Name: Productie, kristallisatie en structuur bepalen van C. difficile PPEP-1 via Microseeding en zink-SAD (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Leer hoe je hoogwaardige kristallen van rPPEP-1 uit Clostridium difficile produceert via microseeding voor röntgendiffractie. Deze methode verbetert kristalkwaliteit en versnelt structurele analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken het personeel bij de bundellijn X06DA bij de Zwitserse Light Source, Paul-Scherrer-Instituut, Villigen, Zwitserland voor ondersteuning tijdens het verzamelen van gegevens synchrotron. We zijn dankbaar voor Monika Gompert voor een uitstekende technische ondersteuning. Het project werd ondersteund door de Universiteit van Keulen en verlenen INST 216 / 682-1 FUGG van de Duitse Research Council. Een PhD beurs van de International Graduate School in Development Gezondheid en Ziekte aan CP wordt erkend. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen uit de Europese Gemeenschap Zevende Kaderprogramma (FP7 / 2007-2013) onder subsidieovereenkomst nr 283.570 (BioStruct-X).

<ol><li>Bouza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+Clostridium+difficile+infection%3A+understanding+the+healthcare+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden.</a> Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).</li>
<li>O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection+caused+by+the+epidemic+BI%2FNAP1%2F027+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1913-1924 (2009).</li>
<li>Mitchell, B. G., Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+and+Clostridium+difficile+infection%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Resist+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">Mortality and Clostridium difficile infection: a review.</a> Antimicrob Resist Infect Control. 1 (1), (2012).</li>
<li>George, W. L., Sutter, V. L., Finegold, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+agent-induced+diarrhea--a+bacterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial agent-induced diarrhea--a bacterial disease.</a> J Infect Dis. 136 (6), 822-828 (1977).</li>
<li>George, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Clostridium+difficile+as+a+cause+of+pseudomembranous+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+J%22%5BJournal%5D)">Identification of Clostridium difficile as a cause of pseudomembranous colitis.</a> Br Med J. 1 (6114), 695(1978).</li>
<li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrative+review%3A+the+new+epidemic+of+Clostridium+difficile-associated+enteric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficile-associated enteric disease.</a> Ann Intern Med. 145 (10), 758-764 (2006).</li>
<li>Kelly, C. P., LaMont, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile--more+difficult+than+ever%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile--more difficult than ever.</a> N Engl J Med. 359 (18), 1932-1940 (2008).</li>
<li>Ünal, C. M., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapeutic+strategies+for+Clostridium+difficile+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Novel therapeutic strategies for Clostridium difficile infections.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (3), 269-285 (2016).</li>
<li>Kelly, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Monoclonal+Antibody%2C+Bezlotoxumab+Targeting+C.+difficile+Toxin+B+Shows+Efficacy+in+Preventing+Recurrent+C.+difficile+Infection+%28CDI%29+in+Patients+at+High+Risk+of+Recurrence+or+of+CDI-Related+Adverse+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Monoclonal Antibody, Bezlotoxumab Targeting C. difficile Toxin B Shows Efficacy in Preventing Recurrent C. difficile Infection (CDI) in Patients at High Risk of Recurrence or of CDI-Related Adverse Outcomes.</a> Gastroenterology. 150 (4), S122(2016).</li>
<li>Tsutsumi, L. S., Owusu, Y. B., Hurdle, J. G., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+discovery+of+treatments+for+C.+difficile+infection%3A+A+clinical+and+medicinal+chemistry+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Progress in the discovery of treatments for C. difficile infection: A clinical and medicinal chemistry review.</a> Curr Top Med Chem. 14 (1), 152-175 (2014).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+secreted+Pro-Pro+endopeptidase+PPEP-1+%28ZMP1%2FCD2830%29+modulates+adhesion+through+cleavage+of+the+collagen+binding+protein+CD2831%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile secreted Pro-Pro endopeptidase PPEP-1 (ZMP1/CD2830) modulates adhesion through cleavage of the collagen binding protein CD2831.</a> FEBS Lett. 589 (24), 3952-3958 (2015).</li>
<li>Cafardi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+zinc+metalloprotease+through+a+global+analysis+of+Clostridium+difficile+extracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel zinc metalloprotease through a global analysis of Clostridium difficile extracellular proteins.</a> PLoS One. 8 (11), e81306(2013).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+secreted+metalloprotease+%28CD2830%29+from+Clostridium+difficile+cleaves+specific+proline+sequences+in+LPXTG+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel secreted metalloprotease (CD2830) from Clostridium difficile cleaves specific proline sequences in LPXTG cell surface proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (5), 1231-1244 (2014).</li>
<li>Schacherl, M., Pichlo, C., Neundorf, I., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+of+Proline-Proline+Peptide+Bond+Specificity+of+the+Metalloprotease+Zmp1+Implicated+in+Motility+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Basis of Proline-Proline Peptide Bond Specificity of the Metalloprotease Zmp1 Implicated in Motility of Clostridium difficile.</a> Structure. 23 (9), 1632-1642 (2015).</li>
<li>Rawlings, N. D., Waller, M., Barrett, A. J., Bateman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEROPS%3A+the+database+of+proteolytic+enzymes%2C+their+substrates+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Release 10.0), D503-D509 (2014).</li>
<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeds+to+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeds to crystals.</a> J Struct Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li>
<li>Dauter, Z., Dauter, M., Dodson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jolly+SAD%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Jolly SAD.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (Pt 3), 494-506 (2002).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+PyMOL+Molecular+Graphics+System%22">The PyMOL Molecular Graphics System</a>. , Schrödinger, LLC. (2002).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+phase+ambiguity+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography.</a> Methods Enzymol. 115, 90-112 (1985).</li>
<li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Zwart, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+structure+solution+with+the+PHENIX+suite%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated structure solution with the PHENIX suite.</a> Methods Mol Biol. 426, 419-435 (2008).</li>
<li>Zheng, H., Handing, K. B., Zimmerman, M. D., Shabalin, I. G., Almo, S. C., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallography+over+the+past+decade+for+novel+drug+discovery+-+where+are+we+heading+next%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next?</a> Expert Opin Drug Discov. 10 (9), 975-989 (2015).</li>
<li>Rubino, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+zinc-bound+Zmp1%2C+a+zinc-dependent+metalloprotease+secreted+by+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of zinc-bound Zmp1, a zinc-dependent metalloprotease secreted by Clostridium difficile.</a> J Biol Inorg Chem. 21 (2), 185-196 (2016).</li>
<li>Carson, M., Johnson, D. H., McDonald, H., Brouillette, C., Delucas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((His-tag+impact+on+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">His-tag impact on structure.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63 (Pt 3), 295-301 (2007).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasteiger%2C+E+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).</li>
<li>Dummler, A., Lawrence, A. M., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+the+detection+of+soluble+fusion+constructs+expressed+in+E.+coli+using+a+modular+set+of+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors.</a> Microb Cell Fact. 4, 34(2005).</li>
<li>Stura, E. A., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+the+streak+seeding+technique+in+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Crys+Growth%22%5BJournal%5D)">Applications of the streak seeding technique in protein crystallization.</a> J Crys Growth. 110 (1), 270-282 (1991).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Röntgenkristallografie blijft de snelste en meest nauwkeurige manier vast driedimensionale omgeving-atomaire resolutie structuren van eiwitten 28. Het vereist echter de groei van geordende éénkristallen. Deze zijn vaak moeilijk te bereiken en de kristallijne toestand kunstmatig. Een vergelijking van eiwitstructuren bepaald met röntgenkristallografie met die bepaald met andere methoden, met name NMR, zich over het algemeen een goede overeenstemming. Bij PPEP-1, een NMR structuur onlangs gepubliceerd 29</s...

Clostridium difficile is een van de belangrijkste oorzaken van nosocomiale antibiotica geassocieerde diarree infecties 1. Dit Grampositieve anaërobe bacterie wordt via de sporenvorm via de fecaal-orale route. In de afgelopen tien jaar, nieuwe &#39;&#39; epidemie &#39;&#39; of &#39;&#39; hypervirulent &#39;&#39; stammen (bv BI / NAP1 / 027) veroorzaakte een drastische toename van nieuwe infecties en fataliteit prijzen in Noord-Amerika en Europa 2. C. difficile-geassocieerde ziekte (CDAD) is een levensbedreigende darm ontsteking met een hoge fataliteit tarieven 3. De symptomen variëren van 4 tot diarree pseudomembraneuze colitis 5 en de vaak fatale toxisch megacolon 6. Behandeling van CDAD is moeilijk als de virulente stammen zijn multiresistente en de herhaling is hoog 7. Momenteel therapie omvat antibiotica metronidazol, fidaxomicine of vancomycine, of repetititief terugkerende gevallen fecale microbiota transplantatie. Nieuwe therapeutische strategieën zijn dringend nodig 8. Er is enige vooruitgang is geboekt als het therapeutische monoklonaal antilichaam Bezlotoxumab, gericht op C. difficile toxine B 9, heeft onlangs met succes geslaagd voor fase III klinische studies en is ingediend voor goedkeuring bij de FDA en EMA. Daarnaast worden nieuwe antibiotica getest momenteel in verschillende stadia van klinische proeven 10. Om een ​​effectieve behandeling van nieuwe therapeutische doelen moeten worden geïdentificeerd ontwikkelen. De recent ontdekte C. difficile protease proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) is een dergelijk veelbelovend doelwit, het gebrek aan PPEP-1 in een knock-out stam vermindert virulentie van C . difficile in vivo 11. PPEP-1 is een uitgescheiden metalloprotease 12,13 splitsen twee C. difficile adhesinen hun C-terminus 13 waardoor aldus de hechtende bacteria van de menselijke darm epitheel. Daarom wordt betrokken bij het handhaven van het evenwicht tussen de vastzittende en beweeglijke fenotype van C. difficile. Om selectieve remmers te ontwikkelen tegen PPEP-1 en te begrijpen hoe het haar substraten erkent intieme kennis van de driedimensionale structuur is onontbeerlijk. We hebben loste het eerste kristalstructuur van PPEP-1 alleen en in complex met een substraat peptide 14. PPEP-1 is de eerste bekende protease dat selectief splitst peptidebindingen tussen twee prolineresten 15. Het bindt het substraat in een dubbelblinde wijze geknikte en stabiliseert via langere alifatisch-aromatische netwerk van residuen in de S-lus die de protease actieve plaats 14 omvat. Dit substraat bindingsmodus uniek is PPEP-1 en niet in menselijke proteasen date. Dit maakt het een veelbelovende drug target, en off-target effecten van remmers zeer onwaarschijnlijk. Het ontwikkelen en het scherm selectieve PPEP-1 inwibitors in de toekomst een grote hoeveelheid zuiver en monodisperse PPEP-1 eiwit nodig. Teneinde voorts de wijze van binding van eerste remmers, co-kristalstructuren met PPEP-1 te bepalen zullen bepalen. In onze handen PPEP-1 produceert voortdurend vergroeide kristallen. Aldus hebben we een optimalisatieprocedure enkelvoudige diffractie kwaliteit kristallen van PPEP-1 kunnen produceren. In dit protocol beschrijven we in detail de productie, zuivering, kristallisatie en structuur oplossing van PPEP-1 14. We maken gebruik van intracellulaire expressie in Escherichia coli van een PPEP-1 variant ontbreekt de secretie signaalsequentie, affiniteitschromatografie en size exclusion chromatografie met het verwijderen van de zuivering tag, gevolgd door microseeding 16 in een optimalisatie scherm en structuurbepaling via zink single-golflengte afwijkende dispersie (zink-SAD) 17. Dit protocol kan worden aangepast voor productie en structuurbepaling van andere eiwitten (bv &lt;/ Em&gt; metalloproteasen), en in het bijzonder voor de productie van eiwitten vergroeide kristallen. Op verzoek, plasmide-DNA van het construct (pET28a-NHis-rPPEP-1) en diffractie gegevens kunnen worden verstrekt voor educatieve doeleinden.

<table><tbody><tr><td>Genen / Vectors / celstammen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a vector</td><td>Merck-Millipore</td><td>69864</td><td>Thrombin afsnijdbaar N-terminaal His-tag</td></tr><tr><td>E. coli stam BL21 (DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td><td>RNase H-deficiënt</td></tr><tr><td>Codon-geoptimaliseerd gen (voor E. coli) van PPEP-1 (CD630_28300)</td><td>Geneart (Thermo Fisher Scientific)</td><td>aangepast</td><td>aminozuren 27-220</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Chemicaliën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>ieder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>ieder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antischuim B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td>water-silicone emulsie</td></tr><tr><td>Agar</td><td>ieder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>ieder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A1008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td>bufferkwaliteit</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ieder</td><td></td><td>bufferkwaliteit</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Imidazool</td><td>AppliChem</td><td>A1073</td><td>bufferkwaliteit</td></tr><tr><td>Thrombine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumfosfaat dibasicum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215996</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol 100%</td><td>ieder</td><td></td><td>zuiverste kwaliteit</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td>ieder</td><td></td><td>voor opslag en bevriezing van kristallen</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur (algemeen)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schudende incubator</td><td>ieder</td><td></td><td>temperatuur van 20 &deg;C - 37 &deg;C</td></tr><tr><td>Glaswerk</td><td>ieder</td><td></td><td>baffled Erlenmeyer kolven (50 ml - 2,8 L)</td></tr><tr><td>Centrifuge voor grote kweekvolumes</td><td>ieder</td><td></td><td>centrifuge voor verwerking van volumes tot 12 L</td></tr><tr><td>Sonicator Vibra-Cell VCX500</td><td>Sonics</td><td>SO-VCX500</td><td>of elke andere sonicator/cel-disruptor</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>ieder</td><td></td><td>centrifuge die snelheden tot 150.000 x g biedt</td></tr><tr><td>NiNTA Superflow hars</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lege glazen Econo-Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7371007</td><td>of elke andere lege glazen of plastic kolom</td></tr><tr><td>Grootte-uitsluitingschromatografie kolom HiLoad Superdex 200 16/600</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>Chromatografie systeem &Auml;kta Purifier</td><td>GE Healthcare</td><td>28406264</td><td>of elk ander chromatografie systeem</td></tr><tr><td>Dialyseslang Spectra/Por 3</td><td>Spectrum Labs</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Dialyseslang sluitingen</td><td>Spectrum Labs</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafiltratie units (concentrators) 10.000 NWCO</td><td>ieder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spectrofotometer</td><td>ieder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur (kristallografie)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laag volume pipet 0,1-10 &micro;l</td><td>ieder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Positieve verplaatsing pipet Microman M10</td><td>Gilson</td><td>F148501</td><td></td></tr><tr><td>Kristallisatie robot</td><td>ieder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well kristallisatie platen TTP IQ met drie eiwit wells</td><td>TTP</td><td>4150-05810</td><td>of elke andere 96-well kristallisatie plaat</td></tr><tr><td>24-well CombiClover Junior Plate</td><td>Jena Bioscience</td><td>EB-CJR</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Clear Sealing Tape</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-511</td><td></td></tr><tr><td>Siliconized Glass Cover Slides</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-225</td><td></td></tr><tr><td>Commerciële kristallisatie screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal</td><td>Hampton Research</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>Commerciële kristallisatie screens: Wizard, PACT++, JCSG++</td><td>Jena Bioscience</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>JBS Beads-for-Seeds</td><td>Jena Bioscience</td><td>CO-501</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap SPINE HT (nylon lussen)</td><td>Hampton Research</td><td>diverse</td><td>lus groottes 0,025 mm - 0,5 mm</td></tr><tr><td>CrystalCap Vial</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Foam Dewar 800 ml</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Foam Dewar 2 L</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-675</td><td></td></tr><tr><td>Vial Clamp, Straight</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-670</td><td></td></tr><tr><td>CrystalWand Magnetic, Straight</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 6 Vial Holder</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-711</td><td></td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-708</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane Color Coder - Wit</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-713</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>ieder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rechte microforcep</td><td>ieder</td><td></td><td>voor manipulatie van sealing tape. etc.</td></tr><tr><td>Naald voor acupunctuur</td><td>ieder</td><td></td><td>bijv. uit een apotheek</td></tr><tr><td>Stereo microscoop</td><td>ieder</td><td></td><td>voor inspectie van kristallisatie platen en kristal montage, vergroting tot 160X</td></tr></tbody></table>

productie, kristallisatie en structuur bepalen van<em&gt; c. difficile</em&gt; ppep-1 via microseeding en zink-sad

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Er zijn nieuwe therapieën nodig om Clostridium difficile infecties te behandelen die een grote bedreiging vormen voor de menselijke gezondheid. De C. difficile metalloprotease PPEP-1 is een doelwit voor toekomstige ontwikkeling van remmers om de virulentie van het pathogeen te verminderen. Om biofysische en structurele karakterisering uit te voeren, evenals het screenen van remmers, zullen grote hoeveelheden zuiver en actief eiwit nodig zijn. We hebben een protocol ontwikkeld voor efficiënte productie en zuivering van PPEP-1 door het gebruik van E. coli als expressiegastheer, waardoor voldoende hoeveelheden en zuiverheid van eiwit worden verkregen voor kristallisatie en structuurbepaling. Bovendien kunnen met behulp van microseeding, sterk onderling verweven kristallen van PPEP-1 worden gekweekt tot goed geordende kristallen die geschikt zijn voor röntgendiffractie-analyse. De methoden kunnen ook worden gebruikt om andere recombinante eiwitten te produceren en om de structuren van andere eiwitten te bestuderen die intergrown kristallen produceren.

rPPEP-1 tot overexpressie wordt gebracht in verschillende E. coli-stammen, met de hoogste opbrengst in E. coli BL21 (DE3) Star (figuur 1C). Na de eerste NiNTA affiniteitschromatografiestap de 6xHis-tag met succes kan worden afgesplitst van de meeste eiwitten en in de tweede stap NiNTA onverteerde proteïne volledig worden gescheiden van trombine gedigereerde eiwit (figuur 1D). Op een S200 kolom 16/600 ongemerkte rPPEP-1 migreert als mono...

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is een uitgescheiden metalloprotease en veelbelovend geneesmiddel-doelwit van de humane ziekteverwekker Clostridium difficile. Hier beschrijven we alle methoden die nodig zijn voor de productie en structuurbepaling van dit eiwit.

Productie, kristallisatie en structuur bepalen van<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via Microseeding en zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Het algemene doel van deze procedure is om efficiënt enkele roosterdiffractiekwaliteitkristallen van recombinant proline proline endopeptidase-1, of rPPEP-1, eiwit te laten groeien. Zonder deze methode produceert rPPEP-1 onmiddellijk sterk onderling vergroeide kristallen die niet geschikt zijn voor röntgendiffractieanalyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een groot aantal goed geordende en goed diffracterende kristallen voor structurele bepaling van rPPEP-1 kan worden geproduceerd in een korte periode van tijd en met beperkte materiaalinvoer.Deze procedure maakt gebruik van de microcity-methode en kan worden aangepast voor elke succesvolle initiële kristallisatieconditie van rPPEP-1, evenals zijn substraatpeptidecomplexen. Deze methode kan worden aangepast om goed geordende kristallen van vrijwel elk eiwit te produceren dat onderling vergroeide kristallen oplevert. Het kan ook worden gebruikt in cross-seeding experimenten, eiwitvariatie of in cokristallisatie-experimenten met kleine moleculen.Visuele demonstratie van de omgang met kristallisatiemethoden is cruciaal, aangezien zelfs kleine variaties een significant effect kunnen hebben op de diffractiekwaliteit van de kristallen. Voer kristallisatieproeven uit in het sitting drop-formaat met behulp van standaard commercieel verkrijgbare schermen en een kristallisatierobot. Concentreer eerst het gezuiverde eiwit tot 12 milligram per milliliter met behulp van een centrifugaal ultrafiltratieapparaat in vijf minutenintervallen bij 4000 keer g en vier graden Celsius.Meng het eiwit na elk interval om precipitatie en verergering te voorkomen. Bepaal de eiwitconcentratie bij 280 nanometer met behulp van de extinctiecoëfficiënt van 25.900 per molair centimeter. Na het in evenwicht brengen van het eiwit tot 20 graden Celsius verwijdert u alle deeltjes en stof door 10 minuten te centrifugeren bij 16000 keer g en 20 graden Celsius.Om kristallisatieproeven uit te voeren, gebruikt u voorgevulde kristallisatieplaten die zijn afgesloten en bewaard bij vier graden Celsius. Wanneer u proeven instelt, werk dan snel, aangezien de kleine volumes snel uitdrogen. Gebruik indien mogelijk ook een vochtigheidskamer rond de dock van de robot.Nadat alle kristallisatieplaten zijn uitgebalanceerd tot 20 graden Celsius, stelt u het scherm in door eiwit en reservoir in subwells twee tot vier te pipetten. Gebruik een druppelvolume van 300 nanoliter. Gebruik eiwit-reservoirverhoudingen van 200:100 voor subwell twee, 150:150 voor subwell drie en 100:200 voor subwell vier.Verzegeld de plaat onmiddellijk en plaats deze in een kamer bij 20 graden Celsius. Inspecteer de schalen na het instellen elke dag tijdens de eerste week en volg daarna wekelijkse inspectie. Voor een cokristallisatie van de substraatpeptide rPPEP-1 complexen, meng rPPEP-1 bij 24 milligram per milliliter in een 1:1 verhouding met een zevenvoudige molaire overmaat van peptideoplossing, lyofilisaatpoeder opgelost in tris gebufferd zoutoplossing.Na incubatie gedurende 30 minuten bij 20 graden Celsius, verwijdert u alle deeltjes en stof door 10 minuten te centrifugeren bij 16000 keer g en 20 graden Celsius. Ga verder met kristallisatie met behulp van dezelfde microseeding-procedure als voor het ongebonden rPPEP-1-eiwit. Zeer onderling vergroeide kristallen van rPPEP-1 verschenen na twee dagen in een voorwaarde die 2,4 molaire ammoniumfosfaat dibasisch en 0,1 molaire trisapseal pH 8,5 bevatte.Om de initiële voorwaarde te optimaliseren, gebruik software om de volumes en het pipetschema te berekenen om twee milliliter van elke voorwaarde te verkrijgen die 10 optimaliseringsschermen mogelijk maakt. Voorwaarden omvatten 1,8 tot 2,55 molaire ammoniumfosfaat dibasisch in stappen van 0,15 molaire evenals 0,1 molaire trisapseal pH 7,5 tot 9,0 in stappen van 0,5 pH-eenheden. Bereid een rasterscherm voor dat 24 voorwaarden uit voorraadoplossingen omvat.Gebruik het pipetschema om de afzonderlijke voorwaarden samen te stellen. Pipet 200 microliter van elke rasterschermoplossing in de putjes van een 24-wellsplaat en breng de plaat in evenwicht bij 20 graden Celsius. Stel de kristallisatieplaat handmatig in.Gebruik een druppelvolume van drie microliter en een eiwit-reservoirverhouding van 2:1, 1,5:1:5 en 1:2. Gebruik hiervoor een positieve verplaatsingspijp om luchtbelvorming te voorkomen. Verzegeld de plaat onmiddellijk.Plaats vervolgens de plaat in een kamer bij 20 graden Celsius. Na één tot vier dagen verschijnen zeer onderling vergroeide kristallen van rPPEP-1 in de vier voorwaarden die 2,55 molaire ammoniumfosfaat dibasisch en 0,1 molaire trisapseal pH 7,5 tot 9,0 bevatten, terwijl er geen kristallen worden gevormd in de resterende 20 voorwaarden. Voer de microseeding-procedure uit om enkele kristallen van rPPEP-1 in deze voorwaarden te verkrijgen.Om een microseed-stock voor te bereiden, kiest u eerst een enkele onderling vergroeide kristallen van een van de succesvolle voorwaarden. Breng vervolgens 50 microliter van de respectieve moedervloeistof over in een 1,5 milliliterbuisje met een kleine, zeer gepolijste glazen kraal en een microliter van de moedervloeistof op het glazen deksel. Gebruik een gemonteerde nylon-smeermiddel, vis de kristallen eruit en breng deze over in de druppel op het glazen deksel.Breng vervolgens de vloeistof met de kristallen over in de buis en vortex met hoge snelheid gedurende 30 seconden, zorg ervoor dat de glazen kraal ronddraait. Maak een 1:1000 verdunning van de zaadstock in een nieuwe 1,5 milliliterbuis met dezelfde vers bereide voorwaarde en vortex gedurende vijf seconden. Verwijder vervolgens het afdichtingsdeksel van de plaat die de 20 voorwaarden met heldere druppels bedekt.Pipet 0,5 microliter van de zaadstock in de putjes. Verzegeld de plaat en plaats deze in een kamer bij 20 graden Celsius. Na het toepassen van deze microseeding-techniek verschijnen enkele kristall

production-crystallization-structure-determination-c-difficile-ppep-1

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hierin wordt beschreven de procedure geïmplementeerd in de Caffrey Membrane Structurele en Functionele Biologie Groep handmatig in te stellen tot kristallisatie onderzoeken van membraaneiwitten in lipide mesofasen.

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

Structure-based drug design speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van geneesmiddelen. Nastreven van meerdere doelen tegelijkertijd verhoogt de kans op succes voor lood ontdekking. Het volgende artikel belicht hoe de Seattle Structural Genomics Centrum Infectieziektebestrijding maakt gebruik van een multi-target benadering voor gen-tot-structuur bepaling van de PB2 influenza A subunit.

Multi-target Parallel Processing Aanpak voor Gene-to-structuur bepalen van de Influenza Polymerase PB2 Subunit

Source: Figueroa, D. M., et.al. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the production of Escherichia coli spheroplasts by first inhibiting cell division to induce filamentation, followed by enzymatic digestion of the cell wall. The process includes controlled addition of a chelating agent, DNase, and an osmotic stabilizer to ensure proper spheroplast formation and...

Preparation of E. coli Spheroplasts

Biofysische en biochemische studies van interacties tussen membraan-ingebed eiwitdomeinen geconfronteerd met vele technische uitdagingen, waarvan de eerste is het verkrijgen van passende studiemateriaal. Dit artikel beschrijft een protocol voor het produceren en zuiveren van disulfide-gestabiliseerde transmembraan peptide complexen die geschikt zijn voor structurele analyse door oplossing kernspinresonantie (NMR) en andere analytische toepassingen.

Productie van Disulfide gestabiliseerde Transmembrane peptidecomplexen voor structurele studies

β-vat buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben veel functies binnen de buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten. Hier hopen we een bekende knelpunt in structurele studies te verlichten door protocollen te presenteren voor de productie van β-vat OMP's in voldoende hoeveelheden voor structuurbepaling door röntgenkristallografie of NMR-spectroscopie.

Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins

Een gestroomlijnde protocol voor het uitvoeren van een uitgebreide biochemische en structurele karakterisering van een koolhydraat-substraat bindend-proteïne van Streptococcus pneumoniae is gepresenteerd.

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Hier presenteren we een protocol voor de productie van gramnegatieve Escherichia coli (E. coli) spheroplasts en gram-positieve Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasten duidelijk visualiseren en snel karakteriseren Peptide-bacteriën interacties. Dit biedt een systematische methode om te definiëren membraan lokaliseren en translocating peptiden.

Productie en visualisatie van bacteriële Spheroplasts en protoplasten te karakteriseren antimicrobiële Peptide lokalisatie

We beschrijven protocollen voor de structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO door Röntgen kristallografie. De methoden omvatten eiwit expressie, zuivering en karakterisering, evenals strategieën voor succesvolle kristal optimalisatie en structuurbepaling van het eiwit in zijn ongebonden vorm.

Productie, kristallisatie en structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO

Dit protocol is ontwikkeld om de dimer-dodecamer overgang van TmPep1050, een M42 aminopeptidase, op structureel niveau te bestuderen. Het is een eenvoudige pijplijn vanaf eiwitzuivering tot röntgengegevensverwerking. Crystallogenesis, data set indexatie, en moleculaire vervanging zijn benadrukt door middel van een geval van studie, TmPep1050H60A H307A variant.

X-Ray Kristallografie om de oligomerische staat overgang van de Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 studie

Een veelzijdig microfluïdisch apparaat wordt beschreven dat de kristallisatie van een enzym mogelijk maakt met behulp van de contradiffusiemethode, de introductie van een substraat in de kristallen door weken en de 3D-structuurbepaling van het enzym: substraatcomplex door een seriële analyse van kristallen in de chip bij kamertemperatuur.

Kristallisatie en structurele bepaling van een enzym: substraatcomplex door seriële kristallografie in een veelzijdige microfluïdische chip

Structuurbepaling van macromoleculaire complexen met behulp van cryoEM is routine geworden voor bepaalde klassen van eiwitten en complexen. Hier wordt deze pijplijn samengevat (monstervoorbereiding, screening, gegevensverzameling en -verwerking) en worden lezers gericht op verdere gedetailleerde bronnen en variabelen die kunnen worden gewijzigd in het geval van meer uitdagende exemplaren.

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Leer hoe je hoogwaardige kristallen van rPPEP-1 uit Clostridium difficile produceert via microseeding voor röntgendiffractie. Deze methode verbetert kristalkwaliteit en versnelt structurele analyse.

Productie, kristallisatie en structuur bepalen van

Meer video's verkennen