Name: Twee Technieken om Hypoparathyroid Mice Maken: parathyroïdectomie Met behulp van GFP Klieren en difterie-toxine-Mediated bijschildklier Ablation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Leer twee methoden om muismodellen van verworven hypoparathyroïdie te maken: chirurgische parathyroïdectomie met GFP-geleide fluorescentie en selectieve ablatie via difterietoxine. Deze modellen behouden schildklierfunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de NIH subsidies R01-DK100584 en China State Key Laboratory Mondziekten Open Funding SKLOD2015OF01 (RB). Wij danken Wenping Zhao, Tadatoshi Sato, en Kelly Lauter om hulp.

Deze studie is goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van het Massachusetts General Hospital. Verkrijgen van passende institutionele goedkeuring voor dit dier studie voordat u begint. Sommige technieken zouden moeten worden aangepast aan lokale IACUC eisen. 1. GFP-PTX Muizen <ol><li> Verkrijgen PTHcre + muizen en Rosa-mTmG muizen op 8-10 weken oud voor verdere paring. </li><li> Terugkruising de PTHcre + muizen (gemengde 129; FVB achtergrond) met C57BL / 6-muizen gedurende 6 generaties muizen met C57BL / 6 achtergrond te verkrijgen. </li><li> Inteelt PTHcre + muizen PTHcre + / + muizen 17 te verkrijgen. OPMERKING: Om genotypering uit te voeren, halen het DNA uit het puntje van de staart en het gebruiken voor PCR. De PCR-primers als volgt controleren heterozygotie en homozygotie van de PTHcre transgene zijn: forward primer A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, reverse primer A &#39;, TCAGATCACACCACACAGCA, forward primer B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, reverse primer B &#39;, GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17. </li><li> Cross PTHcre + / + muizen 16 met Rosa-mTmG muizen 18. Spenen PTHcre; mTmG pups toen 4 weken oud. </li><li> Verdoven 8-10 weken oud PTHcre; mTmG muizen door ip injectie van tribroomethanol (Avertin) bij 0,6 mg / g lichaamsgewicht, of andere middelen zoals ketamine / xylazine. Gebruik buprenorfine 0,1 mg / kg sc elke 12 uur als een pijnstillend middel 48 uur na de operatie volgens een goedgekeurd protocol. Zorgen voor passende diepte van de anesthesie door de teen knijpen terugtrekking reflex of andere middelen. Plaats het dier in rugligging. </li><li> Uit te breiden en de voorbereiding van de ventrale halsgebied door het scheren van de huid met behulp van enkele rand messen. Ontsmet de geschoren huid met een povidonjodium antiseptische pad. </li><li> Bedek het dier met steriele chirurgische afdekdoeken om verontreiniging van de operatieplaats deze en gebruik geautoclaveerd microsurgical instrumenten voor de chirurgische ingreep. </li><li> Snijd een 2 cm longitudinale incisie in de huid met een chirurgische scalpel. Ontleden fascia en duw de speekselklieren aan de kant door stompe dissectie met gebogen gekartelde tang. </li><li> Onder de dissectie microscoop met halogeenlicht en een 4 - 5x vergroting, knippen en scheiden de paratracheale spieren met behulp van scherpe tang tips en bloot de luchtpijp. </li><li> Identificeer de schildklier met de rechter en linker kwab naast de luchtpijp. </li><li> Schakel de lichtbron om tl-licht en visualiseren van de twee groene-fluorescerende bijschildklieren. OPMERKING: Gewoonlijk worden de twee bijschildklieren bij of nabij het oppervlak van de schildklier, maar soms zijn ze zich verder weg. </li><li> Haal de groene bijschildklieren met behulp van chirurgische pincet en schaar. Gebruik steriel gaasje voor hemostase en zorgvuldig te controleren langs de luchtpijp om ervoor te zorgen dat alle groene weefsel is verwijderd. </li&gt; <li> Sluit de paratracheale spieren door onderbroken hechtdraad met behulp van 6-0 polyglactin 910 hechtingen. Sluit de incisie in de huid door Halsted hechtdraad met behulp van 6-0 polyglactin 910 hechtingen. </li><li> Optioneel: Injecteer 10 ul / g lichaamsgewicht normale steriele 0,9% natriumchlorideoplossing de muizenmaagjes vloeistofvervanging. </li><li> Plaats postchirurgische dieren een aparte kooi op een warme incubator (37 ° C) gedurende lichaamstemperatuur herstel. Zodra de muizen zijn wakker en in de liggende positie, zet pellet chow en water met wat gelatine eten op de kooi vloer. </li><li> Na een postsurgical observatie periode van 2 uur, terug muis om het dier faciliteit en volg de lokale voorschriften voor postoperatieve zorg. </li><li> 3 dagen na parathyroïdectomie, het verkrijgen van 10 pi staart bloed en geïoniseerd Ca ++ met behulp van een analysator te meten, zoals het bloed gas systeem Ca ++ / pH-analyzer. Succesvolle parathyroïdectomie resultaten in het bloed geïoniseerd Ca ++ gelijk of lager dan -2SD van schijn-geopereerde control muizen (1,20 mmol / l in onze experimenten n = 30). </li></ol> 2. PTH-Cre-muizen iDTR <ol><li> Verkrijgen PTHcre + en DTR fl / fl muizen op 8-10 weken oud om te paren. </li><li> Terugkruising de PTHcre muizen (gemengde 129; FVB achtergrond) met C57BL / 6-muizen gedurende 6 generaties muizen met C57BL / 6 achtergrond te verkrijgen. </li><li> Inteelt de PTHcre + (C57BL / 6 achtergrond) muizen PTHcre + / + muizen 17 te verkrijgen. LET OP: Voor het uitvoeren van genotypering, DNA van muizen staart tips werd geëxtraheerd en gebruikt voor PCR. Genotypering primers: voorwaartse primer A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, reverse primer A &#39;, TCAGATCACACCACACAGCA, forward primer B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, reverse primer B&#39;, GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17. </li><li> Mate PTHcre + / + muizen 16 met DTR fl / fl muizen 19 tot PTHcre-iDTR muizen te verkrijgen. </li><li> Bereid DT-oplossing door verdunning diphtherieen toxine poeder met steriele zoutoplossing tot een concentratie van 0,5 ug / ml. Steriel filter en bewaar monsters bij -80 ° C. </li><li> Kies 8-10 weken oud PTHcre-iDTR muizen voor injectie experiment. Dooi DT monster tot kamertemperatuur toedienen DT intraperitoneaal in 5 ug / kg (10 ul / g) lichaamsgewicht van het dier. Voor maximale efficiëntie en toxiciteit minste wordt DT toediening herhaald voor een totaal van 2 injecties in een 3-daags interval 17. </li><li> 3 dagen na de tweede injectie, neemt 10 pi staart bloed van elke PTHcre-iDTR / PTHcre-iDTR-mTmG muis en meet bloed Ca ++ met behulp van een Blood Gas Systeem Ca ++ / pH-analyzer. OPMERKING: We definiëren muizen bloed geïoniseerd Ca ++ lager dan 1,18 mmol / L als hypoparathyroid muizen, 2SD gelijk onder het gemiddelde van het voertuig geïnjecteerde controlemuizen (n = 22). </li></ol>

<ol><li>Brandi, M. L., Brown, E. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrandi%2C+ML+%22Hypoparathyroidism%22">Hypoparathyroidism</a>. , Springer. (2015).</li>
<li>van Abel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+control+of+renal+Ca%282%2B%29+transport+proteins+by+parathyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Coordinated control of renal Ca(2+) transport proteins by parathyroid hormone.</a> Kidney Int. 68, 1708-1721 (2005).</li>
<li>Sebastian, E. M., Suva, L. J., Friedman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+intermittent+PTH%281-34%29+and+PTH%287-34%29+on+bone+microarchitecture+and+aortic+calcification+in+experimental+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Differential effects of intermittent PTH(1-34) and PTH(7-34) on bone microarchitecture and aortic calcification in experimental renal failure.</a> Bone. 43, 1022-1030 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Ortiz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+deficiency+reduces+circulating+levels+of+FGF23%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Calcium deficiency reduces circulating levels of FGF23.</a> J Am Soc Nephrol. 23, 1190-1197 (2012).</li>
<li>Liao, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+Fibroblast+Growth+Factor+23+and+Biochemical+and+Bone+Histomorphometric+Alterations+in+a+Chronic+Kidney+Disease+Rat+Model+Undergoing+Parathyroidectomy%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Relationship between Fibroblast Growth Factor 23 and Biochemical and Bone Histomorphometric Alterations in a Chronic Kidney Disease Rat Model Undergoing Parathyroidectomy.</a> PloS one. 10, e0133278(2015).</li>
<li>Fox, J., Care, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+low+calcium+and+low+phosphorus+diets+on+the+intestinal+absorption+of+water+in+intact+and+parathyroidectomized+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Effect of low calcium and low phosphorus diets on the intestinal absorption of water in intact and parathyroidectomized pigs.</a> Calcif Tissue Int. 31, 253-255 (1980).</li>
<li>Finco, D. R., Brown, S. A., Ferguson, D. C., Crowell, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+parathyroidectomy+of+the+dog%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Selective parathyroidectomy of the dog.</a> Can J Vet Res. 57, 288-292 (1993).</li>
<li>Can, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parathyroid+allotransplantation+in+rabbits+without+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Parathyroid allotransplantation in rabbits without cultivation.</a> Int J Clin Exp Med. 7, 280-284 (2014).</li>
<li>Dunn, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoblasts+in+the+stroma+of+the+parathyroid+glands+of+strain+C58+mice%5BTitle%5D)+AND+%22j+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Melanoblasts in the stroma of the parathyroid glands of strain C58 mice.</a> j Natl Cancer Inst. 10, 725-733 (1949).</li>
<li>CRIVER. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.criver.com/products-services/basic-research/rodent-surgery/soft-tissue-procedures">http://www.criver.com/products-services/basic-research/rodent-surgery/soft-tissue-procedures</a> (2010).</li>
<li>Sakai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+development+in+immobilized+bone+is+suppressed+by+parathyroidectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Metab%22%5BJournal%5D)">Osteoclast development in immobilized bone is suppressed by parathyroidectomy in mice.</a> J Bone Miner Metab. 23, 8-14 (2005).</li>
<li>Miao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+abnormalities+in+Pth-null+mice+are+influenced+by+dietary+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Skeletal abnormalities in Pth-null mice are influenced by dietary calcium.</a> Endocrinology. 145, 2046-2053 (2004).</li>
<li>Gunther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+ablation+of+parathyroid+glands+reveals+another+source+of+parathyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic ablation of parathyroid glands reveals another source of parathyroid hormone.</a> Nature. 406, 199-203 (2000).</li>
<li>Hough, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+calcium-sensing+receptor+mutation+in+the+mouse+is+associated+with+cataracts+and+ectopic+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activating calcium-sensing receptor mutation in the mouse is associated with cataracts and ectopic calcification.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13566-13571 (2004).</li>
<li>Hannan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Calcilytic+Agent+NPS+2143+Rectifies+Hypocalcemia+in+a+Mouse+Model+With+an+Activating+Calcium-Sensing+Receptor+%28CaSR%29+Mutation%3A+Relevance+to+Autosomal+Dominant+Hypocalcemia+Type+1+%28ADH1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The Calcilytic Agent NPS 2143 Rectifies Hypocalcemia in a Mouse Model With an Activating Calcium-Sensing Receptor (CaSR) Mutation: Relevance to Autosomal Dominant Hypocalcemia Type 1 (ADH1).</a> Endocrinology. 156, 3114-3121 (2015).</li>
<li>Libutti, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parathyroid+gland-specific+deletion+of+the+mouse+Men1+gene+results+in+parathyroid+neoplasia+and+hypercalcemic+hyperparathyroidism%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Parathyroid gland-specific deletion of the mouse Men1 gene results in parathyroid neoplasia and hypercalcemic hyperparathyroidism.</a> Cancer Res. 63, 8022-8028 (2003).</li>
<li>Bi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphtheria+Toxin-+and+GFP-Based+Mouse+Models+of+Acquired+Hypoparathyroidism+and+Treatment+with+a+Long-Acting+Parathyroid+Hormone+Analog%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Diphtheria Toxin- and GFP-Based Mouse Models of Acquired Hypoparathyroidism and Treatment with a Long-Acting Parathyroid Hormone Analog.</a> J Bone Miner Res. , (2015).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
<li>Buch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-inducible+diphtheria+toxin+receptor+mediates+cell+lineage+ablation+after+toxin+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A Cre-inducible diphtheria toxin receptor mediates cell lineage ablation after toxin administration.</a> Nat Methods. 2, 419-426 (2005).</li>
<li>Dunn, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoblasts+in+the+stroma+of+the+parathyroid+glands+of+strain+C58+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Melanoblasts in the stroma of the parathyroid glands of strain C58 mice.</a> J Natl Cancer Inst. 10, 725-733 (1949).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

We tonen de techniek van GFP geleide parathyreoïdectomie transgene muizen met GFP expressie selectief in de bijschildklieren. In de PTHcre, mTmG muizen, dubbele fluorescentie (groen GFP-expressie van Cre cellen en rode tomaten in niet-Cre tot expressie cellen) konden wij duidelijk aan, en nauwkeurig alle bijschildklieren verwijderen zonder de schildklieren. Terwijl we de voorkeur aan het gebruik van de dubbele-fluorescentie mTmG muizen voor de mogelijkheid om fluorescerend rood non-bijschildklierweefsel identificeren, moeten onze procedure ook goed werken met behulp van enkele fluorescerende dieren zoals de tomaat rood (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) Hze / J) muis. De procedure is relatief gemakkelijk uit te voeren, vereist ongeveer 20 minuten per muis, en resulteert in een ernstige en aanhoudende hypoparathyroid fenotype. Bovendien is een ander voordeel van de GFP-positieve bijschildklieren is het gemak van detecteren van afwijkende bijschildklieren. Onze studies tonen aanmislocalisatie van de bijschildklieren op ongeveer een kwart van B6 muizen (figuur 1), die gemakkelijk in onze muismodel worden gedetecteerd door de groene fluorescentie. Anders dan thyro-parathyreoïdectomie, onze techniek vermijdt de verwijdering van de schildklier met daaropvolgende noodzaak schildklierhormonen en het onbekende effect van verwijdering van de schildklier calcitonine producerende C-cellen. Fluorescent gelabelde bijschildklieren kan ook worden gebruikt voor andere onderzoeken die de isolatie van de bijschildklieren nodig. De beperking van dit model omvat de vereiste operatie. Basic microchirurgie vaardigheden en een dissectie microscoop met een fluorescerende lichtbron nodig. Een tweede techniek voor het genereren hypoparathyroid muizen die de noodzaak van chirurgie elimineert aangetoond. Difterietoxine-behandelde PTHcre-iDTR muizen vertonen een milder hypoparathyroïdie fenotype, maar gewoon voor dat het injecteren van DT intraperitoneaal in de muis. De kritische deel for genereren dit model werd de optimalisatie van de dosis en het doseringsschema. Hoge doses DT tot toxiciteit maar lage doses verlaagde de werkzaamheid van de benadering. We hebben vastgesteld dat de dosis regiment 2 injecties met 5 ug / kg, toegediend 3 dagen na elkaar, resulteerde in betrouwbaar en stabiel hypocalcemie geen / minimale mortaliteit. Uiteindelijk hopen we dat deze twee benaderingen leveren nuttige muismodellen voor verworven hypoparathyreoïdie. Volgens een nieuw langwerkend PTH rapporteerden wij het eerste gebruik van beide modellen het bepalen van de effectiviteit van nieuwe geneesmiddelen voor hypoparathyreoïdie 17.

Sinds de eerste systematische beschrijving van de bijschildklieren in menselijke en in verschillende andere soorten van Sandström in 1880 1, kan begrijpen wat deze kleine endocrien orgaan voor menselijke fysiologie met voortdurend verbeterd. Bijschildklieren scheiden bijschildklierhormoon (PTH), de belangrijkste regulator van calcium metabolisme. PTH is een belangrijke hormoon op fosfaat homeostase en botturnover 1, 2. Per ongeluk verwijderen of beschadiging van de bijschildklieren tijdens de hals chirurgie is de meest voorkomende oorzaak van hypoparathyreoïdie, een ziekte die wordt gekenmerkt door een lage bloed calcium, lage PTH, en verhoogde fosfor 1. Om beter studie hypoparathyroïdie en testen van nieuwe therapieën, betrouwbare en gemakkelijk toegankelijke muismodellen nodig verworven. Muizen worden veel gebruikt in onderzoek, omdat een groot aantal genetische hulpmiddelen zijnvailable in deze soort toelaat verfijnde mechanistische studies in vivo. Hoewel chirurgische parathyroïdectomie (PTX) kan worden gebruikt bij ratten 2, 3, 4, 5, en grotere zoogdieren 6, 7, 8, het technische uitdaging bij muizen vanwege de kleine omvang van de klieren en hun variabele anatomische verdeling 9. Daarom is thyro-parathyroïdectomie (TPTX) typisch uitgevoerd bij muizen, waarbij de schildklier en bijschildklieren elkaar 10 verwijderd. Echter, lage schildklierhormoon niveaus zijn een potentiële confounder in experimenten, complicerende dit model. Bovendien worden C-cellen in de schildklier, die calcitonine, een hormoon belangrijke calcium homeostase in knaagdieren, produceren ook verloren na verwijdering van de driyroids 11. Verschillende genetische muismodellen van hypoparathyroïdie bestaan die de PTH-null muis 12, de GCM2-null muis 13, en de Nuf muis met een activerende mutatie in het calcium receptor (CASR) 14, 15 omvatten. Echter, deze genetische defecten reeds tijdens de embryonale ontwikkeling aanwezig, en de functie van de bijschildklieren is derhalve reeds tijdens embryogenese aangetast. Dit kan invloed hebben op de ontwikkeling van organen zoals het skelet. Dit in tegenstelling tot patiënten met postoperatieve hypoparathyroidism die de ziekte op latere leeftijd verwerven. Bovendien zijn sommige muismodellen vertonen vroegtijdige sterfte en verminderde vruchtbaarheid, die het gebruik 12, 13, 14 verder compliceert. We ontwikkelden twee nieuwe muis modellen voor verworven hypoparathyreoïdie. Met behulp van genetisch gemanipuleerde muizen die GFP tot expressie specifiek in de bijschildklieren kan de bijschildklieren gemakkelijke identificatie voor chirurgische verwijdering zonder de schildklier. Deze muis werd geproduceerd door het kruisen van de PTH-Cre muizen, waarin Cre recombinase tot expressie brengt onder de controle van de 5,5 kb promotor PTH 16 met ROSA mTmG muis. De resulterende PTHcre; mTmG muizen uitdrukken groen fluorescerend eiwit specifiek in parathyroïde cellen. De tweede muismodel gebruikt dezelfde PTH-Cre, dit keer naar een STOP cassette uit de induceerbare DTR muis specifiek verwijderen, wat resulteert in expressie van het difterietoxine receptor in de bijschildklieren. Systemische toediening van DT vernietigt parathyroïde cellen, waardoor de dieren hypoparathyroid zonder operatie. De twee muismodellen die in deze studie tonen een stabiele hypocalcemische fenotype over de drie maanden durende observatie period. De procedures zijn eenvoudig uit te voeren, het fenotype is reproduceerbaar, en de hypoparathyroid muizen vertonen een hoge overlevingskans 17.

<table><tbody><tr><td>ROSAmT/mG muizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>7676</td><td></td></tr><tr><td>PTH-Cre muizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5989</td><td></td></tr><tr><td>iDTRmuizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>7900</td><td></td></tr><tr><td>6-0 polyglactin 910 hechtdraad met naald</td><td>Ethicon, Inc</td><td>J510G</td><td></td></tr><tr><td>Veiligheidsmesjes met enkele scherpe rand</td><td>American Safety Razor Company</td><td>66-0089</td><td></td></tr><tr><td>Wegwerp scalpel</td><td>Feather Safety Razor Co., LTD</td><td>72042-11</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-jodium preparaat pads</td><td>Dynarex Corporation</td><td>1108</td><td></td></tr><tr><td>Gaasverband</td><td>Busse. Inc</td><td>BHD707</td><td></td></tr><tr><td>0,9% natriumchloride-oplossing</td><td>HOSPIRA Worldwide, Inc</td><td>07983-09</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 29 G insulinespuit</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>329622</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische sneetuigen</td><td>3M</td><td>6640EZ</td><td></td></tr><tr><td>Dumstar biologie pincetten</td><td>Roboz Surgical Instrument Co., Inc</td><td>RS-4984</td><td></td></tr><tr><td>Micro-dissectieveer schaar</td><td>Roboz Surgical Instrument Co., Inc</td><td>RS-5605</td><td></td></tr><tr><td>Naaldhouder</td><td>MILTEX.,Inc</td><td>V98-42</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-Tribroomethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyl-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>Voor het oplossen van de 2,2,2-Tribroomethanol</td></tr><tr><td>Difterietoxinepoeder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0564</td><td>Oplossen in 0,9% natriumchloride-oplossing bij 1 mg/mL als de stamoplossing bij -80 &#176;C</td></tr><tr><td>Multicap bloedopname capillaire buisjes</td><td>Siemens Healthcare Diagnostics Ltd</td><td>855578</td><td>Voor het verzamelen van bloed in iCa2+ analyse met behulp van RapidLab 348 Ca2+/pH analyzator</td></tr><tr><td>RapidLab 348 Ca2+/pH analyzator</td><td>Siemens Healthcare</td><td></td><td>Voor iCa2+ analyse</td></tr></tbody></table>

twee technieken om hypoparathyroid mice maken: parathyroïdectomie met behulp van gfp klieren en difterie-toxine-mediated bijschildklier ablation

Two Techniques to Create Hypoparathyroid Mice: Parathyroidectomy Using GFP Glands and Diphtheria-Toxin-Mediated Parathyroid Ablation

Hypoparathyreoïdie (HP) is een aandoening die wordt gekenmerkt door lage niveaus van PTH, wat leidt tot hypocalciëmie, hyperfosfatemie en een lage botomzet. De meest voorkomende oorzaak van de ziekte is de onbedoelde verwijdering van de bijschildklieren tijdens een schildklieroperatie. Er zijn nieuwe therapieën voor HP nodig, maar om deze te testen zijn betrouwbare diermodellen van verworven HP nodig.
Hier demonstreren we de generatie van twee muismodellen van verworven HP. In het GFP-PTX-model werden muizen met groen fluorescerend proteïne (GFP) specifiek in de bijschildklieren (PTHcre-mTmG) gecreëerd door PTHcre+ muizen te kruisen met Rosa-mTmGfl/fl muizen. Groen fluorescerende bijschildklieren zijn gemakkelijk te identificeren onder een fluorescentie dissectiemicroscoop en parathyreoïdectomie wordt uitgevoerd in minder dan 20 minuten. Na door fluorescentie geleide chirurgie zijn muizen uitgesproken hypocalcemisch. In tegenstelling tot de traditionele thyro-parathyreoïdectomie, laat deze nauwkeurige chirurgische aanpak de schildklier en de schildklierfunctie intact. Het tweede model, dat geen chirurgie vereist, is gebaseerd op een difterie-toxine aanpak. PTHcre-iDTR muizen, die het difterietoxine (DT) receptor specifiek in de bijschildklieren tot expressie brengen, werden gegenereerd door de inductible DTR muis te kruisen met de PTHcre muis. Bijschildkliercellen worden dus gevoelig voor difterietoxine (DT) en kunnen selectief worden vernietigd door muizen systemisch te injecteren met DT. Het resulterende hypocalcemische fenotype is stabiel.

Ligging van de bijschildklieren Eerst namen we de verdeling van de bijschildklieren van 54 PTHcre-mTmG muizen waargenomen onder de fluorescerende dissectie microscoop. 74% (40/54) muizen hadden twee groene bijschildklieren (Figuur 1 A, C, E), 26% (14/54) muizen hadden een extra derde bijschildklier (Figuur 1B, D, F). Geen muis met een klier of meer dan drie klieren waargenomen. Meestal bijschildklieren zijn gelegen nabij de bovenrand van de schildklier (58%, 71/122 Figuur 1A (1,2) B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3)). 27% (33/122) klieren zijn gelegen nabij de onderrand van de schildklier (figuur 1C (1), D (3), F (1)) en 13% (16/122) werden van de t gelegenhyroid gland (Figuur 1B (3), E (1), F (2)). Onze bevindingen komen overeen met en uit te breiden eerdere bevindingen van verschillende locaties van de bijschildklieren 20. GFP-PTX Muizen De hele operatie uit narcose tot het sluiten van de huid incisie duurde ongeveer 20 minuten per muis. De overlevingskans van postoperatieve muizen gedurende een 3-maanden observatieperiode was 96,3% (53/55). 92,4% (49/53) GFP-PTX muizen vertoonden geïoniseerd calcium niveaus die 2 SD onder het gemiddelde van schijn-geopereerde controle muizen of lager waren. De hypoparathyroid fenotype in de GFP-PTX muizen (hypocalcemie, lage PTH en verhoogde serum fosfaat) was stabiel gedurende de gehele observatieperiode van 3 maanden. Belangrijker schildklierfunctie niet verschilde van schijn-geopereerde dieren 3 maanden na de operatie (TSH = 42 ± 24 tegenover 30 ± 15 mU / l, p = 0,171; T4 = 30,0 ± 0,6 vs. 3,1 ± 0,9 ug / dl, p = 0,707 (figuur 2). PTH-cre-iDTR Muizen DT geïnjecteerd PTH-Cre-iDTR muizen ontwikkelden hypoparathyroïdie (lage bloed geïoniseerd calcium, verhoogde bloed fosfor en ten onrechte een lage normale PTH niveaus). We hebben eerder gemeld dat enkele PTH positieve cellen ontsnappen aan de ablatie van difterietoxine, waarin de meetbare circulerend PTH en daarom enigszins mildere fenotype van deze muizen 17. Hypoparathyroïdie in GFP-PTX Muizen en PTH-cre-iDTR Muizen Aanzienlijke vermindering van het bloed Ca ++ en serum PTH-niveaus werden waargenomen in GFP-PTX muizen 3 dagen na de operatie, in vergelijking met niveaus gevonden in schijn-geopereerde muizen (Ca ++ = 1,05 ± 0,40 vs. </em&gt; 1,30 ± 0,03 mmol / l, p &lt;0,05; PTH = 32 ± 22 vs. 580 ± 137 pg / ml, p &lt;0,05). De hypoparathyroïdie fenotype was stabiel over de 3-maanden observatieperiode (figuur 3A, met toestemming van (referentie # 17)). Na 2 injecties met 5 ug / kg DT 3 dagen interval dosis en regime geoptimaliseerd om zo weinig mogelijk DT om de maximale hypoparathyroid fenotype geven de DT geïnjecteerd-PTH cre-iDTR muizen vertoonden significante hypocalcemie en verlaagde PTH ten opzichte voertuig controle muizen, die in de 90 dagen observatieperiode bleef (Ca ++ = 1,10 ± 0,07 mmol / l versus 1,26 ± 0,05 mmol / l, p &lt;0,05; PTH = 218 ± 156 pg / ml versus 572 ± 164 pg / ml, p &lt;0,05) (Figuur 3B, met toestemming van (referentie # 17)). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig1.jpg" /> Figuur 1: <strong&gt; Vertegenwoordiger Beelden van de verschillende locaties van de bijschildklieren in 54 PTHcre-mTmG Muizen bij TL Dissection Microscope. Muizen hadden hetzij twee (A, C, E) of drie (B, D, F) groene bijschildklieren. Meest bijschildklieren zijn gelegen nabij de bovenrand (A (1,2) B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3) of nabij de onderrand van de schildklier (C (1), D (3), F (1)). In zeldzame gevallen, sommige waren ectopisch gelegen (B (3), E (1), F (2)). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55010/55010fig1large.jpg" target="_blank">klik hier om bekijk een grotere versie van dit cijfer.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig2.jpg" /> Figuur 2: TSH en T4 niveau van GFP-PTX Muizen. 3 maanden na GFP-PTX werd serum verkregen voor TSH en T4 measurem<html> enten. GFP-PTX muizen TSH (42 ± 24 mU / L) (A) en T4 concentraties (3,0 ± 0,6 ug / dl) (B) die niet verschilt van controlemuizen (TSH = 30 ± 15 mU / L, p waren = 0,171, n = 11, T4 = 3,1 ± 0,9, p = 0,707, n = 11). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55010/55010fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig3.jpg" /> Figuur 3: Blood Ca ++ en PTH Levels in GFP-PTX Muizen en DT geïnjecteerd-PTH Cre-iDTR Muizen. Zowel GFP-PTX muizen (A) en DT-PTH geïnjecteerd cre-iDTR muizen (B) vertoonden stabiele hypocalcemie en verlaagde PTH niveaus gedurende 3 maanden observatieperiode (N = 6-8, *** p &lt;0,001) (herdrukt met toestemming van referentie # 17).es / ftp_upload / 55010 / 55010fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Muizen met verworven hypoparathyreoïdie zouden nuttig zijn voor het bestuderen van nieuwe medicamenteuze behandelingen voor hypoparathyreoïdie. Er worden twee procedures gedemonstreerd om dergelijke muizen te creëren. De GFP-PTX muis wordt gegenereerd door chirurgische parathyreoïdectomie geleid door groen fluorescerende bijschildklieren. Een tweede, niet-chirurgische benadering is gebaseerd op parathyreoïde-specifieke expressie van de difterietoxine-receptor.

Twee Technieken om Hypoparathyroid Mice Maken: parathyroïdectomie Met behulp van GFP Klieren en difterie-toxine-Mediated bijschildklier Ablation

Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most ...

Het algemene doel van deze procedure is om twee muismodellen van verworven hypoparathyreoïdie te genereren die gebruiksvriendelijk zijn, een stabiel fenotype produceren en de schildklierfunctie intact laten. Het belangrijkste voordeel van deze twee modellen is dat ze de precieze verwijdering van de bijschildklieren bij muizen mogelijk maken, ofwel door fluorescentie-gestuurde chirurgie, of door PTH-specifieke expressie van de difterietoxine-receptor, waardoor de cellen selectief kunnen worden getarget en vernietigd zonder de aangrenzende schildklier te beïnvloeden. We hopen dat onze muismodellen in staat zullen zijn om cruciale vragen op het gebied van hypoparathyreoïdie te beantwoorden.Kunnen PTH-analoge therapieën bijvoorbeeld helpen om normale serumcalciumspiegels te behouden zonder de urinaire calciumuitscheiding te verhogen? Deze modellen kunnen ook worden gebruikt om andere klinische vragen bij hypoparathyreoïdie te bestuderen. Wordt de botsterkte bijvoorbeeld beïnvloed door hypoparathyreoïdie en verandert deze na behandeling?Dergelijke vragen zijn moeilijk te beantwoorden bij patiënten, maar deze muismodellen kunnen worden gebruikt om ze aan te pakken. Begin met het anesthetiseren van muizen van acht tot 10 weken oud die GFP specifiek in de bijschildklieren tot expressie brengen, volgens een goedgekeurd protocol. Plaats het dier in rugligging en bevestig een adequate diepte van de anesthesie door de afwezigheid van een terugtrekreflex bij een knijptest van de teen of via andere middelen.Rek de ventrale halsregio uit en bereid de operatie voor door de vacht weg te scheren. Desinfecteer de geschoren huid met een povidonjodium-antiseptisch doekje en bereid vervolgens de incisielocatie voor met een chirurgische scrub en een alcoholspoeling volgens uw goedgekeurde protocol. Dek daarna het dier af met steriele chirurgische doeken om contaminatie van de operatieplaats te verminderen.Maak na het zetten van een longitudinale incisie van 2 centimeter met een chirurgisch scalpel gebruik van gebogen, gekartelde pincetten om de fascia te dissekeren en duw de speekselklieren opzij. Gebruik vervolgens, terwijl de operatieve plaats door een dissectiemicroscoop wordt bekeken, de punten van scherpe pincetten om de paratracheale spieren door te snijden en te scheiden, zodat de trachea zichtbaar wordt. Identificeer de rechter- en linkerlob van de schildklier die zich naast de trachea bevinden.Schakel vervolgens de lichtbron over naar fluorescent licht en visualiseer de twee groen fluorescentie vertonende bijschildklieren. Knaagdieren hebben doorgaans slechts twee bijschildklieren. Als u de twee bijschildklieren naast de schildklier aan elke zijde niet kunt identificeren, moet er worden gedacht aan ectopisch gelegen bijschildklieren en moet er een zorgvuldige zoektocht naar deze langs de trachea worden uitgevoerd.Gebruik vervolgens een chirurgische pincet en een schaar om de groene bijschildklieren voorzichtig te verwijderen en controleer zorgvuldig langs de trachea om er zeker van te zijn dat al het groene weefsel is verwijderd. Gebruik steriel gaas voor hemostase. Sluit de paratracheale spieren met onderbroken hechtingen.Sluit de huidincisie met Halstead-hechtingen. Plaats het dier na de operatie in een aparte kooi op een warmtepad voor het herstel van de lichaamstemperatuur. Zodra de muis wakker is, plaatst u pelletvoer en water met wat gelatinevoedsel op de bodem van de kooi.Keer na een postoperatieve observatieperiode van twee uur terug met de muis naar de dierfaciliteit. Analyseer drie dagen na de parathyreoïdectomie 10 µL staartbloed op geïoniseerd calcium met behulp van een analyseapparaat, zoals een bloedgas-systeem, calcium- en pH-analyseapparaat. Als de parathyreoïdectomie succesvol is, zal het geïoniseerde calcium in het bloed gelijk zijn aan of lager zijn dan min twee standaarddeviaties van dat van de sham-geopereerde controlemuizen.Begin met het bereiden van een difterietoxine-oplossing door difterietoxine-poeder te verdunnen met steriele zoutoplossing tot een concentratie van 0,5 micrograms per milliliter. Filter de oplossing steriel en verdeel deze in aliquots. Injecteer vijf micrograms per kilogram lichaamsgewicht difterietoxine in muizen van acht tot 10 weken oud die de difterietoxine-receptoren specifiek in de bijschildklieren tot expressie brengen.Analyseer drie dagen na een tweede injectie van difterietoxine 10 µL staartbloed op geïoniseerd calcium, zoals eerder beschreven. De volgende beelden zijn representatief voor de diverse locaties van de bijschildklieren bij muizen die GFP specifiek in de bijschildklier tot expressie brengen. De muizen hadden twee of drie groene bijschildklieren.De meeste bijschildklieren waren gelegen nabij de superieure rand of nabij de inferieure rand van de schildklier. In zeldzame gevallen waren sommige bijschildklieren ectopisch gelegen. Een van de voordelen van ons muismodel is dat de schildklier intact blijft.Deze figuur toont de TSH-spiegels van GFP-PTX-muizen drie maanden na parathyreoïdectomie. Deze figuur toont de T4-metingen. GFP-PTX-muizen vertonen TSH-concentraties en T4-concentraties die niet verschilden van die van de controlemuizen.Deze afbeelding toont de bloedcalciumspiegels en PTH-spiegels in GFP-PTX-muizen. Deze afbeelding toont de bloedcalciumspiegels en PTH-spiegels in PTHcre-iDTR-muizen die zijn geïnjecteerd met difterietoxine. Zowel de GFP-PTX-muizen als de met DT geïnjecteerde PTHcre-iDTR-muizen vertoonden een stabiele hypocalciëmie en verlaagde PTH-spiegels over een observatieperiode van drie maanden.Zodra de techniek onder de knie is, kan de GFP-geleide parathyroïdectomie in ongeveer 20 minuten voor de gehele procedure worden uitgevoerd. Een enkele injectie met difterietoxine neemt niet meer dan een minuut in beslag als deze correct wordt uitgevoerd. Na deze procedure ontwikkelen deze muizen hypoparathyreoïdie en kunnen ze worden gebruikt als preklinisch ziektemodel.Vragen kunnen worden beantwoord zoals de effectiviteit van verschillende PTH-hormoonanalogen bij de behandeling van hypoparathyreoïdie. Houd er rekening mee dat difterietoxine gevaarlijk is en dat medewerkers de gebruikelijke immunisaties tegen difterietoxine moeten hebben. Persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals maskers en handschoenen, moeten altijd worden gedragen tijdens het uitvoeren van deze procedures.

two-techniques-to-create-hypoparathyroid-mice-parathyroidectomy-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video describes the procedure for orthotopic inoculation of thyroid cancer cells into the thyroid gland of mouse models, which may then serve as a valuable platform to assess carcinogenesis and discover potential treatment strategies.

Orthotopic Inoculation of Thyroid Cancer Cells into Murine Thyroid: A Procedure to Establish Orthotopic Thyroid Cancer Mouse Model

Generatie van een orthotope muismodel van anaplastisch schildkliercarcinoom wordt hier beschreven. Deze techniek maakt chirurgische plaatsing van menselijk anaplastisch schildklierkanker cellen in de schildklier van immunodeficiënte muizen, waardoor een meer klinisch relevante instelling van ziekteprogressie en screen vernieuwende therapeutische interventies bestuderen.

Een orthotope Muis Model van Anaplastisch Schildklier Carcinoom

Opklaren is een krachtige tool waarmee beeldvorming verschillende biologische processen in levende dieren. In dit artikel presenteren we een gedetailleerde werkwijze voor het afbeelden van de dynamiek van subcellulaire structuren, zoals de secretoire granules in de speekselklieren van levende muizen.

Intravitale Microscopy for Imaging Subcellulaire Structuren in Levende muizen die fluorescerende eiwitten

Dit artikel bevat een bijgewerkte aanpak van de klassieke kwartel-kip chimera systeem te bestuderen van de vorming van het orgel, door het combineren van nieuwe in vitro en in ovo experimentele procedures.

De aanpak in twee stappen om te verkennen van de vroege - en Late-stadia van de vorming van het orgel in de aviaire Model: de zwezerik en de bijschildklier klieren organogenese paradigma

Tot op heden wordt de ontwikkeling van bijschildklier (PG) identificatiemethoden beperkt door het gebrek aan diermodellen in preklinisch onderzoek. Hier stellen we een eenvoudig en effectief rattenmodel op voor intraoperatieve PG-beeldvorming en evalueren we de effectiviteit ervan door ijzeroxidenanodeeltjes te gebruiken als een nieuw PG-contrastmiddel.

Oprichting van een eenvoudig en effectief rattenmodel voor intraoperatieve beeldvorming van bijschildklieren

Hier presenteren we een protocol om de methodologie voor de transorale endoscopische thyroidectomie vestibulaire benadering in detail te beschrijven.

Transorale endoscopische thyroidectomie Vestibulaire benadering voor schildklierlobectomie

Verschillende soorten diermodellen van Hashimoto's thyroiditis zijn vastgesteld, net als spontane auto-immune thyroiditis bij de NOD-muis. H-2h4-muizen zijn een eenvoudig en betrouwbaar model voor HT-inductie. Dit artikel beschrijft deze aanpak en evalueert het pathologische proces voor een beter begrip van het SAT-muizenmodel.

Generatie van een muis Spontane auto-immuun thyroiditis model

Een diermodel van verworven hypoparathyreoïdie (HypoPT) is cruciaal om te begrijpen hoe HypoPT de homeostase van minerale ionen beïnvloedt en om de effectiviteit van nieuwe behandelingen te verifiëren. Hier wordt een techniek gepresenteerd om een verworven hypoparathyreoïdie (AHypoPT) rattenmodel te genereren door bijschildklierectomie (PTX) met behulp van koolstofnanodeeltjes.

Generatie van hypoparathyroïde ratten via koolstof-nanodeeltje-geassisteerde bijschildklierectomie

De transorale robotische totale thyreoïdectomie en bilaterale centrale regionale lymfeklierdissectie met behulp van drie poorten zonder okselincisie zijn haalbaar en veilig voor papillair schildkliercarcinoom in een vroeg stadium. Hier presenteren we de operatieve technieken van deze operatie.

Transorale robotische totale thyreoïdectomie en bilaterale centrale regionale lymfeklierdissectie voor papillair schildkliercarcinoom

Dit protocol presenteert een snelle en niet-dodelijke methode voor het verkrijgen van bijschildklieren van varkens. De procedure bestaat uit drie hoofdstappen: bereiding van varkens met anesthesie, eenzijdige thymusverwijdering en ex vivo identificatie en extractie van de intrathymische bijschildklier.

Inkoop van bijschildklieren van levende donorvarkens en ex vivo identificatie

Leer twee methoden om muismodellen van verworven hypoparathyroïdie te maken: chirurgische parathyroïdectomie met GFP-geleide fluorescentie en selectieve ablatie via difterietoxine. Deze modellen behouden schildklierfunctie.

Twee Technieken om Hypoparathyroid Mice Maken: parathyroïdectomie Met behulp van GFP Klieren en difterie-toxine-Mediated bijschildklier Ablation (Video) | JoVE Journal

Twee Technieken om Hypoparathyroid Mice Maken: parathyroïdectomie Met behulp van GFP Klieren en difterie-toxine-Mediated bijschildklier Ablation

Meer video's verkennen