Name: De chip-exo Methode: Het identificeren van eiwit-DNA interacties met Near basenparen Precision (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Leer de ChIP-exo methode voor het identificeren van eiwit-DNA interacties met nabij basenpaar precisie. Deze techniek helpt onderzoekers genregulatie en epigenetica te bestuderen met uitzonderlijk lage achtergrondruis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken het Venters Lab en leden van de Afdeling Moleculaire Fysiologie en Biofysica voor nuttige discussies. Speciale dank aan Frank Pugh voor zijn begeleiding, mentoring en vele inzichtelijke discussies over de nuances van ChIP-exo terwijl ik een post-doctoraal fellow was in zijn laboratorium.

<ol><li>Venters, B. J., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+eukaryotic+genes+are+transcribed%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How eukaryotic genes are transcribed.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+dynamics+of+enhanceosome+assembly+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells.</a> Cell. 156, 1274-1285 (2014).</li>
<li>Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+MEF2+target+gene+analysis+in+cardiac+and+skeletal+muscle+reveals+novel+regulation+of+DUSP6+by+p38MAPK-MEF2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling.</a> Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).</li>
<li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+ArgR-DNA+complexes+at+the+genome-scale+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).</li>
<li>Katainen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF%2Fcohesin-binding+sites+are+frequently+mutated+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer.</a> Nat Genet. 47, 818-821 (2015).</li>
<li>Murphy, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancient+protein-DNA+interaction+underlying+metazoan+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination.</a> Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).</li>
<li>Zere, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Targets+and+Features+of+BarA-UvrY+%28-SirA%29+Signal+Transduction+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems.</a> PLoS One. 10, e0145035(2015).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li>
<li>Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnucleosomal+structures+and+nucleosome+asymmetry+across+a+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome.</a> Cell. , 1377-1388 (2014).</li>
<li>Pugh, B. F., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Organization+of+Human+Transcription+Initiation+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes.</a> PLoS One. 11, e0149339(2016).</li>
<li>Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneTrack--a+genomic+data+processing+and+visualization+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework.</a> Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).</li>
<li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS computational biology. 8, e1002638(2012).</li>
<li>Bardet, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+transcription+factor+binding+sites+from+ChIP-seq+data+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution.</a> Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MACE%3A+model+based+analysis+of+ChIP-exo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MACE: model based analysis of ChIP-exo.</a> Nucleic Acids Res. 42, e156(2014).</li>
<li>Bentley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-exo+method+for+identifying+genomic+location+of+DNA-binding+proteins+with+near-single-nucleotide+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24(2012).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).</li>
<li>Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Illumina-based+ChIP-exonuclease+method+provides+insight+into+FoxA1-DNA+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties.</a> Genome Biol. 14, R147(2013).</li>
<li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

<html> We presenteren een functioneel genomische protocol om de precieze bindende locatie voor chromatine interactie eiwitten in een onbevooroordeelde, genoom-brede wijze op in de buurt van basenparen resolutie te bepalen. De meest kritische stap om in de buurt van basenparen in kaart brengen van de resolutie te bereiken is de exonuclease behandeling van de ChIP verrijkte DNA terwijl de immunoprecipitaat op de magnetische hars blijft. Ogenschijnlijk, kon eiwitcomplexen potentieel te blokkeren in vivo footprintin...

Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) is een krachtige methode om mechanismen van genregulatie bestuderen door het selectief verrijken van DNA-fragmenten die interageren met een bepaald eiwit in levende cellen. Detectiemethoden-ChIP verrijkte DNA-fragmenten ontwikkeld als technologie verbetert, van detectie van een enkele locus (standaard ChIP-qPCR) hybridisatie aan oligonucleotide microarrays (ChIP-chip) bij hoge doorvoer sequentiebepaling (ChIP-seq) 1. Hoewel ChIP-seq wijdverbreide toepassing, chromatine heterogeniteit en niet-specifieke DNA-interacties heeft gezien hebben kwaliteit van de gegevens leidt tot valse positieven en onnauwkeurig mapping belemmerd. Om deze beperkingen te omzeilen, Dr. Frank Pugh ontwikkelde de chip-exo-methode 2. De meest opvallende eigenschap van ChIP-exo is verbanden met een 5 &#39;naar 3&#39; exonuclease, effectief footprinting transcriptiefactor bindende plaatsen. Hierdoor de ChIP-exo methode produceert een grotere resolutie, groter dynamisch bereik van detection, en een lager achtergrondgeluid. Hoewel ChIP-exo is meer technisch uitdagende te beheersen dan ChIP-seq, wordt het op grote schaal aangenomen studies gericht zijn op unieke ultra high-resolution inzichten te krijgen met behulp van diverse biologische systemen 3-8. Inderdaad, ChIP-exo met succes toegepast op bacteriën, gist, muis, rat en humane cellen. Als bewijs van het principe werd ChIP-exo oorspronkelijk gebruikt om de precieze bindingsmotief identificeren een handvol gist transcriptiefactoren 2. De techniek werd ook gebruikt in gist om de organisatie van de transcriptie pre-initiatie complex te bestuderen, en subnucleosomal structuur van verschillende histonen 9,10 ontcijferen. Meer recent, leveraged we ChIP-exo naar aangrenzende TFIIB en Pol II bindend gebeurtenissen in de menselijke initiatiefnemers op te lossen, en toonde aan dat op grote schaal uiteenlopende transcriptie komt voort uit verschillende initiatie complexen 11. De workflow hier gepresenteerde is geoptimaliseerd en streamlined voor zoogdierlijke ChIP-exo (figuur 1). Eerst worden levend primaire of weefselkweek cellen behandeld met formaldehyde te bewaren in vivo eiwit-DNA-interacties via een covalente verknoping. De cellen worden gelyseerd en chromatine afgeschoven naar ~ 100-500 basenparen grootte fragmenten. ChIP vervolgens selectief verrijkt voor DNA-fragmenten verknoopt aan het eiwit van belang. Op dit punt worden ChIP-seq bibliotheken typisch bereid die inherent de detectieresolutie de gemiddelde fragmentgrootte van enkele honderden basenparen beperkt. Echter, ChIP-exo overwint deze beperking door bijsnijden links en rechts 5 &#39;DNA grenzen van het eiwit-DNA verknoping plaats met lambda exonuclease. Sequencing bibliotheken worden vervolgens geconstrueerd uit DNA exonuclease digestie zoals hieronder beschreven. De resulterende geneste 5 &#39;grenzen vormen een in vivo footprint van de eiwit-DNA-interactie (Figuur 1, stap 14), en worden gedetecteerd door sequenering. although de chip-exo methode is meer betrokken dan ChIP-seq, overgangen tussen de meeste stappen vereist eenvoudige kraal wassen, welk monster verlies en experimentele variabiliteit minimaliseert. Belangrijk is, aangezien ChIP-exo is een verfijnde versie van ChIP-seq, een monster dat is succesvol met chip-seq moet ook succesvol met chip-exo zijn. De in vivo footprinting van eiwit-DNA interacties met chip-exo resultaten in een fundamenteel verschillende datastructuur van ChIP-seq. Hoewel gemeenschappelijke ChIP-seq bellers kunnen worden toegepast op ChIP-exo data, om de meest nauwkeurige piek gesprekken te verkrijgen raden wij bioinformatica instrumenten die specifiek ontworpen met de unieke structuur van de chip-exo gegevens in het achterhoofd. Deze omvatten Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla en ExoProfiler 12-15.

<table><tbody><tr><td>37% formaldehyde, methanol vrij, 10 x 10 ml ampullen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>Sectie 3</td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI)</td><td>Roche Life Science</td><td>11873580001</td><td>Secties 4, 8</td></tr><tr><td>Bioruptor sonicator</td><td>Diagenode</td><td>UCD200</td><td>Sectie 5</td></tr><tr><td>15 ml polystyreenbuizen</td><td>BD Falcon</td><td>352095</td><td>Sectie 5</td></tr><tr><td>MagSepharose Protein G Xtra beads</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9670-66</td><td>Sectie 6</td></tr><tr><td>DynaMag-1.5 ml Side Magnetisch Rek</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Secties 6-17, 22</td></tr><tr><td>Mini-Tube Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>Secties 7, 22</td></tr><tr><td>T4 DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0203</td><td>Sectie 9</td></tr><tr><td>DNA Polymerase I, Klenow</td><td>New England BioLabs</td><td>M0210</td><td>Sectie 9</td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2 (10x Reactie Buffer 2)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7002</td><td>Secties 9-11, 13, 15, 20</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382</td><td>Secties 9-16</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Roche Life Science</td><td>010419979001</td><td>Secties 9, 11, 13</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447</td><td>Secties 9, 12, 19, 23</td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201</td><td>Secties 9, 13</td></tr><tr><td>dATP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0440</td><td>Secties 10, 20</td></tr><tr><td>Klenow 3'-5' Exo Minus</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212</td><td>Secties 10, 20</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202</td><td>Secties 11, 21</td></tr><tr><td>Φ-29 DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0269</td><td>Secties 12, 19</td></tr><tr><td>10x Φ-29 Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0269</td><td>Secties 12, 19</td></tr><tr><td>Lambda Exonuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>M0262</td><td>Sectie 14</td></tr><tr><td>10x Lambda Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0262</td><td>Sectie 14</td></tr><tr><td>RecJf Exonuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>M0264</td><td>Sectie 15</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche Life Science</td><td>03115828001</td><td>Sectie 16</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Roche Life Science</td><td>010901393001</td><td>Sectie 18</td></tr><tr><td>10x T4 Ligase Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202</td><td>Sectie 21</td></tr><tr><td>AMPure XP (opruiming) beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Sectie 22</td></tr><tr><td>Q5 Hot Start DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0493</td><td>Sectie 23</td></tr><tr><td>5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer)</td><td>New England BioLabs</td><td>B9027</td><td>Sectie 23</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Sectie 25</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td>Sectie 26</td></tr><tr><td>Optical Clear Qubit tubes</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td>Sectie 26</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Sectie 26</td></tr></tbody></table>

de chip-exo methode: het identificeren van eiwit-dna interacties met near basenparen precision

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Chromatine immunoprecipitatie (chip) is een onmisbaar instrument op het gebied van de epigenetica en genregulatie dat specifieke eiwit-DNA-interacties isolaten. ChIP gekoppeld met high throughput sequencing (ChIP-seq) wordt vaak gebruikt om de genomische locatie van eiwitten die interageren met chromatine bepalen. Echter, ChIP-seq belemmerd door een relatief lage resolutie in kaart brengen van enkele honderden basenparen en hoge achtergrond signaal. De chip-exo-methode is een verfijnde versie van de chip-seq die substantieel verbetert zowel de resolutie en lawaai. Het belangrijkste verschil van de ChIP-exo methode is het opnemen van lambda exonuclease vertering in de bibliotheek bereiding workflow effectief footprint links en rechts 5 &#39;DNA grenzen van het eiwit-DNA verknoping plaats. De chip-exo bibliotheken worden vervolgens onderworpen aan high throughput sequentiebepaling. De resulterende gegevens kunnen worden benut om unieke en ultra-hoge resolutie inzicht te verschaffen in de functionele organisatie of het genoom. Hier beschrijven we de ChIP-exo methode die wij hebben geoptimaliseerd en gestroomlijnd voor zoogdierlijke systemen en de volgende generatie sequencing-door-synthese platform.

De volgende cijfers illustreren representatieve resultaten van de chip-exo-protocol hier gepresenteerd. In tegenstelling tot traditionele ChIP-seq methodieken enkele enzymatische stappen, ChIP-exo vereist elf sequentieel, afhankelijk enzymatische reacties (figuur 1). Zo moet zorg bij elke stap worden gezorgd dat elke reactiecomponent wordt toegevoegd aan zijn respectieve reactiemengsel master mix. We raden aan het genereren van een formulaic spreadsheet op basis van de r...

Hier presenteren we een protocol om een resolutie van bijna base-paar te bereiken van eiwit-DNA-interacties. Dit wordt verkregen door exonuclease-behandeling van DNA-fragmenten die selectief zijn verrijkt door chromatine-immunoprecipitatie (ChIP-exo) gevolgd door high-throughput sequencing.

De chip-exo Methode: Het identificeren van eiwit-DNA interacties met Near basenparen Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

Het algemene doel van deze functionele genomische technologie is om de precieze genomische locaties te identificeren die een bepaald eiwit in levende cellen bezet. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van genregulatie en epigenetica, zoals hoe de transcriptiemachinerie zich assembleert en werkt in de context van chromatine. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de exacte genomische locatie voor eiwit-DNA-interacties bijna op basenniveau met uitzonderlijk lage achtergrondvervuiling onthult.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het protocol complex is en gedurende het hele proces aandacht voor detail vereist. Om nucleaire lysaten te soniceren, begint u met het plaatsen van harsadapters in 15 milliliter polystyreenbuisjes met nucleaire extracten. Soniceer de lysaten in een ijskou waterbad op gemiddeld vermogen gedurende 30 seconden aan en 30 seconden uit voor in totaal twee sessies van 15 minuten.Om de sonicatieresultaten te controleren, brengt u twee monsters van 10 microliter uit elk buisje over naar 1,5 milliliterbuisjes. Draai vervolgens de crosslinks om door de eerste 10 microliter monster te combineren met 10 microliter TE-RNase A en 0,2 microliters van proteinase K. Incubeer het buisje gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens vier microliters 6X xyleen DNA kleurstof toe.Voeg voor het tweede 10 microliter monster twee microliters 6X xyleen DNA kleurstof toe om de crosslinks te behouden. Laat beide monsters draaien op een 1,5% agarosegel bij 140 volt gedurende ongeveer 30 tot 45 minuten totdat de broomfenoldye in de laatste driekwart van de weg is gegaan. Als de sonicatie succesvol was, brengt u gesoniceerde lysaten over naar twee milliliterbuisjes met 150 microliters 10% Triton X-100 en mengt u door te vortexen.Pellet het onoplosbare chromatine en puin door de gesoniceerde lysaten 20.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten te centrifugeren. Breng vervolgens de supernatanten over naar nieuwe twee milliliterbuisjes. Bewaar de monsters onbeperkt bij min 80 graden Celsius.Voor elke chromatine immunoprecipitatie of ChIP-reactie, combineert u 1,5 milliliter gesoniceerde extracten met antilichaamparelkettingconjugaten in 1,5 milliliterbuisjes. Incubeer de buisjes op een minibuisjesrotator met een snelheid van negen bij vier graden Celsius overnacht. Controleer na een paar minuten om ervoor te zorgen dat de monsters niet lekken en goed mengen.De volgende dag, draai de buisjes kort door om de vloeistof in de doppen te verzamelen en plaats de buisjes een minuut lang op een magnetisch rek. Aspeer vervolgens het extract. Voeg 0,75 milliliter RIPA-buffer toe aan elk buisje.Vervolgens verwijdert u de buisjes van het magnetisch rek en draait u ze enkele keren om te mengen. Na een korte draai plaatst u de buisjes terug op het magneetrek en aspeert u het supernatant. Voeg na de laatste wasstap 0,75 milliliter 10 millimolar Tris HCL toe aan elk buisje.Verwijder de buisjes van het magnetisch rek en draai de monsters enkele keren om te mengen. Na een korte draai plaatst u de buisjes terug op het rek en aspeert u het supernatant. Nadat u de afwerkings- en detailreacties volgens het tekstprotocol hebt uitgevoerd, vult u de berekeningen van de ligatie master mix in.Maak vervolgens de ligatiemix in een 1,5 milliliterbuisje op ijs en pipet om de oplossing te mengen. Met de monsters op het magnetisch rek, voegt u 48 microliter P7 ligatie master mix en twee microliters van een ander adapterindex toe aan elk van de monsterharsen. Incubeer de monsters in een ThermoMixer bij drie keer g bij 25 graden Celsius gedurende twee uur.Na het wassen van de monsters en het uitvoeren van de Phy 29 nick reparatie en kinasereacties volgens het tekstprotocol, vult u de berekeningen van de lambda exonuclease master mix in en maakt u de lambda exonuclease mix in een 1,5 milliliterbuisje op ijs. Voeg 50 microliter lambda exonuclease mix toe aan elk monsterhars terwijl deze nog op het magnetisch rek staat. Incubeer vervolgens de monsters in een ThermoMixer bij drie keer g bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.Na het afzuipen van de laatste wasstap zoals beschreven in het tekstprotocol, voert u de RecJf nuclease reactie uit door de berekeningen van de RecJf master mix in te vullen en de RecJf mix op ijs te maken. Voeg 50 microliter van de RecJf mix toe aan elk monsterhars op het magnetisch rek. Incubeer vervolgens de monsters in een ThermoMixer bij drie keer g bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.Na het afzuipen van de laatste wasstap, bereidt u de ChIP elutiebuffer en proteinase K master mix voor en voegt u 200 microliter van de oplossing toe aan elk monsterhars. Incubeer de monsters in een ThermoMixer bij drie keer g bij 65 graden Celsius gedurende de nacht met een verwarmd deksel om condensatie te voorkomen. De volgende dag, draait u de monsters kort en plaatst u de buisjes een minuut lang op het magnetisch rek.Breng vervolgens 200 microliter supernatant over naar een nieuw 1,5 milliliterbuisje met 200 microliter TE buffer. Na DNA extractie, P7 primaire extensie en ATL reacties, vult u de berekeningen van de P5 adapter ligatietafel master mix in en maakt u de ligatie master mix op ijs. Voeg 20 microliter van de ligatiemix toe aan elk monster en pipet om te mengen.Incubeer vervolgens de monsters in een thermische cycler bij 25 graden Celsius gedurende twee uur. Voer DNA-zuivering en -kwantificering uit volgens het tekstprotocol. Zoals hier getoond, is het de moeite waard om tijd te besteden aan het optimaliseren van de sonicatiecondities om hoogwaardige chromatine extracten te verkrijgen die DNA-fragmenten tussen 100 tot 500 basenparen opleveren.Een elektroforetisch mobiliteitsverschuivingsassay wordt gebruikt om te verifiëren dat de gesoniceerde extracten intacte eiwit-DNA-crosslinks bevatten, wat duidelijk is als een superverschuiving van

the-chip-exo-method-identifying-protein-dna-interactions-with-near

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Chromatine Interactie Analyse door Gekoppeld-End Tag Sequencing (Chia-PET) is een methode...

Chromatine Interactie Analyse met gepaarde-End Tag Sequencing (Chia-PET) voor het in kaart brengen van chromatine Interacties en begrijpen Transcriptie Verordening

In this video, we demonstrate the chromatin immunoprecipitation technique to identify protein binding sites on specific regions of the genomic DNA of oligodendrocyte precursor cells via the selective immunoprecipitation of protein-bound chromatin fragments. This method helps to study the interaction of several regulatory proteins, including transcription factors involved in gene regulation.

Chromatin Immunoprecipitation to Identify Target Protein Binding Sites on Genomic DNA

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

Deze video artikel beschrijft een in vitro microarray gebaseerde methode om het gen doelstellingen en bindingsplaatsen bepalen voor twee componenten systeem respons toezichthouders.

DNA-affiniteit-gezuiverd Chip (DAP-chip) methode om Gene Doelen bepalen voor bacteriële Twee componenten Regulatory Systems

Sequentiële zout winning van chromatine gebonden eiwitten is een nuttig instrument voor het bepalen van de bindende eigenschappen van grote eiwitcomplexen. Deze methode kan worden gebruikt om te evalueren van de rol van individuele subeenheden of domeinen in de algehele affiniteit van een eiwit complex om te bulk chromatine.

Sequentiële zout extracties uit te voeren voor de analyse van Bulk chromatine bindende eigenschappen van chromatine complexen wijzigen

We beschrijven chromatin endogene splitsing gekoppeld aan high-throughput sequencing (ChEC-seq), een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -orthogonale methode voor het mappen van eiwitbindingsplaatsen genoom-wijd met micrococculaire nuclease (MNase) fusie-eiwitten.

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Nauwkeurige bepaling van eiwitbindende locaties in het genoom is belangrijk voor het begrijpen van genregulatie. Hier beschrijven we een genomische mapping methode die chromatine-immunogeprecipiteerd DNA behandelt met exonucleasevertering (ChIP-exo) gevolgd door sequencing met hoge doorvoer. Deze methode detecteert eiwit-DNA interacties met near base-pair mapping resolutie en hoge signaal-ruisverhouding bij zoogdierneuronen.

Hoge resolutie mapping van eiwit-DNA interacties in muis stamcel-afgeleide neuronen met behulp van chromatine immunoprecipitation-exonuclease (ChIP-Exo)

Dit artikel introduceert essentiële stappen van immunostaining en chromatine immunoprecipitatie. Deze protocollen worden vaak gebruikt om DNA-schadegerelateerde cellulaire processen te bestuderen en om de rekrutering van eiwitten die betrokken zijn bij DNA-reparatie te visualiseren en te kwantificeren.

Visualiseren en kwantificeren van endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade

De interactie van een ATP-afhankelijke chromatine remodeller met een DNA-ligand wordt beschreven met behulp van CD-spectroscopie. De geïnduceerde conformatieveranderingen op een genpromotor geanalyseerd door de gegenereerde pieken kunnen worden gebruikt om het mechanisme van transcriptionele regulatie te begrijpen.

CD-spectroscopie om DNA-eiwitinteracties te bestuderen

CUT&amp;RUN en zijn varianten kunnen worden gebruikt om de eiwitbezetting op chromatine te bepalen. Dit protocol beschrijft hoe de eiwitlokalisatie op chromatine kan worden bepaald met behulp van eencellige uliCUT &amp; RUN.

Single-Cell Factor Lokalisatie op Chromatine met behulp van Ultra-Low Input Cleavage Under Targets en Release met Nuclease

Een UV-gebaseerde ChIRP-methode om directe interacties tussen lncRNA en eiwitten te identificeren.

Een UV-gebaseerde ChIRP-methode voor de verifieerbare identificatie van eiwitten die direct interageren met LncRNA: van gekweekte cellen tot muistestikels

Leer de ChIP-exo methode voor het identificeren van eiwit-DNA interacties met nabij basenpaar precisie. Deze techniek helpt onderzoekers genregulatie en epigenetica te bestuderen met uitzonderlijk lage achtergrondruis.

De chip-exo Methode: Het identificeren van eiwit-DNA interacties met Near basenparen Precision

Meer video's verkennen