Productie, kristallisatie en structuur bepalen van C. difficile PPEP-1 via Microseeding en zink-SAD
December 30th, 2016
Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is een uitgescheiden metalloprotease en veelbelovend geneesmiddel-doelwit van de humane ziekteverwekker Clostridium difficile. Hier beschrijven we alle methoden die nodig zijn voor de productie en structuurbepaling van dit eiwit.
Het algemene doel van deze procedure is om efficiënt enkele roosterdiffractiekwaliteitkristallen van recombinant proline proline endopeptidase-1, of rPPEP-1, eiwit te laten groeien. Zonder deze methode produceert rPPEP-1 onmiddellijk sterk onderling vergroeide kristallen die niet geschikt zijn voor röntgendiffractieanalyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een groot aantal goed geordende en goed diffracterende kristallen voor structurele bepaling van rPPEP-1 kan worden geproduceerd in een korte periode van tijd en met beperkte materiaalinvoer.
Deze procedure maakt gebruik van de microcity-methode en kan worden aangepast voor elke succesvolle initiële kristallisatieconditie van rPPEP-1, evenals zijn substraatpeptidecomplexen. Deze methode kan worden aangepast om goed geordende kristallen van vrijwel elk eiwit te produceren dat onderling vergroeide kristallen oplevert. Het kan ook worden gebruikt in cross-seeding experimenten, eiwitvariatie of in cokristallisatie-experimenten met kleine moleculen.
Visuele demonstratie van de omgang met kristallisatiemethoden is cruciaal, aangezien zelfs kleine variaties een significant effect kunnen hebben op de diffractiekwaliteit van de kristallen. Voer kristallisatieproeven uit in het sitting drop-formaat met behulp van standaard commercieel verkrijgbare schermen en een kristallisatierobot. Concentreer eerst het gezuiverde eiwit tot 12 milligram per milliliter met behulp van een centrifugaal ultrafiltratieapparaat in vijf minutenintervallen bij 4000 keer g en vier graden Celsius.
Meng het eiwit na elk interval om precipitatie en verergering te voorkomen. Bepaal de eiwitconcentratie bij 280 nanometer met behulp van de extinctiecoëfficiënt van 25.900 per molair centimeter. Na het in evenwicht brengen van het eiwit tot 20 graden Celsius verwijdert u alle deeltjes en stof door 10 minuten te centrifugeren bij 16000 keer g en 20 graden Celsius.
Om kristallisatieproeven uit te voeren, gebruikt u voorgevulde kristallisatieplaten die zijn afgesloten en bewaard bij vier graden Celsius. Wanneer u proeven instelt, werk dan snel, aangezien de kleine volumes snel uitdrogen. Gebruik indien mogelijk ook een vochtigheidskamer rond de dock van de robot.
Nadat alle kristallisatieplaten zijn uitgebalanceerd tot 20 graden Celsius, stelt u het scherm in door eiwit en reservoir in subwells twee tot vier te pipetten. Gebruik een druppelvolume van 300 nanoliter. Gebruik eiwit-reservoirverhoudingen van 200:100 voor subwell twee, 150:150 voor subwell drie en 100:200 voor subwell vier.
Verzegeld de plaat onmiddellijk en plaats deze in een kamer bij 20 graden Celsius. Inspecteer de schalen na het instellen elke dag tijdens de eerste week en volg daarna wekelijkse inspectie. Voor een cokristallisatie van de substraatpeptide rPPEP-1 complexen, meng rPPEP-1 bij 24 milligram per milliliter in een 1:1 verhouding met een zevenvoudige molaire overmaat van peptideoplossing, lyofilisaatpoeder opgelost in tris gebufferd zoutoplossing.
Na incubatie gedurende 30 minuten bij 20 graden Celsius, verwijdert u alle deeltjes en stof door 10 minuten te centrifugeren bij 16000 keer g en 20 graden Celsius. Ga verder met kristallisatie met behulp van dezelfde microseeding-procedure als voor het ongebonden rPPEP-1-eiwit. Zeer onderling vergroeide kristallen van rPPEP-1 verschenen na twee dagen in een voorwaarde die 2,4 molaire ammoniumfosfaat dibasisch en 0,1 molaire trisapseal pH 8,5 bevatte.
Om de initiële voorwaarde te optimaliseren, gebruik software om de volumes en het pipetschema te berekenen om twee milliliter van elke voorwaarde te verkrijgen die 10 optimaliseringsschermen mogelijk maakt. Voorwaarden omvatten 1,8 tot 2,55 molaire ammoniumfosfaat dibasisch in stappen van 0,15 molaire evenals 0,1 molaire trisapseal pH 7,5 tot 9,0 in stappen van 0,5 pH-eenheden. Bereid een rasterscherm voor dat 24 voorwaarden uit voorraadoplossingen omvat.
Gebruik het pipetschema om de afzonderlijke voorwaarden samen te stellen. Pipet 200 microliter van elke rasterschermoplossing in de putjes van een 24-wellsplaat en breng de plaat in evenwicht bij 20 graden Celsius. Stel de kristallisatieplaat handmatig in.
Gebruik een druppelvolume van drie microliter en een eiwit-reservoirverhouding van 2:1, 1,5:1:5 en 1:2. Gebruik hiervoor een positieve verplaatsingspijp om luchtbelvorming te voorkomen. Verzegeld de plaat onmiddellijk.
Plaats vervolgens de plaat in een kamer bij 20 graden Celsius. Na één tot vier dagen verschijnen zeer onderling vergroeide kristallen van rPPEP-1 in de vier voorwaarden die 2,55 molaire ammoniumfosfaat dibasisch en 0,1 molaire trisapseal pH 7,5 tot 9,0 bevatten, terwijl er geen kristallen worden gevormd in de resterende 20 voorwaarden. Voer de microseeding-procedure uit om enkele kristallen van rPPEP-1 in deze voorwaarden te verkrijgen.
Om een microseed-stock voor te bereiden, kiest u eerst een enkele onderling vergroeide kristallen van een van de succesvolle voorwaarden. Breng vervolgens 50 microliter van de respectieve moedervloeistof over in een 1,5 milliliterbuisje met een kleine, zeer gepolijste glazen kraal en een microliter van de moedervloeistof op het glazen deksel. Gebruik een gemonteerde nylon-smeermiddel, vis de kristallen eruit en breng deze over in de druppel op het glazen deksel.
Breng vervolgens de vloeistof met de kristallen over in de buis en vortex met hoge snelheid gedurende 30 seconden, zorg ervoor dat de glazen kraal ronddraait. Maak een 1:1000 verdunning van de zaadstock in een nieuwe 1,5 milliliterbuis met dezelfde vers bereide voorwaarde en vortex gedurende vijf seconden. Verwijder vervolgens het afdichtingsdeksel van de plaat die de 20 voorwaarden met heldere druppels bedekt.
Pipet 0,5 microliter van de zaadstock in de putjes. Verzegeld de plaat en plaats deze in een kamer bij 20 graden Celsius. Na het toepassen van deze microseeding-techniek verschijnen enkele kristall
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel bespreekt de productie en structuurbepaling van proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1), een metalloprotease van Clostridium difficile. De focus ligt op een methode om hoogwaardige kristallen van recombinant PPEP-1 te kweken voor röntgendiffractie-analyse.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Structuurbiologie
- Eiwiskristallografie
- Biochemie
Achtergrond
- PPEP-1 is een uitgescheiden metalloprotease met potentie als doelwit voor geneesmiddelen.
- Kristallisatie van rPPEP-1 is uitdagend vanwege ingegroeide kristallen.
- Efficiënte kristalgroei is essentieel voor structurele analyse.
- De microcity-methode kan worden aangepast voor verschillende kristallisatiecondities.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het produceren van enkele roosterdiffractiekwaliteitskristallen van rPPEP-1.
- Om structurele bepaling van rPPEP-1 en zijn substraatcomplexen mogelijk te maken.
- Om een veelzijdige aanpak te bieden die toepasbaar is op andere eiwitten die ingegroeide kristallen opleveren.
Gebruikte methoden
- Microcity-methode voor kristalgroei.
- Aanpassing voor initiële kristallisatiecondities.
- Cross seeding-experimenten.
- Cokristallisatie met kleine moleculen.
Belangrijkste resultaten
- Efficiënte productie van goed-geordende kristallen van rPPEP-1.
- Een groot aantal geschikte kristallen voor röntgendiffractie.
- Methode toepasbaar op verschillende eiwitkristallisatiescenario's.
- Potentieel voor bredere toepassingen in structurele biologie.
Conclusies
- De ontwikkelde methode verbetert de kristalkwaliteit voor rPPEP-1 aanzienlijk.
- Deze aanpak kan structurele studies van andere eiwitten verbeteren.
- Toekomstig onderzoek kan deze techniek benutten voor geneesmiddelontdekking.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Determining the atomic structure of virulence factors like C. difficile PPEP-1 enables structure-guided inhibitor design to reduce pathogenicity. Reliable production of diffraction-quality crystals is a prerequisite for fragment screening and lead optimization in anti-infective programs. This microseeding protocol addresses a common bottleneck in structural biology by converting intergrown crystals into single-lattice forms suitable for X-ray diffraction.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of PPEP-1's substrate binding mode through high-resolution structural data.
- Operational Value: Provides pure, active protein in sufficient quantities for biophysical assays and inhibitor screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates well-ordered crystals capable of near-atomic resolution X-ray diffraction for detailed active-site mapping.
- Operational Value: Uses microseeding to optimize crystallization conditions with limited protein input, increasing throughput.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by revealing how substrate peptides interact with PPEP-1 via hydrogen bonds and aliphatic-aromatic networks.
- Operational Value: Produces crystals suitable for ligand soaking or co-crystallization to evaluate inhibitor binding.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the structural biology workflow from protein production to lead identification, enabling iterative cycles of crystallization, data collection, and structure-based design.
- Discovery Biology: Facilitates target validation by providing structural insights into PPEP-1 function and inhibition mechanisms.
- Screening: Yields crystals compatible with fragment screening and X-ray diffraction data collection for hit identification.
- Analytics: Delivers electron density maps that reveal substrate binding conformations and potential inhibitor interaction points.
- Translational Research: Connects atomic-level structural data to preclinical inhibitor optimization through defined binding modes.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other proteins prone to intergrown crystal formation, broadening utility across targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protease-substrate interactions through clear visualization of binding modes.
- Operational Value: Enables reproducible production of single-lattice crystals from initially poor crystallization hits.
- Strategic Value: Accelerates lead identification by providing high-quality structural data for computational docking and medicinal chemistry.
- Portfolio Impact: Improves confidence in target druggability assessments, supporting risk-adjusted investment decisions.
Implementation Considerations
- Expertise in protein purification, crystallization screening, and microseeding techniques.
- Access to crystallization robots, imaging systems, and X-ray diffraction beamlines.
- Standardization of protein concentration, drop ratios, and seeding protocols across teams.
- Adaptation of buffer conditions (e.g., ammonium phosphate, Tris pH) for different protein targets.
- Limitations include dependency on initial crystallization hits and optimization time for seed stock preparation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
Initial Screening of rPPEP-1 and Co-crystallization of rPPEP-1 with Ligands Using Commercial Screens
3:54
Crystal Optimization Using Microseeding
7:35
Crystal Mounting
10:45
Results: Evaluation of rPPEP-1 Crystal Growth Using Optimization Procedure
12:48
Conclusion
