Live-Imaging om te studeren microtubuli Dynamic Instabiliteit in taxaan-resistente borstkankers
20 februari 2017
In dit artikel rapporteren we een protocol dat een in vivo methode beschrijft om microtubuli dynamische instabiliteit te meten in docetaxel-resistente borstkankercellen (MCF-7TXT). In deze methode wordt een deconvolutie-microscopie-beeldvormingssysteem gebruikt om de expressie van GFP-tubuline in doelcellen te detecteren.
Het algemene doel van dit experiment is om de dynamische instabiliteit van microtubuli te meten in docetaxel-resistente borstkankercellen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de celbiologie te beantwoorden over de dynamische instabiliteit van microtubuli onder fysiologische omstandigheden, en na verschillende medicamenteuze behandelingen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het een eenvoudig, betrouwbaar en fysiologisch toepasbaar protocol biedt voor het bestuderen van microtubuli-dynamica in levende cellen.
Voordat u met de procedure begint, kweekt u de borstkankercellen in compleet kweekmedium in 10 centimeter kweekschalen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide tot de juiste mate van confluentie. De dag voor het experiment spoelt u 24 millimeter poly L-lysine gecoate glasdeksels met 70%alcohol en stelt u de schuiven bloot aan UV-licht gedurende de nacht. De volgende ochtend plaatst u één glasdeksel in elk putje van een zesputjesplaat.
Was vervolgens de culturen met PBS en los de cellen in elk schaaltje op met 0,5 milliliter trypsine EDTA. Wanneer de cellen zijn begonnen om zich van de schotelbodem te heffen, neutraliseert u de trypsine met vijf milliliter vers kweekmedium en telt u de cellen. Voeg vervolgens ongeveer één maal 10 de vijfde cellen toe aan elk glasdeksel, schud de schotel voorzichtig en plaats de cellen terug in de incubator voor minimaal 36 uur.
Om de microtubuli-dynamica van de cellen te meten, mengt u de GFP-gelabelde alpha-tubulin stockoplossing meerdere keren door inversie om een homogene oplossing te garanderen zonder vortexing. Vervolgens vervangt u het kweekmedium in elk putje door twee milliliter vers medium dat 40 microliter van de gelabelde tubuline bevat. Schud de schotel voorzichtig om een volledige menging van de marker met het kweekmedium mogelijk te maken en plaats de schotel terug in de incubator voor nog eens 24 uur.
De volgende dag vervangt u het kweekmedium door vers medium dat docetaxel bevat en plaatst u de schotel terug in de incubator voor 30 minuten. Terwijl de cellen worden geïnhibeerd, zet u de omgekeerde fluorescentiemicroscoop aan en verwarmt u de monsterhouder voor op 37 graden Celsius. Selecteer vervolgens de 60X 1,42 NA olie-objectieflens en monteer de eerste glasdeksel op de monsterhouder.
Bedek het monster met één milliliter vers 37 graden Celsius docetaxel bevattend medium en lokaliseer een cluster van platte cellen met een hoge GFP-gelabelde alpha-tubuline fluorescentie-intensiteit met duidelijk zichtbare microtubulistructuren. Richt u op het perifere gebied van een van de cellen in het cluster en stel de juiste belichtingstijd in in de beeldverwervingsfrequentie. Precies 50 minuten na het toevoegen van de eerste dosis docetaxel begint u met het opnemen van de microtubuli-dynamica gedurende twee minuten, waarbij u elke twee seconden een foto maakt.
Wanneer alle beelden zijn vastgelegd, beeldt u de volgende cel af zoals net gedemonstreerd, totdat er beelden zijn vastgelegd voor vijf cellen in totaal uit alle drie de putjes van elke docetaxel-concentratie. Wanneer alle beelden zijn vastgelegd voor elke remmerconcentratie opent u het deconvolutieprogramma, binnen het microscoopsysteem en klikt u op proces. Selecteer vervolgens deconvolve en sleep het beeldbestand naar het invoervenster.
Klik op do om het beeld te deconvolveren en open het gedeconvolveerde beeldbestand in de microscoopsoftware. Klik op bestand en sla op als film. Stel het filmformaat in op AV en de animatiestijl op vooruit.
Stel de compressiekwaliteit in op 100%en de framesnelheid op vijf per seconde. Controleer vervolgens het vakje door de tijd animeren en klik op do om de video te genereren. In dit representatieve experiment werden normale en docetaxel-resistente borstkankercellen behandeld met docetaxel en geïmagingd zoals net gedemonstreerd, maar de effecten van de behandeling op microtubuligroei en -verkorting waren het meest duidelijk in de niet-docetaxel-resistente cellen.
Inderdaad, het meten van de groeisnelheid van microtubuli en de verkorting onder behandelingsvoorwaarden van 0,5 micromolar docetaxel geeft een sterke remming van de tubuline-dynamica van ouderlijke maar niet van docetaxel-resistente cellen. Eenmaal onder de knie, kan het hele proces binnen 60 uur worden voltooid als de technieken correct worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om platte cellen te selecteren, met een hoge GFP-tubuline fluorescentie-intensiteit, en om zowel de intensiteit van de excitatiefluorescentie als de duur van de blootstelling te verminderen om vervaging van de GFP-fluorescentie te voorkomen.
Sinds de ontwikkeling ervan heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van cel- en kankerbiologie om de effecten van verschillende microtubuli-targetende middelen op normale en kankercellen te beoordelen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u dynamische instabiliteit van microtubuli kunt meten in levende cellen onder verschillende omstandigheden.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het meten van de dynamische instabiliteit van microtubuli in docetaxel-resistente borstkankercellen met behulp van deconvolution microscopie. De methode richt zich op de expressie van GFP-tubuline in levende cellen, wat inzicht geeft in het gedrag van microtubuli onder medicamenteuze behandeling.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Celbiologie
- Kankeronderzoek
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Microtubuli spelen een cruciale rol in de celstructuur en -functie.
- Docetaxelresistentie is een aanzienlijke uitdaging bij de behandeling van borstkanker.
- Inzicht in de dynamiek van microtubuli kan therapeutische strategieën informeren.
- GFP-tubuline maakt real-time visualisatie van het gedrag van microtubuli mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het bestuderen van microtubulusdynamiek in levende cellen.
- Het onderzoeken van de effecten van medicamenteuze behandelingen op de instabiliteit van microtubuli.
- Het verbeteren van het begrip van de biologie van kankercellen.
Gebruikte methoden
- In vivo imaging van microtubuli met behulp van deconvolution microscopie.
- Kweek van docetaxel-resistente borstkankercellen (MCF-7 TXT).
- Expressie van GFP-tubuline voor visualisatie.
- Voorbereiding van met poly-L-lysine gecoate dekglasjes voor celadhesie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van microtubuli-dynamiek in levende cellen.
- Demonstratie van de instabiliteit van microtubuli als reactie op een medicijnbehandeling.
- Vaststelling van een protocol dat op diverse celtypen kan worden toegepast.
- Inzicht in de mechanismen van medicijnresistentie in kankercellen.
Conclusies
- Het protocol biedt een waardevol instrument voor het bestuderen van microtubuli-dynamiek.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van het gedrag van kankercellen onder behandeling.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methode om andere therapeutische strategieën te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor management
Het meten van de dynamische instabiliteit van microtubuli in levende kankercellen biedt een fysiologisch relevante analyse om resistentiemechanismen tegen microtubuli-targetende middelen (MTA) te evalueren. Deze benadering maakt targetvalidatie mogelijk door het gedrag van microtubuli te koppelen aan de respons op geneesmiddelen, wat het voorspellende vertrouwen bij preklinische MTA-screening ondersteunt. De methode helpt bij het verminderen van risico's bij taxaan-gebaseerde therapieën door resistentiefenotypes vroegtijdig in het ontdekkingsproces te identificeren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt de therapeutische hypothese door de groei- en verkortingssnelheden van microtubuli te kwantificeren bij blootstelling aan docetaxel.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van de expressie van GFP-getagd tubuline in levende cellen om real-time, fysiologisch toepasbare beeldvorming mogelijk te maken zonder fixatie-artefacten.
- Voorspellende waarde: Maakt onderscheid tussen docetaxel-gevoelige en resistente fenotypen op basis van de inhibitie van microtubuli-dynamiek, wat bijdraagt aan de beoordeling van de betrouwbaarheid van het target.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaar voor Assay: Stelt een gestandaardiseerd protocol vast voor het meten van microtubuli-dynamiek in adherente borstkankercellen met behulp van deconvolutionele microscopie.
- Kwantitatieve Output: Genereert time-lapsegegevens die metingen van de groei- en verkortingssnelheden van microtubuli als functionele read-outs mogelijk maken.
- Toepassing voor Screening: Ondersteunt de evaluatie van MTA-effecten op microtubuli-instabiliteit in levende cellen, wat screening van verbindingen of genotypen faciliteert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Modelleert taxaanresistentie in borstkankercellen afgeleid van MCF-7, wat een weerspiegeling is van klinisch waargenomen resistentiemechanismen.
- Translationele continuïteit: Verbindt veranderingen in microtubuli-dynamiek met docetaxel-geïnduceerde mitotische arrest en apoptosisresistentie.
- Risicogebaseerde besluitvorming: Maakt vroege identificatie van resistentie-fenotypen mogelijk, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen in MTA-ontwikkelingsprogramma's.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische evaluatie, in het bijzonder voor microtubuli-targetende agentia waarbij het resistentiemechanisme gekoppeld is aan veranderde microtubuli-dynamiek.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing over het gedrag van microtubuli als determinant van de medicijnrespons in levende cellen.
- Screening: Biedt een assay-klaar systeem voor het kwantificeren van veranderingen in de microtubuli-instabiliteit na verbinding- of genetische perturbatie.
- Analytiek: Maakt meting van de groei- en verkortingssnelheden van microtubuli mogelijk als kwantitatieve, tijdopgeloste outputs voor de vergelijking van condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt metingen van dynamische instabiliteit met functionele uitkomsten zoals mitotische arrestatie en apoptose in resistente versus sensitieve cellen.
- Hergebruik op bedrijfsniveau: Vestigt een herbruikbaar imagingplatform dat toepasbaar is op meerdere MTA-klassen en celmodellen buiten docetaxel-resistente borstkanker.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid bij target-validatie door microtubuli-dynamiek te koppelen aan het drug-fenotype in een fysiologische context.
- Operationele waarde: Biedt een betrouwbaar, gestandaardiseerd protocol voor live-cell imaging met minimale gespecialiseerde apparatuur buiten fluorescentiemicroscopie.
- Strategische waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij MTA-resistentie, waardoor vroegtijdige risicoreductie en een verbeterde kapitaalefficiëntie in oncologieprogramma's mogelijk worden.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering van MTA-kandidaten door resistentiemechanismen te identificeren vóór in vivo-studies.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in live-cell imaging, fluorescentiemicroscopie en microtubuli-biologie.
- Afhankelijk van toegang tot een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met olie-objectief, een klimaatkamer en deconvolutionsoftware.
- Necessiteert standaardisatie van celzaaien, GFP-tubuline-expressie en de timing van de medicamentbehandeling over de experimenten heen.
- Houdt rekening met aanpassingen voor verschillende celtypen, microtubuli-markers of imaging-modaliteiten.
- Beperkt door risico's op fotobleaching, wat een zorgvuldige controle van de excitatie-intensiteit en belichtingsduur vereist, zoals vermeld in het protocol.
