Twee Technieken om Hypoparathyroid Mice Maken: parathyroïdectomie Met behulp van GFP Klieren en difterie-toxine-Mediated bijschildklier Ablation

Het algemene doel van deze procedure is om twee muismodellen van verworven hypoparathyroidisme te genereren die gemakkelijk te gebruiken zijn, een stabiel fenotype produceren en de schildklierfunctie intact laten. Het grote voordeel van deze twee modellen is dat ze de nauwkeurige verwijdering van bijschildklieren bij muizen mogelijk maken, hetzij door middel van door fluoresceren geleide chirurgie, of door PTH specifieke expressie van de difterietoxine receptor, waardoor de cellen selectief kunnen worden aangevallen en vernietigd zonder de naburige schildklier te beïnvloeden. We hopen dat onze muismodellen in staat zullen zijn om belangrijke vragen op het gebied van hypoparathyroidisme te beantwoorden.

Kan bijvoorbeeld PTH analoog therapieën helpen om normale serumcalciumspiegels te handhaven zonder de urinaire calciumexcretie te verhogen? Deze modellen kunnen ook worden gebruikt om andere klinische vragen in hypoparathyroidisme te bestuderen. Is bijvoorbeeld de botsterkte aangetast door hypoparathyroidisme en verandert deze met de behandeling?

Deze vragen zijn moeilijk te beantwoorden bij patiënten, maar deze muismodellen kunnen worden gebruikt om ze aan te pakken. Begin met het anesthetiseren van acht-tot 10-weken oude muizen, GFP specifiek in bijschildklieren tot expressie brengen volgens een goedgekeurd protocol. Plaats het dier in rugligging en zorg voor een passende anesthesiediepte door het ontbreken van een teenpinsreflex of op andere wijze.

Breid de ventrale nekregio uit en bereid de operatie voor door het haar te scheren. Desinfecteer de geschoren huid met een povidonjodium antisepticumpad en bereid vervolgens de incisieplaats voor met behulp van een chirurgisch scrubmiddel en alcoholrinsing volgens uw goedgekeurde protocol. Bedek vervolgens het dier met steriele chirurgische schermen om contaminatie van de chirurgische plaats te verminderen.

Na het maken van een 2 centimeter longitudinale incisie met een chirurgisch scalpel, gebruik gebogen, gekartelde forceps om de fascia te dissecteren en duw de speekselklieren opzij. Terwijl u de chirurgische plaats bekijkt door een dissectiemicroscoop, gebruikt u de uiteinden van scherpe forceps om de paratracheale spieren te snijden en te scheiden en de luchtpijp bloot te leggen. Identificeer de rechter en linker lobben van de schildklier naast de luchtpijp.

Schakel vervolgens de lichtbron naar fluorescerend licht en visualiseer de twee groene fluorescente bijschildklieren. Knaagdieren hebben doorgaans slechts twee bijschildklieren. Als u de twee bijschildklieren naast de schildklier aan elke kant niet kunt identificeren, moeten ectoopisch gelegen bijschildklieren worden vermoed en moet een zorgvuldige zoektocht naar hen langs de luchtpijp worden uitgevoerd.

Gebruik vervolgens chirurgische forceps en schaar om de groene bijschildklieren voorzichtig te verwijderen en controleer zorgvuldig langs de luchtpijp om ervoor te zorgen dat al het groene weefsel is verwijderd. Gebruik steriele gaasjes voor hemostase. Sluit de paratracheale spieren met onderbroken hechtingen.

Sluit de huidsnede met Halstead hechtingen. Plaats het postoperatieve dier in een aparte kooi op een verwarmingspad voor herstel van de lichaamstemperatuur. Zodra de muis wakker is, plaatst u pelletvoer en water met wat gelatinevoedsel op de kooibodem.

Na een postoperatieve observatieperiode van twee uur, brengt u de muis terug naar de dierfaciliteit. Drie dagen na parathyroidectomie, analyseer 10 microliter staartbloed voor geïoniseerd calcium met behulp van een analyzator zoals het bloedgassysteem, calcium- en pH analyzator. Als parathyroidectomie succesvol is, zal het geïoniseerde calcium in het bloed gelijk zijn aan of minder dan minus twee standaardafwijkingen van dat van sham-geopereerde controlemuizen.

Begin met het bereiden van difterietoxine oplossing door difterietoxine poeder te verdunnen met steriele zoutoplossing tot een concentratie van 0,5 microgram per milliliter. Filter de oplossing sterieel en verdeel in afgescheiden delen. Injecteer vijf microgram per kilogram lichaamsgewicht difterietoxine in acht-tot 10-weken oude muizen, die de difterietoxine receptoren specifiek in de bijschildklieren tot expressie brengen.

Drie dagen na een tweede injectie van difterietoxine, analyseer 10 microliter staartbloed voor geïoniseerd calcium, zoals eerder. Hieronder volgen representatieve afbeeldingen van de verschillende locaties van de bijschildklieren bij muizen die GFP specifiek in de bijschildklieren tot expressie brengen. Muizen hadden of twee of drie groene bijschildklieren.

De meeste bijschildklieren bevonden zich nabij de superieure rand of nabij de inferieure rand van de schildklier. In zeldzame gevallen waren sommige bijschildklieren ectoopisch gelegen. Een van de voordelen van ons muismodel is dat de schildklier intact blijft.

Deze figuur toont TSH niveaus van GFP-PTX muizen drie maanden na parathyroidectomie. Deze figuur toont T4 metingen. GFP-PTX muizen vertonen TSH concentraties en T4 concentraties die niet verschilden van controlemuizen.

Deze afbeelding toont bloedcalciumniveaus en PTH niveaus in GFP-PTX muizen. Deze afbeelding toont bloedcalciumniveaus en PTH niveaus in difterietoxine geïnjecteerde PTHcre-iDTR muizen. Zowel GFP-PTX muizen als DT geïnjecteerde PTHcre-iDTR muizen vertoonden stabiele hypocalcemie en verlaagde PTH niveaus gedurende een observatieperiode van drie maanden.

Eenmaal beheerst, kan de GFP geleide parathyroidectomie in ongeveer 20 minuten worden uitgevoerd voor de hele procedure. Een enkele injectie van difterietoxine duurt niet meer dan een minuut als deze correct wordt uitgevoerd. Na deze procedure ontwikkelen deze muizen hypoparathyroidisme en kunnen ze worden gebruikt als een preklinisch ziektemodel.

Vragen kunnen worden beantwoord, zoals de werkzaamheid van verschillende PTH hormoonanalogen bij de behandeling van hypoparathyroidisme. Vergeet niet dat difterietoxine gevaarlijk is, en dat werknemers de gebruikelijke difterietoxine immunisaties moeten hebben. Persoonlijke beschermingsmiddelen zoals maskers en handschoenen moeten altijd worden gedragen tijdens het uitvoeren van deze procedures.