Name: Live-Imaging om te studeren microtubuli Dynamic Instabiliteit in taxaan-resistente borstkankers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Leer microtubuli dynamische instabiliteit meten in docetaxel-resistente borstkankercellen via live-imaging met GFP-tubulin en deconvolutiemicroscopie. Deze methode biedt inzicht in gedrag onder behandeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek wordt ondersteund door financiering van CBCF (aan ZW).

1. Voorbereiding van de Cellen voor Live Imaging <ol><li> Celcultuur en zaaien <ol><li> Gebruik MCF-7 borstkankercellen geselecteerd op resistentie tegen docetaxel (MCF-7 TXT) en de niet-resistente ouderlijke cellijn (MCF-7 CC). De gedetailleerde selectieproces en de karakterisering van deze geselecteerde cellijnen werden eerder 24 beschreven. </li><li> Groeien alle cellen in 10 cm kweekschalen bij 37 ° C in een medium bestaande 90% Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) en 10% foetaal runderserum (FBS) aangevuld met niet-essentiële aminozuren. Handhaaf het medium in een 5% CO2 atmosfeer. Onderhouden MCF-7 cellen bij TXT 5 nM docetaxel. </li><li> Zaad cellen op dekglaasjes voor levende beeldvorming. Steriliseren 24 mm poly-L-lysine beklede dekglaasjes door ze af te spoelen met 70% alcohol en vervolgens bloot te stellen aan UV nachts. Plaats de dekglaasjes in een 6-well cultuur plaat van 35 mm. place één dekglaasje in elk putje. </li><li> Verwijder het medium uit de 10-cm kweekschaal en was de cellen met PBS. Voeg 0,5 ml trypsine-EDTA op de schotel naar de cellen van de schaal los. Voeg 5 ml kweekmedium de schotel naar de trypsine na het losmaken van de cellen neutraliseren. </li><li> Tel de cellen met een hemocytometer om het aantal cellen per volume-eenheid te bepalen. </li><li> Voeg ongeveer 10 5 cellen aan elke put op basis van het aantal cellen per volume-eenheid. Na voorzichtig schudden, zet de plaat terug in de incubator om de cellen te hechten aan de dekglaasjes. </li></ol></li><li> Expressie van GFP-gelabeld α-tubuline <ol><li> Om te testen microtubule dynamiek transduceren de cellen met GFP-gelabeld α-tubuline de commerciële GFP transductie controle (bv BacMam) volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Cultuur van de cellen in de put gedurende 36 uur in een 37 ° C celkweek incubator com toestaancomplete hechting en 60% samenvloeiing. </li><li> Bereken de juiste hoeveelheid GFP-gelabeld α-tubuline te voegen aan elk putje, volgens de volgende vergelijking: <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/55027/55027eq1.jpg" /> Het aantal cellen is het geschatte totale aantal cellen in de put bij de etikettering en de gewenste PPC is het aantal deeltjes per cel. OPMERKING: zaaien MCF-7 cellen moeten verdubbelen het aantal cellen van 10 5 tot 2 x 10 5 met een gewenste PPC van 20, het volume nodig zijn voor elk dekglaasje dus 40 pl. Voor verschillende cellen, berekend op het volume op basis van de bovenstaande formule kan niet de beste. Het exacte volume moet worden aangepast aan de werkelijke expressieniveau van GFP-tubuline. </li><li> Meng de GFP hebben herhaaldelijk α-tubuline door inversie om een ​​homogene oplossing te verzekeren. Doe niet vortex. LET OP: Voor de controle, de Null (controle) reagens mist elke zoogdieren genetischeelementen en kunnen worden gebruikt om te bepalen potentiaal baculovirus gemedieerde effecten en achtergrondfluorescentie. Een niet-gerichte GFP transductie controle kan ook worden gebruikt, die oplichten de gehele cel. </li><li> Vervang het kweekmedium met vers medium. Voeg 2 ml van het nieuwe medium en 40 ul van GFP-gelabeld α-tubuline aan elk putje. </li><li> Schud de plaat voorzichtig om volledige menging van GFP-gelabeld α-tubuline met het kweekmedium mogelijk te maken. Zet de plaat naar de incubator en incubeer gedurende 24 uur om de expressie van GFP-tubuline mogelijk. </li></ol></li><li> Behandel cellen met docetaxel Opmerking: Dit experiment is het effect van docetaxel op microtubule dynamische instabiliteit testen. Aldus worden de cellen behandeld met de gewenste concentratie van docetaxel. <ol><li> Bereid een medium bestaande 90% DMEM en 10% FBS aangevuld met niet-essentiële aminozuren. Gebruik DMEM zonder fenolrood omdat fenolrood kunnen interfereren met de fluorescence van GFP-tubuline. Voeg de gewenste concentratie docetaxel (variërend van 10 nM tot 10 uM). De voorraad oplossing van docetaxel 10 mm in dimethylsulfoxide (DMSO). </li><li> Voorverwarmen de docetaxel medium tot 37 ° C in de weefselkweek incubator. </li><li> Vervang het normale kweekmedium met de docetaxel medium en incubeer gedurende 30 min in weefselkweek incubator. Er moet ten minste 3 dekglaasjes per putje voor elke concentratie docetaxel. </li></ol></li></ol> 2. Live-Imaging te onderzoeken microtubuli Dynamic Instabiliteit <ol><li> Opstellen van het systeem <ol><li> Experimenten uitvoeren in een kamer gehandhaafd op 37 ° C en 5% CO2. Acquire fluorescentie beelden door tijdsverloop met een microscopische systeem uitgerust met een 60x, 1,42 NA olie-objectief op een omgekeerde fluorescentie microscoop en met een CCD-camera. </li><li> Stel de cellen voor levende beeldvorming. Pre-warm zowel het monster houder enhet medium tot 37 ° C. Kies een dekglaasje te onderzoeken. Monteer de dekglaasje van de rente op een monsterhouder en incubeer het met 1 mL van de docetaxel-medium bereid in stap 1.3.1. </li></ol></li><li> Live-beeldvorming van microtubule dynamische instabiliteit <ol><li> Identificeer de cellen die worden gebruikt voor de beeldvorming. Zij moet vlak zijn, een hoge fluorescentie-intensiteit van GFP expressie-tubuline en microtubuli duidelijke structuren. </li><li> Kies een cel uit de groep van geïdentificeerde cellen uit stap 2.2.1 om eerst te onderzoeken. Focus op het perifere gebied van de geïdentificeerde cel. Het opzetten van het programma voor de belichtingstijd en de frequentie van het beeld acquisitie. Aangezien de blootstelling is meestal 0,5 s, worden de beelden om de twee s worden verworven. </li><li> Laat nog eens 20 min voor de stappen van 1,33 tot 2.2.3. Dus precies 50 minuten na toevoeging van docetaxel, zoals beschreven in stap 1.3.3, start beeldvorming (dit is voor standaardisatie). </li><li> Noteer de microtubule dynamics gedurende 2 minuten, het nemen van een foto om de 2 s. In totaal krijgen 60 beelden voor het geïdentificeerde cel. </li><li> Ga naar de volgende geïdentificeerde cel en herhaal de stappen 2.2.2 tot 2.2.4. Herhaal deze procedure tot 5 cellen zijn afgebeeld. Het is noodzakelijk om dit te doen voor de tijd bereikt 70 min na toevoeging van docetaxel, zoals beschreven in stap 1.3.3. </li><li> Voor elke behandeling staat, herhaalt u de stappen 2.2.1 tot en met 2.2.5 voor 3 verschillende dekglaasjes. In totaal afbeelding 15 cellen, die is genoeg gegevens om microtubule dynamische instabiliteit te meten. </li></ol></li></ol> 3. Beeldverwerking en data-analyse <ol><li> Deconvolutie afbeeldingen <ol><li> Deconvolutie van de verkregen beelden van een hoge kwaliteit te bereiken. Open de deconvolutie programma met de microscoop systeem. </li><li> Klik op &quot;Process&quot; en selecteer &quot;Deconvolutie.&quot; Sleep het beeldbestand om het venster &quot;Input&quot; en klik op &quot;Do.&quot; Het beeldbestand wordt deconvolved, en dedeconvolved bestand wordt automatisch opgeslagen als een nieuw bestand. </li></ol></li><li> Generatie van video&#39;s <ol><li> Klik op het deconvolved image-bestand te openen met uitgeruste software. </li><li> Klik op &quot;File&quot; en selecteer &quot;Opslaan als film.&quot; Selecteer de &quot;Movie formaat&quot; als &quot;AV&quot; en de &quot;Animation stijl&quot; als &quot;Forward&quot;. Stel de &quot;Compression kwaliteit&quot; tot &quot;100%&quot; en de &quot;Frame rate&quot; op &quot;5 / seconde.&quot; </li><li> Vink het vakje van &quot;Animate door de tijd&quot; en klik op &quot;Do it.&quot; De video wordt gegenereerd. </li></ol></li><li> Meting van microtubuli verkorting en groeisnelheid <ol><li> Identificeer de microtubuli die wordt gebruikt voor de meting. Voor elke cel wordt een paar microtubules kunnen hun verkorting of groei gevolgd duidelijk en volledig. </li><li> Onderzoekt elk frame van de video op het frame of het starten lengte van de microtubule toont een identificatiend het frame met de meest verlengd of verkort microtubuli. Meet de lengteverandering tussen de twee microtubuli en de tijd tussen de twee frames. </li><li> Bereken de snelheid van de groei of verkorting door de verandering in de lengte te delen door de tijd (het apparaat is micrometer / s). Voor elke behandeling staat, volgt ten minste 10 cellen en het meten van ten minste 20 microtubules. </li><li> Bereken het gemiddelde en de standaardafwijking voor elke behandeling conditie. Analyseer het statistisch verschil tussen de voorwaarden voor het gebruik van de Student-test. Rapporteren de gegevens in een tabel en / of in een diagram. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+cancer+incidence%2C+mortality%2C+and+prevalence+across+five+continents%3A+defining+priorities+to+reduce+cancer+disparities+in+different+geographic+regions+of+the+world%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world.</a> J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).</li>
<li>Yardley, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+and+the+role+of+combination+chemotherapy+in+improving+patient+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Breast+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes.</a> Int J Breast Cancer. 2013, 137414(2013).</li>
<li>Jassem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin+and+paclitaxel+versus+fluorouracil%2C+doxorubicin%2C+and+cyclophosphamide+as+first-line+therapy+for+women+with+metastatic+breast+cancer%3A+final+results+of+a+randomized+phase+III+multicenter+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial.</a> J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).</li>
<li>Nabholtz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docetaxel+and+doxorubicin+compared+with+doxorubicin+and+cyclophosphamide+as+first-line+chemotherapy+for+metastatic+breast+cancer%3A+results+of+a+randomized%2C+multicenter%2C+phase+III+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial.</a> J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).</li>
<li>Zelnak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+taxane+and+anthracycline+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+J%22%5BJournal%5D)">Overcoming taxane and anthracycline resistance.</a> Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).</li>
<li>Rivera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+anthracycline-resistant+and+taxane-resistant+metastatic+breast+cancer+and+new+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+J%22%5BJournal%5D)">Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options.</a> Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).</li>
<li>Longley, D. B., Johnston, P. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15641020">Molecular mechanisms of drug resistance.</a> J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).</li>
<li>Downing, K. H., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallographic+structure+of+tubulin%3A+implications+for+dynamics+and+drug+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct.Funct%22%5BJournal%5D)">Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding.</a> Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).</li>
<li>McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxanes%2C+microtubules+and+chemoresistant+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.Biophys.Acta%22%5BJournal%5D)">Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer.</a> Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).</li>
<li>Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+microtubule+dynamic+instability+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of microtubule dynamic instability in living cells.</a> Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).</li>
<li>Dumontet, C., Jordan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-binding+agents%3A+a+dynamic+field+of+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).</li>
<li>Jordan, M. A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Cancer%22%5BJournal%5D)">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?</a> J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).</li>
<li>Kavallaris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+and+resistance+to+tubulin-binding+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Cancer%22%5BJournal%5D)">Microtubules and resistance to tubulin-binding agents.</a> Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).</li>
<li>Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+microtubule+protofilament+number+induced+by+Taxol+binding+to+an+easily+accessible+site.+Internal+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics.</a> J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).</li>
<li>Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxanes%3A+microtubule+and+centrosome+targets%2C+and+cell+cycle+dependent+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Cancer+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action.</a> Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+mechanisms+underlying+acquired+resistance+to+taxanes+in+selected+docetaxel-resistant+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 14 (37), (2014).</li>
<li>Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenetics+of+target+genes+across+doxorubicin+disposition+pathway%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review.</a> Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).</li>
<li>Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxane+resistance+in+breast+cancer%3A+mechanisms%2C+predictive+biomarkers+and+circumvention+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat.Rev%22%5BJournal%5D)">Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies.</a> Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).</li>
<li>Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BetaIII-tubulin+induces+paclitaxel+resistance+in+association+with+reduced+effects+on+microtubule+dynamic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability.</a> J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).</li>
<li>Banerjee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+levels+of+tyrosinated+alpha-%2C+beta%28III%29-%2C+and+beta%28IV%29-tubulin+isotypes+in+paclitaxel-resistant+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.Biophys.Res.Commun%22%5BJournal%5D)">Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells.</a> Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).</li>
<li>Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+class+I+beta-tubulin+sensitizes+Taxol-resistant+breast+adenocarcinoma+cells+harboring+a+beta-tubulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation.</a> Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).</li>
<li>Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+of+drug-resistant+MCF-7+cells%3A+implications+for+relation+to+extracellular+matrix+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother.Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins.</a> Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).</li>
<li>Hembruff, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+drug+transporters+and+drug+accumulation+in+the+temporal+acquisition+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.Cancer%22%5BJournal%5D)">Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance.</a> BMC.Cancer. 8, 318(2008).</li>
<li>Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+dynamic+instability+of+steady-state+microtubules+in+vitro+by+video-enhanced+differential+interference+contrast+microscopy+with+an+appendix+by+Emin+Oroudjev%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev.</a> Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).</li>
<li>Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+in+vivo%3A+a+test+of+mechanisms+of+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover.</a> J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).</li>
<li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy%3A+rate+constants+and+transition+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li>
<li>Desai, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+polymerization+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule polymerization dynamics.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).</li>
<li>Walczak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+and+tubulin+interacting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins.</a> Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Er zijn twee belangrijke methoden microtubule dynamische instabiliteit meten: in vitro en in vivo. In de in vitro werkwijze wordt gezuiverd tubuline gebruikt microtubule dynamische instabiliteit-computer verbeterde time-lapse differentiële interferentie contrast microscopie meten. In de in vivo werkwijze gemicroinjecteerd fluorescerende tubuline of expressie GFP-tubuline, wordt opgenomen in microtubules. De dynamiek (groei en verkorting) van de microtubuli wordt vervolgens geregistree...

<html> De belangrijkste oorzaak van de sterfte aan borstkanker is door middel van metastase 1, 2. Taxanen zoals paclitaxel en docetaxel, worden momenteel gebruikt als eerstelijnsbehandeling regimes voor de behandeling van metastatische borstkanker 2, 3, 4, 5, 6. Ze behoren tot een groep van microtubulus richtende middelen (MTA) die dynamiek van microtubuli verstoren. Een van de grootste uitdagingen voor gebruik taxanen curatieve therapie is de ontwikkeling van resistentie taxaan in kankercellen, wat leidt tot terugkeer van de ziekte 7. Geneesmiddelresistentie goed voor meer dan 90% van alle sterfgevallen bij patiënten met metastatische borstkanker 7. Microtubuli worden gevormd door de polymerisatie van α- en β-tubuline heterodimerenclass = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9. De precieze regeling van de dynamiek van microtubuli is van belang voor vele cellulaire functies, zoals mobiele polarisatie, voortgang van de celcyclus, intracellulair transport en cell signaling. Ontregeling van microtubuli en hun dynamiek celfunctie verstoren en leiden tot celdood 10, 11. Afhankelijk van hoe zij veroorzaken deze ontregeling, kan MTA drugs worden geclassificeerd als microtubule stabiliserende middelen (dat wil zeggen, taxanen) of microtubule-destabalizing middelen (dat wil zeggen, vinca alkaloïden of colchicine plaatse bindmiddelen) 20. Ondanks hun tegengestelde effecten op microtubuli massa, op een voldoende dosering, beide klassen kunnen kankercellen te doden door hun effecten op de dynamiek van microtubuli 21. Taxanen werken voornamelijk door het stabiliseren van de microtubule as 12, waardoorchromosomale foutieve uitlijning. De daaropvolgende voortdurende activering van de spindel montage checkpoint (SAC) arresteert de cel in mitose. Langdurige mitose veroorzaakt apoptose dan 13, 14. Taxaan reageert met microtubuli door het taxaan bindingsplaats op β-tubuline 8, 15, die alleen aanwezig in gemonteerde tubuline 16. Meerdere mechanismen voor taxaan weerstand zijn voorgesteld 9, 17. Deze mechanismen omvatten zowel algemene multidrug resistentie door de overexpressie van drug-efflux eiwitten en taxaan-specifieke weerstand 5, 9, 18, 19. Bijvoorbeeld kan taxaan-resistente kankercellen veranderde expressie en functie van bepaalde β-badUlin isotypen 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. Door toepassing van een in vivo methode om microtubule dynamische instabiliteit meten, laten we zien dat, in vergelijking met niet-resistente, ouderlijke MCF-7 cellen 17 CC, de microtubule dynamiek van docetaxel-resistente MCF-7 TXT cellen zijn ongevoelig voor behandeling met docetaxel. Om een ​​beter begrip van de functie van MTA en het exacte mechanisme van taxaan-resistentie in kankercellen, is het essentieel om microtubule dynamiek meten. Hier rapporteren we een in vivo werkwijze voor het doen. Via levende beeldvorming in combinatie met de expressie van GFP-gelabeld tubuline in cellen, kunnen we de microtubule dynamiek van MCF-7 TXT en MCF-7 cellen met CC en wi metenthout de behandeling met docetaxel. Het resultaat kan ons helpen het ontwerpen van meer doeltreffende geneesmiddelen die taxaan weerstand kan overwinnen.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>12483</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti (100x)</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>docetaxel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01885-5mg-F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM phenol red-free</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>21063</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10613</td><td>Belangrijk reagens voor het tot expressie brengen van GFP-tubuline in cellen</td></tr><tr><td>CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B10383</td><td>Controle</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich+B9:AA9</td><td>472301</td><td>voor het oplossen van docetaxel</td></tr><tr><td>22-mm glazen dekglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-101</td><td></td></tr><tr><td>6-well kweekplaat</td><td>Greiner Bio-One International</td><td>6 Well Celi Culture Plate</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision Microscopie Beeldvormingssystemen</td><td>GE Health</td><td></td><td>Dit systeem is uitgerust met een weerstation voor het regelen van temperatuur en CO2. Het is ook uitgerust met Worx Software voor deconvolutie en time-lapse controle.</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25%), fenolrood</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific</td><td>Hausser Scientific, Gedistribueerd door VWR</td><td>Leverancier Nr.: 1492 VWR Nr.:15170-172</td><td></td></tr></tbody></table>

live-imaging om te studeren microtubuli dynamic instabiliteit in taxaan-resistente borstkankers

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Taxanes zoals docetaxel behoren tot een groep van microtubuli-targetende middelen (MTA's) waarop vaak wordt teruggegrepen om kanker te behandelen. Echter, taxaanresistentie in kankercellen vermindert drastisch de effectiviteit van het langetermijngebruik van de geneesmiddelen. Geaccumuleerd bewijs suggereert dat de mechanismen die ten grondslag liggen aan taxaanresistentie zowel algemene mechanismen omvatten, zoals de ontwikkeling van multidrugresistentie als gevolg van de overexpressie van geneesmiddel-effluxeiwitten, als taxaan-specifieke mechanismen, zoals die welke microtubulidynamiek omvatten.
Omdat taxanes zich richten op celmicrotubuli, is het meten van microtubulidynamische instabiliteit een belangrijke stap in het bepalen van de mechanismen van taxaanresistentie en biedt het inzicht in hoe deze resistentie kan worden overwonnen. In het experiment werd een in vivo methode gebruikt om microtubulidynamische instabiliteit te meten. GFP-gelabelde α-tubuline werd geëxpresseerd en geïncorporeerd in microtubuli in MCF-7 cellen, waardoor het mogelijk was om de microtubulidynamiek op te nemen door middel van time lapse met behulp van een gevoelige camera. De resultaten toonden aan dat, in tegenstelling tot de niet-resistente ouderlijke MCF-7CC cellen, de microtubulidynamiek van docetaxel-resistente MCF-7TXT cellen ongevoelig is voor docetaxelbehandeling, wat de resistentie tegen docetaxel-geïnduceerde mitotische arrestatie en apoptose veroorzaakt. Dit artikel zal deze in vivo methode van het meten van microtubulidynamische instabiliteit beschrijven.

Met het protocol hier gepresenteerde bestudeerden we het effect van docetaxel op de microtubule dynamiek van normale (MCF-7 CC) en docetaxel-resistente (MCF-7 TXT) borstkankercellen. Twee reeksen beelden tonen het effect van docetaxel (0,5 uM) Groei microtubuli en verkorting in MCF-7 CC en MCF-7 TXT cellen (Figuur 1A). Ook berekenden de groei microtubuli en beperking...

In dit artikel rapporteren we een protocol dat een in vivo methode beschrijft om microtubuli dynamische instabiliteit te meten in docetaxel-resistente borstkankercellen (MCF-7TXT). In deze methode wordt een deconvolutie-microscopie-beeldvormingssysteem gebruikt om de expressie van GFP-tubuline in doelcellen te detecteren.

Live-Imaging om te studeren microtubuli Dynamic Instabiliteit in taxaan-resistente borstkankers

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Het algemene doel van dit experiment is om de dynamische instabiliteit van microtubuli te meten in docetaxel-resistente borstkankercellen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de celbiologie te beantwoorden over de dynamische instabiliteit van microtubuli onder fysiologische omstandigheden, en na verschillende medicamenteuze behandelingen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het een eenvoudig, betrouwbaar en fysiologisch toepasbaar protocol biedt voor het bestuderen van microtubuli-dynamica in levende cellen.Voordat u met de procedure begint, kweekt u de borstkankercellen in compleet kweekmedium in 10 centimeter kweekschalen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide tot de juiste mate van confluentie. De dag voor het experiment spoelt u 24 millimeter poly L-lysine gecoate glasdeksels met 70%alcohol en stelt u de schuiven bloot aan UV-licht gedurende de nacht. De volgende ochtend plaatst u één glasdeksel in elk putje van een zesputjesplaat.Was vervolgens de culturen met PBS en los de cellen in elk schaaltje op met 0,5 milliliter trypsine EDTA. Wanneer de cellen zijn begonnen om zich van de schotelbodem te heffen, neutraliseert u de trypsine met vijf milliliter vers kweekmedium en telt u de cellen. Voeg vervolgens ongeveer één maal 10 de vijfde cellen toe aan elk glasdeksel, schud de schotel voorzichtig en plaats de cellen terug in de incubator voor minimaal 36 uur.Om de microtubuli-dynamica van de cellen te meten, mengt u de GFP-gelabelde alpha-tubulin stockoplossing meerdere keren door inversie om een homogene oplossing te garanderen zonder vortexing. Vervolgens vervangt u het kweekmedium in elk putje door twee milliliter vers medium dat 40 microliter van de gelabelde tubuline bevat. Schud de schotel voorzichtig om een volledige menging van de marker met het kweekmedium mogelijk te maken en plaats de schotel terug in de incubator voor nog eens 24 uur.De volgende dag vervangt u het kweekmedium door vers medium dat docetaxel bevat en plaatst u de schotel terug in de incubator voor 30 minuten. Terwijl de cellen worden geïnhibeerd, zet u de omgekeerde fluorescentiemicroscoop aan en verwarmt u de monsterhouder voor op 37 graden Celsius. Selecteer vervolgens de 60X 1,42 NA olie-objectieflens en monteer de eerste glasdeksel op de monsterhouder.Bedek het monster met één milliliter vers 37 graden Celsius docetaxel bevattend medium en lokaliseer een cluster van platte cellen met een hoge GFP-gelabelde alpha-tubuline fluorescentie-intensiteit met duidelijk zichtbare microtubulistructuren. Richt u op het perifere gebied van een van de cellen in het cluster en stel de juiste belichtingstijd in in de beeldverwervingsfrequentie. Precies 50 minuten na het toevoegen van de eerste dosis docetaxel begint u met het opnemen van de microtubuli-dynamica gedurende twee minuten, waarbij u elke twee seconden een foto maakt.Wanneer alle beelden zijn vastgelegd, beeldt u de volgende cel af zoals net gedemonstreerd, totdat er beelden zijn vastgelegd voor vijf cellen in totaal uit alle drie de putjes van elke docetaxel-concentratie. Wanneer alle beelden zijn vastgelegd voor elke remmerconcentratie opent u het deconvolutieprogramma, binnen het microscoopsysteem en klikt u op proces. Selecteer vervolgens deconvolve en sleep het beeldbestand naar het invoervenster.Klik op do om het beeld te deconvolveren en open het gedeconvolveerde beeldbestand in de microscoopsoftware. Klik op bestand en sla op als film. Stel het filmformaat in op AV en de animatiestijl op vooruit.Stel de compressiekwaliteit in op 100%en de framesnelheid op vijf per seconde. Controleer vervolgens het vakje door de tijd animeren en klik op do om de video te genereren. In dit representatieve experiment werden normale en docetaxel-resistente borstkankercellen behandeld met docetaxel en geïmagingd zoals net gedemonstreerd, maar de effecten van de behandeling op microtubuligroei en -verkorting waren het meest duidelijk in de niet-docetaxel-resistente cellen.Inderdaad, het meten van de groeisnelheid van microtubuli en de verkorting onder behandelingsvoorwaarden van 0,5 micromolar docetaxel geeft een sterke remming van de tubuline-dynamica van ouderlijke maar niet van docetaxel-resistente cellen. Eenmaal onder de knie, kan het hele proces binnen 60 uur worden voltooid als de technieken correct worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om platte cellen te selecteren, met een hoge GFP-tubuline fluorescentie-intensiteit, en om zowel de intensiteit van de excitatiefluorescentie als de duur van de blootstelling te verminderen om vervaging van de GFP-fluorescentie te voorkomen.Sinds de ontwikkeling ervan heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van cel- en kankerbiologie om de effecten van verschillende microtubuli-targetende middelen op normale en kankercellen te beoordelen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u dynamische instabiliteit van microtubuli kunt meten in levende cellen onder verschillende omstandigheden.

live-imaging-to-study-microtubule-dynamic-instability-taxane

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een experimenteel muismodel van bot metastase is opgericht naar aanleiding intracardiale levering van luciferase expressie mamma tumorcellen. De ontwikkeling van tumoren en resulteerde osteolytische laesie werden longitudinaal gevolgd met bioluminescentie en micro-CT beeldvorming.

Monitoring tumormetastasen en osteolytische laesies met bioluminescentie en Micro CT Imaging

We beschrijven een werkwijze voor beeldvorming respons op...

Leef Imaging van de Drug antwoorden in de tumor micro-omgeving in muismodellen van Kanker van de Borst

Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen afkomstig van genetisch gemanipuleerde muizen met borstkanker te bepalen of er correlaties tussen specifieke gedragsparameters en verschillende genetische laesies beoordelen.

Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker

Door het gebruik van transgene reportermuizen en injecteerbare fluorescerende labels, maakt langdurige intravitale spinning disk confocale microscopie directe visualisatie mogelijk van het gedrag van myeloïde cellen in darmadnomen in het ApcMin/+ colorectaal kankermodel.

Real-time beeldvorming van myeloïde cellen Dynamiek in Apc Min / + Intestinale Tumoren door draaiende schijf confocale microscopie

Hier beschrijven we een methode van lange-termijn tijds-lapse microscopie om individuele cellen longitudinaal te volgen in reactie op anti-kanker therapieën.

Through the Looking Glass: Time-lapse microscopie en Longitudinal volgen van enkele cellen aan anti-kanker Therapeutics Studie

Dit protocol beschrijft het gebruik van multiphoton microscopie tot uitgebreide time-lapse beeldvorming van meercellige interacties uit te voeren in real time, in vivo bij enkele resolutie cel.

Extended Time-lapse intravitale Imaging van Real-time Meercellige Dynamiek in de tumor micro

Hier presenteren we de real-time bewaking van de cel migratie in een wondgenezing assay met behulp van TIP60-verarmd MCF10A borst epitheliale cellen. De uitvoering van live-cel beeldvormingstechnieken in ons protocol kan we analyseren en visualiseren van eencellige verkeer in real time en in de tijd.

Live-imaging van borst epitheliale cel migratie na de voorbijgaande uitputting van TIP60

Live-cel imaging biedt een schat aan informatie op afzonderlijke cellen of hele populaties die onbereikbaar is door de vaste cel imaging alleen. Hier, worden live-cel imaging protocollen te beoordelen cel lot beslissingen naar aanleiding van de behandeling met de anti-mitotische drug paclitaxel beschreven.

Op lange termijn Live-cel Imaging om te beoordelen van cel lot in reactie op Paclitaxel

Een protocol voor het in beeld brengen van de dynamische microtubuli in vivo met behulp van fluorescerend gelabeld Eindbindend eiwit is gepresenteerd. We beschreven de methoden om de dynamische microtubuli in het posterieure laterale microtubuli (PLM) neuron van C. elegans te labelen,in beeld te geven en te analyseren .

In vivo Beoordeling van microtubule dynamica en oriëntatie in Caenorhabditis elegans neuronen

Hier wordt een op TIRF-microscopie gebaseerde in vitro reconstitutietest gepresenteerd om tegelijkertijd de dynamiek van twee microtubulipopulaties te kwantificeren en te vergelijken. Er wordt een methode beschreven om tegelijkertijd de collectieve activiteit van meerdere microtubule-geassocieerde eiwitten op verknoopte microtubulibundels en enkele microtubuli te bekijken.

Gelijktijdige visualisatie van de dynamica van crosslinked en enkele microtubuli in vitro door TIRF-microscopie

We rapporteren een techniek die live beeldvorming mogelijk maakt van microtubule dynamica in glioblastoom (GBM) cellen die een gewerveld hersenweefsel binnendringen. Door de orthotopische injectie van fluorescerend gelabelde GBM-cellen te koppelen aan een transparant zebravisbrein met intravitale beeldvorming met hoge resolutie, kan de cytoskeletdynamiek worden gemeten tijdens in situ kankerinvasie.

Live imaging van microtubulidynamica in glioblastoomcellen die het zebravisbrein binnendringen

Leer microtubuli dynamische instabiliteit meten in docetaxel-resistente borstkankercellen via live-imaging met GFP-tubulin en deconvolutiemicroscopie. Deze methode biedt inzicht in gedrag onder behandeling.

Live-Imaging om te studeren microtubuli Dynamic Instabiliteit in taxaan-resistente borstkankers

Meer video's verkennen