen in de precardiale sinus van transparante 2-dagen oude zebravis-embryo's waarvan de vaatwand is gemarkeerd door een contrasterende fluorescerende reporter. Na injectie moeten de kankercellen in circulatie overleven en vervolgens extravaseren uit de bloedvaten in weefsels in het staartgebied van het embryo. Extravaseerde kankercellen worden efficiënt geïdentificeerd en gescored in levende embryo's via fluorescentiebeeldvorming op een vast tijdstip. Deze techniek kan worden aangepast om intravasatie en/of competitie tussen een heterogene mix van kankercellen te bestuderen door de injectieplaats te veranderen naar de dooierzak. Samen kunnen deze methoden een kenmerkend gedrag van kankercellen evalueren en mechanismen onthullen die indicatief zijn voor kwaadaardige progressie naar het metastatische fenotype.

Hier hebben we getest de vasculaire invasieve vermogen van veelgebruikte borstkankercellijnen in een zebravis embryo model (figuur 1). Strenge criteria werden gebruikt in het noteren extravasatie voor deze verschillende cellijnen, waarbij positieve gebeurtenissen alleen werden geteld als de kankercellen duidelijk had geëxtravaseerd, dit gebeurt vooral om eventuele vals-positieven die kunnen voortvloeien uit het maken cellulaire afval te beperken. <p class="jove_conte...

Deze werkwijze gebruikt zebravisembryo&#39;s efficiënt testen vasculaire invasieve vermogen van kankercellen. Fluorescerende kankercellen worden geïnjecteerd in de precardiac sinus of dooierzak ontwikkelende embryo&#39;s. cel kanker vasculaire invasie en extravasatie wordt beoordeeld via fluorescentie microscopie van de staart regio 24-96 uur later.

Het testen van de Vasculaire Invasieve Vermogen van kankercellen in zebravis (<em&gt; Danio Rerio</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

Het algemene doel van deze procedure is om het kwaadaardige en invasieve gedrag van kankercellen in een zebravis-embryomodel te beoordelen. Deze methode helpt onderzoekers te bepalen of kankercellen kunnen invasief zijn vanuit een functioneel circulatoire systeem, waardoor een sleutelstap in de metastatische cascade wordt gemodelleerd. Het grote voordeel van deze techniek is dat het zebravis-embryomodel deze beoordeling en een kortere doorlooptijd biedt dan soortgelijke experimenten die vaak bij muizen worden uitgevoerd.De procedure wordt gedemonstreerd door Doctor Eric Glasgow, die de zebravis-kernfaciliteit bij Georgetown University leidt. Na het voorbereiden van kankercellen, reagentia en zebravis-embryo's volgens het tekstprotocol, bevestigt u het micro-injectiesysteem aan een geperste luchtbron en zet u de stroombron aan. Test de druk door op het voetpedaal te drukken.Er moet een korte luchtpuls uit de naaldhouder komen. Voeg 20 milliliter 2X Tricaine-oplossing toe aan een injectieplaat en plaats de plaat op een shaker om het te laten gelijkwaardig zijn. Herhaal vervolgens de gelijkmaking met een tweede aliquot van 2X Tricaine.Gebruik vervolgens een plastic pipette om een groe

testing-vascular-invasive-ability-cancer-cells-zebrafish-danio

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Deze video beschrijft een micro-injection methode voor de levering van borstkankercellen in de perivitelline ruimte van transgene zebravis embryo's. Na incubatie visualiseren we het embryo onder een fluorescerende microscoop om kankercelinvasie, verspreiding en metastase te observeren.

zPDX-analyse van invasiviteit: onderzoek naar invasief gedrag van gemetastaseerde kankercellen in zebravisembryo xenografts

This video describes the zebrafish xenograft assay to assess in vivo tumor formation and study the effect of therapeutic agents.

Zebrafish Xenograft Assay: A Method to Assess the Anti-cancer Efficacy of Therapeutics on Tumorigenicity in Zebrafish In Vivo

Een snelle manier om te screenen op melanoom modifiers met behulp van een zebravis autochtone tumor model gepresenteerd. Het maakt gebruik van de miniCoopR vector waarmee expressie van genen kandidaat melanoom in melanocyten. Een methode om melanoom-vrije overleving bochten, een invasie assay, een protocol voor antilichaam kleuring van schaal melanocyten en een melanoom transplantatie assay te verkrijgen zijn beschreven.

Screening op Melanoom Modifiers het gebruik van een zebravis Autochtone tumormodel

We beschrijven hier xenograft zebravismodellen behulp van twee verschillende injectieplaatsen, dat wil zeggen, perivitelline ruimte en het kanaal van Cuvier, aan de invasief gedrag te onderzoeken en de intravasation en extravasatie potentieel van menselijke borstkankercellen respectievelijk beoordelen.

Invasief gedrag van menselijke borstkankercellen in embryonale zebravis

De transplantatie van kankercellen is een belangrijk instrument voor de identificatie van kankermechanismen en therapeutische reacties. Huidige technieken zijn afhankelijk van immuun-incompetente dieren. Hier beschrijven we een methode om zebravis tumorcellen te transplanteren in immuun-competente embryo's voor de langetermijnanalyse van tumorcelgedrag en in vivo drugresponsen.

Transplantatie van zebravis-pediatrische hersentumoren in immuungecompetente gastheren voor langdurige studie van tumorcellen gedrag en drugrespons

Het doel van deze methode is het genereren van een in vivo model van tumor angiogenese door xenotransplanterende tumorcellen van zoogdieren tot een embryo van zebravis dat fluorescently gelabelde bloedvaten heeft. Door beeldvorming van de xenotransplantaatmodellen is en geassocieerde vaten kan een kwantitatieve meting van de angiogene respons worden verkregen.

In vivo beeldvorming en Kwantatie van de gastheer Angiogenic respons in zebravis tumor xenografts

Zebrafish xenograft modellen zorgen voor high-throughput drug screening en fluorescerende beeldvorming van menselijke kankercellen in een in vivo micro-omgeving. We ontwikkelden een workflow voor grootschalige, geautomatiseerde medicijnscreening op patiënt-afgeleide leukemiemonsters bij zebravissen met behulp van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging unit.

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Hier beschreven is een methode voor het gebruik van zebravis embryo's om het vermogen van gefunctionaliseerde nanodeeltjes te bestuderen om menselijke kankercellen in vivo richten. Deze methode maakt de evaluatie en selectie van optimale nanodeeltjes mogelijk voor toekomstige tests bij grote dieren en in klinische proeven.

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Hier bieden we een stapsgewijs protocol, met tips om xenograften te genereren en richtlijnen voor tumorgedragsanalyse, whole-mount immunofluorescentie en confocale beeldvorming kwantificering.

Generatie zebravislarven xenografts en tumorgedragsanalyse

We beschrijven een protocol voor xenotransplantatie in de dooier van transparante zebravisembryo's dat wordt geoptimaliseerd door een eenvoudige, snelle stadiëringsmethode. Analyses na injectie omvatten overleving en het beoordelen van de ziektelast van xenogetransplanteerde cellen door middel van flowcytometrie.

Een eenvoudige, snelle en effectieve methode voor tumor xenotransplantatie analyse in transparante zebravis embryo's

Dit protocol biedt stapsgewijze instructies voor het genereren en oplossen van problemen met xenotransplantaten voor acute lymfatische leukemie (ALL) bij de mens uit cellijnen en vers patiëntenmateriaal in kortstondig immunosuppressie-zebravisembryo's, samen met richtlijnen voor de beoordeling van de geneesmiddelrespons met behulp van flowcytometrie. De experimentele pijplijn kan ook worden aangepast voor solide tumoren.

Snelle in vivo voorspelling van geneesmiddelrespons met behulp van leukemieceltransplantaten in zebravisembryo's

Leer hoe je de vasculaire invasieve capaciteit van kankercellen test in zebravisembryo's. Deze methode gebruikt fluorescentie-microscopie om celinvasie te beoordelen en versnelt onderzoek naar metastase.

Het testen van de Vasculaire Invasieve Vermogen van kankercellen in zebravis (

Meer video's verkennen