Name: In vitro differentiatie van humane CD4 + FOXP3 + geïnduceerde regulatoire T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 + T cellen met behulp van een TGF-β-bevattende Protocol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Leer hoe je humane FOXP3-positieve regulatoire T-cellen (iTregs) genereert van naïeve CD4+ T-cellen in vitro met behulp van TGF-β. Deze methode maakt reproduceerbare fenotypering mogelijk voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nina Nagel wordt dankbaar erkend voor technische assistentie tijdens de video-opnames en experimentele voorbereiding. We danken Eva-Maria Weiss voor hulp met het intracellulaire FOXP3-kleuringsprotocol en Elisabeth Suri-Payer en Nina Oberle voor het opzetten van het nTreg-isolatieprotocol. Matilda Eriksson en Peri Noori worden erkend voor laboratoriumbeheer.
Financiering: A.S. werd ondersteund door een Marie Curie Intra European Fellowship binnen het 7e Europese Communautaire Kaderprogramma, de Dr. Åke Olsson Stichting en KI-onderzoeksstichtingen; A.S. en J.T. werden ondersteund door een CERIC (Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease)-subsidie, J.T. werd ondersteund door Vetenskapsrådet Geneeskunde en Gezondheid (Dnr 2011-3264), Torsten Söderberg Foundation, FP7 STATegra, AFA Insurance en Stockholm County Council.

<ol><li>Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells%3A+history+and+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells: history and perspective.</a> Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).</li>
<li>DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prognostic+value+of+FoxP3%2B+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+cancer%3A+A+critical+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Can+Res%22%5BJournal%5D)">The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the literature.</a> Clin Can Res. 18 (11), 3022-3029 (2012).</li>
<li>Liu, C., Workman, C. J., Vignali, D. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Regulatory+T+Cells+in+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Targeting Regulatory T Cells in Tumors.</a> FEBS J. , (2016).</li>
<li>Trzonkowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-in-man+clinical+results+of+the+treatment+of+patients+with+graft+versus+host+disease+with+human+ex+vivo+expanded+CD4%2BCD25%2BC%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+C.</a> Clin. Immunol. 133, 22-26 (2009).</li>
<li>Brunstein, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+ex+vivo+expanded+T+regulatory+cells+in+adults+transplanted+with+umbilical+cord+blood%3A+safety+profile+and+detection+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics.</a> Blood. 117, 1061-1070 (2011).</li>
<li>Di Ianni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tregs+prevent+GVHD+and+promote+immune+reconstitution+in+HLA-haploidentical+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation.</a> Blood. 117, 3921-3928 (2011).</li>
<li>Edinger, M., Hoffmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+in+stem+cell+transplantation%3A+strategies+and+first+clinical+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences.</a> Curr. Opin. Immunol. 23, 679-684 (2011).</li>
<li>Bluestone, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes+immunotherapy+using+polyclonal+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells.</a> Science Transl Med. 7 (315), 189(2015).</li>
<li>Haribhai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+for+induced+regulatory+T+cells+in+tolerance+induction+in+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis.</a> J. Immunol. 182, 3461-3468 (2009).</li>
<li>Haribhai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+requisite+role+for+induced+regulatory+T+cells+in+tolerance+based+on+expanding+antigen+receptor+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity.</a> Immunity. 35, 109-122 (2011).</li>
<li>Abbas, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells%3A+recommendations+to+simplify+the+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature.</a> Nat.Immunol. 14, 307-308 (2013).</li>
<li>Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+adaptive+foxp3%2B+regulatory+T+cells%3A+more+of+the+same+or+a+division+of+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor.</a> Immunity. 30, 626-635 (2009).</li>
<li>Huehn, J., Polansky, J. K., Hamann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+FOXP3+expression%3A+the+key+to+a+stable+regulatory+T-cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 83-89 (2009).</li>
<li>Schmitt, E. G., Williams, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+function+of+induced+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation and function of induced regulatory T cells.</a> Front Immunol. 4, 152(2013).</li>
<li>Pillai, V., Ortega, S. B., Wang, C. K., Karandikar, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+regulatory+T-cells%3A+a+state+attained+by+all+activated+human+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.Immunol%22%5BJournal%5D)">Transient regulatory T-cells: a state attained by all activated human T-cells.</a> Clin.Immunol. 123, 18-29 (2007).</li>
<li>Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I. H., Huizinga, T. W., Toes, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+FOXP3+in+human+activated+nonregulatory+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells.</a> Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).</li>
<li>Josefowicz, S. Z., Rudensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+lineage+commitment+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance.</a> Immunity. 30, 616-625 (2009).</li>
<li>Sun, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+intestine+lamina+propria+dendritic+cells+promote+de+novo+generation+of+Foxp3+T+reg+cells+via+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.Exp.Med%22%5BJournal%5D)">Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid.</a> J.Exp.Med. 204, 1775-1785 (2007).</li>
<li>Coombes, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+specialized+population+of+mucosal+CD103%2B+DCs+induces+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+via+a+TGF-beta+and+retinoic+acid-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism.</a> J. Exp. Med. 204, 1757-1764 (2007).</li>
<li>Kang, S. G., Lim, H. W., Andrisani, O. M., Broxmeyer, H. E., Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+A+metabolites+induce+gut-homing+FoxP3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Vitamin A metabolites induce gut-homing FoxP3+ regulatory T cells.</a> J. Immunol. 179, 3724-3733 (2007).</li>
<li>Mucida, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+can+directly+promote+TGF-beta-mediated+Foxp3%28%2B%29+Treg+cell+conversion+of+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid can directly promote TGF-beta-mediated Foxp3(+) Treg cell conversion of naive T cells.</a> Immunity. 30, 471-472 (2009).</li>
<li>Schmidt, A., Eriksson, M., Shang, M. -M., Weyd, H., Tegnér, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Analysis+of+Protocols+to+Induce+Human+CD4%2BFoxp3%2B+Regulatory+T+Cells+by+Combinations+of+IL-2%2C+TGF-beta%2C+Retinoic+Acid%2C+Rapamycin+and+Butyrate%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate.</a> PloS one. 11 (2), 0148474(2016).</li>
<li>Furusawa, Y., Obata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">regulatory T cells.</a> Nature. 504, 446-450 (2013).</li>
<li>Arpaia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+produced+by+commensal+bacteria+promote+peripheral+regulatory+T-cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation.</a> Nature. 504, 451-455 (2013).</li>
<li>Battaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+promotes+expansion+of+functional+CD4%2BCD25%2BFOXP3%2B+regulatory+T+cells+of+both+healthy+subjects+and+type+1+diabetic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients.</a> J. Immunol. 177, 8338-8347 (2006).</li>
<li>Hippen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+ex+vivo+expansion+of+human+natural+regulatory+T+cells+%28T%28regs%29%29+with+minimal+loss+of+in+vivo+functional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity.</a> Sci. Transl. Med. 3, 41(2011).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+macrophages+induce+CD4%28%2B%29Foxp3%28%2B%29+regulatory+T+cells+via+binding+and+re-release+of+TGF-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+cell+biol%22%5BJournal%5D)">Human macrophages induce CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells via binding and re-release of TGF-β.</a> Immunol cell biol. , (2016).</li>
<li>Baron, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+demethylation+in+the+human+FOXP3+locus+discriminates+regulatory+T+cells+from+activated+FOXP3%28%2B%29+conventional+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells.</a> Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+regulatory+T+cells+rapidly+suppress+T+cell+receptor-induced+Ca%282%2B%29%2C+NF-kappaB%2C+and+NFAT+signaling+in+conventional+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca(2+), NF-kappaB, and NFAT signaling in conventional T cells.</a> Sci. Signal. 4, 90(2011).</li>
<li>Ohkura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+stimulation-induced+epigenetic+changes+and+Foxp3+expression+are+independent+and+complementary+events+required+for+Treg+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell receptor stimulation-induced epigenetic changes and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg cell development.</a> Immunity. 37, 785-799 (2012).</li>
<li>Hill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+enhances+Foxp3+induction+indirectly+by+relieving+inhibition+from+CD4%2BCD44hi+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid enhances Foxp3 induction indirectly by relieving inhibition from CD4+CD44hi Cells.</a> Immunity. 29, 758-770 (2008).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+Sulfide+Promotes+Tet1-+and+Tet2-Mediated+Foxp3+Demethylation+to+Drive+Regulatory+T+Cell+Differentiation+and+Maintain+Immune+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Hydrogen Sulfide Promotes Tet1- and Tet2-Mediated Foxp3 Demethylation to Drive Regulatory T Cell Differentiation and Maintain Immune Homeostasis.</a> Immunity. 43 (2), 251-263 (2015).</li>
<li>Yue, X., Trifari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Foxp3+stability+through+modulation+of+TET+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Control of Foxp3 stability through modulation of TET activity.</a> The Journal of experimental medicine. 213 (3), 377-397 (2016).</li>
<li>Sasidharan Nair, V., Song, M. H., Oh, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+Facilitates+Demethylation+of+the+Foxp3+Enhancer+in+a+Tet-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Vitamin C Facilitates Demethylation of the Foxp3 Enhancer in a Tet-Dependent Manner.</a> J Immunol. 196 (5), 2119-2131 (2016).</li>
<li>Geiger, T. L., Tauro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+and+nurture+in+Foxp3+%2B+regulatory+T+cell+development%2C+stability%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nature and nurture in Foxp3 + regulatory T cell development, stability, and function.</a> Hum Immunol. 73 (3), 232-239 (2012).</li>
<li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2-induced+CD4%2BFoxp3%2B+T+cells+attenuate+acute+graft-versus-host+disease+by+suppressing+expansion+and+killing+of+effector+CD8%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TGF-β-induced CD4+Foxp3+ T cells attenuate acute graft-versus-host disease by suppressing expansion and killing of effector CD8+ cells.</a> J Immunol. 193 (7), 3388-3397 (2014).</li>
<li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory T Cells.</a> Immunol Invest. 36 (5-6), 607-628 (2007).</li>
<li>McMurchy, A. N., Levings, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+assays+with+human+T+regulatory+cells%3A+a+technical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+immunol%22%5BJournal%5D)">Suppression assays with human T regulatory cells: a technical guide.</a> Eur J immunol. 42 (1), 27-34 (2012).</li>
<li>Mutis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+regulatory+T+cells+control+xenogeneic+graft-versus-host+disease+induced+by+autologous+T+cells+in+RAG2-%2F-gammac-%2F-+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+cancer+res%22%5BJournal%5D)">Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice.</a> Clin cancer res. 12 (18), 5520-5525 (2006).</li>
<li>Tran, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+suppression+assay+for+functional+assessment+of+human+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+mol+biol%22%5BJournal%5D)">In vitro suppression assay for functional assessment of human regulatory T cells.</a> Meth mol biol. 979, 199-212 (2013).</li>
<li>Oberle, N., Eberhardt, N., Falk, C. S., Krammer, P. H., Suri-Payer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Suppression+of+Cytokine+Transcription+in+Human+CD4%2BCD25+T+Cells+by+CD4%2BFoxp3%2B+Regulatory+T+Cells%3A+Independence+of+IL-2+Consumption%2C+TGF-beta%2C+and+Various+Inhibitors+of+TCR+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapid Suppression of Cytokine Transcription in Human CD4+CD25 T Cells by CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells: Independence of IL-2 Consumption, TGF-beta, and Various Inhibitors of TCR Signaling.</a> J. Immunol. 179, 3578-3587 (2007).</li>
<li>Shevach, E. M., Thornton, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tTregs%2C+pTregs%2C+and+iTregs%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences.</a> Immunol. Rev. 259, 88-102 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De beschreven protocol kan de robuuste inductie van menselijke CD4 + FOXP3 + iTregs van naïeve humane CD4 + T-cellen. Het omvat een nieuw protocol dat we onlangs beschreven met een combinatie van TGF-β, ATRA en rapamycine, voor inductie van iTregs met superieure in vitro onderdrukkende functie 22. In vergelijking met andere gepubliceerde protocollen ander voordeel is de inductie van verschillende iTreg populaties parallel door verschillende protocollen, die de directe vergelijking van de e...

CD4 + CD25 + FOXP3 + regulerende T-cellen (Tregs) onderdrukken andere immuuncellen en zijn kritische mediatoren van perifere tolerantie voorkomen autoimmuniteit en overmatige ontsteking 1. Het belang van Tregs wordt geïllustreerd door de menselijke ziekte immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathie X-gebonden syndroom (IPEX), waarbij verlies van Tregs door mutaties in het `master&#39; Treg transcriptiefactor forkhead box P3 (FOXP3) leidt tot ernstige systemische auto-immuunziekte, dodelijke op jonge leeftijd. Echter, Tregs fungeren als een tweesnijdend zwaard in het immuunsysteem als ze ook kunnen belemmeren anti-tumor immuniteit in bepaalde instellingen 2. Therapeutische manipulatie van Treg aantal en de functie is dan ook om tal van klinisch onderzoek onderworpen. Bij kanker kunnen depletie van Tregs gewenst zijn en enig succes van klinische benaderingen bevordert verder onderzoek 3. In auto-immuun- en ontstekingsziekten, in aanvulling op therapeutische werking van Tregs in several muis ziektemodellen, recent als eerste in-man proeven van adoptieve Treg overdracht te voorkomen graft versus -host ziekte (GvHD) 4-7 en de veiligheid in de behandeling van type 1 diabetes 8 beoordelen toonde veelbelovende resultaten. Natuurlijk voorkomende Tregs (nTregs) omvatten-thymus afgeleide tTregs en perifeer veroorzaakte pTregs, met niet-redundante essentiële functies voor het behoud van de gezondheid van 9-11. Echter, nTreg aantallen zijn beperkt, het stimuleren van de complementaire aanpak van het induceren van Tregs (iTregs) in vitro van naïeve T-cel voorlopers 12. Still stabiliteit van iTregs, waarschijnlijk door een gebrek aan demethylering in de zogenoemde Treg-gedemethyleerde specifieke regio (TSDR) in FOXP3 gen locus 13, een punt van zorg en verschillende studies geven aan dat in vivo geïnduceerde Tregs stabieler 14. Tot op heden, FOXP3 blijft de beste eiwit mArker voor Tregs, maar het is niet absoluut specifiek omdat conventionele menselijke CD4 + CD25 T-cellen die tijdelijk gemiddeld niveau van expressie FOXP3 bij activering 15,16. Hoewel aanzienlijke vooruitgang is geboekt in het ophelderen van de regulering van FOXP3 meningsuiting, nog veel te ontdekken met betrekking tot de inductie, de stabiliteit en de functie van FOXP3 name in menselijke cellen. Ondanks verschillen nTregs in vitro geïnduceerde FOXP3 + CD4 + T-cellen kunnen worden gebruikt als een modelsysteem voor de moleculaire mechanismen van FOXP3 inductie bestuderen en als uitgangspunt voor protocollen in de toekomst die het mogelijk maken voor het genereren van iTregs die meer lijken op in zijn ontwikkeling vivo gegenereerd Tregs, die van toepassing zijn voor adoptieve overdracht strategieën in de toekomst zou kunnen zijn. Noch `goud standard&#39; protocol menselijke iTregs induceren en huidige protocollen werden ontwikkeld volgens nabootsen Treg-inducerende omstandigheden in vivo: interleukine 2 (IL-2) En transformerende groeifactor β (TGF-β) signalering cruciaal voor FOXP3 inductie in vivo 17, en all-trans retinoïnezuur (ATRA) - die in vivo wordt geproduceerd door de darm geassocieerde dendritische cellen - wordt vaak gebruikt om FOXP3 inductie verbeteren in vitro 18-21. We hebben extra personeel Treg-inducerende protocollen gebruikt butyraat 22, een darmflora afkomstige korte keten vetzuur dat recentelijk werd aangetoond dat murine Treg inductie 23,24 vergroten ontwikkeld. We hebben ook onlangs een nieuw protocol voor het genereren van iTregs met superieure onderdrukkende functie in vitro met behulp van een combinatie van TGF-β, ATRA en rapamycine 22, waarbij de laatste een klinisch goedgekeurd zoogdieren doelwit van rapamycin (mTOR-remmer) waarvan bekend is dat te bevorderen FOXP3 onderhoud tijdens de menselijke Treg expansie 25,26. Deze methode beschrijft de reproduceerbaarvitro genereren van humane CD4 + FOXP3 + iTregs met een aantal verschillende omstandigheden, en de latere fenotypering van flowcytometrie en kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR) protocol-specifieke expressiepatronen van FOXP3 en andere Treg handtekening moleculen openbaren zoals CD25, CTLA-4, EOS, en onderdrukking van IFN-γ en SATB1 expressie 22. De gegenereerde celpopulaties kan worden gebruikt voor functionele bepalingen inzake onderdrukkende activiteit of voor moleculaire studies, ofwel betreffende algemene FOXP3 regulators of effecten specifiek voor bepaalde verbindingen zoals butyraat of rapamycine bestuderen. Verder inzicht in de moleculaire mechanismen die Treg differentiatie is zeer relevant voor toekomstige therapeutische benaderingen in auto-immuniteit of kanker om specifiek te richten moleculen betrokken bij Treg generatie en functie.

<table><tbody><tr><td>All-trans retinoic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50MG&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7</td><td>eBioscience</td><td>17-4777-42</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD25 microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-983</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD25-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-024</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD28 antibody, LEAF Purified&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>302914</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45RA, FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-247</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45RO PE clone UCHL1</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>345770</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a</td><td>eBioscience</td><td>48-0086-42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421</td><td>BD Biosciences</td><td>562743</td><td></td></tr><tr><td>anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k</td><td>eBioscience</td><td>11-7319-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11754-250</td><td></td></tr><tr><td>Density centrifugation medium: Ficoll-Paque</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 99.7%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS, heat inactivated</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye, eFluor 780&nbsp;&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14 or 65-0865-18&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 Staining Buffer Set</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Let op: bevat paraformaldehyde. Kan ook worden gekocht in gecombineerde kit met antilichaam; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set</td></tr><tr><td>GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>human naive CD4 T cell isolation kit II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>Human serum albumin 50 g/L</td><td>Baxter</td><td>1501057</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS-columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>17-4714-42</td><td></td></tr><tr><td>mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 &#956;g</td><td>eBioscience</td><td>11-4714-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173</td><td>BD Biosciences</td><td>563464</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet plastic, individually packed</td><td>Sarstedt</td><td>86.1172.001&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585-1MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>EMD (Merck)</td><td>553210-100UG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-2, CF</td><td>R&amp;D</td><td>202-IL-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TGF-beta 1, CF</td><td>RnD</td><td>240-B-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>72400-054&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium butyrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887-250MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage)&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182; assay ID: Hs01085834_m1</td><td>Let op: bevat paraformaldehyde</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351370; assay ID: Hs04194366_g1&nbsp;&nbsp;</td><td>Let op: bevat paraformaldehyde</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369514</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro differentiatie van humane cd4 + foxp3 + geïnduceerde regulatoire t-cellen (itregs) van naïeve cd4 + t cellen met behulp van een tgf-β-bevattende protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatorische T-cellen (Tregs) zijn een integraal onderdeel van perifere tolerantie, ze onderdrukken immuunreacties tegen eigen structuren en voorkomen zo auto-immuunziekten. Klinische benaderingen om Tregs adoptief over te dragen, of om Tregs te verminderen bij kanker, zijn aan de gang met veelbelovende eerste resultaten. 
Omdat het aantal natuurlijk voorkomende Tregs (nTregs) zeer beperkt is, kan het voordelig zijn om bepaalde Treg-kenmerken te bestuderen met behulp van in vitro geïnduceerde Tregs (iTregs). Tot nu toe is de beste, hoewel niet absoluut specifieke, eiwitmarker om Tregs te onderscheiden de transcriptiefactor FOXP3. Ondanks het belang van Tregs, inclusief niet-overbodige rollen van perifer geïnduceerde Tregs, zijn de protocollen om iTregs te genereren momenteel controversieel, vooral voor menselijke cellen. Dit protocol beschrijft daarom de in vitro differentiatie van humane CD4+FOXP3+ iTregs uit humane naïeve T-cellen met behulp van een reeks Treg-inducerende factoren (TGF-β plus IL-2 alleen, of hun combinatie met retinoïnezuur, rapamycine of butyraat) parallel. Het beschrijft ook de fenotypische karakterisering van deze cellen door middel van flowcytometrie en qRT-PCR. 
Deze protocollen resulteren in reproduceerbare expressie van FOXP3 en andere Treg-kenmerkende genen en maken het mogelijk om algemene FOXP3-regulatiemechanismen te bestuderen, evenals protocolspecifieke effecten om de impact van bepaalde factoren te bepalen. iTregs kunnen worden gebruikt om verschillende fenotypische aspecten en moleculaire mechanismen van Treg-inductie te bestuderen. Gedetailleerde moleculaire studies worden vergemakkelijkt door relatief grote aantallen cellen die kunnen worden verkregen. 
Een beperking voor de toepassing van iTregs is de relatieve instabiliteit van FOXP3-expressie in deze cellen in vergelijking met nTregs. iTregs die door deze protocollen worden gegenereerd, kunnen ook worden gebruikt voor functionele assays zoals het bestuderen van hun onderdrukkende functie, waarbij iTregs geïnduceerd door TGF-β plus retinoïnezuur en rapamycine superieure onderdrukkende activiteit vertonen. De onderdrukkende capaciteit van iTregs kan echter verschillen van nTregs en het gebruik van geschikte controles is cruciaal.

Figuur 1 toont een schema van de experimentele opstelling. Figuur 2 toont een representatief zuiverheid- kleuring voor magnetisch geïsoleerde naïeve CD4 + T-cellen en nTregs. F IGUUR 3A toont de flowcytometrie gating strategie en Figuur 3B toont representatieve FOXP3 en CD25 flowcytometrie kleuringen op dag 6 van de cultuur onder de aangegeven iTreg...

Dit protocol beschrijft de reproduceerbare productie en fenotypering van mens veroorzaakte regulerende T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 + T-cellen in vitro. Verschillende protocollen voor FOXP3 inductie mogelijk maken voor de studie van specifieke iTreg fenotypes verkregen met de respectieve protocollen.

In vitro differentiatie van humane CD4 + FOXP3 + geïnduceerde regulatoire T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 + T cellen met behulp van een TGF-β-bevattende Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

De algemene doelen van dit experiment zijn om humane FOXP3-positieve regulatoire T-cellen in vitro te induceren uit naive CD4 T-cellen en hun fenotype te analyseren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van T-cel immunologie te beantwoorden, zoals hoe gebeurt de differentiatie van regulatoire T-cellen op moleculair niveau? Het grote voordeel van deze techniek is dat het de reproduceerbare generatie en fenotypering van humane FOXP3-positieve regulatoire T-cellen mogelijk maakt.Hoewel deze methode inzichten kan bieden in de differentiatie van regulatoire T-cellen, kan deze ook worden aangepast om andere CD4 T-cel subpopulaties en andere immuuncellen van belang te bestuderen. De visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de PBMC en magnetische bit isolatie stappen gemakkelijker te begrijpen zijn wanneer ze worden getoond in plaats van beschreven. Om perifere bloed T-cellen te isoleren, begint u door 15 milliliter kamertemperatuur dichtheidsgradiënt medium toe te voegen in vijf 50-milliliter buizen per buffy coat, en brengt u het uiteindelijke buffy coat volume op 180 milliliter met kamertemperatuur PBS.Kanteel vervolgens een buis met dichtheidsgradiën

in-vitro-differentiation-human-cd4-foxp3-induced-regulatory-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Tregs zijn krachtige onderdrukkers van het immuunsysteem. Er is een gebrek van unieke oppervlakte markers om ze te definiëren, dus, de definities van Tregs zijn vooral functioneel. Hier beschrijven we een...

Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

Wij beschrijven een werkwijze voor het regulerende, geheugen naïeve T-cellen van een menselijke bloed donoren. Gepolariseerde Tregs kan worden vergeleken met andere subgroepen in verschillende genetische en functionele toepassingen met genetische homogeniteit, zoals onderdrukking assay ook hier beschreven.

Genereren van Induced regulatoire T-cellen uit primaire menselijke naïef en geheugen T-cellen

CD4+ regulatorische T-cellen zijn krachtige immuunmodulatoren en hebben belangrijke functies in immuunhomeostase. Het gebrek aan deze cellen in perifeer bloed maakt functionele studies uitdagend, specifiek in de context van HIV-1-infectie. We beschrijven hier een methode om functionele CD4+ Tregs te isoleren en uit te breiden van perifeer bloed van HIV-1-geïnfecteerde individuen.

Nieuwe tools om regulatoire T-cellen van HIV-1-geïnfecteerde individuen Expand

Adenovirale genoverdracht in naïeve CD4 T-cellen met transgene expressie van de Coxsackie adenovirus receptor kan de moleculaire analyse van regulatoire T...

Adenovirale transductie van Naïeve CD4 T-cellen aan Treg Differentiatie Studie

Muis embryonale stamcellen kunnen in vitro worden gedifferentieerd tot T-cellen met behulp van het OP9-DL1 co-cultuursysteem. Succes bij deze procedure vereist zorgvuldige aandacht voor reagens/celonderhoud en belangrijke techniekgevoelige stappen. Hier bespreken we deze kritieke parameters en bieden we een gedetailleerd protocol om de adoptie van deze technologie te stimuleren.

Afleiding van T cellen In Vitro Van muis embryonale stamcellen

Naïve CD4+ T-cellen polariseren naar verschillende subsets, afhankelijk van de omgeving op het moment van activering.  De differentiatie van naïve CD4+ T-cellen naar verschillende effector-subsets kan in vitro worden bereikt door de toevoeging van T-celreceptor-stimuli en specifieke cytokine-signalen.

Muis Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiatie in T cel subsets

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het genereren van tumor antigeen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige Thymus emigants (iTE) door een driedimensionaal (3D) Thymus cultuur systeem. iET zijn een homogene deelverzameling van T-cellen die nauw verwant zijn aan naïeve T-cellen met de capaciteit voor proliferatie, Geheugenvorming en tumor onderdrukking.

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

Dit protocol biedt een gestroomlijnde workflow voor het genereren en testen van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen (CAR Tregs).

Generatie van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen

Dit protocol biedt een in vitro co-kweekstrategie om de effecten van regulerende T-cellen op de proliferatie en differentiatie van effector T-cellen te onderzoeken.

In vitro Functionele analyse van regulerende T-cellen: Focus op proliferatie en differentiatie

We presenteren een protocol om antigeen-specifieke muis T-cellen te produceren met behulp van retrovirale...

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

Leer hoe je humane FOXP3-positieve regulatoire T-cellen (iTregs) genereert van naïeve CD4+ T-cellen in vitro met behulp van TGF-β. Deze methode maakt reproduceerbare fenotypering mogelijk voor immunologisch onderzoek.

In vitro differentiatie van humane CD4 + FOXP3 + geïnduceerde regulatoire T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 + T cellen met behulp van een TGF-β-bevattende Protocol (Video) | JoVE Journal

In vitro differentiatie van humane CD4 ⁺ FOXP3 ⁺ geïnduceerde regulatoire T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 ⁺ T cellen met behulp van een TGF-β-bevattende Protocol

Meer video's verkennen