Het testen van de Vasculaire Invasieve Vermogen van kankercellen in zebravis (
3 november 2016
Deze werkwijze gebruikt zebravisembryo's efficiënt testen vasculaire invasieve vermogen van kankercellen. Fluorescerende kankercellen worden geïnjecteerd in de precardiac sinus of dooierzak ontwikkelende embryo's. cel kanker vasculaire invasie en extravasatie wordt beoordeeld via fluorescentie microscopie van de staart regio 24-96 uur later.
Het algemene doel van deze procedure is om het kwaadaardige en invasieve gedrag van kankercellen in een zebravis-embryomodel te beoordelen. Deze methode helpt onderzoekers te bepalen of kankercellen kunnen invasief zijn vanuit een functioneel circulatoire systeem, waardoor een sleutelstap in de metastatische cascade wordt gemodelleerd. Het grote voordeel van deze techniek is dat het zebravis-embryomodel deze beoordeling en een kortere doorlooptijd biedt dan soortgelijke experimenten die vaak bij muizen worden uitgevoerd.
De procedure wordt gedemonstreerd door Doctor Eric Glasgow, die de zebravis-kernfaciliteit bij Georgetown University leidt. Na het voorbereiden van kankercellen, reagentia en zebravis-embryo's volgens het tekstprotocol, bevestigt u het micro-injectiesysteem aan een geperste luchtbron en zet u de stroombron aan. Test de druk door op het voetpedaal te drukken.
Er moet een korte luchtpuls uit de naaldhouder komen. Voeg 20 milliliter 2X Tricaine-oplossing toe aan een injectieplaat en plaats de plaat op een shaker om het te laten gelijkwaardig zijn. Herhaal vervolgens de gelijkmaking met een tweede aliquot van 2X Tricaine.
Gebruik vervolgens een plastic pipette om een groep embryo's over te brengen naar een klein schaaltje met 2X Tricaine-oplossing. Gebruik een gel-loadingtip om de micro-injectienaald achter te vullen met kankercellen. Plaats de naald in een elektrodenopslagpot met de puntige kant naar beneden, zodat de cellen zich nabij de punt nestelen.
Breng 20 tot 30 verdovende embryo's over naar een injectieplaat door embryo's met veel 2X Tricaine te verzamelen in een plastic pipette. Laat de embryo's op de punt van de pipette rusten en spuug de embryo's vervolgens voorzichtig in de trog van de injectieplaat, waarbij de embryo's over de lengte van de trog worden verdeeld. Richt de embryo's uit met de koppen omhoog en de buiken naar de steile wand van de trog.
Bevestig de naald aan de naaldhouder van de micro manipulator. Plaats vervolgens de injectieplaat onder de stereoscoop met de 60-graadswand aan de linkerkant en focus op het bovenste embryo bij 25X-vergroting. Positioneer de micro manipulator zodat wanneer de naald wordt uitgebreid, deze het embryo zal doorboren.
Breid vervolgens de naald uit met het oog totdat deze bijna het embryo raakt. Kijk nu onder de microscoop en lijn de naald uit tegen het embryo. Om de cellen te injecteren, prikt u door de embryo-trog in de dooierzak.
Druk op het voetpedaal en plaats de punt net bij, maar niet in, de precardiale sinus. De kracht van de injectie zal de cellen in de hartsinus werpen. Alternatief kan de injectie van cellen in de dooierzak het onderzoek van verschillende facetten van vasculaire invasie mogelijk maken, zoals beschreven in het manuscript.
Gebruik de rechterhand om de injectienaald uit te breiden en terug te trekken. Met de linkerhand maakt u fijne aanpassingen om de volgende embryo te positioneren. Wanneer de hele plaat is geïnjecteerd, brengt u de naald terug naar de elektrodenopslagpot.
Om de embryo's naar de herstelplak te brengen, kantelt u de injectieplaat om de embryo's aan de onderkant te trekken, wast u eventuele embryo's uit de trog en gebruikt u de plastic pipette om ze te verzamelen. Laat de embryo's in de bodem van de pipette bezinken en breng ze vervolgens over naar de herstelplak in een minimale hoeveelheid Tricaine. Incubeer de herstelplak gedurende één uur op 28 graden Celsius, voordat u de levensvatbare embryo's scheidt van dode embryo's en puin.
Incubeer de plak op 33 graden Celsius totdat deze klaar is voor scoren. Nadat een batch embryo's is verdoofd om te worden beoordeeld, plaatst u een verdoofde larve op een depressiemicroscoopglas in een druppel Tricaine. Oriënteer larven lateraal voor optimale beeldvorming van de caudale regio.
Plaats de dia op een samengestelde fluorescentiemicroscoop met een 10X objectieflens. Score de larven door het aantal kankercellen te tellen dat met succes uit de vaat is geïnvasieerd door op en neer te focussen door de staartregio om intacte cellen duidelijk te onderscheiden. Smelt 1,5% agarose Tricaine-oplossing en breng het op 37 graden Celsius.
Na het verdoven van de embryo's zoals eerder, brengt u een embryo in een druppel Tricaine-oplossing over naar het beeldvormingsoppervlak. Gebruik een glazen pipette om de overtollige Tricaine-oplossing te verwijderen en het embryo op het beeldvormingsoppervlak te behouden. Breng vervolgens één druppel gesmolten agarose-oplossing aan over het embryo.
Werk snel, voordat de agarose polymeriseert, gebruik een delicaat gereedschap zoals een wimperborstel om de embryo lateraal te oriënteren voor beeldvorming, en zorg ervoor dat de embryo plat langs het beeldvormingsoppervlak is. Wanneer de agarose-druppel is gepolymeriseerd, dompelt u deze onder in Tricaine-oplossing. Ten slotte onderwerpt u het levende zebravis-embryo aan microscopische beeldvorming.
Van de zeven borstkankercellijnen die zijn getest op hun vasculaire invasieve vermogen in zebravis-embryo's, vertoonde de MDA-MB-231-cellijn het grootste aantal extravasate kankercellen per embryo wanneer beoordeeld, 96 uur na injectie. Het werd ook waargenomen dat BT-474-cellen gemakkelijk in de caudale regio van de embryo's invasief waren, terwijl andere cellijnen zoals MCF-7, SK-BR-3 en T-47D-cellen minimaal invasief waren. In een aangepaste assay die een andere injectieplaats gebruikt, werd een concurrentie-experiment uitgevoerd waarbij twee populaties van MDA-MB-231-cellen, die verschillen in hun vasculaire invasieve vermogen, tegelijkertijd werden geïnjecteerd in de dooierzak van zich ontwikkelende embryo's.
Na het scoren werd vastgesteld dat MDA-MB-231-cellen die werden gepropageerd onder confluente kweekcondities vóór injectie, een vermindering vertoonden in intravasatie in de circulatie en daarom een verminderde aanwezigheid in de caudale regio van de embryo's. Eenmaal beheerst, kunnen de zebravis-embryo-injecties in vier uur worden gedaan als ze correct worden uitgevoerd
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze methode maakt gebruik van zebravisembryo's om de vasculair invasieve capaciteit van kankercellen efficiënt te testen. Fluorescerende kankercellen worden geïnjecteerd in de precardiale sinus of de dooierzak van embryo's in ontwikkeling, waarna hun vasculaire invasie via fluorescentiemicroscopie wordt beoordeeld.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Zebravissenembryo's bieden een model voor het bestuderen van het gedrag van kankercellen.
- Dit model maakt real-time observatie van de invasie van kankercellen mogelijk.
- Inzicht in vasculaire invasie is cruciaal voor onderzoek naar kankermetastase.
- De techniek biedt een sneller alternatief voor traditionele muismodellen.
Doel van de studie
- Om het maligne en invasieve gedrag van kankercellen te beoordelen.
- Om een cruciale stap in de metastatische cascade te modelleren.
- Om het vermogen van kankercellen om vanuit een functioneel circulatiesysteem te invaderen te evalueren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van kankercellen en zebravisembryo's.
- Injectie van fluorescerende kankercellen in embryo's.
- Beoordeling van vasculaire invasie via fluorescentiemicroscopie.
- Monitoring van het gedrag van kankercellen gedurende 24 tot 96 uur.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle visualisatie van invasie van kankercellen in zebravissenembryo's.
- Aantoonde de efficiëntie van het zebravismodel voor kankeronderzoek.
- Bood inzichten in de dynamiek van extravasatie van kankercellen.
- Kortere doorlooptijd in vergelijking met muismodellen.
Conclusies
- Het zebravissenbel embryo-model is effectief voor het bestuderen van cancerisinvasie.
- Deze methode kan onderzoek naar kankermetastasering versnellen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze techniek voor verdere inzichten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het beoordelen van vasculaire invasie van kankercellen in een fysiologisch relevant en toch high-throughput systeem pakt een kritieke flessenhals in het metastase-onderzoek aan. Het zebravissenbryo-model maakt een snelle functionele validatie van invasieve fenotypes mogelijk, wat bijdraagt aan het vroegtijdig minimaliseren van risico's bij targets en aan hypothese-gestuurde screening. Deze aanpak overbrugt de kloof tussen overgesimplificeerde in vitro assays en arbeidsintensieve zoogdiermodellen, waardoor er een voorspellende waarde ontstaat voor daaropvolgende preklinische prioritering.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & doelwitvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door te testen of kankercellen kunnen extravaseren vanuit een functioneel circulatiesysteem.
- Operationele waarde: Biedt een kwantitatieve readout van het invasieve vermogen binnen 96 uur, waardoor tijdlijnen voor targetvalidatie worden versneld.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt fenotypische screening om verbindingen of genetische modifiers te identificeren die vasculaire invasie onderdrukken.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert gestandaardiseerde, op fluorescentie gebaseerde resultaten die geschikt zijn voor automatisering en aanpassing naar multi-well platen.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gebruik van consistente injectieplaatsen en scorecriteria om een betrouwbare evaluatie van verbindingen over verschillende batches te garanderen.
- Schaalbaarheid: Maakt parallel testen van heterogene kankercelpopulaties mogelijk, zoals in competitie-assays, om de relatieve invasieve fitheid te beoordelen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Modelleert een geconserveerde stap in de metastatische progressie, waardoor bevindingen kunnen worden vertaald naar zoogdiersystemen.
- Translationele continuïteit: Resultaten kunnen worden gevalideerd in muismodellen, wat risicogebaseerde beslissingen over verdere ontwikkeling ondersteunt.
- Mechanistische risicoreductie: Helpt bij het blootleggen van moleculaire drijvers van extravasatie, wat bijdraagt aan de ontwikkeling van biomarkers en strategieën voor combinatietherapie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie en levert functioneel bewijs voor maligne eigenschappen voordat er aanzienlijke investeringen worden gedaan in leadoptimalisatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van invasieroutes en verduidelijkt mechanismen van intravasatie en extravasatie.
- Screening: Levert kwantitatieve, op imaging gebaseerde readouts die vergelijking van het invasieve potentieel tussen cellijnen of behandelingscondities mogelijk maken.
- Analytiek: Genereert telbare extravasatie-events per embryo, wat statistische analyse en hit-selectie in screeningcampagnes faciliteert.
- Translationeel onderzoek: Verbindt vroege invasieve fenotypen met preklinische validatie via geconserveerde metastatische stappen.
- Bedrijfbrede herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar platform voor het beoordelen van vasculaire invasie binnen oncologieprogramma's en therapeutische modaliteiten.
Operationele & bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit door genetische of farmacologische verstoringen te koppelen aan invasief gedrag in een gevasculariseerde context.
- Operationele waarde: Biedt standaardisatie, een korte doorlooptijd en lage resource-vereisten in vergelijking met muismodellen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door niet-invasieve kandidaten vroegtijdig te identificeren, waardoor het risico op falen in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van gevalideerd invasief potentieel.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met zebravissen, micro-injectie en fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van micro-injectieapparatuur, een onder druk staande gasbron en stereoscopische of samengestelde fluorescentiemicroscopen.
- Vereist gestandaardiseerde embryonale stadiëring, anesthesieprotocollen en scoringscriteria om consistentie tussen experimenten te waarborgen.
- Aanpassing aan verschillende kankertypes kan optimalisatie van celmarkering, injectievolume en incubatietemperatuur vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten restricties wat betreft de levensvatbaarheid van embryo's en de noodzaak van grondige training om de nauwkeurigheid van de scoring te handhaven.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Injecting Cancer Cells into the Pre-cardiac Sinus of Zebrafish Embryos
3:58
Scoring Extravasation
4:37
Mounting Embryos onto Slides and Subsequent Fluorescence Imaging
5:34
Results: Vascular Invasion of Cancer Cell Lines in Zebrafish Embryos
6:50
Conclusion
