De chip-exo Methode: Het identificeren van eiwit-DNA interacties met Near basenparen Precision

Het algemene doel van deze functionele genomische technologie is om de precieze genomische locaties te identificeren die een bepaald eiwit in levende cellen bezet. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van genregulatie en epigenetica, zoals hoe de transcriptiemachinerie zich assembleert en werkt in de context van chromatine. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de exacte genomische locatie voor eiwit-DNA-interacties bijna op basenniveau met uitzonderlijk lage achtergrondvervuiling onthult.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het protocol complex is en gedurende het hele proces aandacht voor detail vereist. Om nucleaire lysaten te soniceren, begint u met het plaatsen van harsadapters in 15 milliliter polystyreenbuisjes met nucleaire extracten. Soniceer de lysaten in een ijskou waterbad op gemiddeld vermogen gedurende 30 seconden aan en 30 seconden uit voor in totaal twee sessies van 15 minuten.

Om de sonicatieresultaten te controleren, brengt u twee monsters van 10 microliter uit elk buisje over naar 1,5 milliliterbuisjes. Draai vervolgens de crosslinks om door de eerste 10 microliter monster te combineren met 10 microliter TE-RNase A en 0,2 microliters van proteinase K. Incubeer het buisje gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens vier microliters 6X xyleen DNA kleurstof toe.

Voeg voor het tweede 10 microliter monster twee microliters 6X xyleen DNA kleurstof toe om de crosslinks te behouden. Laat beide monsters draaien op een 1,5% agarosegel bij 140 volt gedurende ongeveer 30 tot 45 minuten totdat de broomfenoldye in de laatste driekwart van de weg is gegaan. Als de sonicatie succesvol was, brengt u gesoniceerde lysaten over naar twee milliliterbuisjes met 150 microliters 10% Triton X-100 en mengt u door te vortexen.

Pellet het onoplosbare chromatine en puin door de gesoniceerde lysaten 20.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten te centrifugeren. Breng vervolgens de supernatanten over naar nieuwe twee milliliterbuisjes. Bewaar de monsters onbeperkt bij min 80 graden Celsius.

Voor elke chromatine immunoprecipitatie of ChIP-reactie, combineert u 1,5 milliliter gesoniceerde extracten met antilichaamparelkettingconjugaten in 1,5 milliliterbuisjes. Incubeer de buisjes op een minibuisjesrotator met een snelheid van negen bij vier graden Celsius overnacht. Controleer na een paar minuten om ervoor te zorgen dat de monsters niet lekken en goed mengen.

De volgende dag, draai de buisjes kort door om de vloeistof in de doppen te verzamelen en plaats de buisjes een minuut lang op een magnetisch rek. Aspeer vervolgens het extract. Voeg 0,75 milliliter RIPA-buffer toe aan elk buisje.

Vervolgens verwijdert u de buisjes van het magnetisch rek en draait u ze enkele keren om te mengen. Na een korte draai plaatst u de buisjes terug op het magneetrek en aspeert u het supernatant. Voeg na de laatste wasstap 0,75 milliliter 10 millimolar Tris HCL toe aan elk buisje.

Verwijder de buisjes van het magnetisch rek en draai de monsters enkele keren om te mengen. Na een korte draai plaatst u de buisjes terug op het rek en aspeert u het supernatant. Nadat u de afwerkings- en detailreacties volgens het tekstprotocol hebt uitgevoerd, vult u de berekeningen van de ligatie master mix in.

Maak vervolgens de ligatiemix in een 1,5 milliliterbuisje op ijs en pipet om de oplossing te mengen. Met de monsters op het magnetisch rek, voegt u 48 microliter P7 ligatie master mix en twee microliters van een ander adapterindex toe aan elk van de monsterharsen. Incubeer de monsters in een ThermoMixer bij drie keer g bij 25 graden Celsius gedurende twee uur.

Na het wassen van de monsters en het uitvoeren van de Phy 29 nick reparatie en kinasereacties volgens het tekstprotocol, vult u de berekeningen van de lambda exonuclease master mix in en maakt u de lambda exonuclease mix in een 1,5 milliliterbuisje op ijs. Voeg 50 microliter lambda exonuclease mix toe aan elk monsterhars terwijl deze nog op het magnetisch rek staat. Incubeer vervolgens de monsters in een ThermoMixer bij drie keer g bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Na het afzuipen van de laatste wasstap zoals beschreven in het tekstprotocol, voert u de RecJf nuclease reactie uit door de berekeningen van de RecJf master mix in te vullen en de RecJf mix op ijs te maken. Voeg 50 microliter van de RecJf mix toe aan elk monsterhars op het magnetisch rek. Incubeer vervolgens de monsters in een ThermoMixer bij drie keer g bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Na het afzuipen van de laatste wasstap, bereidt u de ChIP elutiebuffer en proteinase K master mix voor en voegt u 200 microliter van de oplossing toe aan elk monsterhars. Incubeer de monsters in een ThermoMixer bij drie keer g bij 65 graden Celsius gedurende de nacht met een verwarmd deksel om condensatie te voorkomen. De volgende dag, draait u de monsters kort en plaatst u de buisjes een minuut lang op het magnetisch rek.

Breng vervolgens 200 microliter supernatant over naar een nieuw 1,5 milliliterbuisje met 200 microliter TE buffer. Na DNA extractie, P7 primaire extensie en ATL reacties, vult u de berekeningen van de P5 adapter ligatietafel master mix in en maakt u de ligatie master mix op ijs. Voeg 20 microliter van de ligatiemix toe aan elk monster en pipet om te mengen.

Incubeer vervolgens de monsters in een thermische cycler bij 25 graden Celsius gedurende twee uur. Voer DNA-zuivering en -kwantificering uit volgens het tekstprotocol. Zoals hier getoond, is het de moeite waard om tijd te besteden aan het optimaliseren van de sonicatiecondities om hoogwaardige chromatine extracten te verkrijgen die DNA-fragmenten tussen 100 tot 500 basenparen opleveren.

Een elektroforetisch mobiliteitsverschuivingsassay wordt gebruikt om te verifiëren dat de gesoniceerde extracten intacte eiwit-DNA-crosslinks bevatten, wat duidelijk is als een superverschuiving van